CN106727688A - 一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法 - Google Patents
一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法。本发明上述制模方法使用高浓度的Fe3+溶液处理斑马鱼幼鱼或成鱼从而获得骨质疏松模型，该模型具有显著、突出的骨质疏松特征，能够广谱地用于筛选各种治疗骨质疏松症的药物。本发明上述染色方法对斑马鱼幼鱼和成鱼的茜素红染色方法进行优化，提高了斑马鱼、尤其是斑马鱼成鱼的染色效果，使得斑马鱼成鱼能够用于制备骨质疏松模型。
Description
技术领域
本发明涉及骨质疏松动物模型领域，具体而言，涉及一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法及其茜素红染色方法。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一类病症。该病症是老年人常见病、多发病，随着人口老龄化进程的加快，骨质疏松症的发病率越来越高。因此，构建有效的骨质疏松筛药模型，对骨质疏松症的药物治疗和发现安全有效的新药具有重要意义。
目前，用于制备骨质疏松模型的动物主要有大鼠、小鼠和斑马鱼；由于个体小、生长周期快、饲养和维护成本低，相对于大鼠和小鼠而言，斑马鱼作为骨质疏松模型更具有优势。
现阶段，构建斑马鱼骨质疏松模型时主要使用的药物是泼尼松龙和地塞米松，但上述两种药物属于糖皮质激素类药物，在造模时极易因为剂量把握不准而使免疫抑制过强导致斑马鱼胚胎致畸、致死率高。目前还有研究发现，去铁铵或铁调素可修复高铁造成的斑马鱼骨骼发育缺陷，但高铁诱导的幼鱼骨质疏松模型是否能够用于筛选铁螯合剂以外的其他治疗骨质疏松的药物尚未可知。另外，现阶段用于制模的斑马鱼一般选择幼鱼阶段的斑马鱼，与骨质疏松症发病时患者所处的生理阶段(骨质疏松症主要发生在成年尤其是中老年阶段)差异大，不能很好地模拟骨质疏松症。
因此，本领域亟待提出一种制备骨质疏松模型的方法，能够快速、高效地制备用于广泛评价和筛选不同种类的治疗骨质疏松药物的模型。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法，由该方法制备的模型能够用于广谱地筛选各种治疗骨质疏松的药物。
本发明的第二目的在于提供一种对上述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，该方法能够稳定、高效地对斑马鱼幼鱼进行染色。
本发明的第三目的在于提供一种对上述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，该方法能够稳定、高效地对斑马鱼成鱼进行染色。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法，所述方法包括用Fe3+溶液处理斑马鱼的步骤，其中，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度大于0.8mmol/L。
在上述制备方法中，本发明使用Fe3+溶液处理斑马鱼。与泼尼松龙和地塞米松的高致畸率和高致死率不同，Fe3+溶液相对温和，用Fe3+溶液、甚至是高浓度的Fe3+溶液处理斑马鱼也基本不会导致斑马鱼致畸或致死。
其次，阿仑膦酸钠(不属于铁螯合剂，用于治疗骨质疏松，但作用机制尚不清楚)能够修复由本发明上述方法制备而成的骨质疏松模型，表明本发明上述方法制备的模型虽然是利用高铁沉积制备而成，但铁螯合剂以外的其他治疗骨质疏松症的阳性药物也能修复该模型，因此，该模型能够广谱地用于筛选各种不同的治疗骨质疏松症的药物。
本发明上述方法使用高浓度的Fe3+溶液处理斑马鱼，不但显著降低斑马鱼骨骼矿化面积，诱使斑马鱼骨密度显著降低，还引发软骨发育缺陷，降低骨骼调控相关基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表达。因此，与一般骨质疏松模型相比，本发明上述方法制备的斑马鱼模型的总骨量损失更多，所具备的骨质疏松的特征更突出、明显。
