CN114107379B - 一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114107379B
CN114107379B CN202111289115.3A CN202111289115A CN114107379B CN 114107379 B CN114107379 B CN 114107379B CN 202111289115 A CN202111289115 A CN 202111289115A CN 114107379 B CN114107379 B CN 114107379B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cherryntr
sox2
neural stem
sequence
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111289115.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114107379A (zh
Inventor
刘彦梅
付苏雷
费继锋
曾雁云
胡燕
王鹍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Normal University
Original Assignee
South China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Normal University filed Critical South China Normal University
Priority to CN202111289115.3A priority Critical patent/CN114107379B/zh
Publication of CN114107379A publication Critical patent/CN114107379A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114107379B publication Critical patent/CN114107379B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01284—S-(hydroxymethyl)glutathione dehydrogenase (1.1.1.284), i.e. nitroreductase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/50—Amphibians, e.g. Xenopus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用。该构建方法包括如下步骤：(1)通过将Sox2基因的ORF序列、T2A序列以及CherryNTR序列连接到pGEM‑T质粒上，构建所需的供体质粒；(2)将Cas9蛋白、gRNA序列与供体质粒混合后注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，经孵化、发育成幼体、鉴定和筛选、繁育，得到稳定遗传的Sox2:CherryNTR转基因动物；(3)用硝基还原酶的底物处理Sox2:CherryNTR转基因动物，得到神经干细胞特异性消融动物模型。本发明构建的动物模型可用于研究神经干细胞相关疾病的发病机制或开发与神经干细胞相关疾病的治疗方法或药物。

Description

一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
细胞是生命活动的基本单位，多细胞生物的所有生理及病理过程都是由多种细胞参与的复杂过程，研究各种细胞的功能对于理解生命活动具有重要的意义。神经干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞，可以分化为各种类型的神经元和胶质细胞，是神经系统形成的基础。神经干细胞功能异常不仅会导致中枢神经系统发育缺陷，还可能与神经系统疾病的发生有关，如帕金森病、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病等[1]；而且神经干细胞是中枢神经系统损伤再生的细胞来源，包括人类在内的大多数高等动物随着生长发育，中枢神经系统内神经干细胞数量逐渐减少，再生能力逐渐减弱，并最终消失。对神经干细胞功能的研究可以帮助我们更深入理解神经系统发育及再生的细胞机制并为治疗神经损伤性疾病提供有潜力的治疗策略。
墨西哥钝口螈是一种具有强大再生能力的两栖类动物，不仅可以再生四肢及尾部，还可以几乎完美的修复中枢神经系统损伤。与包括人类在内的大多数高等动物不同，墨西哥钝口螈中枢神经系统终身存在大量神经干细胞，在脊髓损伤后，损伤位点头端500微米区域的神经干细胞在损伤后被激活，重新“年轻化”，表现出类似于胚胎发育早期神经干细胞的状态，随后迅速增殖，迁移，分化为神经元并重建神经环路，且再生脊髓组织与损伤前比较，无形态学差异[2-3]，与斑马鱼的脊髓再生相比，墨西哥钝口螈脊髓再生是在细胞生物学及功能水平上对损伤脊髓的精确重建。利用墨西哥钝口螈脑损伤模型的研究表明，再生的脑组织重新生成了损伤前全部的细胞类型，神经干细胞是其再生的细胞来源[4]。利用墨西哥钝口螈研究中枢神经系统损伤后再生的分子及细胞生物学机制，特别是神经干细胞在中枢神经系统损伤再生过程中的功能，将为改善人类中枢神经系统再生提供理论基础。
靶向细胞消融是研究细胞功能的重要方法，但目前在模式动物墨西哥钝口螈中尚未建立任何靶细胞消融方法。虽然在小鼠，斑马鱼等物种中已经开发了多种细胞特异性消融方法，如Diphtheria toxin A[6]，Kid/Kis[7]，HSV tymidine kinase/ganciclovir[8]，Tamoxifen-inducible c-Myc[9]等，但未见有应用于神经干细胞消融的方法；而且这些方法各有缺点[5]，例如：Diphtheria toxin A细胞消融系统有严重的旁观者效应[6]；Kid/Kis系统不仅需要在靶细胞中表达细菌毒素Kid，另外还需在非靶细胞中表达抗毒素Kis[7]；HSVtymidine kinase/ganciclovir系统仅对增殖细胞有效[8]；Tamoxifen-inducible c-Myc系统需要较长的时间才能使的靶细胞消融[9]。因此，在模式动物墨西哥钝口螈中建立一种高效消融神经干细胞的方法不仅具有方法学意义，还具有重要的应用价值。
参考文献：
[1]Winner,Beate,and Jürgen Winkler."Adult neurogenesis inneurodegenerative diseases."Cold Spring Harbor perspectives in biology 7.4(2015):a021287.
[2]Mchedlishvili,Levan,et al."Aclonal analysis of neural progenitorsduring axolotl spinal cord regeneration reveals evidence for both spatiallyrestricted and multipotent progenitors."(2007):2083-2093.
[3]Albors,Aida Rodrigo,et al."Planar cell polarity-mediated inductionof neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration."elife4(2015):e10230.
[4]Amamoto,Ryoji,et al."Adult axolotls can regenerate originalneuronal diversity in response to brain injury."Elife 5(2016):e13998.
[5]Curado,Silvia,Didier YR Stainier,and Ryan M.Anderson."Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish:a spatially andtemporally controlled ablation method with applications in developmental andregeneration studies."Nature protocols 3.6(2008):948.
[6]Kurita,Ryo,et al."Suppression of lens growth byαA-crystallinpromoter-driven expression of diphtheria toxin results in disruption ofretinal cell organization in zebrafish."Developmental biology 255.1(2003):113-127.
[7]Slanchev,Krasimir,et al."Development without germ cells:the roleof the germ line in zebrafish sex differentiation."Proceedings of theNational Academy of Sciences 102.11(2005):4074-4079.
[8]Springer,Caroline J.,and Ion Niculescu-Duvaz."Approaches to gene-directed enzyme prodrug therapy(GDEPT)."Cancer Gene Therapy(2002):403-409.
