CN113402555B - 一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。本发明提供了一种如式I所示的共羧化酶的制备方法，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的混合物使用弱碱性阴离子交换树脂依次经水和pH＝10‑12弱碱性水溶液作为洗脱液洗脱，收集洗出液，得到含如式I所示的共羧化酶的水溶液即可；所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中包括硫胺素一磷酸酯和所述的如式I所示的共羧化酶。

Description

一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法
技术领域
本发明涉及一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。
背景技术
共羧化酶(Cocarboxylase，也称为辅羧酶、硫胺焦磷酸酯或二磷酸酯)是维生素B1焦磷酸酯的内盐，其通常还以四水合物(Cocarboxylase Tetrahydrate，又称四水合辅羧酶或四水合硫胺焦磷酸酯)或盐酸盐(又称焦磷酸硫胺素或氯化维生素B1焦磷酸酯)的形式存在。
共羧化酶同样可与特定的蛋白质一起形成几种酶，它们催化人类和动物有机体代谢中的许多重要反应。
Figure BDA0002414069220000011
已有文献报道焦磷酸硫胺素的制备方法较多。1937年，Stern和Hofer利用维生素Bl和三氯氧磷反应制备了焦磷酸硫胺素[cf.Science,Vol.85,p.483(1937)]。J.Weijlard和H.Tauber利用维生素B1和焦磷酸钠与磷酸的混合液制备了焦磷酸硫胺素，通过利用磷酸钙溶液与大量的有机溶剂处理得到硫胺焦磷酸酯，收率在10％左右[cf.Joural of theAmerican Chemical Society,Vol.60,p.2263(1938)]。1940年，文献报道VB1类似物5-溴化乙烯噻唑和磷酸银反应制备氯化VB1焦磷酸酯，以银盐的形式析出，用硫化氢除去银离子,然后用氯化氢处理得到氯化硫胺焦磷酸酯[cf.Biochemical Journal,Vol.34,p.980(1940)]，上述方法需要用到有毒试剂或者大量的有机溶剂，或者温度较高，不利于环境保护。
US5047223、US2991284、CN1887891A、CN101787048B公开了维生素B1为原料，和磷酸化试剂(例如五氧化二磷与磷酸反应产生的焦磷酸)发生磷酸化反应，先经弱碱性阴离子柱(主要吸附住副产物维生素B1三磷酸酯、维生素B1四磷酸酯等高级磷酸酯，以及磷酸)，浓缩，后经弱酸性阳离子交换树脂纯水洗脱(在水淋洗时牢牢吸附住维生素B1磷酸酶，而辅羧酶却可以毫无保留的洗出，当该树脂柱用10％盐酸淋洗时，又可以将维生素B1磷酸酯完全洗出)，35℃下浓缩，加乙醇析晶可得到产物(最终产物纯度达到99％)，离子柱预处理以及再生过程十分繁琐，2次离子柱，2次35℃下浓缩水所用时长较大。
JP03145495提到产物的分离和提纯，将所得的磷酸混合物过强碱性阴离子柱离子交换树脂，纯水中加入醋酸(或甲酸、丙酸)洗涤，pH<5.5洗脱液用乙醇析晶，为焦磷酸盐，pH＞5.5洗脱液用丙酮析晶为单磷酸盐，纯度最高为96％。
US2991284的实施例2中提到将2kg盐酸硫胺素磷酸化所得的磷酸盐混合物先过强碱性离子交换树脂(permutit ES)在pH 6.6-6.0时，得到单磷酸盐；pH在6.0-5.4下，得到单磷酸盐和焦磷酸盐的混合物，其中单磷酸盐占25％-30％；当pH为5.4-2，得到纯的羧化酶四水合物，该过程中得到纯的焦磷酸酯含量极低，约3％，硫胺磷酸酯和二磷酸酯的分离度较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的共羧化酶的纯化方法繁琐、效果差的缺陷，而提供了一种共羧化酶及其四水合物或盐的制备方法。采用本发明的纯化方法可经一步离子交换得到高纯度(99％以上)的共羧化酶，并可进一步直接制备得到高纯度的四水合物或焦磷酸硫胺素。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的。