在一些实施方式中，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度为0.8～1.2mmol/L，优选1mmol/L。
本发明上述方法对溶液中Fe3+浓度做出进一步优选，采用该优选的Fe3+溶液能够进一步降低斑马鱼骨骼的硬骨矿化面积、软骨面积以及骨骼调控相关基因Bgp、Sox9b、col1a2和col10ala的表达，使斑马鱼所具备的骨质疏松症状更突出。
在一些实施方式中，所述Fe3+溶液包括选自枸橼酸铁铵溶液、FeCl3溶液、硫酸铁铵溶液中的一种或多种，优选地，所述Fe3+溶液为枸橼酸铁铵溶液。
在一些实施方式中，所述Fe3+溶液为枸橼酸铁铵溶液，所述枸橼酸铁铵溶液的浓度大于400μg·ml-1，优选为400～600μg·ml-1，特别优选500μg·ml-1。
在一些实施方式中，所述斑马鱼为幼鱼。
在一些实施方式中，所述斑马鱼为成鱼。
本发明上述方法选择斑马鱼成鱼为枸橼酸铁铵的处理对象，由于成鱼在进行药物处理时已经发育完全，且活力和抵抗力也高于幼鱼，因此，以成鱼为制模对象能够进一步降低制模过程中斑马鱼的致畸率和致死率。更重要地是，该模型是在骨骼发育完成之后的成年阶段诱导出现骨质疏松的症状，与骨质疏松病症发病时所处的阶段和骨骼状态更为接近，因此，与幼鱼模型相比，本发明上述方法制备的成鱼模型能够更好地模拟骨质疏松症，在进行药物筛选时获得更好的筛药效果。
在一些实施方式中，所述斑马鱼为三月龄斑马鱼成鱼。
在一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
将受精后24～72h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养3～5d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养10～20d。
在一些实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
将受精后48h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养4d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养15d，优选地，所述成鱼为三月龄斑马鱼。
在一些实施方式中，在将幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养的期间，每隔10～14h重新更换Fe3+溶液，优选每隔12h重新更换Fe3+溶液；或者，
在将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养的期间，每隔18～36h重新更换Fe3+溶液，优选每隔24h重新更换Fe3+溶液。
本发明还涉及对上述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)用脱色素液脱去斑马鱼骨质疏松模型的色素，所述斑马鱼为斑马鱼幼鱼；(2)用染色工作液对幼鱼进行染色，所述工作液的组分包括茜素红、氢氧化钾、乙醇和水；优选地，所述工作液中茜素红的质量分数为0.003～0.005％，进一步优选为0.004％；氢氧化钾的质量分数为0.5～0.8％，进一步优选0.7％，乙醇的体积分数为0.6～0.8％，进一步优选为0.75％。
本发明上述茜素红染色方法对传统的斑马鱼幼鱼染色方法进行改进，在染色之前先脱去斑马鱼体内的黑色素和黄色素，使斑马鱼透明化，从而令染色背景更干净；并且本发明所述方法用于染色的工作液中含有乙醇和KOH，能够进一步地吸附色素。与传统染色方法相比，本发明所述染色方法具备使染色背景更干净、染色效果更稳定的优点。本发明上述染色方法还对茜素红、KOH和乙醇的含量进行优化，提高上述工作液对斑马鱼幼鱼骨骼染色的稳定性。
