CN107789359A - 一种痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，所述构建方法如下：(1)以60mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型；(2)在糖尿病大鼠坐骨神经上设置环形卡套，环形卡套环绕坐骨神经，与之接触但不压迫。本发明创造性的采用坐骨神经卡压法，将乳胶管套在糖尿病大鼠坐骨神经上，构建痛性糖尿病周围神经病变大鼠模型，实验结果显示，STZ注射+乳胶管置入组大鼠发生MA的几率与STZ注射组大鼠发生相比显著增加(P<0.05)。本发明的方法造模时间短，成模率高，模型稳定，为糖尿病周围神经病变疼痛的发生机制及相关药物研究提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型制备技术领域，具体地说，是一种痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法。
背景技术
糖尿病(DM)是临床上比较多见的一种慢性代谢性疾病，而糖尿病周围神经病变(DPN)是DM常见的一种慢性神经并发症，患病率高达47％～91％，其中痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)的发生率可以达到13％～26％，是DPN的一种常见表型，给患者带来了很大的困苦，甚至导致糖尿病患者截肢、致死的严重后果。PDPN常见的临床表现有肢体对称性麻木、疼痛、烧灼感、发凉、感觉减退，下午或夜间加重，以触痛(allodynia)、自发痛(spontaneouspain)、痛觉过敏(hyperalgesia)为神经病理性疼痛特征。PDPN患者常会因抑郁，随眠障碍以及其他不良反应严重影响日常生活，多数PDPN患者导致残疾，约1/3患者步行需要辅助装置，如拐杖、助行器或轮椅等。虽然PDPN是否导致糖尿病患者病死率增加尚无明确的结论，但是重度慢性疼痛会导致死亡风险增加已有明确结论，可能的原因包括过量服用止痛药和因抑郁引发的自杀行为。目前PDPN顽固性疼痛的治疗尚无理想的有效方法，其发病机制比较复杂，尚不完全清楚，可能与氧化应激、离子通道、炎症反应、高血糖等多种因素有关。因此建立痛性糖尿病周围神经病变大鼠模型，对糖尿病周围神经病变疼痛的发生机制提供稳定的研究基础。
《中国疼痛医学杂志》2007年2月刊登的论文《糖尿病周围神经病变大鼠疼痛模型的建立》，公开采用二月龄SD大鼠按60mg/kg腹腔注射链尿佐菌素，造模前、造模后48小时、6周取尾静脉血测血糖；造模前、造模后1、2、3、4、5、6周测定大鼠50％缩爪机械阈值(PWT)；造模后6周，透视电镜观察腓肠神经超微结构。《时珍国医国药》2015年4月刊登的论文《木丹颗粒对痛性糖尿病周围神经病变大鼠钙通道基因表达的影响》，公开采用Wistar大鼠副将注射链尿佐菌素STZ(53mg/kg)制作PDPN模型，4周后，用Vonfrey纤维丝测双后足机械痛阈。然而现有技术中，关于本发明痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，尚未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供如上所述方法的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，包括如下步骤：在糖尿病大鼠坐骨神经上设置环形卡套，环形卡套环绕坐骨神经，与之接触但不压迫。
作为本发明的一个优选实施方案，所述环形卡套的内径与糖尿病大鼠坐骨神经内径相同。
作为本发明的一个优选实施方案，所述糖尿病大鼠坐骨神经选择范围为坐骨结节近端1cm至远端3cm。
作为本发明的一个优选实施方案，所述环形卡套为筒状，长度为0.7-1.3cm，套在坐骨结节远端1cm的坐骨神经上。
作为本发明的一个优选实施方案，所述环形卡套为乳胶管。
作为本发明的一个优选实施方案，所述构建方法包括如下步骤：以60mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型。
作为本发明的一个优选实施方案，所述构建方法如下：
(1)以60mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型；
(2)在糖尿病大鼠坐骨神经上设置环形卡套，环形卡套环绕坐骨神经，与之接触但不压迫。
作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤2具体为：暴露坐骨结节近端1cm至远端3cm，制作内径与坐骨神经直径相同的长筒状乳胶管，长度为0.7-1.3cm，套在坐骨结节远端1cm的坐骨神经上缝线缝合乳胶管使其内径与坐骨神经直径相同，仅接触但不压迫坐骨神经，缝线缝合肌肉、皮下组织与皮肤。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的方法在构建痛性糖尿病周围神经病变大鼠模型中的应用。
