CN105126119A

CN105126119A - 长非编码核糖核酸mrak009713小干扰rna在制备神经病理痛药物中的应用

Info

Publication number: CN105126119A
Application number: CN201510505282.5A
Authority: CN
Inventors: 李桂林; 祝高春; 梁尚栋; 姜怀德; 郑超然
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-08-17
Also published as: CN105126119B

Abstract

长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA在制备神经病理痛药物中的应用，长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA可减轻神经病理痛大鼠的痛行为反应，降低背根神经节上的P2X₃受体表达，产生防治疼痛的作用。本发明还可在制备涉及P2X₃受体介导神经系统疾病防治药物中的应用。可制成适用于神经病理痛治疗、涉及P2X₃受体介导神经系统疾病防治的口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型的制剂。

Description

长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA在制备神经病理痛药物中的应用

技术领域

本发明涉及神经病理痛镇痛药物用途发明领域。

背景技术

疼痛是大多数疾病具有的共同症状，是人类共有而个体差异很大的一种不愉快的感觉。由于疼痛给人们造成极大痛苦，据2001年第二期《国际疼痛学会通迅》报道：美国106次国会通过一项决议，宣布从2001年元月一日起的十年为“疼痛控制和研究的十年”。由此说明疼痛治疗是世界难题。根据疼痛时程可将疼痛分为急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)。慢性痛包括炎症痛、神经病理痛、癌症痛，是临床上常见主诉之一。由于慢性痛机理复杂，其治疗成为临床上的难题。神经病理痛是指由神经系统损伤或疾病所引起的疼痛综合征，常常表现为自发性的疼痛，对机械、冷、热等伤害性剌激产生痛觉过敏；对非伤害性剌激产生触诱发痛、痛觉倒错和烧灼痛等神经病理性痛觉过敏。常规镇痛药副作用较大(如吗啡容易成瘾)，加之慢性痛持续时间长，对人身心健康危害较大，因此探明其发病机制寻找安全有效的慢性痛防治方法是全世界科学家研究的热点和重点。

嘌呤类物质三磷酸腺苷(ATP)作为重要的信使物质参与痛觉信息传递。嘌呤受体分为P1和P2受体，ATP及其类似物作用于P2受体。P2受体分为配体门控性离子通道型受体(P2X受体)和G蛋白偶联型受体(P2Y受体)。外周感受器感受伤害性刺激后形成伤害冲动是通过脊神经(背根)节初级感觉神经细胞传入。疼痛、伤害性剌激使损伤细胞、应激细胞以及感觉神经末梢本身释放大量ATP，ATP及其作用的P2X受体涉及痛觉及伤害性信息在初级感觉神经元的传递，其中主要是同聚性P2X₃受体和异聚性P2X_2/3受体参与初级感觉神经元的痛觉及伤害性信息传递。基因敲除P2X₃受体和双重基因敲除P2X_2/3受体的小鼠减小了对福尔马林致痛试验的两相反应。P2X₃和P2X_2/3受体介导神经病理痛的痛觉传递。神经病理痛剌激时，P2X₃受体和P2X₃mRNA表达增加，感觉神经元P2X₃受体介导ATP激活的门控通道电流明显增强。应用P2X₃受体反义寡核苷酸及RNA干扰技术可使炎性痛大鼠模型背根神经节的P2X₃受体水平下调，进而明显减轻P2X₃受体激动剂α,β-meATP和福尔马林所致的足底伤害性反应。这些发现为神经病理痛的发病机理提供了新的依据。申请人实验室以前的研究也显示神经病理痛可导致背根感觉神经元P2X₃受体表达增加。目前国外已有研究生产P2X₃受体拮抗剂(如RO3)用于临床治疗疼痛的报道。