在一些实施方式中，上述方法还包括在步骤(1)之后，步骤(2)之前还包括甲醇梯度脱水的操作；优选地，所述甲醇梯度脱水包括将斑马鱼依次置于溶液1、溶液2和溶液3中，其中，溶液1中包括甲醇和含吐温的缓冲液，甲醇的体积分数为20～30％，优选25％，含吐温的缓冲液的体积分数是70～80％，优选75％，所述含吐温的缓冲液优选为PBST或TBST；溶液2中包括甲醇和含吐温的缓冲液，甲醇的体积分数为45～55％，优选50％，含吐温的缓冲液的体积分数是45～55％，优选50％，所述含吐温的缓冲液优选为PBST或TBST；溶液3为100％甲醇溶液。
在一些实施方式中，所述方法还包括在甲醇梯度脱水后将斑马鱼幼鱼置于含DMSO和甲醇的溶液中，其中，DMSO的体积分数为15～25％，优选20％，甲醇的体积分数为75～85％，优选85％。
在本发明的上述方法中，使用含吐温的甲醇溶液进行梯度脱水，并将脱水后的幼鱼置于含DMSO的甲醇溶液中，其中PBST和DMSO都能够增强组织的通透性，提交染料与组织的结合度，从而提高染色效果。
在一些实施方式中，上述脱色素液的组分包括KOH和H2O2，优选地，KOH在脱色素液中的质量分数为0.4～0.6％，优选0.5％，H2O2在脱色素液中的质量分数为2～4％，优选3％。
本发明还涉及一种对上述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，所述方法包括以下步骤：(1)固定斑马鱼骨质疏松模型，其中所述斑马鱼骨质疏松模型为斑马鱼成鱼；(2)梯度脱水；(3)将成鱼腹部剪开，用茜素红染色液染色；(4)胰蛋白酶消化；(5)KOH溶液处理。
现阶段，本领域一般选取幼鱼进行斑马鱼的茜素红染色，尽管成鱼所处的生理阶段以及骨骼状态更接近真实的骨质疏松症，但由于难以染色或染色效果不好，成鱼在构建骨质疏松模型时通常被弃用。而本发明上述方法创造性地选择斑马鱼成鱼作为染色对象，并特别针对斑马鱼成鱼染色效果差的技术问题，在染色过程中将成鱼样本的腹部剪开促进染料在成鱼样本中的渗透，并进一步用胰蛋白酶和KOH溶液处理样本，极大增加样本的透明度，从而成功实现斑马鱼成鱼的茜素红染色，使得斑马鱼成鱼能够成功地用于制备骨质疏松模型。
在一些实施方式中，所述步骤(3)具体包括以下步骤：将成鱼置于茜素红染色液中染色18～30h，优选室温下染色，染色时间优选为24h，所述茜素红溶液中茜素红的质量分数为0.4～0.6％，优选为0.5％，pH值为7.5～8.5。
在一些实施方式，所述步骤(4)具体包括将样本置于胰蛋白酶溶液中处理2～4d，优选在室温下处理3d，所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的质量分数为0.7～1.5％，优选1％。
在一些实施方式中，所述步骤(5)具体包括将样本置于KOH溶液中处理4～6d，优选在室温下处理5d，所述KOH溶液中KOH的质量分数为0.7～1.5％，优选1％。
本发明上述方法对斑马鱼成鱼的茜素红染色所涉及的关键参数和染色条件进行优化，进一步提高了斑马鱼成鱼的茜素红染色效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明上述制模方法使用Fe3+溶液处理斑马鱼，与使用泼尼松龙和地塞米松的常规制模方法相比，本发明所述方法可以显著降低斑马鱼的致畸率和致死率。
2)、本发明上述方法采用高浓度Fe3+溶液处理斑马鱼，由此制备而成的斑马鱼模型不但出现硬骨损伤，同时软骨也出现严重损伤，总骨量损伤增加，骨骼调控相关基因的表达量也显著下降。因此，与常规斑马鱼模型相比，本发明所制模型的骨质疏松特征更明显、突出。
3)、本发明上述方法制备的模型能够筛选铁螯合剂以外的其他治疗骨质疏松症的药物，该模型的应用范围广，能够用于广谱地筛选各种治疗骨质疏松症的药物。
4)本发明所述方法选取斑马鱼成鱼制备骨质疏松模型，进一步降低制模过程中斑马鱼的致畸率和致死率；更重要的是，与幼鱼模型相比，该成鱼模型所处的生理阶段和骨骼状态与真实的骨质疏松症的发病阶段和骨骼状态更为接近，能够更好地模拟骨质疏松症。
