CN112553254A - 一种il10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IL10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用，构建方法包括以下步骤：S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定IL10基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL10基因敲除小鼠模型。采用本发明所述构建发明不仅能够成功构建IL10基因敲除小鼠模型，且具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因敲除小鼠模型构建技术领域，具体涉及一种IL10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用。
背景技术
白细胞介素10(IL-10)是一种具有重要免疫调节功能的抗炎细胞因子。几乎所有的先天和适应性免疫细胞都可以分泌IL10，如巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、上皮细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等。IL-10能通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原Ⅱ(MHCⅡ)的表达,降低其抗原递呈作用，进而下调T细胞的激活，抑制炎性细胞的激活、迁移和粘附。同时，IL10与其受体结合后，激活信号通路，可以抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-1、IL-6、IL-8及粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的合成,从而起到抗炎的作用。IL-10可以通过调节Treg细胞和TH17细胞间的平衡来抑制肿瘤相关炎症。目前，有关基因功能研究最直接有效的方法是建立基因敲除动物模型。
基因敲除动物模型可以通过基因打靶技术构建和CRISPR/Cas9技术构建。基因打靶技术即建立在ES细胞与DNA同源重组等技术基础上的分子生物学技术。利用同源重组技术对ES细胞特定位点的基因进行改造，通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得修饰的遗传信息经生殖系遗传，获得ES细胞来源的小鼠。因此可以在ES细胞上进行基因编辑，获得基因修饰小鼠。
ES细胞打靶技术从同源重组载体的构建、到ES细胞的打靶及阳性克隆筛选、再到ES细胞的囊胚注射获得嵌合小鼠，这个过程大约需要4-6个月时间。而CRISPR/Cas9技术抛开了这部分工作，直接移植注射后的小鼠受精卵获得F0代，大约只需要1个月左右，极大地节省了研发周期和费用。另一方面，通过ES细胞打靶技术获得的基因修饰小鼠，其遗传背景来自于我们选择的ES细胞，而成熟的、可用于基因打靶的ES细胞系通常只有有限的几种品系来源：C57BL/6N、C57BL/6J、129S3以及C57与129的杂交F1系。如果需要其它背景，则需要通过与目的品系野生型小鼠回交的方式获得，回交代数在10代以上。而CRISPR/Cas9技术打破了小鼠品系的限制，可以实现在不同品系、甚至免疫缺陷品系上的遗传修饰，比如：BALB/c、FVB、Nod、Nod-scid等。
目前，还没有采用CRISPR/Cas9技术构建IL10基因敲除小鼠模型成功的案例。
发明内容
本发明的目的在于提供一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，采用本发明所述构建发明不仅能够成功构建IL10基因敲除小鼠模型，且具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。
此外，本发明还提供采用上述构建方法构建的IL10基因敲除小鼠模型以及该IL10基因敲除小鼠模型的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定IL10基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；
S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；
S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL10基因敲除小鼠模型。
IL10基因敲除小鼠模型的构建难点在于异性靶位点gRNA1和gRNA2的设计以及F0代小鼠的基因确定。
本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过设计合理的异性靶位点gRNA1和gRNA2基因序列，成功构建了IL10基因敲除小鼠模型，能够在结肠炎、肿瘤、免疫和炎症相关研究中的应用；本发明所述构建方法具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。
进一步地，先确定F0代小鼠的基因型，筛选杂合子小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子。
进一步地，F0代小鼠的基因型确定过程如下：
提取F0代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
IL10基因敲除小鼠模型的构建另一个难点或关键点在于F0代小鼠和F1代杂合子的基因确定。
本发明通过合理设计PCR扩增序列和测序序列，能够成功对F0代小鼠和F1代杂合子的基因进行确定，进一步提高IL10基因敲除小鼠模型的构建的成功率。
进一步地，获得的F1代杂合子包括2种类型，分别为敲除类型1和敲除类型2，其中，敲除类型1缺失4888个碱基对，敲除类型2缺失4885个碱基对，将敲除类型2的F1代杂合子近交获得F2代小鼠。
进一步地，F1代杂合子的类型确定过程如下：
提取F1代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，还包括对F2代小鼠的鉴定，鉴定过程如下：