[9]Pelengaris,Stella,Michael Khan,and Gerard I.Evan."Suppression ofMyc-induced apoptosis inβcells exposes multiple oncogenic properties of Mycand triggers carcinogenic progression."Cell 109.3(2002):321-334.
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法。
本发明的另一目的在于提供所述神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法构建得到的动物模型的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)通过将Sox2基因的ORF序列(Sox2-ORF)、T2A序列以及CherryNTR(nitroreductase)序列连接到pGEM-T质粒上，构建得到knockin转基因所需的供体质粒pGEMT:Sox2-ORF-T2A-CherryNTR(以其获得转基因动物Sox2:Sox2-ORFΔ-T2A-CherryNTR，以下简称为Sox2:CherryNTR)；其中，Sox2基因的ORF序列如SEQ ID NO：1所示，T2A序列如SEQ ID NO：2所示，CherryNTR序列如SEQ ID NO：3所示；
(2)将Cas9蛋白、gRNA序列与步骤(1)中构建得到的供体质粒pGEMT:Sox2-ORF-T2A-CherryNTR混合后注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，在16～20℃条件下进行孵化，直到孵化完成，发育成幼体，通过表型观察及基因型鉴定，筛选得到F0代Sox2:CherryNTR转基因动物，继续将幼体饲养至成年并进行繁育，可得到稳定遗传的Sox2:CherryNTR转基因动物；
(3)用硝基还原酶(NTR)的底物处理Sox2:CherryNTR转基因动物后，继续常规饲养，得到所述的神经干细胞特异性消融动物模型。
步骤(2)中所述的饲养为按本领域的常规饲养条件进行饲养，如每天喂食适量丰年虾并清洗饲养容器。
步骤(2)中所述的Cas9蛋白为常规市售的Cas9蛋白；优选为NEB公司的Cas9蛋白。
步骤(2)中所述的gRNA序列如SEQ ID NO：4所示。
步骤(2)中所述的墨西哥钝口螈为d/d墨西哥钝口螈。
步骤(2)中所述的繁育为通过如下步骤实现：将F0代Sox2:CherryNTR转基因动物饲养至成年，然后经育种传代得到F1代，依此类推，用获得的子代(F1,F2…)Sox2:CherryNTR转基因动物再进行后续的实验。
步骤(2)中所述的表型观察为：在荧光显微镜下观察荧光表达情况，Sox2：CherryNTR转基因动物的头部和脊髓有Cherry荧光可见。
步骤(3)中所述的硝基还原酶(NTR)的底物为甲硝唑(Metronidazole，MTZ)和硝呋吡醇(Nifurpirinol；NFP)中的至少一种。
所述的甲硝唑的使用浓度为5～20mmol/L；优选为20mmol/L。
所述的硝呋吡醇的使用浓度为2.5～20μmol/L；优选为7.5μmol/L。
步骤(3)中所述的Sox2:CherryNTR转基因动物的体长约2～4cm。
步骤(3)中所述的处理的方式为水浴处理、腹腔注射等。
步骤(3)中所述的处理的时间24h以上。
步骤(3)中所述的饲养的时间为1～20天；优选为20天。
按照上述构建方法构建得到的动物模型在筛选预防和/或治疗神经干细胞相关疾病的药物中的应用。
所述的神经干细胞相关疾病包括小头畸形，帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病,脑损伤，脊髓损伤或精神分裂症等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、墨西哥钝口螈具有强大再生能力，其脑和脊髓都可以近乎完美的再生，是研究中枢神经系统再生的重要模式动物；为了研究神经干细胞在中枢神经系统再生中的作用，本发明利用NTR系统在墨西哥钝口螈中建立条件型靶细胞(神经干细胞)消融方法，实现对靶细胞(神经干细胞)的可控消融，构建了一种神经干细胞特异性消融动物模型。
2、本发明选取神经干细胞的特异性启动子Sox2驱动NTR特异表达，并以knock-in的方式构建相应的转基因动物，通过给予带有硝基的可被NTR还原的底物，其产生的有毒产物可诱导相应转基因动物的神经干细胞死亡(凋亡)。
3、本发明提供的在体研究墨西哥钝口螈神经干细胞功能的方法，为理解墨西哥钝口螈各种生理及病理过程中神经干细胞的功能提供了强有力的工具，特别是再生过程中的细胞功能；值得注意的是，该方法可以通过使用其他类型细胞的特异基因启动子，用于消融各种不同类型的细胞。
4、本发明构建的神经干细胞特异性消融动物模型可用于研究神经干细胞相关疾病的发病机制或开发与神经干细胞相关疾病的治疗方法，例如，利用该动物模型可以研究中枢神经系统再生的细胞机制并开发相应的治疗方法。
附图说明
图1是本发明构建的SceI-Tol2-CAGGS：CherryNTR质粒图谱。
图2是浅表组织电转SceI-Tol2-CAGGS：CherryNTR质粒后经甲硝唑(MTZ)诱导细胞消融后的镜检结果图。
图3是墨西哥钝口螈Sox2基因序列的结构示意图。
图4是构建Sox2：CherryNTR转基因所用gRNA在基因组中的位置示意图。
图5是构建Sox2:CherryNTR转基因所用供体质粒pGEMT:Sox2-ORF-T2A-CherryNTR的结构示意图。
图6是基于Crispr/cas9技术构建Sox2:CherryNTR转基因墨西哥钝口螈的基因重组结构示意图。
图7是Sox2:CherryNTR转基因墨西哥钝口螈的表型图；其中，A为转基因动物相应位点的基因结构图；B为转基因动物头部的明场图；C为Cherry在转基因动物头部的表达模式(可见脑及头部的神经丘为Cherry阳性)；D为C中虚线框部分的放大图；E为转基因动物尾部的明场图；F为Cherry在转基因动物尾部的表达模式(可见脊髓及尾部的神经丘为Cherry阳性)；G为F中虚线框部分的放大图。
图8是基因鉴定PCR产物凝胶电泳结果图；其中，M为Marker；泳道1-3为Sox2：CherryNTR转基因动物的三个个体；泳道4为Sox2：Cherry转基因动物；泳道5为d/d墨西哥钝口螈。
图9是实验所测试硝基化合物分子结构图；其中，A为甲硝唑(MTZ)的分子式；B为硝呋吡醇(NFP)的分子式。
图10是d/d墨西哥钝口螈存活率随药物浓度变化趋势图；其中，A为甲硝唑(MTZ)；B为硝呋吡醇(NFP)。
图11是MTZ和NFP两种药物对Sox2:CherryNTR墨西哥钝口螈的最低有效浓度结果图；其中，A为药物处理后神经丘荧光强度及形态随时间的变化情况；B为不同浓度的MTZ处理Sox2:CherryNTR墨西哥钝口螈24h后，神经丘荧光强度随时间的变化趋势；C为不同浓度的NFP处理Sox2:CherryNTR墨西哥钝口螈24h后，神经丘荧光强度随时间的变化趋势；D为MTZ处理墨西哥钝口螈的浓度使用范围；E为NFP处理墨西哥钝口螈的浓度使用范围。