本发明优点在于：
本发明在构建糖尿病大鼠后，创造性的采用坐骨神经卡压法，将乳胶管套在糖尿病大鼠坐骨神经上，乳胶管环绕神经，与之接触但不压迫，实验结果显示，造模后STZ注射+乳胶管置入组大鼠血糖水平较乳胶管置入对照组显著升高(P<0.05)，STZ注射+乳胶管置入组大鼠体重较乳胶管置入对照组显著降低(P<0.05)，STZ注射+乳胶管置入组大鼠发生MA的几率与STZ注射组大鼠发生相比显著增加(P<0.05)。本发明的方法制备的痛性糖尿病周围神经病变大鼠模型造模时间短，成模率高，模型稳定，为糖尿病周围神经病变疼痛的发生机制及相关药物研究提供基础。
附图说明
附图1是将乳胶管置入STZ注射诱导糖尿病大鼠坐骨神经。图1A.采用9-0缝线缝合乳胶管使其内径与坐骨神经直径相仿，乳胶管环绕神经，与之接触但不压迫(乳胶管可在坐骨神经上移动)；B.3周后行减压术时再次暴露神经，可见神经肿胀，直径与乳胶管内径不相符；C.将乳胶管去除后完全暴露神经，可见神经肿胀、发红明显；附见糖尿病大鼠外观毛发紊乱，发色暗黄。
附图2是von Frey纤维丝测量大鼠PWT。图2A.罩有棕色透明有机玻璃的金属网架，B.有机玻璃两端开放，内有间隔隔开4个小室，一次可容纳4只大鼠进行检测，C.依次以不同强度的von Frey纤维丝，由下往上穿过网眼垂直刺激大鼠右侧后爪掌中部的皮肤，D.大鼠出现缩足、舔足反应记为阳性反应。
附图3是各组大鼠的血糖变化。Control：空白对照组，Latex tube control：乳胶管置入对照组，STZ：STZ注射组，STZ+Latex tube：STZ注射+乳胶管置入组。*，表示STZ注射组与相应对照组(空白对照组)对比P<0.05；#，表示STZ注射+乳胶管置入组与相应对照组(乳胶管置入对照组)对比P<0.05。
附图4是各组大鼠的体重变化。Control：空白对照组，Latex tube control：乳胶管置入对照组，STZ：STZ注射组，STZ+Latex tube：STZ注射+乳胶管置入组。*，表示STZ注射组与相应对照组(空白对照组)对比P<0.05；#，表示STZ注射+乳胶管置入组与相应对照组(乳胶管置入对照组)对比P<0.05。
附图5是实验组大鼠发生MA的数量比例。MA-Negative：触诱发痛阳性，MA-Positive：触诱发痛阴性。*，表示STZ注射+乳胶管置入组大鼠发生MA的比例(26/30)与STZ注射组大鼠发生MA的比例相比P<0.05。
附图6是各组大鼠的PWT变化。Control：空白对照组，Latex tube control：乳胶管置入对照组，STZ：STZ注射组，STZ+Latex tube：STZ注射+乳胶管置入组，NoDecompression：非减压组，Decompression 3w：3周减压组，Decompression 5w：5周减压组。*，表示空白对照组与相应实验组(STZ注射组)对比P<0.05；#，表示乳胶管置入对照组与相应实验组(STZ注射+乳胶管置入组)对比P<0.05；@，3周减压组的PWT与非减压组对比P<0.05。
附图7是实验组大鼠发生TH的数量比例。HT-Negative：热痛觉过敏阳性，HT-Positive：热痛觉过敏阴性。*，表示STZ注射+乳胶管置入组大鼠发生TH的比例(26/30)与STZ注射组大鼠发生TH的比例相比(18/20)P>0.05。
图8是各组大鼠的PWL变化。Control：空白对照组，Latex tube control：乳胶管置入对照组，STZ：STZ注射组，STZ+Latex tube：STZ注射+乳胶管置入组，No Decompression：非减压组，Decompression 3w：3周减压组，Decompression 5w：5周减压组。*，表示空白对照组与相应实验组(STZ注射组)对比P<0.05；#，表示乳胶管置入对照组与相应实验组(STZ注射+乳胶管置入组)对比P<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建
一、糖尿病大鼠模型
成年雄性Sprague-Dawley大鼠(购自上海交通大学医学院附属新华医院实验动物中心，上海生命科学院实验动物中心)，购进初体重200-230g，由上海交通大学医学院附属新华医院实验动物中心进行饲养，层流动物房饲养条件，饲养温度22-24℃，规律12小时昼夜周期，5只大鼠/笼，水源与食物充足。
避光、新鲜配制STZ溶液(链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，以10mg/ml浓度溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(美国Sigma公司，0.1mol/L,pH 4.5)，现用现配，避光运输)，以60mg/kg剂量一次性腹腔注射，1周后测量空腹血糖，血糖浓度>16.7mmol/L即视为糖尿病大鼠模型成功建立。