分离IL10基因敲除纯合小鼠的骨髓细胞，使用含有M-CSF的培养液培养细胞，并用LPS刺激后检测巨噬细胞分群，通过RT-QPCR检测巨噬细胞中IL10的表达。
进一步地，步骤S1中确定的敲除区域为Il10-201(ENSMUST00000016673.5)转录本的exon2-exon5。
采用上述构建方法构建的IL10基因敲除小鼠模型。
一种IL10基因敲除小鼠模型，敲除区域为Il10-201(ENSMUST00000016673.5)转录本的exon2-exon5。
IL10基因敲除小鼠模型在结肠炎、肿瘤、免疫和炎症相关研究中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过设计合理的异性靶位点gRNA1和gRNA2基因序列，首次通过敲除Il10-201(ENSMUST00000016673.5)转录本的exon2-exon5区域建立了小鼠动物模型，能够在结肠炎、肿瘤、免疫和炎症相关研究中的应用。
2、本本发明通过合理设计PCR扩增序列和测序序列，能够成功对F0代小鼠和F1代杂合子的基因进行确定，进一步提高IL10基因敲除小鼠模型的构建的成功率。
3、本发明所述构建方法具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为实施例1F0代小鼠的PCR和测序结果图；图中，数字为鼠尾号，WT为C57BL/6J野生型，N为negative空白对照，M为DNA Marker；
图2为实施例1F1代小鼠的PCR和测序结果图；图中，数字为鼠尾号，WT为C57BL/6J野生型，N为negative空白对照，M为DNA Marker；
图3为实施例1 F2代小鼠引物1的PCR结果一；
图4为实施例1 F2代小鼠引物1的PCR结果二；
图5为实施例1 F2代小鼠引物2的PCR结果一；
图6为实施例1 F2代小鼠引物2的PCR结果二；
图7A为实施例2中小鼠骨髓中IL10表达检测结果图一；
图7B为实施例2中小鼠骨髓中IL10表达检测结果图二；
图8为鉴定策略示意图；
图9为F0小鼠鉴定中1#的测序峰图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
S1、基于CRISPR/Cas9技术，根据IL10基因信息将Il10-201(ENSMUST00000016673.5)转录本的exon2-exon5作为敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示或如表1所示；
表1 gRNA序列信息
| gRNA | gRNA序列(5’-3’) |
| gRNA1 | CTCTGCGTAGTCTCTAGATC |
| gRNA2 | TGTGCCGGCACCAGTGAGAC |
S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔。受体鼠生出的F0代小仔在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA依次进行PCR和测序鉴定，确认基因型；
其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示或如表2所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示或如表3所示：
表2 PCR引物序列
表3测序引物序列
| 测序引物 | 序列5'-3' |
| JS00368-IL10-5wt-tF1 | gccatgagttaaactaaacccaggc |
PCR反应条件如表4所示：
表4
F0代小鼠PCR和测序结果如图1所示：
S3、将步骤S2获得的性成熟的F0代1#号小鼠(图中1#号小鼠为杂合子，5#为纯合子)与野生型C57BL/6J小鼠交配，F0小鼠鉴定中1#的测序峰图如图9所示，野生型C57BL/6J小鼠的基因序列如SEQ ID NO.8所示，其中，gRNA的基因序列如SEQ ID NO.9所示，编码区序列的基因序列如SEQ ID NO.10所示获得的F1代杂合子小鼠；获得的F1代杂合子包括2种类型，分别为敲除类型1和敲除类型2，其中，敲除类型1缺失4888个碱基对，敲除类型2缺失4885个碱基对，将敲除类型2的F1代杂合子近交获得F2代小鼠，鉴定方法同F0代小鼠鉴定，鉴定结果如图2所示，经PCR和测序确认：
10#---13#，15#---17#：-4888bp/wt，E2---E5完全删除，KO阳性；
14#：-4885bp/wt，E2---E5完全删除，KO阳性；
S4、将步骤S3获得的缺失4885个碱基对的F1代杂合子小鼠近交，出生的F2代小鼠在5-7天剪尾及剪脚趾编号，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定(同F0代小鼠鉴定)确认基因型，鉴定结果如图3-图6所示，根据PCR结果确认，1167#，1168#，1170#，1176#，1184#，1186#基因型为-4885bp/-4885bp)，获得F2代纯合子小鼠即为本发明构建的IL10基因敲除小鼠模型。
其中，图3、图4的结果为：
P:Positive Control，为阳性对照
B6：Negative Control为阴性对照，采用B6小鼠基因组DNA
N：No-Template Control为无模板的对照
DL2000 Marker：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图5、图6的结果为：
P:Positive Control，为阳性对照
B6：Negative Control为阴性对照，采用B6小鼠基因组DNA
N：No-Template Control为无模板的对照
DL2000 Marker：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
实施例2：
本实施例是对实施例构建的IL10基因敲除小鼠模型的鉴定，鉴定过程如下：
分离IL10基因敲除纯合小鼠的骨髓细胞，使用含有M-CSF的培养液培养细胞7天，并用LPS刺激1h后检测巨噬细胞分群，通过RT-QPCR检测巨噬细胞中IL10的表达。结果如图7A和7B所示：