图12是20mM MTZ处理Sox2:CherryNTR动物后的实验结果图；其中，A～D为活体荧光成像检测到MTZ处理三天后，Sox2:CherryNTR动物的神经丘中的Cherry阳性细胞发生消融情况(A和B为MTZ处理组，B’为B中虚线框部分的放大图(神经丘中的Cherry阳性细胞显示弥散状)；C和D为DMSO处理的对照组，D’为D中虚线框部分的放大图)；E～H为免疫荧光检测Sox2:CherryNTR动物经20mM MTZ处理后1天，神经丘中Cherry阳性细胞呈Caspase3阳性；I～L为对照组中，Sox2:CherryNTR动物经DMSO处理1天后，神经丘中Cherry阳性细胞未见caspase3表达；M～P为免疫荧光检测Sox2:CherryNTR动物经20mM MTZ处理后3天，神经丘形态被破坏，未检测到Cherry阳性的支持细胞，可见Cherry阳性且Iba1阳性的巨噬细胞；Q～T为对照组中，Sox2:CherryNTR动物经DMSO处理后3天，神经丘形态完整，支持细胞仍呈Cherry阳性。
图13是NFP处理24h后脊髓及神经丘的形态和荧光强度随时间变化情况图；其中，A为Sox2:CherryNTR转基因动物在NFP处理前，尾部脊髓及神经丘形态和荧光强度；B为NFP处理后2天，脊髓的形态及荧光强度；C为NFP处理后8天，脊髓的形态及荧光强度；D为NFP处理后17天，脊髓的形态及荧光强度。
图14是NFP处理24h后脑及头部神经丘的形态和荧光随时间变化情况图；其中，A为NFP处理前，Sox2:CherryNTR转基因动物脑及头部神经丘形态和荧光强度；B为NFP处理后2天，脑的形态及荧光强度；C为NFP处理后8天，脑的形态及荧光强度；D为NFP处理后17天，脑的形态及荧光强度。
图15是NFP处理20天后脊髓形态结构变化及细胞消融情况图；其中，A～C为NFP处理20天后，Sox2:CherryNTR转基因动物尾部的脊髓形态和Cherry阳性神经干细胞(B为DAPI标记的细胞核，C为Cherry标记的神经干细胞，A为B和C的叠加)；D～F为对照组，DMSO处理20天后，Sox2:CherryNTR转基因动物尾部的脊髓形态和Cherry阳性神经干细胞(E为DAPI标记的细胞核，F为Cherry标记的神经干细胞，D为E和F的叠加)。
图16是NFP处理20天后脑形态结构变化情况图；其中，A为NFP处理20天后，使用DAPI标记细胞核，观察到的Sox2:CherryNTR转基因动物脑部形态；B为对照组(DMSO)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中涉及的d/d墨西哥钝口螈购自Ambystoma Genetic StockCenter，是一种自然白化种，因幼体身体透明，被作为实验室常用墨西哥钝口螈品种，故以其为基础构建转基因模型；实验所用的d/d墨西哥钝口螈的体长约2～4cm。
实施例1
本发明用于消融墨西哥钝口螈的神经干细胞，故选用神经干细胞的标志基因Sox2进行以下实验：
1.查找NTR序列并验证
1.1根据文献报道，查找已在斑马鱼中应用于细胞消融的NTR序列，此NTR核酸序列由生物商业服务公司合成获得。具体核苷酸序列如下(SEQ ID NO：5)：
ATGTCCGGACTCAGATCTCGAGCCATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAGCGTCATTCCACTAAGGCATTTGATGCCAGCAAAAAACTTACCCCGGAACAGGCCGAGCAGATCAAAACGCTACTGCAATACAGCCCATCCAGCACCAACTCCCAGCCGTGGCATTTTATTGTTGCCAGCACGGAAGAAGGTAAAGCGCGTGTTGCCAAATCCGCTGCCGGTAATTACGTGTTCAACGAGCGTAAAATGCTTGATGCCTCGCACGTCGTGGTGTTCTGTGCAAAAACCGCGATGGACGATGTCTGGCTGAAGCTGGTTGTTGACCAGGAAGATGCCGATGGCCGCTTTGCCACGCCGGAAGCGAAAGCCGCGAACGATAAAGGTCGCAAGTTCTTCGCTGATATGCACCGTAAAGATCTGCATGATGATGCAGAGTGGATGGCAAAACAGGTTTATCTCAACGTCGGTAACTTCCTGCTCGGCGTGGCGGCTCTGGGTCTGGACGCGGTACCCATCGAAGGTTTTGACGCCGCCATCCTCGATGCAGAATTTGGTCTGAAAGAGAAAGGCTACACCAGTCTGGTGGTTGTTCCGGTAGGTCATCACAGCGTTGAAGATTTTAACGCTACGCTGCCGAAATCTCGTCTGCCGCAAAACATCACCTTAACCGAAGTGTAA。
1.2通过PCR方法在上述NTR序列两端引入酶切位点BsrG1和BamH1(同时去掉Startcodon)，再通过酶切连接的方式连接到SceI-Tol2-CAGGS：Cherry质粒(该质粒是通过将pCAGGsEGFP(Sce)质粒中的EGFP(SEQ ID NO：6)以酶切连接的方式替换为Cherry(SEQ IDNO：7)获得，pCAGGsEGFP(Sce)质粒构建方法参考文献：Sobkow,Lidia,et al."A germlineGFP transgenic axolotl and its use to track cell fate:dual origin of the finmesenchyme during development and the fate of blood cells duringregeneration."Developmental biology 290.2(2006):386-397)中，构建出SceI-Tol2-CAGGS：CherryNTR质粒(图谱见图1)，Cherry与NTR翻译后形成融合蛋白。该质粒中CherryNTR融合蛋白由组成型启动子CAGGS启动，故可在各种组织细胞中表达。另外，Cherry与NTR之间也可由2A序列连接，使Cherry和NTR翻译后形成独立的蛋白，具有相同的效果。
1.3利用电转的方式将该质粒转染到d/d墨西哥钝口螈的浅表组织细胞中(通过电转方式，质粒可进入到多种细胞类型中，如肌肉细胞，成纤维细胞，皮肤表皮细胞等)，进而在多种细胞类型中表达NTR，以此验证序列的有效性及以此序列构建NTR转基因墨西哥钝口螈的可行性。
1.4将表达融合蛋白CherryNTR的质粒SceI-Tol2-CAGGS：CherryNTR和只表达Cherry的质粒SceI-Tol2-CAGGS：Cherry分别电转到d/d墨西哥钝口螈浅表组织的邻近且不同的位置，电转后5天，体视荧光显微镜下可以观察到两种质粒表达的Cherry荧光，如图2所示。然后对电转动物以水浴(将墨西哥钝口螈直接放入含有药物的水中即可，下同)方式进行24小时的药物处理，实验组用20mM的NTR底物甲硝唑(Metronidazole，MTZ)，对照组用二甲基亚砜(DMSO)处理。药物处理第三天在体视荧光显微镜下观察电转SceI-Tol2-CAGGS：CherryNTR质粒的部位，其Cherry荧光基本消失；而电转SceI-Tol2-CAGGS：Cherry质粒的部位，其Cherry荧光在MTZ处理前后未见明显变化。另外，在DMSO处理组，电转CherryNTR质粒的部位，其Cherry荧光在MTZ处理前后也未见明显变化。此结果表明，NTR可在墨西哥钝口螈体内介导细胞的消融。
2.利用基于Crispr/cas9的knockin转基因技术，构建可特异性消融墨西哥钝口螈神经干细胞的转基因品系Sox2：CherryNTR
2.1根据参考文献(Fei,Ji-Feng,et al."Application and optimization ofCRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl(Ambystoma mexicanum)."Nature protocols 13.12(2018):2908-2943.)中的基于Crispr/cas9的转基因技术获得墨西哥钝口螈转基因品系，简要过程如下：