随着基因组测序计划的完成以及新一代深度测序技术的应用，人们发现哺乳动物细胞中多于95％的转录序列为非编码核糖核酸(noncodingRNA,ncRNA)。非编码RNA是一类不编码蛋白质但具有生物学调控功能的RNA分子，它可通过参与mRNA的稳定和翻译水平的调节、蛋白质的运输、RNA的加工和修饰以及影响染色体的结构等机制，调控生物体的基本生命活动，同时与一些重要疾病的病理生理过程相关。非编码RNA包括短非编码核糖核酸(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长非编码核糖核酸(longnon-codingRNA,lncRNA)。长度大于200个碱基(200nt)为长链非编码核糖核酸(lncRNA)。目前长度小于50个核苷酸的非编码RNA(如microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性进展，但对具有功能的长非编码核糖核酸的研究不多。本发明通过坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)大鼠模型，观察长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰核糖核酸处理后大鼠痛行为的变化，以及与介导神经病理痛的P2X₃受体表达变化的关系，为MRAK009713小干扰RNA用于慢性痛(即神经病理痛)的预防和治疗提供帮助。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA的第一个新用途，即长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA在制备治疗神经病理痛药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA的第二个新用途，即长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA在制备涉及P2X₃受体介导神经系统疾病防治药物中的应用。

长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA可减轻神经病理痛大鼠的痛行为反应。长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA在防治神经病理痛的作用机理为：降低背根神经节上的P2X₃受体表达，产生防治疼痛的作用。

附图说明

图1为坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠机械缩足反射阈值变化图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后对CCI大鼠的机械痛行为具有抑制作用。包括对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^*p<0.05，^**p<0.01表示和正常组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

图2为坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠热缩足反射阈值变化图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后对坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠的热敏痛行为具有抑制作用。实验分组包括：对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^*p<0.05，^**p<0.01表示和正常组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

图3为坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠背根神经节(DRG)长非编码核糖核酸MRAK009713的实时定量逆转录-聚合酶链式反应(realtimeRT-PCR)检测结果图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后可降低坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠DRG上调的长非编码核糖核酸MRAK009713水平。实验分组包括：对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^**p<0.01表示和正常组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

图4为坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠DRG的P2X₃受体realtimeRT-PCR检测结果图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后可降低坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠DRG上调的P2X₃受体水平。实验分组包括：对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

图5为坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠DRG的P2X₃受体免疫组织化学检测结果图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后可降低坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠DRG上调的P2X₃受体水平。图5(a)为免疫组织化学实验结果图，图5(b)为实验数据分析比较柱状图，实验分组包括：对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

图6为坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠DRG的P2X₃受体蛋白印迹检测结果图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后可降低坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠DRG上调的P2X₃受体水平。图6(a)为蛋白印迹实验结果图，图6(b)为实验数据分析比较柱状图，实验分组包括：对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^*p<0.05表示和正常组比较，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

图7为坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α变化检测结果图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后可降低坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠上调的血清TNF-α变化水平。实验分组包括：对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

图8为坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠血清白介素(IL)-6变化检测结果图。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理后可降低坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠上调的血清IL-6变化水平。实验分组包括：对照组；假手术组；慢性坐骨神经压迫性损伤组；慢性坐骨神经压迫性损伤+长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰RNA处理组；慢性坐骨神经压迫性损伤+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中^**p<0.01表示和正常组比较，^##p<0.01表示与坐骨神经慢性压迫性损伤模型组比较。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1。

用本技术领域公知的方法，制成适用于神经病理痛治疗的口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型的长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA制剂。

实施例2。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及P2X₃受体介导的相关疾病治疗的口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型的长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA制剂。

总之，长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰核糖核酸以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。

为了更好地理解本发明的实质，下面以长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰核糖核酸对P2X₃受体介导的相关疾病治疗作用研究的实验和结果来证明长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰核糖核酸的用途。

一、材料和方法。

1、动物和分组。

洁净级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，180-200g，由南昌大学医学院实验动物科学部提供。将大鼠随机分为5组，每组12只，分别为对照组(Ctrl)，假手术组(Sham)，坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(Chronicconstrictioninjury，CCI)；坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸(siRNA)处理组(CCI+siRNA)，坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照(negativecontrolsiRNA，NCsi)组(CCI+NCsi)。分别标记，以基础饲料喂养。CCI+siRNA组和CCI+NCsi组大鼠在术后第七天分别鞘内注射给予长非编码核糖核酸MRAK009713siRNA和NCsiRNA一次(核酸量5μg/200g体重，与转染试剂按说明书混匀后注射)。2周后取材(背根神经节)。长非编码核糖核酸MRAK009713小RNA干扰(siRNA)序列由广州锐博公司提供，靶序列：GGCCATTACTGGCTGAGAA，正义链：5’GGCCAUUACUGGCUGAGAAdTdT3’，反义链：3’dTdTCCGGUAAUGACCGACUCUU5’；阴性对照siRNA(NCsi)购至广州锐博公司。在体转染试剂由Entranster^TM公司提供。根据Entranster^TM在体转染说明书，实验第7天对CCI造模成功的大鼠进行长非编码核糖核酸MRAK009713-siRNA在体小干扰实验。

