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Verfahren zur Herstellung des Tetrahydrats und von Salzen der Cocarboxylase
1937 isolierten K. Lohmann und Ph. Schuster das Coenzym der Cocarboxylase aus Hefe
in Form des Aneurin-pyrophosphorsäureesterchlorids. Nach X a rr er (vgl. »Lehrbuch
der organischen Chemie« von P. Karrer, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1948, S.
770) versteht man unter Cocarboxylase das innere Salz des Aneurinpyrophosphorsäureesters
(I)
Inzwischen hat es sich jedoch eingebürgert, mit Cocarboxylase das Aneurin-pyrophosphorsäureesterchlorid
(II)
zu bezeichnen, obwohl diese Verbindung besser mit Cocarboxylase-Hydrochlorid bezeichnet
werden sollte.
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Im folgenden wird mit »Cocarboxylase« deshalb das innere Salz des
Aneurin-pyrophosphorsäureesters (I) bezeichnet.
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Für die Herstellung des Cocarboxylase-Hydrochlorids sind mehrere
Verfahren bekannt.
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Stern und Hofer (vgl. »Science«, Bd. 85 [1937], S. 483) synthetisierten
die Verbindung durch Umsetzung von Aneurin mit POOl5. J. Weijlard und H. Tauber
(vgl. »Journal of the American Chemical Society«, Bd. 60 [1938], S.2263) setzten
Aneurin mit einem Gemisch von Natriumpyrophosphat und Orthophosphorsäure um, während
H. Weil-Malherbe (vgl. »Biochemical Journal«, Bd. 34 [1940], S. 980) das 5-Bromäthyl-thiazol-Analogon
des Aneurins mit Silberphosphat behandelten. In beiden Fällen wurde Cocarboxylase
als Silbersalz isoliert. Weijlard und Tauber zersetzten
dieses mit Schwefelwasserstoff
und isolierten Cocarboxylase-Hydrochlorid durch Behandlung mit Salzsäure.
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Weil-Malherbe führte die Reinigung mit Phosphorwolframsäure durch.
1946 verbesserten Karger und Viscontini (vgl. »Helvetica Chimica Acta«, Bd. 29 [1946],
S. 715) das Verfahren von Weijlard und Tauber.
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Neben den bisher genannten Publikationen existieren noch eine ganze
Reihe von deutschen (663 588, 704 172, 706 835, 708 514 und 729 905) und ausländischen
Patentschriften (vgl. die USA.-Patentschriften 2 188 323, 2224 174, 2 415 544, 2
435 750, die britischen Patentschriften 687 674, 687 673 und die französische Patentschrift
930 643), die sich alle mit der Herstellung oder Reinigung von Cocarboxylase-Hydrochlorid
befassen und im wesentlichen Verfahren betreffen, welche eine direkte Phosphorylierung
des Aneurins gestatten. Alle bisher bekannten Verfahren, auch die Phosphorylierung
mit Polyphosphorsäure, haben jedoch den Nachteil, daß die erzielten Ausbeuten an
reinem Cocarboxylase-Hydrochlond gering sind.
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Bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von Cocarboxylase-Hydrochlorid
werden in mehreren Fällen Ausbeuten zwischen 50 und 950/o der Theorie für Cocarboxylase-Hydrochlorid
angegeben (vergleiche z. B. USA.-Patentschrift 2 435 750, deutsche Patentschrift
708 514 und »Helvetica Chimica Acta«, Bd. 32 [1949], S. 1478 bis 1484). Diese Ausbeuten
lassen sich jedoch nicht reproduzieren. Das ist darauf zurückzuführen, daß man erst
in jüngster Zeit mit speziell entwickelten papierchromatographischen Methoden feststellen
konnte, daß nach den bekannten Verfahren zur Phosphorylierung von Thiamin-Hydrochlorid
mit hochkonzentrierter Orthophosphorsäure
ein Gemisch verschiedener
Phosphorsäureester des Thiamins und nicht ausschließlich reiner Thiaminpyrophosphorsäureester
(»Cocarboxylase«) erhalten wird. Insbesondere haben H. Grunze und E. Thilo (»Die
Papierchromatografie der kondensierten Phosphate«, Akademie-Verlag, Berlin, 1955)
nachgewiesen, daß hochkonzentrierte Orthophosphorsäure aus einem Gemisch von Ortho-,
Pyro-, Tri- und geringen Mengen höherer Polyphosphorsäuren besteht. Das bei der
Phosphorylierung von Thiamin-Hydrochlorid mit hochkonzentrierter Orthophosphorsäure
erhaltene Gemisch verschiedener Thiaminphosphorsäureester entspricht im günstigsten
Falle dem für die Phosphorylierung verwendeten Gemisch der verschiedenen Phosphorsäuren.