5)本发明提供一种优化后的斑马鱼幼鱼茜素红染色方法，能够脱去黑色素和黄色素，降低染色背景，并进一步优化染色工作液的配比，提高斑马鱼幼鱼染色效果的稳定性。
6)本发明提供一种斑马鱼成鱼染色方法，该染色方法克服斑马鱼成鱼茜素红染色难、染色效果不佳的缺陷，通过促进染料的渗透、增加样本透明度以及优化染色液配比的方式改善染色效果，成功对斑马鱼成鱼进行茜素红染色，使得斑马鱼成鱼用于制备骨质疏松模型成为可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同浓度枸橼酸铁铵溶液处理后斑马鱼幼鱼的茜素红染色结果图；
图2为不同浓度枸橼酸铁铵溶液处理后斑马鱼幼鱼的钙黄绿素染色结果图；
图3为不同浓度枸橼酸铁铵溶液处理后斑马鱼幼鱼的阿尔新蓝染色结果图；
图4为不同枸橼酸铁铵溶液处理后斑马鱼幼鱼的骨骼标记基因的mRNA水平表达差异；
图5为阿仑膦酸钠对斑马鱼幼鱼骨质疏松模型的治疗效果图；
图6为枸橼酸铁铵溶液处理后斑马鱼成鱼的茜素红染色结果图；
图7为阿仑膦酸钠对斑马鱼成鱼骨质疏松模型的治疗效果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、建立斑马鱼幼鱼茜素红染色方法：
(1)配制染色所需试剂：a)茜素红溶液：称0.5g的茜素红粉末溶于100ml的95％乙醇中，终浓度为0.5％；b)0.7％KOH溶液：称取0.7g KOH固体溶解于100ml的蒸馏水中，配置成0.7％的KOH溶液。
(2)茜素红染色的具体步骤：
a)样品收集及固定：收集受精后第6天的幼鱼，将幼鱼置于1.5ml的EP管中，于4％PF中4℃固定过夜，不宜超过一星期；
b)脱色素：吸走4％PF,用PBST洗3遍，每次5min；加入脱色素液(0.5％KOH/3％H2O2)直到黑色素及黄色素肉眼观察不可见，中间根据需要置换1～2次溶液，整个过程需要30min～1h，为防止脱色过程中因反应膨胀爆管，脱色素液不宜加满整管；脱色完成后，吸走脱色素液，用PBST快速洗3遍，后加入4％PF再次4℃固定过夜；
c)脱水：吸走4％PF，用PBST洗3次，每次5min；依次用25％甲醇/75％PBST、50％甲醇/50％PBST、100％甲醇溶液进行梯度洗脱，每次5min；最后置于20％DMSO/80％甲醇溶液中，保存于-20℃；
d)复水和染色：将脱水过的幼鱼取出，依次置换成75％、50％、25％甲醇的PBST溶液中，每次5min，最后置换成100％PBST溶液，重复2次，每次5min；吸走PBST溶液，加入工作液，即：0.5％茜素红溶液与0.7％KOH溶液按照1:125配制而成的染色液，置于摇床上，室温避光染12h以上；
e)染色终止：吸走染色液，用PBST洗3次，每次5min；吸走PBST溶液，将幼鱼置于在80％的甘油溶液中避光保存，并观察拍照。
2、建立斑马鱼成鱼茜素红染色方法：
(1)配制染色所需试剂：a)茜素红染色液：称取5.0g茜素红粉末，加入1L的0.5％的KOH溶液中，调pH到7.5～8.5，现配现用。b)胰蛋白酶溶液：称取0.5g的胰蛋白酶(Trypsin)粉末溶于50ml的30％饱和硼酸钠溶液中，再用蒸馏水补至100ml。
(2)茜素红染色的具体步骤：a)将三月龄成鱼麻醉后，放入60mm的培养皿中，加入4％PF，4℃固定2天；b)吸走4％PF，置换成75％乙醇，室温脱水2天，中间更换一次75％乙醇；此时，可以将腹部剪开，小心不要剪到腹鳍，以增加染色剂的渗透性；c)将脱水后的鱼放入0.5％茜素红染色液中，室温染色24h，可放在摇床上轻微摇动；d)回收染色液，将鱼用清水迅速清洗，之后浸泡在胰蛋白酶溶液中，于室温中浸泡3天，期间胰蛋白酶溶液要置换1～2次(此步不可摇动，以防止骨骼脱落)；e)将胰蛋白酶去除干净，加入1％KOH溶液，浸泡5天，期间要更换新鲜的1％KOH溶液，经过此步骤，鱼鳞可以用镊子轻轻刮除；f)先保存在甘油：1％KOH为7:3的溶液中2天，最后换成100％甘油永久保存，并观察拍照。
