CH441322A

CH441322A - Verfahren zur Herstellung des Tetrahydrates der Cocarboxylase

Info

Publication number: CH441322A
Application number: CH6216058A
Authority: CH
Inventors: Adolf Dr Wenz; Georg Dr Goettmann; Hermann Dr Koop
Original assignee: Merck Ag E
Priority date: 1957-09-28
Filing date: 1958-07-24
Publication date: 1967-08-15
Also published as: DE1085527B

Description

Verfahren zur Herstellung des Tetrahydrates der Cocarboxylase
1937 isolierten K. Lohmann und Ph. Schuster das Coenzym der Carboxylase aus Hefe in Form des Aneurin-pyrophosphorsäureester-chlorids. Nach Karrer [vgl. Lehrbuch der organischen Chemie von P. Karrer, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1948), S. 770] versteht man unter Cocarboxylase das innere Salz des Aneurin-pyrophosphorsäureesters (I)
EMI1.1

Inzwischen hat es sich jedoch eingebürgert, mit Cocarboxylase das Aneurin-pyrophosphorsäureester- chlorid (II)
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zu bezeichnen, obwohl diese Verbindung besser mit Cocarboxylase-hydrochlorid bezeichnet werden sollte.

Im folgenden wird mit Cocarboxylase deshalb richtigerweise das innere Salz des Aneurin-pyrophosphorsäureesters (I) bezeichnet.

Für die Herstellung des Cocarboxylase-hydrochlorids sind eine ganze Reihe Verfahren bekannt.

Stern und Hofer [vgl. Science, Bd. 85, S. 483 (1937)] synthetisierten die Verbindung durch Umsatz von Aneurin mit POC13. J. Weijhard und H. Tauber [vgl.

Journal of the American Chemical Society, Bd. 60, S. 2263 (1938)] setzten Aneurin mit einem Gemisch von Natriumpyrophosphat und Orthophosphorsäure um, während H. Weil-Malherbe [vgl. Biochemical Journal, Bd. 34, S. 980 (1940)] das 5-Bromäthyl-thiazol > Analo- gon des Aneurins mit Silberphosphat behandelten. In beiden Fällen wurde Cocarboxylase als Silbersalz isoliert. Weijhard und Tauber zersetzten dieses mit HsS und isolierten Cocarboxylase-hdyrochlorid durch Behandlung mit Salzsäure. Weil-Malherbe führte die Reinigung mit Phosphorwolframsäure durch. 1946 verbesserten Karrer und Viscontini [vgl. Helvetica Chimica Acta, Bd. 29, S. 715 (1946)] das Verfahren von Weijhard und Tauber.

Neben den bisher genannten Publikationen existieren noch eine ganze Reihe von deutschen (Nrn. 663 588, 704 172, 706 835, 708 514 und 729 905) und auslän- dischen Patenten (vgl. amerikanische Patente Nummern 2 188 323, 2 224 174, 2 415 544, 2 435 750, englische Patente Nrn. 687 674, 687 673, französisches Patent Nr. 930643), die sich alle mit der Herstellung oder Reinigung von Cocarboxylase-hydrochlorid befassen und im wesentlichen Verfahren betreffen, welche eine direkte Phosphorylierung des Aneurins gestatten. Alle bisher bekannten Verfahren, auch die Phosphorylierung mit Palyphosphorsäure, haben jedoch den Nachteil, dal3, die erzielten Ausbeuten gering sind.

Darüber hinaus lassen sich die Verfahren in vielen Fällen nicht einwandfrei reproduzieren.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, ein einfaches, wirtschaftliches, technisch durchführbares und gute Ausbeuten lieferndes Verfahren zur Herstellung von Cocarboxylasesalzen zu finden.