2、药物与试剂。

动物体内转染试剂(Entranster^TM-invivo)、兔源性嘌呤2X₃(P2X₃)抗体(Abcam公司)。

3、主要仪器。

BME-410C型全自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)；BME-403VonFrey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75％酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊等。

4、慢性神经病理痛模型制作。

腹腔注射10％的水合氯醛水溶液(3ml/kg体重)进行麻醉，以俯卧位固定在灭菌后的手术台上，使其左后肢伸展，剃去坐骨周围约1cm半径的被毛，碘伏擦拭消毒，酒精脱碘完成备皮，以手术刀切开表皮，暴露股二头肌，止血钳钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，玻璃分针游离出坐骨神经，用4-0铬制羊肠线每隔1mm结扎一道，共结扎4道；逐层缝合肌肉和皮肤；常规饲养。Sham组大鼠只游离坐骨神经，不进行结扎处理。

用10％的水合氯醛水溶液(3ml/kg体重，腹腔注射)，在无菌条件下于大鼠左大腿后外侧切开皮肤，钝性分离出坐骨神经，以4-0铬制羊肠线每隔1mm结扎一道，共结扎4道。结扎过程中可见坐骨神经被结扎处直径略减小，并伴有右后肢一过性抽动，并注意不要结扎太紧以至于完全阻断神经外周的血流。大鼠术后单笼饲养，分别于术前(0d)及术后1,3,5,7,9,11,14d测量机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期(测定时间恒定于每日10∶00-14∶00,室温维持在22±0.5℃)。

5、神经病理痛大鼠机械痛敏检测。

用BME-403VonFrey细丝(中国医学科学院生物医学工程研究所)测定机械缩足反射阈值(mechanicalwithdrawalthreshold,MWT)。置大鼠于透明的有机玻璃箱(22×12×22cm³)中，有机玻璃箱底为1×1cm²的铁丝网。术后大鼠放置于实验室饲养，测试前将大鼠放在有机玻璃箱中适应15min。折力分别为0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0，折力≥26.0g时均记为26.0g。从最小折力开始，每根试验10次，直至出现缩足反射次数大于5/10，即50％反应阈值(即引起10次试验中5次反应的值。重复三次，取其平均值)。每次刺激间隔时间至少大于15s，并待刺激引起的反应(如舔足、甩腿等)完全消失。

6、热痛敏缩足反射阈值的检测。

本测试采用的仪器是BME一410C型全自动热痛刺激仪。将与上述相同的玻璃盒放在3mm厚的玻璃板上，大鼠置于玻璃盒中，待适应30分钟后进行测试。采用热辐射照射大鼠右足底，记录从照射到出现抬腿的时间，即TWL。为防止组织损伤，切断时间为30s。

7、实时定量逆转录-聚合酶链式反应(realtimeRT-PCR)。

(1)提取总RNA并逆转录成cDNA：所有器械均经DEPC处理。在手术后第14天取材，分别取各组大鼠背根神经节，用DEPC处理过的PBS冲洗，置于RNAStore液中﹣20℃保存，提取RNA时将神经节取出移至加有1mlTrizol匀浆器中，研磨后转移到1.5ml的无核酶离心管中，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，静置3min,，低温离心12000g×15min,收集上层无色液相，加入与液相等体积的异丙醇，混匀，常温静置25min，沉淀RNA，之后4℃离心12000g×10min，弃上清，在管底可见少许白色沉淀为RNA，加入1ml无核酶水配置的75％乙醇，充分洗涤RNA。4℃离心5000g×3min后，吸弃上清液，倒置2分钟，略干燥(切勿过分干燥，否则RNA不溶于水)，加20μl无RNase水溶解沉淀。采用50μl逆转录反应体系：无核酶水11.75μl，5×buffer10μl，dNTP3μl，OligDT2μl，MMLV2μl，Rnasin1.25μl，RNA样本20μl，共50μl，离心，恒温37℃水浴1小时。