二、痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)大鼠模型
以50mg/kg剂量一次性腹腔注射戊巴比妥钠麻醉各组大鼠，将各组大鼠手术暴露坐骨神经后，将乳胶管置入STZ注射诱导糖尿病大鼠坐骨神经。具体操作如下：使用头戴式放大镜，在大鼠右侧大腿臀后部修剪毛发，备皮后医用酒精消毒拟手术皮肤区域，行直切口暴露臀部肌肉，解剖分离臀大肌与股二头肌间隙，暴露并游离坐骨神经，暴露范围为坐骨结节近端1cm至远端3cm，制作内径与坐骨神经直径相仿的长筒状乳胶管(取自医用乳胶手套)，长度约为1cm，套在坐骨结节远端1cm的坐骨神经上，采用9-0缝线缝合乳胶管使其内径与坐骨神经直径相仿，仅接触但不压迫坐骨神经(图1A-C)，采用4-0缝线缝合肌肉、皮下组织与皮肤，置回笼中观察。
三、痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)大鼠模型验证方法
1.触诱发痛(Mechanical Allodynia，MA)的检测
1)时间点：分别于大鼠建模前、建模3天后及后续每周进行PWT的检测；
2)将大鼠置于罩有棕色透明有机玻璃的金属网架上，有机玻璃两端开放，内有间隔隔开4个小室(26cm*20cm*14cm)，一次可容纳4只大鼠，金属网架孔径约为1cm*1cm，下方高出实验台约30cm，每次检测前将大鼠置于小室内适应20-30分钟(图2A-B)；
3)依次以不同强度的von Frey纤维丝(0.4，0.6，1.4，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0)从最小力度开始参照up and down法，由下往上穿过网眼垂直刺激大鼠右侧后爪掌中部的皮肤，观察大鼠缩足反应，大鼠出现缩足、舔足则视为阳性反应(图2C-D)，为避免频繁刺激造成耐受或痛敏，每次刺激持续5-6s，同一强度的von Frey纤维丝连续刺激2-3次，刺激无反应时予以更大一级强度的von Frey纤维丝刺激，刺激有反应时则改用小一级强度的von Frey纤维丝刺激，反复类推，不同强度刺激间隔2-3分钟，阳性反应记为"X"，阴性反应记为"O"，从阳性反应那一次开始连测5次，得到一系列"X""O"组合，结合该序列查表得出相应数值，将最后一次von Frey纤维丝的力度(f)代入下列相应公式计算得出50％缩足反应阈值(paw withdrawal threshold,PWT)：
50％缩足反应阈值(g)＝(10[Xf+kδ])/10000
其中Xf＝log(f)，δ为各个von Frey纤维丝的力度取对数log后的均差，一般约为0.224，k为根据测量所得"X""O"组合查表得到的值。
2.热痛觉过敏(TH)的检测
1)时间点：分别于大鼠建模前、建模3天后及后续每周进行后爪回缩潜伏期(pawwithdrawal latency,PWL)的检测；
2)令大鼠充分排便排尿后，将大鼠置于足底热痛觉测试仪上，罩以两端开口、大小约为20cm*30cm*20cm的透明有机玻璃箱内，测试前将大鼠置于小室内适应20-30分钟；
3)热辐射光源聚焦到顶部玻璃，在右侧后爪部形成一个4cm*6cm的光点(温度约维持在30℃)，记录开始照射至大鼠出现缩足、舔足等反应的时间，每只足重复测定3次，间隔10分钟，取平均值记为PWL，每次最长热辐射时间30s，防止灼伤大鼠足底皮肤。
四、实验结果
1.各组大鼠血糖的变化
图3为各组大鼠在建模后不同时间点的血糖水平，从图中可以看出，STZ注射组血糖水平较空白对照组显著升高(P<0.05)，STZ注射+乳胶管置入组血糖水平较乳胶管置入对照组显著升高(P<0.05)。
2.各组大鼠体重的变化
图4为各组大鼠在建模后不同时间点的体重变化，从图中可以看出，STZ注射组大鼠体重较空白对照组显著降低(P<0.05)，STZ注射+乳胶管置入组大鼠体重较乳胶管置入对照组显著降低(P<0.05)。体重是评估糖尿病大鼠模型的辅助参考指标，与空白对照组和乳胶管置入对照组对比，糖尿病大鼠体重增长明显较为缓慢(P<0.05)。
3.各组大鼠发生MA的数量比例
通过术后第3周检测大鼠右后爪PWT，STZ注射组20只大鼠中11只大鼠PWT与对照组相比明显下降(<8g)，视为MA阳性；STZ注射+乳胶管置入组30只大鼠中26只大鼠PWT与对照组相比明显下降，视为MA阳性(图5)。STZ注射+乳胶管置入组大鼠发生MA的比例(26/30)明显比STZ注射组大鼠发生MA的比例多(11/20)，差异具有统计学意义(P<0.05)。
4.各组大鼠的PWT变化