3、设置对比例：参照公开号为CN102980981A的发明专利申请所记载的茜素红染色方法分别对受精后第6天的斑马鱼幼鱼进行染色。
4、染色结果评价
(1)幼鱼茜素红染色效果评价：将本发明建立的幼鱼染色方法的检测结果与对比例的染色结果进行比较，结果表明，本发明所述幼鱼染色方法能够将幼鱼色素去除完全，背景干净，染色效果佳，而对比例的幼鱼染色方法不能将色素完全去除，背景深，影响染色结果。
(2)成鱼茜素红染色效果评价：本发明所述成鱼染色方法能够成功地对成鱼骨骼进行茜素红染色，成鱼骨骼着色深，染色成功率高，染色效果好。
实施例2
1、枸橼酸铁铵诱导建立斑马鱼幼鱼骨质疏松模型
参照以下方法建立枸橼酸铁铵诱导的斑马鱼幼鱼骨质疏松模型：以枸橼酸铁铵(FAC)为造模用药，选用受精后48h的幼鱼暴露于不同浓度的FAC溶液中，FAC浓度分别为50、100、200、500μg·ml-1，同时设普通培养液(Holfreter H20)为对照组，28.5℃下在6孔板中培养4d，至斑马鱼颅骨形成，期间每隔12h换药。
2、斑马鱼幼鱼骨质疏松模型的评价
(1)致畸率和致死量统计：造模结束后统计斑马鱼幼鱼的致畸率和致死率，结果参见表1。由此可见，使用枸橼酸铁铵进行造模时，斑马鱼幼鱼的致畸率为0，其致死率也极低。
表1斑马鱼幼鱼致畸率和致死率
| FAC浓度(μg·ml-1) | 0 | 50 | 100 | 200 | 500 |
| 致畸率 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 致死率 | 5％ | 5％ | 5％ | 10％ | 12％ |
(2)茜素红染色：对培养至6d的斑马鱼骨骼进行茜素红染色，以显微检测和数码成像方法对骨骼染色区域进行定量分析，观察其骨骼钙化程度并进行统计分析，具体检测结果参见图1。
根据图1所示结果可知，斑马鱼幼鱼用茜素红染色后，头骨矿化骨骼部分如脊索(NC)、孔盖(OP)、副蝶骨(PS)、角鳃骨(CB)、角舌骨(CH)和舌骨下颔弓(Hm)呈红色，而非骨组织耳石(Otolith，OT)部分呈棕黑色。经过不同浓度的FAC处理后，斑马鱼头部的染色较浅，如副蝶骨(ps)、孔盖(op)、角舌骨(ch)和脊索(NC)等部位；与对照组相比，随着FAC处理浓度的增加，斑马鱼头部的染色区域逐渐减小，尤其在500μg·ml-1FAC处理组，只可见脊索，且染色面积及程度都大大减弱(图1a)。
采用专业图像软件计算斑马鱼的染色面积(骨矿化面积)。如图1b所示，与对照组相比，50μg·ml-1和100μg·ml-1的FAC对斑马鱼骨骼的矿化面积影响并不显著。但随着FAC处理浓度的增加，斑马鱼骨骼的矿化面积是呈降低趋势的。与对照组相比，当FAC处理浓度为200μg·ml-1时，其骨骼的矿化面积减少明显，具有显著差异(p<0.01)。当FAC处理浓度为500μg·ml-1时，其骨骼矿化面积的减少为对照组的三分之一左右，差异最为显著(p<0.001)。由此可见，浓度为200～500μg·ml-1的FAC可诱导斑马鱼骨骼矿化量显著减少，并呈浓度依赖性。采用同款软件计算累积光密度(IOD，图1c)，用不同浓度FAC处理，对IOD的影响与其对骨矿化面积的影响相似，且随着FAC浓度的增加，IOD值呈现降低趋势且呈现梯度依赖性。当浓度提高至200～500μg·ml-1时，IOD值显著降低。结果进一步说明，FAC的处理浓度为200～500μg·ml-1时，可诱使斑马鱼骨密度显著降低，且呈浓度依赖性。
(3)钙黄绿素染色：对斑马鱼幼鱼进行钙黄绿素染色，观察骨骼钙化程度并计算相对荧光强度以表征骨骼钙化程度，具体结果参见图2。
钙黄绿素染色结果也进一步表明：随着FAC浓度的增加，其骨骼矿化程度减弱，其钙黄绿素染色的部位逐渐减小且荧光的强度逐渐减弱，尤其在脊椎发育上差异更明显，在对照组中第6节脊椎已经开始钙化，而FAC处理组中脊椎数量逐渐减少，在500μg·ml-1FAC组，其脊椎只有一节钙化较为完整，整体钙化严重受损(图2a)；荧光强度计算结果表明：荧光强度的表达随着FAC浓度的增加而逐渐减弱，在200～500μg·ml-1时，其差异非常显著(图2b)。