(2)设计引物：参考文献设计MRAK009713和P2X₃受体引物序列。本发明选用β-actin作为标准内参，引物序列分别为：

(3)聚合酶链式反应反应体系(共20μl)：

TAKARA公司的Real-timePCR试剂盒PremixExTaq^TMII，货号：DRR041。

用ABI7500的实时定量仪器，按下列组分加入进行反应。

PCR反应条件：50℃×2min→95℃×10min→95℃×15sec，60℃×42sec，72℃×1min，共40个循环。

结果分析：通过ABI7500PCR仪自带的7500Softwarev2.0.4软件进行分析。

8、免疫组织化学方法。

(1)提取组织：取各组大鼠DRG，预冷的PBS清洗，4％PFA固定48h后30％蔗糖脱水，切片，其厚度为7μm，切片-20℃保存。

(2)免疫组化。

1)切片取出恢复室温后0.01MPBS洗3次，每次5min；

2)3％的H₂O₂作用5min；

3)PBS洗3次，每次5min；

4)5％BSA液中37℃孵育1h；

5)弃去5％BSA液，转入稀释好的一抗(P2X₃抗体为兔来源，稀释比例为1:100)里4℃过夜；

6)次日，恢复室温半小时后经PBS常规冲洗后放入生物素标记的二抗37℃水浴孵育45min；

7)PBS冲洗后转入SABC液室温30min；

8)PBS冲洗后显微镜下DAB显色2min，放入PBS中以终止显色反应，,经梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。显微镜下拍照。

(3)用Image图像分析系统观察分析反应密度。比较各组免疫化学反应结果。

9、蛋白印迹。

(1)蛋白提取：将DRG置于加有200μl组织裂解液(含PMSF)的1ml匀浆器中，于冰上研磨充分。反复裂解后，将匀浆样品转移到1.5mlEP管中，4℃，12000g离心10min，取上清，按比例加入5×loadingbuffer和DTT，混匀后煮沸5min，使蛋白变性，-20℃保存，备用。

(2)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：

制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，所用试剂如下表：

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶组成(ml)

试剂	分离胶(10％)	积层胶(5％)
			ddH₂O	4.9	5.5
30％丙烯酰胺溶液	6	1.3
			1.5M Tris-HC(pH8.8)	3.8	/
1.0M Tris-HC(pH6.8)	/	1.0
			10％SDS	0.15	0.08
AP	0.15	0.08
			TEMED	0.006	0.008
总体积	15	8

(3)上样及电泳：每孔上样量为25μl(蛋白含量约为20μg)，样本两边加2μl蛋白Marker。浓缩胶恒压90V(约45min)，分离胶120V，待溴酚蓝迁移至胶的下缘时(约90min)停止电泳。

(4)转膜：根据蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量准备合适大小的PVDF膜和2张4层的滤纸，PVDF膜浸入甲醇作用5min后，放入转膜缓冲液中(滤纸置于转膜缓冲液中)浸泡以备用。电泳完毕后转膜，300mA转膜1个小时。

(5)免疫反应。

A)封闭：将膜置于含5％BSA的TBST封闭液中，水平摇床室温作用2h。

B)一抗结合：将膜放入用5％BSA配制的一抗(兔来源的P2X₃稀释比例1:1000，小鼠抗β-actin单抗稀释比例1:800)中，4℃过夜，或室温平摇3h，TBST洗膜3次。

C)二抗结合：将膜用IgG-HRP二抗反应液(P2X₃二抗为山羊抗兔，按1:2000溶于封闭液，β-actin为山羊抗小鼠，按1：5000溶于封闭液)孵育，室温平摇1.5h后，TBST洗膜10min×4次。

D)、免疫复合物的检测：膜加ECL发光剂反应3min后，用保鲜膜包裹，置于X线暗盒，暗室中剪大小合适X线胶片，曝光10s～10min，显影、定影。

(7)半定量分析：胶片扫描后，通过Image图像分析软件分析目的条带在的光密度值，以各组β-actin条带的综合光密度值标化其相应组P2X₃的蛋白表达量。

10、酶联免疫吸附剂测定(Elisa)测定血清TNFα和白介素IL-6水平。

(1)血清准备：在第14天，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，仰卧位固定经颈动脉取血，离心管收集血液后室温静置30min，3000g离心10min，取上清(即血清)，分装后-20℃保存；