小鼠骨髓中的巨噬诱导培养7d后，无论是否使用LPS刺激，wild type与B6-IL10KO小鼠中均能检测到CD11b+F4/80+细胞，且比例相近(图7A)。wild type小鼠巨噬细胞中能检测到IL10 mRNA的表达，经LPS刺激后，IL10表达量增加。在B6-IL10 KO小鼠的巨噬细胞中，有无LPS刺激均未检测到IL-10的表达(图7B)。实施例1构建的IL10基因敲除小鼠模型构建成功。
图8为鉴定策略示意图：其中，
野生型：①PCR反应未获得～217bp条带；②PCR反应可以获得244bp条带
杂合子：①PCR反应可以获得～217bp条带；②PCR反应可以获得244bp条带
纯合子：①PCR反应可以获得～217bp条带；②PCR反应未获得244bp条带。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 成都药康生物科技有限公司
<120> 一种IL10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 1(人工序列1)
<400> 1
ctctgcgtag tctctagatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 2(人工序列2)
<400> 2
tgtgccggca ccagtgagac 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 3(人工序列3)
<400> 3
gccatgagtt aaactaaacc caggc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 4(人工序列4)
<400> 4
taggcatctc ttgcctagtg ttggt 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 5(人工序列5)
<400> 5
aggtgctgct tgtgacagca gag 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 6(人工序列6)
<400> 6
agggatcaga ggttgggtgt gac 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 7(人工序列7)
<400> 7
gccatgagtt aaactaaacc caggc 25
<210> 8
<211> 5765
<212> DNA
<213> 8(人工序列8)
<400> 8
taaatctaga gagtcctagg gaaagccatg agttaaacta aacccaggca catccgaaaa 60
gctaactagg aggtgaatgc attgtctctc ccatgctcaa gaactttctg ttaagtttcc 120
aataaggctc catgttttgc tggctaggac aaaagtctgt ggtctctgcg tagtctctag 180
atctggggga cagaggtttg ggggtttgaa gcagcaccag catagagagc ttgcattaca 240
aaagtattcc cctttcagag ctcctggaac tggtatggag gtccaaagaa ggcagagagc 300
tatgcaaaac aggctttcta taagggactc cagaaaggaa gggttgacac aggtgctctt 360
gaaacctgat ctgactcatc tgaaagaaga ccgggcctgg gtctaacttc tcccagtcag 420
ttaaattcag tcagaagttt ttaaaaacaa ctggatccca agaggaagga ctttgattta 480
actccgggct ctagcactgt caaatcctgt tcttaaaact ctcctttcca cagttgccag 540
ggcatttgaa ttgattacaa attcaaaact ctacaaatgg aaaagtattc aaatgacatg 600
cacattgggt attttcccca gtccttgcat tcacgttctt tatgttcttc cagcaaacaa 660
aggaccagct ggacaacata ctgctaaccg actccttaat gcaggacttt aaggtaagag 720
tccggtgggt gctggggagc gaccaagcga ttagggacgg gacgggaggt gctgcttgtg 780
acagcagagc tgggtctgat gccttgactt tcaaaaagag aagtgagaag accttgactc 840
agcatatcgc cagcagtcaa gggttgtgaa gagctcattc tgtggtaaag ggagaaaatg 900
taactagaag gggcggggat gggggggggg tccctaggaa caggacagtc catcaaggtt 960
agcagcaaca gatcaccatt ccagtaagtc acacccaacc tctgatccct gcctctaggg 1020
ttacttgggt tgccaagcct tatcggaaat gatccagttt tacctggtag aagtgatgcc 1080
ccaggcagag aagcatggcc cagaaatcaa ggagcatttg aattccctgg gtgagaagct 1140
gaagaccctc aggatgcggc tgaggcgctg tgtgagtagc agatgcgttc ttccccaccc 1200
ccaatcccct tagagccacc caacaaatac tgtctcctac agcccagtca ggccacatgc 1260
atccagagac acacacagac tagacaggag actaggtaaa tctagagaga cgcctgtccg 1320