(1)在墨西哥钝口螈组学信息网站(https://www.axolotl-omics.org/)上在线查找并比对Sox2基因的序列和基因结构，其基因序列结构示意图如图3所示。
(2)根据墨西哥钝口螈Sox2基因序列结构可以发现其仅有一个外显子，在临近外显子3’端的非编码区设计gRNA用于knockin转基因。gRNA在基因组中的位置示意图如图4所示，gRNA的序列如下所示：
gRNA序列：5′-ATGTGACAATGAGCGCGG-3′(SEQ ID NO：4)。
(3)根据已经设计的knockin转基因的插入位点，将上述已验证的CherryNTR序列(SEQ ID NO：3)(从SceI-Tol2-CAGGS：CherryNTR质粒中克隆得到)与Sox2基因的ORF序列(SEQ ID NO：1)(sox2基因只有一个外显子，Sox2基因的ORF序列是从基因组中克隆得到的)一起构建到供体质粒(Promega商业化的T载体，货号A3600)中，中间由T2A连接(如SEQ ID NO：2所示：
5′-GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT-3′)(构建方法见参考文献：Fei,Ji-Feng,et al."Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl(Ambystoma mexicanum)."Nature protocols13.12(2018):2908-2943)，获得的供体质粒序列结构示意图如图5所示。其中，
Sox2基因的ORF序列如SEQ ID NO：1所示：
ATGTACAGCATGATGGAGACCGACCTGAAGCCCCCCGCCCCGCAGCAGACCTCCACCAACCCGGGCTCCAACAACAACAGCAGCAACGCCAAAAACAGCCCGGACCGAGTCAAGCGGCCCATGAACGCCTTCATGGTCTGGTCCCGCGGCCAGCGTCGGAAGATGGCGCAGGAGAACCCCAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGGCTGGGCGCCGAGTGGAAGCTGCTCTCCGAGGCCGAGAAGCGGCCCTTCATCGACGAGGCCAAGCGCCTGCGGGCGCTGCACATGAAGGAGCACCCGGATTACAAGTACCGGCCCCGGCGCAAGACGAAGACCCTGATGAAGAAGGACAAGTACACGCTGCCCGGGGGTCTCCTCGGGCCACCTGGGGGTAACGGCATGGGCACCGGCGGCGGCGTGGGGGGCGGCATGAACTCCAGCCAGCGGATGGACAGCTACGCGGCCCACATGAACGGCTGGGCCAACGGCGGCTACGGCATGATGCAGGAGCAGCTGAGCTACGCGCAGCACCCGGGCCTGAGCGCCGCCGCCGCCGCGCAGATGCAGCCCATGCACCGCTACGACGTCAGCAGCCTGCAGTACAACTCCATGAATCCCTCCGCCGCCGCGCAGGGATACATGAACGGCGCCTACATGTCGTACGCGCAGCAAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGCATGTCGCTGGGCTCCATGGGCTCGGTGGTCAAGTCCGAATCGAGTTCGTCCAGCCCGCCCGTCGTCACCTCTTCCTCGTCGCACTCCCGGCCGGGCTGTCACCAGGCCGGGGACCTGAGGGACATGATTAGCATGTACCTGCCCGGGGCCGACGTCCAGGAGCAAGCGGCCGCCGCCGCCGCCCAGAGCAGACTGCACATGTCGCAGCACTACCAGAGCGCGCCCGTGCCGGGCTCGTCCATCAACGGCACGCTGCCCCTCTCGCACATG；
CherryNTR序列如SEQ ID NO：3所示：
ATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCCATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAGCGTCATTCCACTAAGGCATTTGATGCCAGCAAAAAACTTACCCCGGAACAGGCCGAGCAGATCAAAACGCTACTGCAATACAGCCCATCCAGCACCAACTCCCAGCCGTGGCATTTTATTGTTGCCAGCACGGAAGAAGGTAAAGCGCGTGTTGCCAAATCCGCTGCCGGTAATTACGTGTTCAACGAGCGTAAAATGCTTGATGCCTCGCACGTCGTGGTGTTCTGTGCAAAAACCGCGATGGACGATGTCTGGCTGAAGCTGGTTGTTGACCAGGAAGATGCCGATGGCCGCTTTGCCACGCCGGAAGCGAAAGCCGCGAACGATAAAGGTCGCAAGTTCTTCGCTGATATGCACCGTAAAGATCTGCATGATGATGCAGAGTGGATGGCAAAACAGGTTTATCTCAACGTCGGTAACTTCCTGCTCGGCGTGGCGGCTCTGGGTCTGGACGCGGTACCCATCGAAGGTTTTGACGCCGCCATCCTCGATGCAGAATTTGGTCTGAAAGAGAAAGGCTACACCAGTCTGGTGGTTGTTCCGGTAGGTCATCACAGCGTTGAAGATTTTAACGCTACGCTGCCGAAATCTCGTCTGCCGCAAAACATCACCTTAACCGAAGTGTAA。
(4)基于Crispr/cas9技术构建Sox2:CherryNTR转基因墨西哥钝口螈(图6)：通过将Cas9蛋白(CAS9蛋白购自NEB公司，货号为M0646M)、gRNA与供体质粒按质量比为10:8:1混合注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，Cas9蛋白和gRNA复合体会在gRNA的靶序列处制造DNA双链断裂，以此诱导细胞对双链断裂进行修复，进而将供体序列以同源非依赖重组的方式插入基因组中，实现Knockin转基因。
(5)基因编辑墨西哥钝口螈的孵化与饲养：将注射的墨西哥钝口螈卵转移到含有0.1×MMR缓冲液(Marc’s modified Ringer’s solution)的24孔板，每孔1个卵，在16～20℃进行孵化，直到孵化完成，发育成幼体。将孵化完成的幼体转移到杯或者盒子里饲养，每天喂食适量丰年虾并清洗饲养容器。待发育到特定阶段可进行转基因鉴定；其中：
0.1×MMR缓冲液的配制方法如下：
10×MMR：将400mL(毫升)5M(摩尔/升)NaCl，40mL 1M KCl，20mL 1M MgCl2，40mL1M CaCl2，4mL 0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)和100mL 1M HEPES缓冲液(pH 7.2)混合，加去离子水至1500mL，用10M KOH调pH至7.8后，加去离子水定容至2升；
0.1×MMR：取10mL 10×MMR加990mL去离子水配制成0.1×MMR缓冲液。
3.鉴定转基因动物
3.1取F0转基因墨西哥钝口螈(检测所用的蝾螈的体长为2～3cm)，在体式荧光显微镜下观察荧光表达情况，结果如图7所示：由于Sox2表达在中枢神经系统的神经干细胞中，故在此Sox2：CherryNTR转基因动物的头部和脊髓有Cherry荧光可见。另外，由于神经丘(Neuromast)中的支持细胞表达Sox2，故此转基因动物的脑及头部、脊髓及尾部的神经丘呈现Cherry阳性。