Man hat erkannt, dass die Hauptschwierigkeit bei der Isolierung der Cocarboxylase bzw. ihrer Salze aus dem bei der Phosphorylierung von Aneurin entstehenden Gemisch in der Abtrennung stets vorhandenen Aneurinorthophosphorsäureesters liegt, und dass es dabei wesentlich ist, die Gefahr einer Hydrolyse der Cocarboxylase zu Aneurinorthophosphorsäureester durch entsprechend gewählte Bedingungen möglichst zu vermeiden. Es hat sich femer als zweckmässig erwiesen, die bei der Phosphorylierung angewendete oder gebildete überschüssige Orthophosphorsäure möglichst schon vor der eigentlichen Auftrennung des Aneurinphosphorsäure- ester-Gemisches abzutrennen.

Zur Abtrennung der Hauptmenge an Orthophosphorsäure hat man das Phosphorylierungsgemisch entweder aus wässriger Lösung mit Hilfe geeigneter organischer Lösungsmittel wieder ausgefällt und diesen Prozess einige Male wiederholt und/oder man hat das Gemisch über einen schwach basischen Anionenaustauscher z. B. vom Typ Amberlitep IRA 410, Amberlite IR 45 oder Merck Ii , quaternäre Ammoniumbasen auf Polystyrolgrundlage mit abgeschwächter Basizität bzw. sekundäre Amine auf Polystyrolbasis, laufen gelassen.

Bis auf geringe Spuren blieb bei diesem Prozess die Orthophosphorsäure im schwach basischen Anionenaustauscher hängen, und beim Eluieren mit Wasser konnte dann eine Trennung des ablaufenden Phosphorsäureestergemisches erreicht werden,. Im Bereich von pH 6, 5 bis 5, 5 lief eine wässrige Lösung des Aneurinorthophosphorsäureesters ab. Von pH 5, 5-1 enthielt das Eluat in der Hauptsache die Cocarboxylase, die mit zunehmendem saurem pH stärker mit Phosphorsäure vermischt ist.

Eine bessere Trennung hat man erreicht, wenn man die aus dem schwach basischen Anionenaustauscher ablaufende Lösung über einen stark basischen Anionenaustauscher z. B. des Typs Permutait ES oder Am- berlite IRA 400, quaternäre Ammoniumbasen auf Polystyrolgrundlage leitete. Durch Aufteilung des Eluats in die oben angegebenen, pH-Fraktionen erreichte man eine bessere Trennung als bei Anwendung eines schwach basischen Austauschers. Noch einfacher konnte man den Trennungsprozess gestalten, wenn man die aus einem schwach basischen Anionenaustauscher ablaufende Lösung über einen Kationenaustauscher, wie z.

B. Amberlites. IRC 50, IR 100, IR 105 oder IR 120, schwachsaure Polyacrylsäureharze bzw. ein sulfoniertes Polystyrolharz, laufen liess, da solche Kationenaustauscher den Thiaminorthophosphorsäureester festhalten und die freie Cocarboxylase durchlassen.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung des Tetrahydrates der Cocarboxylase, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das bei der Phosphorylierung von Aneurin anfallende Gemisch aus Orthophosphorsäure, Aneurin- (orthophos- phorsäure)-ester, Cocarboxylase und Estern des Aneurins mit höheren Phosphorsäuren in Wasser löst, aus dieser Lösung mit Hilfe eines oder mehrerer Ionenaustauscher eine wässrige Lösung des Tetrahydrats der Cocarboxylase gewinnt und diese daraus durch Ent fernung des als Lösungsmittel dienenden Wassers oder durch Zusatz eines niederen Alkohols oder von Aceton in kristalliner Form isoliert.

Es hat sich gezeigt, dass man sowohl aus dem Eluat eines Kationenaustauschers bzw. aus den Eluat Fraktionen vom pH 5, 5-1 von Anionenaustauschern durch Eindampfen der wässrigen Lösung das kristalline Cocarboxylase-tetrahydrat gewinnen kann. Diese bisher nicht beschriebene Substanz besitzt einen Zersetzungspunkt von 220-225 (bei etwa 140 Aufblähen unter Wasserabgabe) und lässt sich aus wässriger Lösung nach Zusatz von niederen Alkoholen oder Aceton oder sonstigen geeigneten organischen Lösungsmitteln um- kristallisieren. Der pH-Wert einer 5 % igen wässrigen Lösung von Cocarboxylase-tetrahydrat liegt bei 20 bei 3, 0 (gemessen an einer Gaselektrode).