(2)检测前20分钟从冰箱取出试剂盒和血清，平衡至室温。并取出所需的板条，剩余的板条密封后放于4℃保存；

(3)标准曲线的建立：设立8个标准孔，每孔设立3个复孔作为取平均值。每孔中加入试剂盒中的样品稀释液100μl，之后第一孔加入标准品100μl，混匀后取出100μl加入到第二个孔中，如此反复对半稀释到第7孔，混匀后，从第7孔中吸取100μl弃去，每孔体积均为100μl，第8个孔为空白对照；

(4)加样：在剩下的干净板条孔中加入待测血清100μl，并设立3个复孔作为对照；

(5)反应板置于37℃反应120min；

(6)洗板：用试剂盒中的洗涤液充分洗涤反应板4-6次，最后在滤纸上印干液体。

(7)在每孔中加入100μl第一抗体工作液；

(8)反应板充分混匀后置于37℃作用60min；

(9)洗板：用试剂盒中的洗涤液充分洗涤反应板4-6次，最后在滤纸上印干液体；

(10)在每孔中加入100μl酶标抗体工作液；

(11)反应板充分混匀后置于37℃作用60min；

(12)洗板：同上；

(13)在每孔中加入100μl底物液，置于37℃避光作用10min；

(14)在每孔中加入150μl终止液混匀；

(15)测450nm处吸光度。

11、统计学方法。

应用SPSS统计软件对实验数据进行分析,结果以均数±标准差表示，各组之间差异性采用方差分析，组间比较采用LSD法，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01为极显著差异。

二、结果。

(一)行为学结果。

大鼠术后伤口恢复良好，无肢体损伤、运动障碍或自残现象。手术前后测定各组热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值时的基础值无显著性差异(p>0.05)。

1、热痛敏(TWL)测定结果。

坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠模型的热缩足反射潜伏期测定结果显示，手术前各组大鼠手术侧(左侧)后肢热缩足反射潜伏期没有显著性差异(p>0.05)，手术后第5天开始，各坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)大鼠与假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)大鼠相比，手术侧热敏痛阈值明显降低(p<0.05)，到手术后第7天降低更明显(p<0.01)；鞘内注射给药处理后7天(即手术后第14天)，坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)、坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)的热敏痛反应阈值继续降低(p<0.01)，而坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)的热敏痛反应阈值与CCI组相比显著升高(p<0.01)；Sham组和Ctrl组全程无明显变化见(见图1)。

2、机械痛敏(MWT)测定结果。

坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠模型的机械缩足反射潜伏期测定结果显示，手术前各组大鼠手术侧(左侧)后肢机械缩足反射潜伏期没有显著性差异(p>0.05)，手术后第5天开始，各坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)大鼠与假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)大鼠相比，手术侧机械痛阈值明显降低(p<0.05)，到手术后第7天降低更明显(p<0.01)；鞘内注射给药处理后7天(即手术后第14天)，坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)和坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)的机械敏痛反应阈值继续降低(p<0.01)，而坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)的机械敏痛反应阈值与CCI组相比显著升高(p<0.01)；Sham组和Ctrl组全程无明显变化见(见图2)。

(二)实时定量逆转录-聚合酶链式反应(realtimeRT-PCR)结果。

1、长非编码核糖核酸MRAK009713表达。

手术后14天，取手术侧背根神经节，用荧光定量PCR方法测定各组大鼠背根神经节(DRG)中长非编码核糖核酸MRAK009713的表达量。将三次独立实验的PCR结果经系统分析软件和SPSS11.5统计软件分析计算，结果如下：荧光定量PCR结果统计结果显示：与对照组(Ctrl)相比，坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)和坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)MRAK009713的表达有显著升高(p<0.01)；而坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)MRAK009713的表达较CCI组明显降低(p<0.01)，假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)没有显著性差异见(见图3)。

2、嘌呤2X₃受体信使核糖核酸表达。

手术后14天，取手术侧背根神经节，用荧光定量PCR方法测定各组大鼠背根神经节中嘌呤2X₃受体信使核糖核酸(P2X₃mRNA)的表达量。将三次独立实验的PCR结果经系统分析软件和SPSS11.5统计软件分析计算，结果如下：荧光定量PCR结果统计结果显示：与对照组(Ctrl)相比，坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)和坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)P2X₃mRNA的表达有显著升高(p<0.01)；而坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)P2X₃mRNA的表达较CCI组明显降低(p<0.01)，假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)没有显著性差异见(见图4)。