3.2对体式荧光显微镜检测阳性的动物，切取约0.5mm*0.5mm*0.5mm大小的尾尖或指尖组织，通过碱裂解法获得其基因组DNA样品，用于基因鉴定。基因鉴定所用引物：
Forward:5′-GGGCCGACGTCCAGGAGCAA-3′(SEQ ID NO：8)；
Reverse:5′-GATGCTCAAGGGGCTTCATGAT-3′(SEQ ID NO：9)。
将基因组DNA样品进行PCR扩增，获得的产物进行凝胶电泳检测，结果如图8所示：PCR产物片段为1664bp；Forward位于Sox2基因的开放阅读框，Reverse位于插入的poly A片段中；其中，泳道1-3为Sox2：CherryNTR转基因动物的三个个体(3次重复)；泳道4为Sox2:Sox2-ORFΔ-T2A-Cherry转基因动物，简称为Sox2：Cherry(该转基因动物参考文献中描述方法构建得到：Fei,Ji-Feng,et al."Efficient gene knockin in axolotl and its useto test the role of satellite cells in limb regeneration."Proceedings of theNational Academy of Sciences 114.47(2017):12501-12506.)；泳道5为d/d墨西哥钝口螈，作为基因型鉴定(genotyping)的对照。
4.药物使用浓度测试
4.1为了能够高效消融墨西哥钝口螈神经干细胞消融，本发明首先测试了两种药物(NTR的底物，其都是带有硝基的化合物)的非特异性致死浓度。两种药物分别是：Metronidazole(缩略为MTZ)，中文名为甲硝唑；Nifurpirinol(缩略为NFP)，中文名为硝呋吡醇；其分子式如图9所示，都含有硝基基团。
按照以下梯度浓度(表1)采用水浴方式药物处理体长为2～4厘米的d/d墨西哥钝口螈(野生型)，处理时间为24h，然后统计动物在不同时间的存活率。
表1.两种药物的处理浓度
根据两种药物在不同浓度处理后的存活率(图10)，得出它们的非特异性致死浓度分别是：甲硝唑(40mM)，硝呋吡醇(40μM)。因此，Sox2：CherryNTR转基因动物用以上两种药物进行处理时，所用浓度应低于此浓度。
4.2为了获得以上两种药物水浴方式处理产生细胞消融效果的最低有效浓度，本发明选择所构建Sox2:CherryNTR动物的神经丘作为测试模型，因为神经丘位于动物体表，且其支持细胞高表达Sox2，所以对药物处理的反应更灵敏，是一个理想的测试模型。
首先，采用浓度为1.25、2.5、5、10、20mM的甲硝唑(MTZ)及浓度为1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM的硝呋吡醇(NFP)分别处理Sox2:CherryNTR墨西哥钝口螈(体长2～4厘米)24h，以0.4％(v/v)DMSO溶液为对照，在相同参数下拍照，然后利用imageJ测量神经丘的荧光强度，进而统计荧光强度随时间的变化。
结果如图11所示：图11A为药物处理后神经丘的荧光强度及形态随时间的变化情况(dpt：day post treatment，即药物处理结束后的天数)；图11B和11C分别为不同浓度的MTZ及NFP处理Sox2:CherryNTR墨西哥钝口螈24h后，神经丘荧光强度随时间的变化趋势；图11D和11E分别为MTZ及NFP处理墨西哥钝口螈的浓度使用范围；得出两种药物的最低有效浓度分别是：甲硝唑(2.5mM)，硝呋吡醇(2.5μM)。因此，以上两种药物在Sox2：CherryNTR转基因动物中使用浓度范围为MTZ：5mM～20mM，NFP：2.5μM～20μM。
5.药物处理后检测靶细胞(神经干细胞)的消融
5.1本发明测试了两种药物在不同浓度(MTZ：5mM～20mM，NFP：2.5μM～20μM)下对Sox2：CherryNTR转基因动物的Sox2阳性细胞的消融效果，通过水浴方式进行处理(也可其他给药方式，如腹腔注射)，上述两种药物均可诱导Sox2阳性细胞进入凋亡状态，进而被消融。
5.1.1浓度为20mM的MTZ水浴方式处理Sox2:CherryNTR动物
利用浓度为20mM的MTZ处理2～4厘米的Sox2:CherryNTR转基因动物24h，以DMSO处理为对照，然后在处理结束后的第一天、第三天进行活体荧光成像检测和免疫荧光检测。其中，活体荧光成像检测是将药物处理过的动物麻醉后在体式荧光显微镜下观察荧光表达情况；免疫荧光检测是在冰冻切片上进行抗体免疫荧光染色观察特定组织细胞类型中蛋白表达情况，其主要过程如下：使用组织固定液MEMFA对药物处理过的动物进行组织固定，经蔗糖脱水后，使用OCT包埋剂进行冰冻组织包埋；组织块冰冻切片完毕后，冰冻切片用含0.3％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲液进行清洗，并用5％(v/v)胎牛血清进行封闭；封闭结束后，切片在一抗(本实验所用actived-caspase3、Cherry和IbaI一抗均为商业化抗体，分别购自CST，invitrogen和wako公司)中孵育过夜；次日用含0.3％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲液清洗一抗，并用5％(v/v)胎牛血清进行封闭；封闭结束后，切片在相应二抗(Cherry使用偶联550荧光染料的抗大鼠二抗进行标记，购自invitrogen公司；actived-caspase和IbaI使用偶联488荧光染料的抗兔二抗进行标记，购自Jackson公司)中避光孵育2小时；最后用含0.3％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲液清洗二抗完毕后，封片，并用荧光显微镜观察染色结果。
结果如图12所示：通过活体荧光成像检测，第一天可以检测到Sox2阳性的支持细胞表达caspase3，第三天可以检测到Sox2:CherryNTR动物的神经丘中的Cherry阳性细胞显示弥散状，即神经丘中的支持细胞大部分被消融(图12A～D)；免疫荧光检测到Sox2:CherryNTR动物经20mM MTZ处理后1天，神经丘中Cherry阳性细胞呈Caspase3阳性，而对照组中，Sox2:CherryNTR动物经DMSO处理1天后，神经丘中Cherry阳性细胞未见caspase3表达(图12E～H)；免疫荧光检测到Sox2:CherryNTR动物经20mM MTZ处理后3天，神经丘的形态被破坏，未检测到Cherry阳性的支持细胞，可见Cherry阳性且Iba1阳性的巨噬细胞(图12M～P)；对照组中，Sox2:CherryNTR动物经DMSO处理后3天，神经丘的形态完整，支持细胞仍呈Cherry阳性(图12Q～T)。
5.1.2浓度为7.5M的NFP水浴方式处理Sox2:CherryNTR动物
利用浓度为7.5M的NFP处理2～4厘米的Sox2:CherryNTR转基因动物24h，以DMSO处理为对照，并且在药物处理前以及药物处理结束后的2天、8天、17天、20天进行活体荧光成像检测和免疫荧光检测(检测方法同5.1.1)。
结果如图13～16所示：
NFP处理24h后脊髓及神经丘的形态和荧光强度随时间变化情况如图13所示；其中，图13A为Sox2:CherryNTR转基因动物在NFP处理前，尾部脊髓及神经丘形态和荧光强度，可见脊髓荧光强且均匀，神经丘荧光强且形态完整；图13B为NFP处理后2天，脊髓的形态及荧光强度未见明显变化，而神经丘的荧光强度减弱，且出现弥散状；图13C为NFP处理后8天，脊髓荧光明显减弱且呈现斑驳状，而神经丘的形态完全消失，仅可见弥散的Cherry阳性细胞；图13D为NFP处理后17天，尾部部分脊髓荧光几乎消失，而神经丘的荧光强度和形态与处理后8天相比，没有明显变化。