Da das Co carboxylase-tetrahydrat in wässriger Lösung nur schwach sauer reagiert, tritt eine Spaltung zu Aneurinorthophosphorsäureester praktisch nicht ein. Man kann deshalb Cocarboxylase-tetrahydrat beliebig oft aus wässriger Lösung umkristallisieren und die Substanz in höchster Reinheit gewinnen, ohne dass wesentliche Verluste durch Hydrolyse eintreten. Im Warburg-Test zeigt das Cocarboxylase-tetrahydrat die volle Cocarboxylasewirksamkeit, so dass, besonders auch im Hinblick auf seinen günstigen pH-Wert, es für eine di rekte therapeutische Anwendung sehr geeignet ist.

Darüber hinaus besitzt Cocarboxylase-tetrahydrat, weil es kaum zur Hydrolyse neigt, eine wesentlich bessere Haltbarkeit als Cocarboxylase-hydrochlorid, welches das heutige Handelsprodukt für Cocarboxylase darstellt.

Aus dem erfindungsgemäss erhaltenen Cocarboxylasetetrahydrat lassen sich auf einfache Weise durch Umsatz mit wässrigen, alkoholischen, acetonischen oder andern Lösungen von Säuren in organischen Lösungsmitteln die entsprechenden Salze der Cocarboxylase in guten Ausbeuten herstellen. Die Salzbildung gelingt mit anorganischen und organischen Säuren.

Die Ausbeuten an Cocarboxylasesalzen, die durch Umsatz von kristallinem Cocarboxylase-tetrahydrat mit Säuren erhalten werden, sind wesentlich besser als die bei der Herstellung der Salze durch Umsatz von Säuren : mit wässriger Cocarboxylaselösung erzielten. Die aus dem Tetrahydrat der Cocarboxylase hergestellten Salze der Cocarboxylase sind analysenrein und brauchen nicht mehr umkristallisiert zu werden. Zweckmässigerweise arbeitet man so, dass man die Lösung einer Säure in einem organischen Lösungsmittel gegebenenfaIls bei Gegenwart von Wasser vorlegt und das Cocarboxylasetetrahydrat in kristalliner Form zugibt, hierauf abwartet, bis sich das gebildete Salz der Cocarboxylase ausgeschieden hat (was in der Regel nach wenigen Minuten der Fall ist) und anschliessend unter Anwendung der üblichen Methoden, z.

B. durch Absaugen oder Abfiltrieren, die gebildeten Cocarboxylasesalze abtrennt.

Auf diesem Weg wurden z. B. die folgenden Salze der Cocarboxylase hergestellt, von denen bisher nur das-Cocarboxylase-hydrochlorid bekannt war.

Cocarboxylase-hydrochlorid :
Zersetzungspunkt 240 Cocarboxylase-hydrobromid :
Zersetzungspunkt 246-248'
Cocarboxylase-hydrojodid :
Zersetzungspunkt 205-207
Cocarboxylase-nitrat : Zersetzungspunkt 208-210 Cocarboxylase-sulfat : Zersetzungspunkt 120 Cocarboxylase-sulfanilat : Zersetzungspunkt 228-230 Cocarboxylase-naphthalin-ss-sulfonat :
Zersetzungspunkt 198-200
Aus den Salzen der Cocarboxylase kann man das Cocarboxylase-tetrahydrat wieder zurückgewinnen, indem man die Salze der Cocarboxylase über einen geeigneten Ionenaustauscher, wie z. B. Amberlite) IR 45, IRA 400, IRA 401 oder IRA 410 laufen lässt.