本发明提供了一种如式I所示的共羧化酶的制备方法，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的混合物使用弱碱性阴离子交换树脂依次经水和pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液洗脱，收集洗出液，得到含如式I所示的共羧化酶的水溶液即可；所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中包括硫胺素一磷酸酯和所述的如式I所示的共羧化酶(硫胺素二磷酸酯)；
Figure BDA0002414069220000031
所述的弱碱性阴离子交换树脂可为本领域该类制备方法中常规的弱碱性阴离子交换树脂，例如大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，所述的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为下列型号之一：D315、D301、D335、D345；本发明中较佳地为D301。
所述的水可为本领域该类制备方法中常规的水，例如纯水。
所述的pH＝10-12弱碱性水溶液可采用本领域常规的碱调节得到；本发明中较佳地为使用氨水调节得到。
在本发明的某一方案中，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中还可含有硫胺素、硫胺素三磷酸酯和高级磷酸酯中的一种或多种。
在本发明的某一方案中，所述的经水洗脱可为本领域该类反应中常规的操作方法，例如洗脱至洗出液中硫胺素一磷酸酯(磷酸单酯)含量低于百分之一(液相监控，具体条件可如实施例中所示)即可。
在本发明的某一方案中，所述的收集洗出液为收集如式I所示的共羧化酶纯度大于95％洗出液(液相监控，具体条件可如实施例中所示)。
本发明中，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物可采用本领域中共羧化酶的常规制备方法得到，例如参考现有技术：①Science,Vol.85,p.483(1937)；②Joural ofthe American Chemical Society,Vol.60,p.2263(1938)；③Biochemical Journal,Vol.34,p.980(1940)；④US5047223；⑤US2991284；⑥CN1887891A；⑦CN101787048B；或⑧JP03145495中的方法，或者进行常规条件和操作的选择制备得到含共羧化酶的混合物。本发明中特别优选如下步骤制备得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物：
步骤(1)，将水和醇类溶剂依次加入到维生素B1与磷酸化剂进行磷酸化反应后的反应液中进行混合、静置后的上清液除去，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物的粗品；
步骤(2)，将上述的粗品和水形成的溶液，使用水不溶性叔胺、或水不溶性叔胺与有机溶剂的混合溶剂进行洗涤，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物即可。
步骤(1)中，所述的磷酸化剂可为本领域该类磷酸化反应中常规的磷酸化剂，例如焦磷酸，焦磷酸与五氧化二磷或三氯氧磷的混合物，磷酸与五氧化二磷进行反应制备得到的含焦磷酸的混合物，和高浓度磷酸(例如含25％及以上的焦磷酸)中的一种或多种；本发明中较佳地为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物(例如磷酸与五氧化二磷的摩尔比为2:1-1:1，又例如1.2:1-1.3:1)。
所述的磷酸化剂与所述的维生素B1的摩尔比可为本领域该类法中常规的摩尔比；当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，本发明中五氧化二磷与所述的维生素B1的摩尔比较佳地为4:1-2:1(例如3:1-3.5:1)。
当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，所述的混合物可为磷酸与五氧化二磷在100℃-180℃进行反应制备得到，本发明中较佳地为150℃-160℃。
步骤(1)中，所述的醇类溶剂可为本领域该类反应中常规的醇类溶剂，例如异丙醇和/或乙醇。所述的醇类溶剂与所述的维生素B1的体积质量比可为2:1-5:1(例如3:1-4:1)。
步骤(1)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比可为2:1-5:1(例如3:1-4:1)。
步骤(1)中，所述的磷酸化反应的温度可为本领域该类反应中常规的温度，例如100℃-170℃，本发明中较佳地为130℃-140℃。
步骤(2)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比可为1:1-3:1(例如1.5:1-2:1)。
步骤(2)中，本领域技术人员可以理解，所述的水不溶性叔胺可为本领域该类反应中常规的几乎不溶于水或仅稍微溶于水的叔胺；例如8至40个，优选12至36个碳原子的：脂族叔胺(尤其是三辛胺，三己胺和十三烷基胺中的一种或多种)、脂族-环脂族叔胺(例如N，N-二甲基环己胺)和脂族-芳脂族叔胺(例如N，N-二甲基苄胺)中的一种或多种；本发明中较佳地为三辛胺和/或十三烷基胺。
步骤(2)中，本领域技术人员可以理解，所述的有机溶剂可为本领域该类反应中常规的有机溶剂，例如中等极性的水不混溶的有机溶剂(参见Chr.Reichardt，《有机化学中的溶剂效应》，Verlag Chemie，1979，尤其是第242-245页)；例如具有4至8个碳原子的醇类溶剂(例如甲基异丁基甲醇、3-乙基戊醇、1-己醇和甲基环己醇中的一种或多种)、具有4至8个碳原子的醚类溶剂(例如二乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚和二正丁基醚中的一种或多种)、具有5至8个碳原子的酮类溶剂(例如二乙基酮、甲基异丁基酮、苯乙酮和环己酮中的一种或多种)和芳烃类溶剂(例如甲苯)中的一种或多种；本发明中较佳地为异丙醚。
步骤(2)中，所述的水不溶性叔胺的用量可为本领域该类反应中常规的用量，例如基于所述的混合溶剂的所述的水不溶性叔胺质量百分比含量为10％至80％，优选40％至70％的混合溶剂。本领域技术人员可以理解，如果使用仅包含少量胺的混合物，则必须使用大量的胺/溶剂混合物，或者萃取过程必须重复数次。如果使用包含大量胺的胺/溶剂混合物，则单一提取过程可能就足够了。所述的混合溶剂的用量可为本领域该类反应中常规的用量，例如当所述的混合物和水形成的溶液的pH为3至4，特别是3.2至3.4时即可。
本发明提供了一种共羧化酶四水合物的制备方法，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的水溶液进行浓缩，过滤析出的固体，即得共羧化酶四水合物；所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液采用如上所述的含如式I所示的共羧化酶的制备方法制备得到。
所述的浓缩的操作条件和方法可为本领域该类化合物进行浓缩时常规的操作条件和方法，例如所述的浓缩的温度为35℃以下，较佳地为30℃-35℃。
当所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液含过量的碱离子时，较佳地，使用酸中和过量的碱离子后结晶，再过滤析出的固体，即得共羧化酶四水合物；所述的酸可为盐酸；所述的结晶可包括如下步骤：将醇类溶剂加入到所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液中，过滤析出的固体，得到所述的共羧化酶的盐酸盐即可。其中，所述的醇类溶剂可为本领域该类后处理中常规的醇类溶剂，例如异丙醇和/或乙醇。所述的醇类溶剂可为本领域该类后处理中常规的用量，例如，所述的醇类溶剂与所述的含如式I所示的共羧化酶的盐酸盐的溶液的体积比可为2:1-3:1。
本发明还提供了一种共羧化酶盐酸盐的制备方法，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的水溶液进行浓缩，加入浓盐酸调节pH＝2-3，得到含如式I所示的共羧化酶的盐酸盐(即焦磷酸硫胺素)的溶液即可；所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液采用如上所述的含如式I所示的共羧化酶的制备方法制备得到。
所述的浓缩的操作条件和方法可为本领域该类化合物进行浓缩时常规的操作条件和方法，例如所述的浓缩的温度为35℃以下，较佳地为30℃-35℃。
所述的共羧化酶盐酸盐的制备方法还可包括如下结晶步骤：将醇类溶剂加入到所述的含如式I所示的共羧化酶的盐酸盐的溶液中，过滤析出的固体，得到所述的共羧化酶的盐酸盐即可。
其中，所述的醇类溶剂可为本领域该类后处理中常规的醇类溶剂，例如异丙醇和/或乙醇。所述的醇类溶剂可为本领域该类后处理中常规的用量，例如，所述的醇类溶剂与所述的含如式I所示的共羧化酶的盐酸盐的溶液的体积比可为2:1-3:1。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：采用本发明的纯化方法可经一步离子交换得到高纯度(99％以上)的共羧化酶，并可进一步直接制备得到高纯度(99％以上)的四水合物或焦磷酸硫胺素。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
共羧化酶的制备
称取磷酸(85％，24g，0.20mol)，五氧化二磷(22.5g，0.158mol)，加入三颈瓶中100℃下反应2h。称取VB1(16g，0.048mol)分批加入，100℃下反应3.5h，TLC显示反应完全后，停止加热，加入水48ml，搅拌溶解，冰水浴下搅拌，并加入异丙醇60ml，搅拌30min后，放置冰箱过夜。
将上清液去除后，得到黄色油状物质，加入水24ml溶解，溶解后，加入三辛胺：异丙醚＝1：1(20ml)，洗涤两次。将样品(放置冰箱过夜后，产物会以黄色油状物的形式在底部析出，去除上清液后，黄色油状物是部分磷酸以及磷酸酯的混合物，洗涤的是主要是磷酸)装至D301阴离子交换树脂中，先用纯水洗脱，至到液相监控洗出液磷酸单酯含量低于百分之一，再用氨水调节pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液，收集洗出液，将所得洗出液进液相监控纯度，选择纯度大于95％合并洗出液，纯度：95.54％。
共羧化酶四水合物的制备
将洗出液在30-35℃浓缩至2-3ml，加入盐酸(例如1M盐酸)中和过量碱离子，用2-3倍量异丙醇析出产物，即得到共羧化酶四水合物。
焦磷酸硫胺素的制备
将洗出液在40℃蒸至2-3ml，加入浓盐酸调节pH＝2-3，用2-3倍量异丙醇析出产物(1.6g)，熔点：238-241℃；纯度：96.55％。
(检测条件：色谱柱：C18，4.6×250mm,5mm，柱温：45℃，检测波长：239nm，流速：0.8ml/min，进样量：20μl，运行时间：30min，流动相：流动相A:甲醇，流动相B：磷酸二氢钠浓度为23mmol/L、辛烷磺酸钠浓度为5mmol/L，用磷酸调节pH＝2.5的离子对缓冲液，等度洗脱：A:B＝46:54)；m/z425[M+H]+；1H NMR(600MHz,D2O)：δ9.66(s,1H),7.92(s,1H),5.56(s,2H),4.21-4.18(m,2H),3.34-3.32(t,2H),2.62(s,3H),2.56(s,3H)；13C NMR(600MHz,D2O):δ163.16，162.96，154.93，144.12，143.40，135.82，106.43，64.89，49.88，27.59，20.90，11.08。
实施例2
共羧化酶的制备
称取磷酸(85％，24g，0.20mol)，五氧化二磷(22.5g，0.158mol)，加入三颈瓶中100℃下反应2h。称取VB1(16g，0.048mol)分批加入，100℃下反应3.5h，TLC显示反应完全后，停止加热，加入水48ml，搅拌溶解，冰水浴下搅拌，并加入异丙醇60ml，搅拌30min后，放置冰箱过夜。
将上清液去除后，得到黄色油状物质，加入水24ml溶解，溶解后，加入三辛胺：异丙醚＝1：1(20ml)，洗涤两次。将样品(洗完磷酸后的磷酸酯混合物)装至D301阴离子交换树脂中，先用纯水洗脱，至到液相监控洗出液磷酸单酯含量低于百分之一，用氨水调节pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液，收集洗出液，将所得洗出液进液相，选择纯度大于95％合并洗出液，纯度：95.43％。
焦磷酸硫胺素的制备
将洗出液在30-35℃蒸至2-3ml，加入浓盐酸调节pH＝2-3，用2-3倍量异丙醇析出产物(1.81g)，纯度：99.03％。
实施例3焦磷酸硫胺素的制备
共羧化酶的制备
称取磷酸(85％，24g，0.20mol)，五氧化二磷(22.5g，0.158mol)，加入三颈瓶中150-160℃下反应2h。称取VB1(16g，0.048mol)分批加入，130-140℃下反应3.5h，TLC显示反应完全后，停止加热，加入水48ml，搅拌溶解，冰水浴下搅拌，并加入异丙醇60ml，搅拌30min后，放置冰箱过夜。
将产物上清液去除后，得到黄色油状物质，加入水24ml溶解，溶解后，加入三辛胺：异丙醚＝1：1(20ml萃取)，萃取两次。将样品装至D301阴离子交换树脂中，先用纯水洗脱，至到液相监控洗出液磷酸单酯含量低于百分之一，用氨水调节pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液，收集洗出液，将所得洗出液进液相，选择纯度大于95％合并洗出液。
焦磷酸硫胺素的制备
将洗出液在30-35℃蒸至2-3ml，加入浓盐酸调节pH＝2-3，用2-3倍量异丙醇析出产物(3.24g)纯度：99.21％。
对比例1
采用US2991284中的方法
称取磷酸(85％，24g，0.20mol)，五氧化二磷(22.5g，0.158mol)，加入三颈瓶中100℃下反应2h。称取VB1(16g，0.048mol)分批加入，100℃下反应3.5h，TLC显示反应完全后，停止加热，加入水48ml，搅拌溶解，冰水浴下搅拌，并加入异丙醇60ml，搅拌30min后，放置冰箱过夜。
将产物上清液去除后，得到黄色油状物质，加入水24ml溶解，溶解后，加入三辛胺：异丙醚＝1：1(20ml萃取)，萃取两次。将样品装至D301阴离子交换树脂中，用醋酸调节纯水，收集pH<5.5洗脱液，HPLC监控得到单磷酸酯，继续调节pH，尝试pH在6.5得到的也是单磷酸酯，用氨水调节pH＝7.5、pH＝8.5得到了有少量的焦磷酸酯的洗脱液，继续调节pH＝9-10，收集得到焦磷酸硫胺素纯度小于10％洗脱液。
对比例2
称取磷酸(85％，24g，0.20mol)，五氧化二磷(22.5g，0.158mol)，加入三颈瓶中100℃下反应2h。称取VB1(16g，0.048mol)分批加入，100℃下反应3.5h，TLC显示反应完全后，停止加热，加入水48ml，搅拌溶解，冰水浴下搅拌，并加入异丙醇60ml，搅拌30min后，放置冰箱过夜。
将产物上清液去除后，得到黄色油状物质，加入水24ml溶解，溶解后，加入三辛胺：异丙醚＝1：1(20ml萃取)，萃取两次。将样品装至D301阴离子交换树脂中，用氨水调节pH＝12-13，收集得到焦磷酸硫胺素纯度小于80％洗脱液。
对比例3
采用CN101787048中的方法
称取磷酸(85％，5.4g，0.0468mol)，五氧化二磷(4.19g，0.0295mol)，加入三颈瓶中100℃下反应2h。称取VB1(4g，0.0118mol)分批加入，100℃下反应3.5h，TLC显示反应完全后，停止加热，加入水12ml，搅拌溶解，冰水浴下搅拌，并加入异丙醇35ml，搅拌30min后，放置冰箱过夜。
将产物上清液去除后，得到黄色油状物质，加入水5ml溶解，溶解后，加入三辛胺：异丙醚＝1：1(5ml萃取)，萃取两次。将样品装至D301阴离子交换树脂中，用纯水洗脱，液相监控洗脱液，得到洗脱液中焦磷酸硫胺素纯度均小于15％。
采用上述对比例1、2、3中的方法均无法收集到纯度大于95％的洗出液。
本领域中，在进行共羧化酶纯化中，最后都使用酸性条件下才能得到纯度较高的产品，例如现有技术US5047223、US2991284、CN1887891A、CN101787048B、JP03145495等。而本发明采用了本领域现有技术构思不同的技术方案，在减少离子交换树脂柱步骤的情况下，在效果上(特别是纯度)还达到了现有技术的水平。

Claims (14)

1.一种如式I所示的共羧化酶的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的混合物使用弱碱性阴离子交换树脂依次经水和pH＝10-12弱碱性水溶液作为洗脱液洗脱，收集洗出液，得到含如式I所示的共羧化酶的水溶液即可；所述的含共羧化酶的混合物中包括硫胺素一磷酸酯和所述的如式I所示的共羧化酶；
Figure FDA0003846696720000011
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的弱碱性阴离子交换树脂为大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂；
和/或，所述的水为纯水；
和/或，所述的pH＝10-12弱碱性水溶液为使用氨水调节得到；
和/或，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物中还含有硫胺素、硫胺素三磷酸酯和高级磷酸酯中的一种或多种；
和/或，所述的经水洗脱为洗脱至洗出液中硫胺素一磷酸酯含量低于百分之一即可。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的弱碱性阴离子交换树脂为下列型号之一：D315、D301、D335或D345；
和/或，所述的收集洗出液为收集如式I所示的共羧化酶纯度大于95％洗出液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物采用如下步骤制备得到：步骤(1)，将水和醇类溶剂依次加入到维生素B1与磷酸化剂进行磷酸化反应后的反应液中进行混合、静置后的上清液除去，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物的粗品；
步骤(2)，将上述的粗品和水形成的溶液，使用水不溶性叔胺、或水不溶性叔胺与有机溶剂的混合溶剂进行洗涤，得到所述的含如式I所示的共羧化酶的混合物即可。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述的磷酸化剂为焦磷酸，焦磷酸与五氧化二磷或三氯氧磷的混合物，磷酸与五氧化二磷进行反应制备得到的含焦磷酸的混合物，和高浓度磷酸中的一种或多种；
和/或，步骤(1)中，所述的醇类溶剂为异丙醇和/或乙醇；
和/或，步骤(1)中，所述的醇类溶剂与所述的维生素B1的体积质量比为2:1-5:1；
和/或，步骤(1)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比为2:1-5:1；
和/或，所述的磷酸化反应的温度为100℃-170℃；
和/或，步骤(2)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比为1:1-3:1；
和/或，步骤(2)中，所述的水不溶性叔胺为12至36个碳原子的：脂族叔胺、脂族-环脂族叔胺和脂族-芳脂族叔胺中的一种或多种；
步骤(2)中，所述的有机溶剂为具有4至8个碳原子的醇类溶剂、具有4至8个碳原子的醚类溶剂、具有5至8个碳原子的酮类溶剂和芳烃类溶剂中的一种或多种；
步骤(2)中，基于所述的混合溶剂的所述的水不溶性叔胺质量百分比含量为10％至80％。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，磷酸与五氧化二磷的摩尔比为2:1-1:1；
和/或，步骤(1)中，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，五氧化二磷与所述的维生素B1的摩尔比为4:1-2:1；
和/或，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，所述的混合物为磷酸与五氧化二磷在100℃-180℃进行反应制备得到；
和/或，步骤(1)中，所述的醇类溶剂与所述的维生素B1的体积质量比为3:1-4:1；
和/或，步骤(1)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比为3:1-4:1；
和/或，步骤(1)中，所述的磷酸化反应的温度为130℃-140℃；
和/或，步骤(2)中，所述的水与所述的维生素B1的体积质量比为1.5:1-2:1；
和/或，步骤(2)中，当所述的水不溶性叔胺为12至36个碳原子的脂族叔胺时，所述的12至36个碳原子的脂族叔胺为三辛胺，三己胺和十三烷基胺中的一种或多种；
和/或，步骤(2)中，当所述的水不溶性叔胺为12至36个碳原子的脂族-环脂族叔胺时，所述的12至36个碳原子的脂族-环脂族叔胺为N，N-二甲基环己胺；
和/或，步骤(2)中，当所述的水不溶性叔胺为12至36个碳原子的脂族-芳脂族叔胺时，所述的12至36个碳原子的脂族-芳脂族叔胺为N，N-二甲基苄胺；
和/或，步骤(2)中，当所述的有机溶剂为具有4至8个碳原子的醇类溶剂时，所述的具有4至8个碳原子的醇类溶剂为甲基异丁基甲醇、3-乙基戊醇、1-己醇和甲基环己醇中的一种或多种；
和/或，步骤(2)中，当所述的有机溶剂为具有4至8个碳原子的醚类溶剂时，所述的具有4至8个碳原子的醚类溶剂为二乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚和二正丁基醚中的一种或多种；
和/或，步骤(2)中，当所述的有机溶剂为具有5至8个碳原子的酮类溶剂时，所述的具有5至8个碳原子的酮类溶剂为二乙基酮、甲基异丁基酮、苯乙酮和环己酮中的一种或多种；
和/或，当所述的有机溶剂为芳烃类溶剂时，所述的芳烃类溶剂为甲苯；
和/或，步骤(2)中，基于所述的混合溶剂的所述的水不溶性叔胺质量百分比含量为40％至70％。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，磷酸与五氧化二磷的摩尔比为1.2:1-1.3:1；
和/或，步骤(1)中，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，五氧化二磷与所述的维生素B1的摩尔比为3:1-3.5:1；
和/或，当所述的磷酸化剂为磷酸与五氧化二磷制备得到的含焦磷酸的混合物时，所述的混合物为磷酸与五氧化二磷在150℃-160℃进行反应制备得到。
8.一种共羧化酶四水合物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的水溶液进行浓缩，过滤析出的固体，即得共羧化酶四水合物；所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液采用如权利要求1-6中任一项所述的含如式I所示的共羧化酶的制备方法制备得到。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩的温度为35℃以下；
和/或，当所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液含过量的碱离子时，使用酸中和过量的碱离子后结晶，再过滤析出的固体，即得共羧化酶四水合物。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩的温度为30℃-35℃；
和/或，所述的酸为盐酸；
和/或，所述的结晶包括如下步骤：将醇类溶剂加入到所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液中，过滤析出的固体，得到所述的共羧化酶即可。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的醇类溶剂为异丙醇和/或乙醇；
和/或，所述的醇类溶剂与所述的含如式I所示的共羧化酶的溶液的体积比为2:1-3:1。
12.一种共羧化酶盐酸盐的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将含如式I所示的共羧化酶的水溶液进行浓缩，加入浓盐酸调节pH＝2-3，得到含如式I所示的共羧化酶的盐酸盐的溶液即可；所述的含如式I所示的共羧化酶的水溶液采用如权利要求1-7中任一项所述的含如式I所示的共羧化酶的制备方法制备得到。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，
所述的浓缩的温度为35℃以下；
和/或，所述的共羧化酶盐酸盐的制备方法还包括如下结晶步骤：将醇类溶剂加入到所述的含如式I所示的共羧化酶的盐酸盐的溶液中，过滤析出的固体，得到所述的共羧化酶的盐酸盐即可。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述的浓缩温度为30℃-35℃；
和/或，所述的醇类溶剂为异丙醇和/或乙醇；
和/或，所述的醇类溶剂与所述的含如式I所示的共羧化酶的盐酸盐的溶液的体积比为2:1-3:1。
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