NFP处理24h后脑及头部神经丘的形态和荧光随时间变化情况如图14所示；其中，图14A为NFP处理前，Sox2:CherryNTR转基因动物脑及头部神经丘形态和荧光强度，可见脑部荧光强且均匀，神经丘荧光强且形态完整；图14B为NFP处理后2天，脑的形态及荧光强度未见明显变化，而神经丘的荧光强度减弱，且出现弥散状；图14C为NFP处理后8天，脑荧光明显减弱且出现萎缩，而神经丘的形态完全消失，仅可见弥散的Cherry阳性细胞；图14D为NFP处理后17天，脑部荧光更弱，且与处理后8天相比萎缩更严重，而神经丘的荧光强度和形态与处理后8天相比，没有明显变化。
NFP处理20天后脊髓形态结构变化及细胞消融情况如图15所示；其中，图15A～C为NFP处理20天后，Sox2:CherryNTR转基因动物尾部的脊髓形态和Cherry阳性神经干细胞，可见脊髓形态被严重破坏，Cherry阳性神经干细胞几乎不可见；图15D～F为对照组，DMSO处理20天后，Sox2:CherryNTR转基因动物尾部的脊髓形态和Cherry阳性神经干细胞，可见脊髓形态完整，室管膜区Cherry阳性神经干细胞分布正常。
NFP处理20天后脑形态结构变化情况如图16所示；其中，图16A为NFP处理20天后，使用DAPI标记细胞核，观察到Sox2:CherryNTR转基因动物脑部形态被严重破坏，神经干细胞所在的室管膜区几乎不可见；图16B为对照组(DMSO)，可见脑部组织形态结构完整，室管膜区完整。
上述结果表明：神经丘、脊髓及脑中的Cherry阳性神经干细胞逐渐消融，在第20天时可以检测到脊髓及脑中的神经干细胞被消融。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Sox2基因的ORF序列
<400> 1
atgtacagca tgatggagac cgacctgaag ccccccgccc cgcagcagac ctccaccaac 60
ccgggctcca acaacaacag cagcaacgcc aaaaacagcc cggaccgagt caagcggccc 120
atgaacgcct tcatggtctg gtcccgcggc cagcgtcgga agatggcgca ggagaacccc 180
aagatgcaca actcggagat cagcaagcgg ctgggcgccg agtggaagct gctctccgag 240
gccgagaagc ggcccttcat cgacgaggcc aagcgcctgc gggcgctgca catgaaggag 300
cacccggatt acaagtaccg gccccggcgc aagacgaaga ccctgatgaa gaaggacaag 360
tacacgctgc ccgggggtct cctcgggcca cctgggggta acggcatggg caccggcggc 420
ggcgtggggg gcggcatgaa ctccagccag cggatggaca gctacgcggc ccacatgaac 480
ggctgggcca acggcggcta cggcatgatg caggagcagc tgagctacgc gcagcacccg 540
ggcctgagcg ccgccgccgc cgcgcagatg cagcccatgc accgctacga cgtcagcagc 600
ctgcagtaca actccatgaa tccctccgcc gccgcgcagg gatacatgaa cggcgcctac 660
atgtcgtacg cgcagcaagg cggcggcggc ggcggcggag gcggcatgtc gctgggctcc 720
atgggctcgg tggtcaagtc cgaatcgagt tcgtccagcc cgcccgtcgt cacctcttcc 780
tcgtcgcact cccggccggg ctgtcaccag gccggggacc tgagggacat gattagcatg 840
tacctgcccg gggccgacgt ccaggagcaa gcggccgccg ccgccgccca gagcagactg 900
cacatgtcgc agcactacca gagcgcgccc gtgccgggct cgtccatcaa cggcacgctg 960
cccctctcgc acatg 975
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2A序列
<400> 2
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 3
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CherryNTR序列
<400> 3
atggccatca tcaaggagtt catgcgcttc aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc 60
cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc 120
aagctgaagg tgaccaaggg tggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag 180
ttcatgtacg gctccaaggc ctacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacttgaag 240
ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg 300
gtgaccgtga cccaggactc ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg 360
cgcggcacca acttcccctc cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag 420
gcctcctccg agcggatgta ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat caagcagagg 480
ctgaagctga aggacggcgg ccactacgac gctgaggtca agaccaccta caaggccaag 540
aagcccgtgc agctgcccgg cgcctacaac gtcaacatca agttggacat cacctcccac 600
aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc 660
ggcatggacg agctgtacaa gtccggactc agatctcgag ccatggatat catttctgtc 720
gccttaaagc gtcattccac taaggcattt gatgccagca aaaaacttac cccggaacag 780
gccgagcaga tcaaaacgct actgcaatac agcccatcca gcaccaactc ccagccgtgg 840
cattttattg ttgccagcac ggaagaaggt aaagcgcgtg ttgccaaatc cgctgccggt 900