Auf diese Weise kann das Cocarboxylase-tetrahydrat auch aus dem reinen Cocarboxylase-hydrochlorid hergestellt werden.

Nach Teruo Tanaka [vgl. Journal of the Pharma ceutical Society Japan, Bd. 76, S. 1314-1318 (1956), referiert in Chemical Abstracts, Bd. 51, S. 3607 (1957)] gelangt man zum Cocarboxylase-hydrochlorid, indem man das bei der Phosphorylierung von Vitamin-Bl mit Polyphosphorsäure erhaltene Gemisch nach mehr maligem Umfällen aus Wasser mit Athanol wieder in Wasser löst, mit NH40H auf pH 7 einstellt und über eine mit dem Dowex-1 X 8 -Austauscher gefüllte Säule laufen lässt.

Hierauf wird Aneurinorthophosphorsäureester, der als Nebenprodukt im Gemisch vorliegt, mit Wasser eluiert und anschliessend durch Eluieren mit 0, 005molarer wässriger HCl eine wässrige Lösung von Cocarboxylase-hydrochlorid erhalten, die einge- engt und durch Versetzen mit Athanol auf kristallisiertes Cocarboxylase-hydrochlorid aufgearbeitet wird. Diese Methode liefert, abgesehen von der schlechten Ausbeute, nur ein Cocarboxylase-hydrochlorid vom Zersetzungspunkt 215-216 . Dieses Cocarboxylase-hydrochlorid muss demnach noch einen erheblichen Prozent- satz an Verunreinigungen, wie z. B. Orthophosphorsäureester, enthalten.

Demgegenüber wird nach dem vor- liegenden Verfahren Cocarboxylase-hydrochlorid in wesentlich besserer Ausbeute und in höchster Reinheit erhalten (der Zersetzungspunkt des nach dem vorliegenden Verfahren gewonnenen Cocarboxylase-hydrochlorids liegt bei 240 ). Durch Umkristallisation aus wässrig-alkoholischer Lösung lässt sich Cocarboxylasehydrochlorid zwar etwas aufreinigen, aber man muss dabei grosse Ausbeuteverluste in Kauf nehmen, weil das Cocarboxylase-hydrochlorid durch Hydrolyse zu einem erheblichen Prozentsatz in das Orthophosphat bzw. Chlorid des Aneurinorthophosphorsäureesters übergeht.

Ahnliche Nachteile weisen die in den belgischen Patenten Nrn. 548 447 und 550 722 beschriebenen Verfahren zur Herstellung bzw. Reinigung von Cocarboxylase-hydrochlorid auf. Nach dem Verfahren des belgischen Patentes Nr. 548 477 wird das bei der Phosphorylierung von Vitamin Bi erhaltene Phosphorylierungsgemisch mit Hilfe eines Anionenaustauschers aufgetrennt und die Cocarboxylase enthaltende Eluatfraktion anschliessend mit Säuren zu den entsprechenden Salzen (angegeben ist lediglich Cocarboxylasehydrochlorid) umgesetzt. Verständlicherweise ist die dabei erzielte Ausbeute ausserordentlich gering, weil es sich nicht vermeiden lässt, dass sich Cocarboxylasehydrochlorid in wässrigem Medium stark hydrolytisch zersetzt. Es bildet sich z.

B. das Orthophosphat oder das Chlorid des Aneurin-orthophosphorsäureesters.

Dieses Verfahren ist deswegen wirtschaftlich uninteressant. Auch das im belgischen Patent Nr. 550 772 beschrieben, Reinigungsverfahren vermeidet diese Ka lamität nicht. Nach dem dort beschriebenen Verfahren wird Cocarboxylase-hydrochlorid ebenfalls durch Fäl- lung mit wäBriger Salzsäure aus wässriger Cocarboxylaselösung erhalten. Die hierbei auftretenden Nachteile sind dieselben wie oben beschrieben.