gtgtcgggtc tcttgctcat ctgtctctga gcgagtgtgg gagtgacttt gaggcactca 1380
cacgtgaaga tttgcgcata gccttcctgt tatttgtgag tcattgtggg ttattagcta 1440
ctcccctctc tctccatggg aaggctgggg cttcagtcat ggctccctca cctctgggct 1500
gccagctgag gctcccaagc acaggaaaac attcatctct ttatctcatc ttttgggaag 1560
caaattcagt ggcacagagc tgggctgaca ggacgctggt gtttcagaag ggccagaaga 1620
ctgctatccc taagccagta tctatgaata atacagtcgg ggcatctatg tctctgaagc 1680
gatgccttgg ctgctcttgt ttttcttact tctctcactg atactgggac atcagctgga 1740
gtctacttgt gcaacggttc tggcctgacg atttggcccc agtagctgag actttcgctc 1800
ctctctcaga cacctagaaa tagttcatgg tggttgagat tggagataga caagaagaga 1860
cactaaaaac agaacaggtg ccttggagct ctgagagaca aaacccgaga cctgagttca 1920
cacccacact tagcaagcca tcttagtgat tgcaaagaca tacattgcat ctttctaggc 1980
tgtcctctgc tgtccccctc agtccctacc gaaatagata aggaccaatc acggctcagt 2040
tctccctggg agctaagaag tgggcattga agatgagcaa gggtgtctcc ttcctcacac 2100
aacaagatag tttcccccaa gtaccatgga tgcagaattc aagcaagaat taccaatgct 2160
ctcttttttc ttcttcagca tcgatttctc ccctgtgaaa ataagagcaa ggcagtggag 2220
caggtgaaga gtgattttaa taaggtaagt ggcaaagggg gcgagtgtaa caagacctct 2280
gtctactcac caaagcgcag aaggagggcg ggagctattc tgcacctgga gtgtgggaac 2340
ccagcaaatg gtgtgacctc ctctgccagt tagaaagcca ccacctcagt tacatttgtt 2400
ttctgcaaag cgtctctggc agtttctaaa tgactgctcc acttttgcag gcttttggct 2460
tagactgacc agacagccta tgagcacagg gcactaggtg ttgaggagag tgacatagga 2520
aacagaaagt acagaaagta ccttgttggg aaacaggctg aacccacaag tacagaaagc 2580
agacatgaat taatttactc aggtacatca ttggggctca gcctggatgc ccctccccca 2640
aatcagaacg agcagaaagc agaattctta cttgtcccgg ggcactttcc acctggcaaa 2700
caaaatgagg tttcacactt ccaactgcct gtgaacctat tcaaccctag ttcccagaag 2760
ccatgtggcc tacatcatca tctttgtggg ctaggcagag acacctggca gggctctaac 2820
attagtgggc atgaattcca tgacagcagg tcagagctgc agggtgagga ctgcctacac 2880
actcaaaaca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa caccaaccat ttccctgcta tctctatcac 2940
tgccctgctt acaaactgct ccctctggca tctttgcata acattctgca taagcattat 3000
atgagcactg gcctcttaaa aaaaattagt tgaaaaggtg ccaccctgaa gacagtgctt 3060
tggggactga atgcttccct tgctgactcc tggcagtgct taaagctggg agaaggttgg 3120
tcccaccaca tcctgactac tacagtatag ttgtctctct tctttcattt ccctgtcccc 3180
atttctttat tgtacataaa gtaactggtg tatgtgcaca cacatagtgc tctctctttc 3240
ttttcctttt ttaaactaaa tggccgatgt tctgttctgg ttggcatcag atggagatgg 3300
tctgggggaa agtactgggt ttgtgaaaat acccccttct ccattagtgg catgctcttt 3360
cagctcttat ctttatattc cagtaagtta ttttgctctc attgttttaa caaaagaacc 3420
caacaacacc aaatctttgc ataccttgtt cgattggaga attttaatgt ttttcattta 3480
tcattgtaaa accgaggaca attttataac ttttttgtac gtggctgtta catgtagggc 3540
aatctgtctt taagtaggga taaattactc ttgaataaaa tgatcctaga tagttttccc 3600