STZ注射组与STZ注射+乳胶管置入组大鼠对机械刺激有明显的阳性反应，在造模后3天到1周时间内，与对照组大鼠相比，两组实验组大鼠的右后爪平均PWT均出现明显的降低(<8g)。在第3周末时，两组实验组大鼠的右后爪平均PWT未见明显差异(P>0.05)，随后将MA阳性的26只STZ注射+乳胶管置入组大鼠随机、大致平均分为三组，分别是非减压组8只，3周减压组9只，5周减压组9只。在随后的4周中，非减压组大鼠的右后爪平均PWT未见明显波动，仍保持较低水平，约为2.5-3.5g左右；3周减压组大鼠的右后爪平均PWT在后4周中逐渐出现回升，在第7周时其右后爪平均PWT较非减压组和STZ注射组大鼠显著增大(P<0.05)；5周减压组大鼠的右后爪平均PWT在后两周稍有回升，但与同期非减压组和STZ注射组大鼠相比无明显统计学差异(P>0.05)(图6)。
5.各组大鼠发生TH的数量比例
通过术后第1周检测大鼠右后爪PWL，STZ注射组20只大鼠中18只大鼠PWL与对照组相比明显下降，视为TH阳性；STZ注射+乳胶管置入组30只大鼠中28只大鼠PWL与对照组相比明显下降，视为TH阳性(图7)。STZ注射+乳胶管置入组大鼠发生TH的比例(28/30)与STZ注射组大鼠发生TH的比例(18/20)无明显统计学差异(P>0.05)。
6.各组大鼠的PWL变化
STZ注射组与STZ注射+乳胶管置入组大鼠对热辐射刺激有明显的阳性反应，在造模后3天到1周时间内，与对照组大鼠相比，两组实验组大鼠的右后爪平均PWL均出现明显的降低。在第3周末时，两组实验组大鼠的右后爪平均PWL未见明显差异(P>0.05)，在随后的4周中，各实验组(包括各减压亚组)的右后爪平均PWL均表现为下降趋势，在第7周末时，各组实验组大鼠的右后爪平均PWL未见明显差异(P>0.05)(图8)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：在糖尿病大鼠坐骨神经上设置环形卡套，环形卡套环绕坐骨神经，与之接触但不压迫。
2.根据权利要求1所述痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，所述环形卡套的内径与糖尿病大鼠坐骨神经内径相同。
3.根据权利要求1所述痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，所述糖尿病大鼠坐骨神经选择范围为坐骨结节近端1cm至远端3cm。
4.根据权利要求1所述痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，所述环形卡套为筒状，长度为0.7-1.3cm，套在坐骨结节远端1cm的坐骨神经上。
5.根据权利要求1所述痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，所述环形卡套为乳胶管。
6.根据权利要求1所述痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：以60mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型。
7.根据权利要求1所述痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：
(1)以60mg/kg剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型；
(2)在糖尿病大鼠坐骨神经上设置环形卡套，环形卡套环绕坐骨神经，与之接触但不压迫。
8.根据权利要求7所述痛性糖尿病周围神经病变大鼠改良模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2具体为：暴露坐骨结节近端1cm至远端3cm，制作内径与坐骨神经直径相同的长筒状乳胶管，长度为0.7-1.3cm，套在坐骨结节远端1cm的坐骨神经上缝线缝合乳胶管使其内径与坐骨神经直径相同，仅接触但不压迫坐骨神经，缝线缝合肌肉、皮下组织与皮肤。
9.权利要求1-8任一所述的方法在构建痛性糖尿病周围神经病变大鼠模型中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN110250109A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-09-20 | 上海交通大学医学院附属新华医院 | 乙醛酸代谢异常相关疾病模型的构建方法、组合物及试剂盒和应用 |
| CN110403727A (zh) * | 2019-08-01 | 2019-11-05 | 吉林大学 | 一种坐骨神经慢性压迫模型的构建装置 |
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2017
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