(4)阿尔新蓝染色：对斑马鱼幼鱼进行阿尔新蓝染色，观察其头部及颅面部软骨的发育情况，进行统计分析，具体结果参见图3。
如图3所示：与对照组相比，斑马鱼头部的麦克耳软骨(mk)、副蝶骨(ps)、角舌骨(ch)、腭方骨(pq)、角鳃骨(cb1-5)和舌骨下颌结合弓(hm)等部位发育存在明显缺陷，且随着浓度增加，缺陷越明显，发育越不完全。甚至在500μg·ml-1FAC的处理下，斑马鱼头部的骨骼染色几乎无信号显示(图3a)，说明FAC对骨骼发育有抑制作用。此外，通过图像软件Imagepro plus 6.0对图像进行分析，计算斑马鱼的染色面积，其染色面积的变化是逐渐减少的趋势，且在100μg·ml-1时就有显著性差异，浓度越高差异性越明显，呈浓度梯度依赖性(图3b)。由此可见，FAC不但影响骨密度，还引发软骨发育的严重缺陷。
(5)mRNA的检测：检测成骨细胞分化特异表达的基因以及调控软骨发育相关基因的mRNA水平变化。
骨钙素(Bglap或Bgp)，是一种由造骨细胞合成的结构蛋白，通过促进造骨细胞钙化为成骨细胞而参与骨骼发育，而成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。Sox9b调控软骨形成的重要转录因子，col1a2、col10a1a是软骨标记基因，参与骨膜内成骨及软骨内成骨的调控过程。通过半定量检测上述基因的mRNA表达，结果如图4所示：随着FAC处理浓度的增加，bgp基因电泳条带的亮度逐渐减弱，尤其在500μg·ml-1FAC组减弱尤为明显，说明其mRNA表达随着FAC浓度提高而下调(图4a)。对条带进行定量分析，计算bgp的相对表达量。与对照组相比，在低浓度FAC处理组，上述几个基因的mRNA表达量降低均没有显著差异。当FAC处理浓度为500μg·ml-1时，sox9b和col10a1a的mRNA表达水平下降至对照组三分之一(图4b,c)；BGP和col1a2的表达量下降为对照组的一半水平，差异都非常显著(图4d，e)。
实施例3
阿仑膦酸钠能良好地修复FAC诱导的幼鱼骨质疏松症
幼鱼修复：收集受精后48h的斑马鱼幼鱼随机分成4组，每组至少30枚，分别为：对照组即正常的养鱼水培养至第10天；造模组即500μg·ml-1FAC处理至第10天；阴性药对照组即FAC处理4天，再换成H2O培养4天；阳性药修复组即FAC处理4天，再换成0.1％的阳性药阿仑膦酸钠培养4天。收集处理后即第10天的4组幼鱼，进行茜素红染色、钙黄绿素染色以及阿尔新蓝染色检测硬骨及软骨发育的修复情况，结果如图5所示。实验结果表明无论是从骨密度、矿化程度还是软骨发育，阿仑膦酸钠能够极好地修复由FAC造成的骨钙化减少及软骨缺失。
实施例4
枸橼酸铁铵诱导建立斑马鱼成鱼骨质疏松模型
成鱼造模：选用三月龄的斑马鱼成鱼，采用500μg·ml-1FAC浸泡处理15天，以正常培养液(Holfreter H2O)为对照，每组样本量8条，每天换药一次，喂食一次，15天后统计斑马鱼成鱼的致畸率和致死率，并进行茜素红染色，观察钙化及矿化程度。结果表明：(1)与幼鱼相比，造模过程中斑马鱼成鱼的致畸率为0，而致死率与斑马鱼幼鱼相比进一步降低(统计结果参见表2)；(2)FAC处理后引发斑马鱼整骨矿化程度明显下降，包括脊椎、腹鳍和尾鳍等部位(结果参见图6b1-b3)。
表2斑马鱼成鱼致畸率和致死率
| FAC浓度(μg·ml-1) | 0 | 500 |
| 致畸率 | 0 | 0 |
| 致死率 | 0 | 7％ |
实施例5
阿仑膦酸钠对成鱼骨质疏松具有良好的治疗效果
成鱼修复：选用三月龄的斑马鱼成鱼，随机分成4组，每组8条，分别为：对照组即正常的养鱼水培养至第25天；造模组即500μg·ml-1FAC处理至第25天；阴性药对照组即FAC处理15天，再换成H2O培养10天；阳性药修复组即FAC处理15天，再换成0.1％的阳性药阿仑膦酸钠培养10天。每天换药一次、喂食一次，收集处理后的4组成鱼，进行茜素红染色测硬骨骨密度修复情况。
根据实验方案所述方法进行分组处理，收集处理后的25天的成鱼进行茜素红染色，结果如图7所示。实验结果表明FAC处理后引发的斑马鱼整骨密度降低症状可由阿仑膦酸钠极好地修复，包括脊椎、腹鳍和尾鳍等部位(图7d1-d3)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种制备斑马鱼骨质疏松模型的方法，其特征在于，所述方法包括用Fe3+溶液处理斑马鱼的步骤，其中，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度大于0.8mmol/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液中Fe3+的摩尔浓度为0.8～1.2mmol/L，优选1mmol/L。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述Fe3+溶液包括选自枸橼酸铁铵溶液、FeCl3溶液、硫酸铁铵溶液中的一种或多种，优选地，所述Fe3+溶液为枸橼酸铁铵溶液。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述斑马鱼为幼鱼或成鱼。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
将受精后24～72h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养3～5d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养10～20d。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
将受精后48h的幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养4d；或者，将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养15d，优选地，所述成鱼为三月龄斑马鱼。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在将幼鱼暴露在Fe3+溶液中培养的期间，每隔10～14h重新更换Fe3+溶液，优选每隔12h重新更换Fe3+溶液；或者，
在将成鱼暴露在Fe3+溶液中培养的期间，每隔18～36h重新更换Fe3+溶液，优选每隔24h重新更换Fe3+溶液。
8.对权利要求4～7任一项所述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)用脱色素液脱去斑马鱼骨质疏松模型的色素，所述斑马鱼为斑马鱼幼鱼；(2)用染色工作液对幼鱼进行染色，所述工作液的组分包括茜素红、氢氧化钾、乙醇和水；优选地，所述工作液中茜素红的质量分数为0.003～0.005％，进一步优选为0.004％；氢氧化钾的质量分数为0.5～0.8％，进一步优选0.7％，乙醇的体积分数为0.6～0.8％，进一步优选为0.75％。
9.对权利要求4～7任一项所述斑马鱼骨质疏松模型进行茜素红染色的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)固定斑马鱼骨质疏松模型，其中所述斑马鱼骨质疏松模型为斑马鱼成鱼；(2)梯度脱水；(3)将成鱼腹部剪开，用茜素红染色液染色；(4)胰蛋白酶消化；(5)KOH溶液处理。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：将成鱼置于茜素红染色液中染色18～30h，优选室温下染色，染色时间优选为24h，所述茜素红溶液中茜素红的质量分数为0.4～0.6％，优选为0.5％，pH值为7.5～8.5。
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