ttcaagtcaa gcgtcttgtt gtttaaataa acttcttgtt taaaatgaaa aaaaaaaaaa 3660
caaacaaaca aaaaaaagct gggagaaggt ataggagaaa caggggaagg cacggcccct 3720
tcccaaagca gacggacaaa tctttgggtc cttcagctcc caacacaaga aagcagagat 3780
ctttctatgc tcagcatcct tcccagggca gggagcccct cagcccacca atgggtacta 3840
accagatgct tctctcccca cacagctcca agaccaaggt gtctacaagg ccatgaatga 3900
atttgacatc ttcatcaact gcatagaagc atacatgatg atcaaaatga aaagctaaaa 3960
cacctgcagt gtgtattgag tctgctggac tccaggacct agacagagct ctctaaatct 4020
gatccaggga tcttagctaa cggaaacaac tccttggaaa acctcgtttg tacctctctc 4080
cgaaatattt attacctctg atacctcagt tcccattcta tttattcact gagcttctct 4140
gtgaactatt tagaaagaag cccaatatta taattttaca gtatttatta tttttaacct 4200
gtgtttaagc tgtttccatt ggggacactt tatagtattt aaagggagat tatattatat 4260
gatgggaggg gttcttcctt gggaagcaat tgaagcttct attctaaggc tggccacact 4320
tgagagctgc agggcccttt gctatggtgt cctttcaatt gctctcatcc ctgagttcag 4380
agctcctaag agagttgtga agaaactcat gggtcttggg aagagaaacc agggagatcc 4440
tttgatgatc attcctgcag cagctcagag ggttccccta ctgtcatccc ccagccgctt 4500
catccctgaa aactgtggcc agtttgttat ttataaccac ctaaaattag ttctaataga 4560
actcattttt aactagaagt aatgcaattc ctctgggaat ggtgtattgt ttgtctgcct 4620
ttgtagcaga ctctaatttt gaataaatgg atcttattcg aattacagtg tggtgtctat 4680
tgagttctgt ctgatttaaa agaaaaatcc cttaaaattc cagagggcag aagcagtgaa 4740
tcttagactc cacaaaaaga atgccagcaa cctctccagg aaggggttga gctcggatca 4800
gatcagagga aagtcttgcc tggctttcaa agcatcagca taaactactg atatcttcaa 4860
gctcagtcct ttaaaatgtg tcctgaaacc ttaaaaggca ttctaccttc caaagctagg 4920
gaaggtgatt ctaagtaacc atcggaagga agtgggaagc atcaaagctg aaactctgag 4980
acgaaatgtt ggggttaaaa atggaagcta ggggcaggag ggtggggaga tggctcagca 5040
gttagagtgt gtgccggcac cagtgagaca ggagttcata tccttggaat ccaaccaaca 5100
cacaaccaac actaggcaag agatgcctaa tgtgtcagtg gttgcttcaa gctccagagg 5160
tcctggggtg aacttagatc tgtcttgggg gcgctctctg gggattaaca caaattcatc 5220
actagtttct agaactggga aatcgtctgg atactactgg caatcacaat taaaaactcc 5280
tgccaagcct gccaaaccct ttcacatgct aagcaaacat ctgctgctca actaggtctc 5340
cagcctcttg acactttgag ataaggcctc aaggcagttc agtatggcct tgaactcagc 5400
tcttcctgcc tccgctgccc aagtactggg actcttcttc aaactgaggt cacaggcagc 5460
agagttgagc cattagggtt ggatagaggt aaacaaacct actcagctcc caaaggatgc 5520
aaccactctt cctgccccct ccctgagcca ccagatagat attagactga cttctgcctg 5580
gggtaggggg agtggctggg gaagccctac taaatgtctc gtgactttga ggataagggg 5640
aaataatgag ctgagtaacc ctaacaccac atacacacac acacacacac acacacacac 5700
acacacacac acgtgctggc caggcagccc gggacagggt gggtgggagc tgacaagctg 5760
tggtg 5765
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 9(人工序列9)
<400> 9
ctctgcgtag tctctagatc tgtgccggca ccagtgagac 40