Demgegenüber bedeutet das erfindungsgemässe Verfahren einen wesentlichen technischen Fortschritt, weit es den Reinigungsprozess vom jeweiligen Salz der Cocarboxylase auf das Cocarboxylase-tetrahydrat verlegt und dadurch Umkristallisationen der aus dem Cocarboxylase-tetrahydrat hergestellten Salze überflüssig werden. Darüber hinaus ist das neue Cocarboxylasetetrahydrat selbst eine therapeutisch wichtige Anwendungsform der Cocarboxylase und bildet gleichzeitig die Schlüsselsubstanz für viele daraus herstellbare physiolo gisch interessante Salze der Cocarboxylase.

Beispiel 1
2 kg Vitamin B1 werden auf die übliche Weise phosphoryliert, die Phosphorylierungsschmelze in 6-8 Liter Wasser (+ Eis) unter starkem Rühren bei einer Temperatur unterhalb 10 gelöst, die wässrige Lösung in 100 Liter 96 % igen Alkohol eingerührt und über Nacht zum Absitzen stehengelassen. Das überstehende Lösungsmittel wird von einem ausgeschiedenen Sirup abdekantiert, letzterer in 4 Liter Wasser aufgenommen.

Die so erhaltene Lösung wird je nach der Menge der darin enthaltenen Phosphorsäure über 20-30 Liter eines schwach basischen Anionenaustauschers (beispielsweise ein sekundäres Amin auf Polyesterbasis, wie z. B. Amberlite IRA 45 , laufen gelassen. Anschliessend wird so lange mit Wasser nachgewaschen, bis das ablaufende Eluat keine Reaktion mehr auf Thiamin zeigt. Es fallen etwa 25 Liter einer Lösung an, die bei 30 und 12 Torr auf 6 Liter konzentriert werden. Der eingeengte Rückstand wird zur Trennung des Thiamin-orthophosphorsäureesters von dem Thiamin-pyrophosphorsäureester auf 20-30 Liter Kationenaustauscher ( Amberlite IRC 50 ) gegeben und mit Wasser nachgespült, bis das Eluat thiaminfrei ist.

Erhalten werden 70-80 Liter einer Lösung, die im Umlaufverdampfer bei 30 und 12 Torr auf 1, 5 Liter eingeengt wird. Zu dem Konzentrat werden langsam unter Rühren 7, 5 Liter 96 % iger Alkohol zugegeben.

Das Cocarboxylase-tetrahydrat scheidet sich in Form feiner Stäbchen aus. Die Ausbeute beträgt 530 g mit einem Schmelzpunkt von 220-225 unter Zersetzung (Sintern unter Wasserabgabe bei 140 ). Der Thiaminorthophosphorsäureester, der im Kationenaustauscher haftet, wird durch Auswaschen mit 10% iger Salzsäure abgelöst, die wässrige salzsaure Lösung (etwa 50 bis 60 Liter) auf 3 Liter bei 40-45 und 12 Torr eingedampft und der Rückstand mit der Sfachen Menge Alkohol gefällt. Es scheiden sich 1, 3 kg Thiaminorthophosphorsäureesterchlorid-hydrochlorid ab. Aus 2 kg Vitamin Bi entstehen demnach :
530 g Cocarboxylase-tetrahydrat und
1, 3 kg Thiamin-orthophosphorsäureesterchlorid- hydrochlorid.

Beispiel 2
2 kg Vitamin B1 werden wie im Beispiel 1 phosphoryliert, gelöst und das erhaltene Phosphorsäureester- gemisch durch Fällen mit Alkohol von der Hauptmenge Phosphorsäure befreit. Der Sirup wird in 5 Liter Wasser aufgenommen, die gesamte Menge Lösung auf einmal über 25 Liter eines stark basischen Austauschers (Permutit ES) gegeben, und mit Wasser nachgewaschen.