aattacgtgt tcaacgagcg taaaatgctt gatgcctcgc acgtcgtggt gttctgtgca 960
aaaaccgcga tggacgatgt ctggctgaag ctggttgttg accaggaaga tgccgatggc 1020
cgctttgcca cgccggaagc gaaagccgcg aacgataaag gtcgcaagtt cttcgctgat 1080
atgcaccgta aagatctgca tgatgatgca gagtggatgg caaaacaggt ttatctcaac 1140
gtcggtaact tcctgctcgg cgtggcggct ctgggtctgg acgcggtacc catcgaaggt 1200
tttgacgccg ccatcctcga tgcagaattt ggtctgaaag agaaaggcta caccagtctg 1260
gtggttgttc cggtaggtca tcacagcgtt gaagatttta acgctacgct gccgaaatct 1320
cgtctgccgc aaaacatcac cttaaccgaa gtgtaa 1356
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA序列
<400> 4
atgtgacaat gagcgcgg 18
<210> 5
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NTR核酸序列
<400> 5
atgtccggac tcagatctcg agccatggat atcatttctg tcgccttaaa gcgtcattcc 60
actaaggcat ttgatgccag caaaaaactt accccggaac aggccgagca gatcaaaacg 120
ctactgcaat acagcccatc cagcaccaac tcccagccgt ggcattttat tgttgccagc 180
acggaagaag gtaaagcgcg tgttgccaaa tccgctgccg gtaattacgt gttcaacgag 240
cgtaaaatgc ttgatgcctc gcacgtcgtg gtgttctgtg caaaaaccgc gatggacgat 300
gtctggctga agctggttgt tgaccaggaa gatgccgatg gccgctttgc cacgccggaa 360
gcgaaagccg cgaacgataa aggtcgcaag ttcttcgctg atatgcaccg taaagatctg 420
catgatgatg cagagtggat ggcaaaacag gtttatctca acgtcggtaa cttcctgctc 480
ggcgtggcgg ctctgggtct ggacgcggta cccatcgaag gttttgacgc cgccatcctc 540
gatgcagaat ttggtctgaa agagaaaggc tacaccagtc tggtggttgt tccggtaggt 600
catcacagcg ttgaagattt taacgctacg ctgccgaaat ctcgtctgcc gcaaaacatc 660
accttaaccg aagtgtaa 678
<210> 6
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> EGFP序列
<400> 6
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 7
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cherry序列
<400> 7
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Forward
<400> 8
gggccgacgt ccaggagca 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Reverse
<400> 9
gatgctcaag gggcttcatg at 22

Claims (7)

1.一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过将Sox2基因的ORF序列、T2A序列以及CherryNTR序列连接到pGEM-T质粒上，构建得到knockin转基因所需的供体质粒pGEMT:Sox2-ORF-T2A-CherryNTR；其中，Sox2基因的ORF序列如SEQ ID NO：1所示，T2A序列如SEQ ID NO：2所示，CherryNTR序列如SEQ ID NO：3所示；
(2)将Cas9蛋白、gRNA序列与步骤(1)中构建得到的供体质粒pGEMT:Sox2-ORF-T2A-CherryNTR混合后注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，在16～20℃条件下进行孵化，直到孵化完成，发育成幼体，通过表型观察及基因型鉴定，筛选得到F0代Sox2:CherryNTR转基因动物，继续将幼体饲养至成年并进行繁育，得到稳定遗传的Sox2:CherryNTR转基因动物；
(3)用硝基还原酶的底物处理Sox2:CherryNTR转基因动物后，继续常规饲养，得到所述的神经干细胞特异性消融动物模型；
步骤(2)中所述的gRNA序列如SEQ ID NO：4所示；
步骤(3)中所述的硝基还原酶的底物为硝呋吡醇；
所述的硝呋吡醇的使用浓度为2.5～20μmol/L。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
所述的硝呋吡醇的使用浓度为7.5μmol/L。
3.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的墨西哥钝口螈为d/d墨西哥钝口螈；
步骤(3)中所述的Sox2:CherryNTR转基因动物的体长为2～4cm。
4.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的处理的方式为水浴处理或腹腔注射；
步骤(3)中所述的处理的时间24h以上。
5.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的饲养的时间为1～20天。
6.按照权利要求1～5任一项所述的构建方法构建得到的动物模型在筛选预防和/或治疗神经干细胞相关疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述的神经干细胞相关疾病为小头畸形，帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病，脑损伤，脊髓损伤或精神分裂症。
CN202111289115.3A 2021-11-02 2021-11-02 一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用 Active CN114107379B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111289115.3A CN114107379B (zh) 2021-11-02 2021-11-02 一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111289115.3A CN114107379B (zh) 2021-11-02 2021-11-02 一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114107379A CN114107379A (zh) 2022-03-01