(三)嘌呤2X₃受体免疫组化结果。

结果分析表明，嘌呤2X₃受体(P2X₃)的免疫反应性在坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)DRG中表达较假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)明显增高(p<0.01)，给予长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA处理后，坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)P2X₃受体的免疫反应性表达较CCI组明显降低(p<0.01)，而与Sham组和Ctrl组比无显著差异(p>0.05)。坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)P2X₃受体的免疫反应性表达与CCI组无显著差异(p>0.05)(见图5)。

(四)嘌呤2X₃受体蛋白印迹结果。

蛋白印迹结果经β-肌动蛋白(β-actin)标化后显示：坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)和坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)的L4/L5背根神经节(DRG)中P2X₃受体的表达与假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)相比明显升高(p<0.05)；而坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)的L4/L5背根神经节中P2X₃受体的表达与CCI组相比明显降低(p<0.01)(见图5)。

(六)酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测结果。

1、ELISA检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)结果。

取各组大鼠血清，按说明书操作。根据试剂盒标准品的浓度梯度：500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml、7.8125pg/ml的对数值和其测定的吸光度(OD)值作标准曲线作图，由软件进行分析得出肿瘤坏死因子-α(TNF-α)回归方程式Y＝-0.39ln(X)+2.358，R²＝0.989(Y表示样品的OD值，X表示样品浓度)，将Y值带入，得出各组血清TNF-α。结果经SPSS11.5统计软件进行统计分析。计算结果表明，与假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)相比，坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)和坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)大鼠血清中TNF-α含量显著升高(p<0.01)；而坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)大鼠血清中TNF-α含量较CCI组明显降低(p<0.01)(见图7)。

2、ELISA检测大鼠血清白介素-6(IL-6)结果。

取各组大鼠血清，按说明书操作。根据试剂盒标准品的浓度梯度：500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml、7.8125pg/ml的对数值和其测定的吸光度(OD)值作标准曲线作图，由软件进行分析得出白介素-6(IL-6)回归方程式Y＝-0.37ln(X)+2.417，R²＝0.981(Y表示样品的OD值，X表示样品浓度)，将Y值带入，得出各组血清IL-6含量。结果经SPSS11.5统计软件进行统计分析。计算结果表明，与假手术组(Sham)和对照组(Ctrl)相比，坐骨神经慢性压迫性损伤模型组(CCI)和坐骨神经慢性压迫性损伤模型+scrambledsiRNA(乱序小干扰核糖核酸)阴性对照组(CCI+NCsi)大鼠血清中IL-6含量显著升高(p<0.01)；而坐骨神经慢性压迫性损伤模型+MRAK009713小干扰核糖核酸处理组(CCI+siRNA)大鼠血清中TNF-α含量较CCI组明显降低(p<0.01)(见图8)。

发明人实验室的研究发现在鞘内注射注射长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰核糖核酸后，坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠背根神经节中长非编码核糖核酸MRAK009713的表达降低，同时观察到在注射干扰试剂后神经病理痛模型大鼠的机械痛和热敏痛阈值升高，表明长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰核糖核酸可降低神经病理大鼠的痛行为。长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰核糖核酸处理后同时可下调神经病理痛大鼠背根神经节P2X₃受体的表达，降低神经病理痛大鼠血清中细胞炎性因子—肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的含量。因此，长非编码核糖核酸MRAK009713的小干扰核糖核酸可能通过减少肿瘤坏死因子-α和白介素-6的释放、降低神经病理大鼠背根神经节P2X₃受体的表达、抑制背根神经节P2X₃受体介导的伤害性信息传递，减轻神经病理痛模型大鼠的痛行为。

Claims

1.长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA在制备神经病理痛药物中的应用。

2.长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA在制备涉及P2X₃受体介导神经系统疾病防治药物中的应用。

3.长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA制成适用于神经病理痛治疗的口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型的制剂。

4.长非编码核糖核酸MRAK009713小干扰RNA制成适用于涉及P2X₃受体介导的相关疾病治疗的口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型的制剂。