Es werden drei Fraktionen abgetrennt. Von pH 6, 6-6, 0 läuft im Eluat Thiamin-orthophosphorsäureester ab. Als zweite Fraktion folgt von pH 6, 6-5, 4 Cocarboxylasetetrahydrat, verunreinigt mit etwa 25-30% Thiamin orthophosphorsäureester. Zum Schluss wird eine Fraktion von pH 5, 4-2 erhalten, die praktisch reines Cocarboxylase-tetrahydrat enthält. Die erste Fraktion wird bei 12 Torr und 35 eingedampft und der Thiamin-orthophosphorsÏureester durch Fällung des Konzentrates mit Alkohol zur Kristallisation gebracht.

Aus der zweiten Fraktion werden auf die gleiche Weise 746 g eines Estergemisches auskristallisiert, das durch Lösen in 1, 5 Liter Wasser und unter Zusatz von 3, 5 Liter Alkohol umkristallisiert wird. An reinem Cocarboxylase-tetrahydrat werden 412 g erhalten. In der Mutterlauge ist der Thiamin-orthophosphorsäureester enthalten, der auf bekannte Weise isoliert wird. Durch Einengen der dritten Fraktion und Fällen mit Alkohol werden nochmals 81 g Cocarboxylase-tetrahydrat ge wonnen. Insgesamt ergibt dieser Ansatz :
493 g Cocarboxylase-tetrahydrat und
1, 0 kg Thiamin-orthophosphorsäureester.

Beispiel 3
Ein Gemisch von 20 g Thiamin-orthophosphorsäure- esterphosphat, 20 g Cocarboxylase-tetrahydrat und 20 g Orthophosphorsäure werden in 100 cm3 Wasser gelöst, über 300 cm3 eines schwach basischen Austauschers Merck II geschickt und mit Wasser nachgewaschen.

In der Hauptfraktion von pH 6, 7 bis 6, 3 fällt eine Lö sung an, die ein Gemisch des Thiamin-ortho-und -pyrophosphorsäureesters enthält (30 g), das nach Beispiel 2 aufgearbeitet wird. Im pH-Bereich von 6, 3 bis 4, 9 läuft ein Eluat ab, das reines Cocarboxylase-tetra- hydrat enthält und wie im Beispiel 2 isoliert wird (3 g).

Beispiel 4
Ein Gemisch nach Beispiel 3 wird mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers ( Amberlite IRA 410 oder Merck II ) von der Phosphorsäure befreit, mit Wasser nachgewaschen und das Eluat, das sowohl den Thiamin-orthophosphorsäureester als auch Cocarboxylase enthält, eingedampft. Das Konzentrat von etwa 200 cm3 läuft anschliessend über 250 cm3 eines stark basischen Austauschers ( Permutit ES), in dem die Trennung nach Beispiel 2 vorgenommen wird.

Beispiel 5 a) 10 g gemäss Beispiel 1 erhaltenen Cocarboxylasetetrahydrat werden in 25 cm3 5 % iger wÏ¯riger Salzsäure gelöst und unter R hren 75 cm3 Aceton einge- tropft. Das abgeschiedene Hydrochlorid der Cocarboxylase wird abgesaugt. Die Ausbeute beträgt 9, 5 g. Die Substanz schmilzt bei 240 unter Zersetzung.

Anstelle von wässriger Salzsäure kann vorteilhafte auch methanolische Salzsäure verwendet werden. Dabei geht das Tetrahydrat zunächst in Lösung und scheidet sich nach einigen Minuten als Chlorid in der gleichen Ausbeute und derselben Qualität wie aus der wässrigen Lösung aus. b) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in einer Mischung von 7 cm3 48% iger Bromwasserstoffsiiure und 18 cm3 Wasser gelöst und wie im Beispiel 6 mit Aceton gefällt. Es werden 9, 8 g Cocarboxylase-hydrobromid vom Schmelzpunkt 246-248 (unter Zersetzung) erhalten. c) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in 10 cm3 57% iger Jodwasserstoffsäure und 15 cm3 Wasser gelöst und wie im Beispiel 5 a) gefällt.