CN114107379B true CN114107379B (zh) 2024-04-30

Family

ID=80380109

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111289115.3A Active CN114107379B (zh) 2021-11-02 2021-11-02 一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114107379B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125268B (zh) * 2022-06-23 2023-12-22 华南师范大学 一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113373150A (zh) * 2021-06-18 2021-09-10 南方科技大学 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113373150A (zh) * 2021-06-18 2021-09-10 南方科技大学 一种靶向dat基因的sgRNA及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration;Ji-Feng Fei et al;PNAS;第114卷(第47期);摘要，图1B，图2B *
Gfap-Positive Radial Glial Cells Are an Essential Progenitor Population for Later-Born Neurons and Glia in the Zebrafish Spinal Cord;Kimberly Johnson et al;Glia;第64卷(第07期);第1171页最后1段, 第1172页第2段 *
The use of transgenics in the laboratory axolotl;Lydia Tilley et al;Developmental Dynamics;第942-956页 *
基于硝基还原酶/甲硝唑系统构建斑马鱼急性肾损伤模型;侯庆等;肾脏病与透析肾移植杂志(第02期);第130-134页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114107379A (zh) 2022-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Herpin et al. Specification of primordial germ cells in medaka (Oryzias latipes)
Gibert et al. Zebrafish as a genetic model in pre-clinical drug testing and screening
MX2007014139A (es) Piggybac como una herramienta para manipulacion genetica y analisis en vertebrados.
Fujimura et al. Tol2-mediated transgenesis in tilapia (Oreochromis niloticus)
JP2015519082A (ja) 条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するための方法および組成物
KR101563017B1 (ko) 불활성화된 내인성 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 닭
CN114040971A (zh) CRISPR-Cas效应子多肽及其使用方法
CN114107379B (zh) 一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用
EA039787B1 (ru) Сельскохозяйственное животное с абляцией клеток зародышевой линии и способы его получения
JP2022522848A (ja) ゲノム編集された鳥
Deiters et al. Conditional transgene and gene targeting methodologies in zebrafish
US20200149063A1 (en) Methods for gender determination and selection of avian embryos in unhatched eggs
Ueda et al. Generation of transgenic newt Cynops pyrrhogaster for regeneration study
Allen et al. Using phiC31 integrase to make transgenic Xenopus laevis embryos
Accorsi et al. A new genetically tractable non-vertebrate system to study complete camera-type eye regeneration
Pisharath Validation of nitroreductase, a prodrug-activating enzyme, mediated cell death in embryonic zebrafish (Danio rerio)
KR20210106412A (ko) 유전적으로 변형된 불임 조류 및 이의 재구성 방법
Coward et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis
KR20230173124A (ko) 암컷 부화 새끼를 생산하기 위한 새 및 이를 생산하는 방법
US20050071891A1 (en) Repressible sterility of animals
CN115992176A (zh) 一种构建可通过药物诱导Cas9蛋白表达的模型猪的方法
Yamada et al. Abolition of egg diapause by ablation of suboesophageal ganglion in parental females is compatible with genetic engineering methods
Matsumoto et al. Targeted gene delivery in the cricket brain, using in vivo electroporation
CN118048401A (zh) 一种诱导特异性细胞类型消融的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用
WO2021193596A1 (ja) 一時処理培地、処理キット、胚発生停止抑制剤、胚発生停止抑制方法、発生工学産物作製方法、移植方法、治療方法、及び発生工学産物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant