CN101096380B - 一种从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化分离技术领域。本发明所要解决的技术问题在于公开一种从生物转化或多酶反应液中分离CDP-C的方法，以克服现有技术中存在的CDP-C回收率低和胞苷酸无法回收的技术缺陷。本发明的技术方案是将CDP-C反应液依次通过阳离子交换柱1、阴离子交换柱2和阴离子交换柱3；用去离子水洗涤柱1-3；用pH5.0的溶液串洗阴离子交换柱2和阴离子交换柱3；用高浓度的盐和盐酸浓液将CDP-C从阴离子交换柱3上洗脱得到高纯度的CDP-C溶液；用pH3.0的溶液洗脱阴离子交换柱2上吸附的CMP。本发明的方法分离时间缩短，水耗量降低60％以上，产品容易结晶，可高收率的获得CDP-C产品，并可回收大部分未反应完的CMP。
Description
技术领域
本发明涉及一种胞二磷胆碱的分离纯化方法。尤其是从生物转化或多酶反应液中，采用新型离子交换树脂组合柱层析，分离纯化胞二磷胆碱的方法。
背景技术
胞二磷胆碱(cytidine diphosphate choline，简称CDP-Choline，CDP-C)是机体卵磷脂合成的重要中间体，是磷脂代谢所必需的辅酶。在临床上，CDP-C在脑中磷脂代谢受损的状态下可以改善磷脂的代谢，从而促进意识的恢复。对脑外伤、脑手术所致的意识障碍，以及对一些慢性病如脑卒中后遗症、帕金森氏病、中枢性眩晕、耳鸣、青光眼和感觉性神经耳聋有一定的疗效。
CDP-C可用化学合成和生物合成制备。化学合成CDP-C通常需要制备一些中间体(如胞苷酸吗啡胍盐或胞嘧啶二磷酸二酚等)，工艺烦琐；虽然Kennedy曾采用加入大量的二环己基羰基二亚胺(DCC)[2]作缩合剂直接缩合胞苷酸(CMP)和磷酸胆碱来制备CDP-C(Kennedy E.P.，J.Biol.Chem，1956，222：185)，但DCC试剂价格昂贵，用于工业生成成本过高；Kikugawa[10](Kikugawa，Chem.Pharmaceut.Bull，1971，19：1011)和上海实验生物研究所(海实验生物研究所核酸研究组，生物化学与生物物理进展，1975，1：19)曾采用对甲苯磺酰氯代替DCC作缩合剂直接缩合CMP和磷酸胆碱来制备CDP-C，但仍存在着操作要求严格和转化率不高等问题。
利用生物体内的相关酶系进行生物法合成，具有反应条件温和、转化率高、成本低等特点，因此近年CDP-C的生产大多都采用生物合成。
生物合成中，以CMP与磷酸胆碱(盐)为底物生物合成CDP-C最为成熟。如文献给出了利用酵母生物转化合成CDP-C的生产条件：pH8.0，20mmol/L CMP，酵母550g/L，磷酸盐缓冲液为200mmol/L，葡萄糖1000mmol/L，磷酸胆碱90mmol/L，硫酸镁20mmol/L，反应时间在24-32小时，反应温度在28℃，CDP-C转化率可达80％以上(生物化学与生物物理进展，1977，(4)：15-19)。
生物合成的CDP-C反应液中，含有蛋白质，色素，未反应完的磷酸盐，磷酸胆碱，硫酸镁，胞苷酸，以及葡萄糖代谢副产物和胞苷等物质，这使CDP-C的分离纯化带来很多困难。
CDP-C的分离提取先要经过离心去除菌体，调酸、调碱去除蛋白；然后活性炭吸附洗脱；离子交换树脂吸附，分部洗脱等步骤，一般回收率不超过40％，在工业生产中损耗严重(生物化学与生物物理学报，1976，8(3)：199-205；黄颖，医药工业，1985，16(1)：3-5)。另外价格较贵的未反应完的胞苷酸无法回收。
发明内容
本发明需要解决的问题在于公开一种组合柱层析法从生物转化或多酶反应液(以下简称反应液)中分离CDP-C的方法，以克服现有技术的缺陷，并适用于工业规模生产。
本发明的构思是这样的：
本发明采用新型离子交换树脂组合层析法(图1)。1#阳柱吸附中的色素，蛋白质，胞苷，调节pH；2#阴柱分离CDP-C和CMP；3#阴柱浓缩CDP-C溶液。
1#阳柱可采用大孔酚醛系弱酸树脂(HD-1)。该树脂可吸附大分子物质，如蛋白质等，亦可交换去除阳离子，如钙、镁离子及胞苷，这样可以保护后续分离不受这些物质的干扰，增加后续柱的吸附量。同时还可以吸附去掉大部分的色素，改变反应液的pH为酸性。
2#阴柱可采用大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂如D301或多孔结构的酚醛缩聚型弱碱性阴树脂如D345或大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂如D315等。由于CDP-C所带负电荷要小于CMP，通过控制pH值可将两者在柱上分离，即CMP吸附到树脂，而CDP-C流出。同时大部分阴离子可被吸附到此柱上。
3#阴柱可采用强碱凝胶型阴离子交换树脂，如：华东理工大学HZ201或其它厂家生产的201×7，201×8等，粒径在0.5-1.0mm之间。CDP-C可在此柱上得到浓缩，减少后续真空浓缩操作能耗。
本发明的特征是，通过新型阴阳离子交换树脂的有序组合层析，可一次性分离纯化得到高纯度的CDP-C，与老工艺相比，柱分离时间缩短，水耗量降低60％以上，产品容易结晶。
本发明的方法依次包括如下步骤：
1)将过滤后CDP-C反应液依次通过1、2、3#柱，使蛋白质、色素、阳离子吸附在1#柱中，阴离子和CMP及少量CDP-C吸附在2#柱中，大量CDP-C吸附在3#柱中。
2)用去离子水洗涤1-3#柱，使1#柱出口不再含CMP。
3)用pH5.0的溶液串洗2-3#柱，使2#柱出口不再含有CDP-C。
4)用高浓度的盐和盐酸浓液将CDP-C从3#柱上洗脱，即可得到高纯度的CDP-C溶液。
5)用pH3.0的溶液洗脱2#柱上吸附的CMP。
通过上述分离过程，可高收率的获得CDP-C产品，并可回收大部分未反应完的CMP，而其它副产物杂质都被柱所吸收或被洗脱时洗掉。
本发明所用的方法具有操作简便，产品回率高，分离效果好，所得产品质量优异，适合大规模工业生产等特点。
附图说明
图1为流程图。
由图1所示本发明所说的方法依次包括如下步骤，
1)将CDP-C反应液过滤后，依次通过1#弱酸型阳离子交换树脂柱，2#弱碱型阴离交换树脂和3#强碱型阴离子交换树脂。上柱总量为1#柱总交换量的5-30％(摩尔比)，最佳为10-15％，即每30升树脂可交换1公斤胞二磷胆碱反应液。柱1∶柱2∶柱3体积比为1∶1.2-2.5∶0.3-0.8，最佳为1∶1.4-1.8∶0.5-0.7。
上柱的线速度为0.11-0.45米/小时，最佳为0.25-0.35米/小时。
上柱液中CDP-C的含量为1-20mg/mL，最佳为5-10mg/mL。
上柱完毕，用去离子水充分淋洗，使1#柱出口不含胞苷酸为止。
2)用pH5.0的溶液淋洗2#柱，使2#柱的出口不含CDP-C为止。然后改用pH3.0的溶液洗脱2#柱，回收含CMP部分，经浓缩结晶得到CMP。
3)用高浓度的盐、酸混合溶液洗脱3#柱，所用的盐可以为可溶性的钠盐或钾盐，本发明采用氯化钠溶液，浓度为0.5-10％，最佳为3-5％。
所用的酸溶液可以硫酸，盐酸，磷酸等。本发明采用的稀盐酸溶液，浓度为0.9-0.00001mol/L，最佳为0.1-0.001mol/L之间。
得到的CDP-C溶液经浓缩后，加入3-5倍体积的乙醇，结晶，即可得到纯度和含量都在98％以上的产品。
本发明所说的1#柱所用树脂为大孔酚醛系弱酸树脂，如HD-1，122，125等，粒径在5-30目，最佳在10-20目；所说的2#柱所用树脂为大孔弱碱性苯乙烯阴离子交换树脂如D301或孔结构的酚醛缩聚型弱碱性阴树脂如D345或大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂如D315等，粒径在在5-30目，最佳在10-20目；所说的3#柱可采用强碱凝胶型阴离子交换树脂，如HZ201、201×7，201×8，Amberlite IRA-900等，粒径在60-150目之间，最佳为80-100目之间。
分析检测方法
钙镁离子采用铬黑T指示剂。蛋白质采用考马斯亮蓝显色法测定。
CDP-C和CMP采用HPLC法测定。
具体实施方式
实施例1
4000mLCDP-C反应液，含CDP-C 34.5g，CMP 5.0g，磷酸盐150g，磷酸胆碱40g，硫酸镁9.7g，蛋白质107mg，按顺序通过1-3#柱，流速为0.3m/h。柱1尺寸为40×1000mm，装处理过的HD-1(H+)树脂1000mL；柱2尺寸为60×1000mm，装处理过的D315(OH-)树脂2000mL；柱3的尺寸为30×1000mm，装处理过的HZ201树脂500mL。
上柱完毕，用1000mL去离子水淋洗。断开柱1和柱2。然后用1500mLpH5.0的稀盐酸溶液淋洗柱2。断开柱2和柱3。再用pH2的稀盐酸溶液(含氯化钠4％)洗脱柱3。收集含CDP-C的洗脱液约800mL，浓缩至100mL，用氢氧化钠调pH7.5。加入400mL无水乙醇，搅拌均匀，置4℃放置16小时，过滤结晶，真空干燥得CDP-C钠盐27.9g，收率为80.9％。经检测CDP-C纯度为98.8％，蛋白质检测为阴性，未检测出磷酸盐及镁离子(＜10ppm)。
另用pH3.0的稀盐洗脱柱2，收集含CMP溶液，经浓缩结晶，得到CMP 4.5g，收率为90％。
实施例2
将实施例1中的CDP-反应液4000mL，依次通过1-3#柱，流速为0.3m/h。
柱1尺寸为40×1000mm，装处理过的HD-1(H+)树脂1000mL；柱2尺寸为60×1000mm，装处理过的D301(OH-)树脂2200mL；柱3的尺寸为30×1000mm，装处理过的Amberlite IRA-900(OH-)树脂450mL。
其它按实施例1操作。
结果得到CDP-C钠盐28.5g，纯度98.9％，收率82.6g。回收胞苷酸4.0g，收率为80％。
实施例3
将实施例1所得的CDP-C(A)和用传统工艺制成的CDP-C(B)用无菌水配制成0.125g/mL溶液，真空密封，在110℃加热30分钟。冷却，在430nm测定吸光度，结果如表1。
表1
| 样品 | A430 |
| A | 0.005 |
| B | 0.072 |
Claims (8)
1.一种从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，包括如下步骤：
1)将胞二磷胆碱反应液依次通过阳离子交换柱1、阴离子交换柱2和阴离子交换柱3；
2)用去离子水洗涤柱1-3，使阳离子交换柱1出口不再含胞苷酸；
3)用pH5.0的溶液串洗阴离子交换柱2和阴离子交换柱3，使阴离子交换柱2出口不再含有胞二磷胆碱；
4)用高浓度的盐和盐酸浓液将胞二磷胆碱从阴离子交换柱3上洗脱，即可得到高纯度的胞二磷胆碱溶液；和，
5)用pH3.0的溶液洗脱阴离子交换柱2上吸附的胞苷酸；
所述的阳离子交换柱1为HD-1、阴离子交换柱2为D315，阴离子交换柱3为HZ2101；上柱总量为阳离子交换柱1总交换量的5-30％，摩尔比。
2.根据权利要求1的从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于，上柱总量为阳离子交换柱1总交换量的10-15％，摩尔比。
3.根据权利要求1的从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于，柱1∶柱2∶柱3体积比为1∶1.2-2.5∶0.3-0.8。
4.根据权利要求3的从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于，柱1∶柱2∶柱3体积比为1∶1.4-1.8∶0.5-0.7。
5.根据权利要求1的从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于，上柱的线速度为0.11-0.45米/小时。
6.根据权利要求5的从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于，上柱的线速度为0.25-0.35米/小时。
7.根据权利要求5的从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于，上柱液中胞二磷胆碱的含量为1-20mg/mL。
8.根据权利要求7的从生物转化或多酶反应液中分离纯化胞二磷胆碱的方法，其特征在于，上柱液中胞二磷胆碱的含量为5-10mg/mL。
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