Es werden 10, 5 g Cocarboxylase-hydrojodid vom Schmelzpunkt 205 bis 207 (unter Zersetzung) erhalten. Diese Substanz enthält 1 Mol Kristallwasser. d) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in 10 cm3 25 iger Salpetersäure und 15 cm3 Wasser gelöst. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 5. Als Ausbeute werden 9, 5 g Cocarboxylasenitrat vom Schmelzpunkt 208-210 (unter Zersetzung) erhalten. Das Nitrat enthält 1 Mol Kristallwasser. e) 10 g Cocarboxylase-tetrahydrat löst man in 30 cm3 10 % iger Schwefelsäure und versetzt die Lösung wie im Beispiel 5 a) mit Aceton. Isoliert werden 10, 0 g Cocarboxylasesulfat vom Schmelzpunkt 120 (unter Zersetzung).

Das Sulfat enthält 1 Mol Kristallwasser. f) 5 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in einer Lösung von 2, 2 g Sulfanilsäure in 80 cm3 60-70 hei¯em Wasser gelöst, auf Zimmertemperatur abgekühlt und wie im Beispiel 5 a) mit Aceton gefällt. Die Ausbeute beträgt 6 g Cocarboxylase-sulfanilat vom Schmelzpunkt 228-230 (unter Zersetzung). g) 5 g Cocarboxylase-tetrahydrat werden in einer Lösung von 2, 5 g/NaphthaIinsulfonsäure in 300 cm3 Wasser gelöst und nach Beispiel 5 a) aufgearbeitet.

Es entstehen 6, 4 g Cocarboxylase-naphthalin-ss*sulfonat vom Schmelzpunkt 198-200 unter Zersetzung. Das Sulfonat enthält l Mol Kristallwasser.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des Tetrahydrates der Cocarboxylase, dadurch gekennzeichnet, dass man das bei der Phosphorylierung von Aneurin anfallende Gemisch aus OrthophosphorsÏure, Aneurin- (orthophos phorsäure)-ester, Cocarboxylase und Estern des Aneurins mit höheren Phosphorsäuren in Wasser löst, aus dieser Lösung mit Hilfe eines oder mehrerer Ionenaustauscher eine wässrige Lösung des Tetrahydrats der Cocarboxylase gewinnt und dieses daraus durch Ent fernung des als Lösungsmittel dienenden Wassers oder durch Zusatz eines niederen Alkohols oder von Aceton in kristalliner Form isoliert.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Phosphorylierungs- produkt vor seiner Behandlung mit den Ionenaustau- schern reinigt, indem man es in Wasser löst, aus der wässrigen Lösung mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, athanor, Propanol, Isopropanol oder Aceton, wieder ausfällt und diesen Prozess zwei-bis dreimal wiederholt.

2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteran- spruch 1, dadurch gekennzeichnet, da¯ man das gereinigte Phosphorylierungsprodukt in wenig Wasser l¯st, die Lösung über einen schwach basischen Anionenaustauscher laufen lässt und das bei pH 5, 5 bis 1 ablaufende Eluat abtrennt.

3. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Eluat aus dem schwach basischen Anionenaustauscher über einen stark basischen Anionenaustauscher laufen lässt und das bei pH 5, 5 bis 1 ablaufende Eluat abtrennt.

4. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Eluat aus dem schwach basischen Anionenaustauscher über einen Kationen- austauscher laufen lässt.

5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das gereinigte Phosphorylierungsprodukt in wenig Wasser löst, die Lösung über einen stark basischen Anionenaustau- scher laufen lässt und das bei pH 5, 5 bis 1 ablaufende Eluat abtrennt.

6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Cocarboxylase-tetra- hydrat durch Behandlung mit einer Säure in das entsprechende Cocarboxylasesalz überführt.