<210> 10
<211> 1078
<212> DNA
<213> 10(人工序列10)
<400> 10
caaacaaagg accagctgga caacatactg ctaaccgact ccttaatgca ggactttaag 60
ggttacttgg gttgccaagc cttatcggaa atgatccagt tttacctggt agaagtgatg 120
ccccaggcag agaagcatgg cccagaaatc aaggagcatt tgaattccct gggtgagaag 180
ctgaagaccc tcaggatgcg gctgaggcgc tgtcatcgat ttctcccctg tgaaaataag 240
agcaaggcag tggagcaggt gaagagtgat tttaataagc tccaagacca aggtgtctac 300
aaggccatga atgaatttga catcttcatc aactgcatag aagcatacat gatgatcaaa 360
atgaaaagct aaaacacctg cagtgtgtat tgagtctgct ggactccagg acctagacag 420
agctctctaa atctgatcca gggatcttag ctaacggaaa caactccttg gaaaacctcg 480
tttgtacctc tctccgaaat atttattacc tctgatacct cagttcccat tctatttatt 540
cactgagctt ctctgtgaac tatttagaaa gaagcccaat attataattt tacagtattt 600
attattttta acctgtgttt aagctgtttc cattggggac actttatagt atttaaaggg 660
agattatatt atatgatggg aggggttctt ccttgggaag caattgaagc ttctattcta 720
aggctggcca cacttgagag ctgcagggcc ctttgctatg gtgtcctttc aattgctctc 780
atccctgagt tcagagctcc taagagagtt gtgaagaaac tcatgggtct tgggaagaga 840
aaccagggag atcctttgat gatcattcct gcagcagctc agagggttcc cctactgtca 900
tcccccagcc gcttcatccc tgaaaactgt ggccagtttg ttatttataa ccacctaaaa 960
ttagttctaa tagaactcat ttttaactag aagtaatgca attcctctgg gaatggtgta 1020
ttgtttgtct gcctttgtag cagactctaa ttttgaataa atggatctta ttcgaatt 1078
Claims (10)
1.一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定IL10基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；
S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；
S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL10基因敲除小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，先确定F0代小鼠的基因型，筛选杂合子小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子。
3.根据权利要求2所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，F0代小鼠的基因型确定过程如下：
提取F0代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求2所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，获得的F1代杂合子包括2种类型，分别为敲除类型1和敲除类型2，其中，敲除类型1缺失4888个碱基对，敲除类型2缺失4885个碱基对，将敲除类型2的F1代杂合子近交获得F2代小鼠。
5.根据权利要求2所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，F1代杂合子的类型确定过程如下：
提取F1代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求1所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括对F2代小鼠的鉴定，鉴定过程如下：
分离IL10基因敲除纯合小鼠的骨髓细胞，使用含有M-CSF的培养液培养细胞，并用LPS刺激后检测巨噬细胞分群，通过RT-QPCR检测巨噬细胞中IL10的表达。
7.根据权利要求1-6任一项所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤S1中确定的敲除区域为Il10-201(ENSMUST00000016673.5)转录本的exon2-exon5。
8.采用权利要求1-7任一项所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法构建的IL10基因敲除小鼠模型。
9.一种IL10基因敲除小鼠模型，其特征在于，敲除区域为Il10-201(ENSMUST00000016673.5)转录本的exon2-exon5。
10.如权利要求8或9所述IL10基因敲除小鼠模型在结肠炎、肿瘤、免疫和炎症相关研究中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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