Da die hochkonzentrierte Orthophosphorsäure nur zu etwa 2501o aus Pyrophosphorsäure
besteht, kann Cocarboxylase-Hydrochlorid theoretisch nur in einer Ausbeute von höchstens
250/o entstehen. Diese Ausbeute könnte höchstens dann gesteigert werden, wenn es
gelänge, einen der anfallenden höheren Thiamin-polyphosphorsäureester partiell zu
hydrolysieren, ohne dabei gleichzeitig die vorhandene Cocarboxylase selbst weiter
abzubauen. Dies ist bisher aber nicht gelungen. Insbesondere ist es nach den bekannten
Verfahren nicht möglich - wie eigene papierchromatographische Untersuchungen eindeutig
zeigen -, Cocarboxylase-Hydrochlorid aus den erhaltenen Thiamin-Phosphorylierungs-Gemischen
in reiner Form ohne stärkste Ausbeuteverluste zu isolieren.
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Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein einfaches,
wirtschaftliches, technisch durchführbares und gute Ausbeuten lieferndes Verfahren
zur Herstellung von Cocarboxylasesalzen zu finden.
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Die Erfindung gründet sich auf der Erkenntnis, daß die Hauptschwierigkeit
bei der Isolierung der Cocarboxylase bzw. ihrer Salze aus den bei der Phosphorylierung
von Aneurin entstehenden Gemischen in der Abtrennung stets vorhandenen Aneurin-orthophosphorsäureesters
liegt und daß es dabei wesentlich ist, die Gefahr einer Hydrolyse der Cocarboxylase
zu Aneurin-orthophosphorsäureester durch entsprechend gewählte Bedingungen möglichst
zu vermeiden. Es hat sich ferner als zweckmäßig erwiesen, die bei der Phosphorylierung
angewendete oder gebildete überschüssige Orthophosphorsäure möglichst schon vor
der eigentlichen Auftrennung des Aneurin-Phosphorsäureester-Gemisches abzutrennen.
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Zur Abtrennung der Hauptmenge an Orthophosphorsäure kann man das
Phosphorylierungsgemisch entweder aus wäßriger Lösung mit Hilfe geeigneter organischer
Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder Aceton, wieder
ausfällen und diesen Prozeß einige Male wiederholen, und/oder man kann das Gemisch
über einen schwach basischen Anionenaustauscher z. B. von Typ Amberlite IR4 410
oder Amberlite IR 45 laufen lassen. Bis auf geringe Spuren bleibt bei diesem Prozeß
die Orthophosphorsäure im schwach basischen Anionenaustauscher hängen, und beim
Eluieren mit Wasser kann dann eine Trennung des ablaufenden Phosphorsäureestergemisches
erreicht werden. Bei einem pH von 6,5 bis 5,5 läuft eine wäßrige Lösung des Aneurin-orthophosphorsäureesters
ab. Bei pB-Werten zwischen 5,5 und 1 ist im Eluat in der Hauptsache Cocarboxylase
enthalten, die mit abnehmendem p-Wert stärker mit Phosphorsäure vermischt ist.
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Eine bessere Trennung kann man erreichen, wenn man die aus dem schwach
basischen Anionenaustauscher ablaufende Lösung über einen stark basischen Anionenaustauscher
z. B. des Typs Permutit ES oder Amberlite IRA 400 leitet. Durch Aufteilung des Eluats
in die oben angegebenen p-Fraktionen erreicht man eine bessere Trennung als bei
Anwendung eines schwach basischen
Austauschers. Noch einfacher kann man den Trennungsprozeß
gestalten, wenn man nach der Hydrolyse des im Gemisch enthaltenen Aneurin-triphosphorsäureesters
die Phosphorsäure mit einem schwach basischen Anionenaustauscher entfernt und die
aus diesem Austauscher ablaufende Lösung über einen Kationenaustauscher, wie z.
B. AmberliteIRC50, IR100, IR 105 oder IR120, laufen läßt, da solche Kationenaustauscher
den Aneurinorthophosphorsäureester festhalten und die freie Cocarboxylase durchlaufen
lassen.
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Es wurde gefunden, daß man sowohl aus dem Eluat eines Kationenaustauschers
bzw. aus den Eluatfraktionen vom pEs-Wert 5,5 bis 1 von Anionenaustauschern durch
Eindampfen der wäßrigen Lösung ein kristallines Cocarboxylase-Tetrahydrat gewinnen
kann. Diese bisher nicht beschriebene Substanz besitzt einen Zersetzungspunkt von
220 bis 2250 C (bei etwa 1400 C Aufblähen unter Wasserabgabe) und läßt sich aus
wäßriger Lösung nach Zusatz von niederen Alkoholen oder Aceton oder sonstigen geeigneten
organischen Lösungsmitteln umkristallisieren.
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Der prrWert einer 50/0eigen wäßrigen Lösung von Cocarboxylase-Tetrahydrat
liegt bei 20° C bei 3,0 (gemessen an einer Gaselektrode). Da das Cocarboxylase-Tetrahydrat
in wäßriger Lösung nur schwach sauer reagiert, tritt eine Spaltung zu Aneurin-orthophosphorsäureester
praktisch nicht ein. Man kann deshalb Cocarboxylase-Tetrahydrat beliebig oft aus
wäßriger Lösung umkristallisieren und die Substanz in höchster Reinheit gewinnen,
ohne daß wesentliche Verluste durch Hydrolyse eintreten. Im Warburg-Test zeigt das
Cocarboxylase-Tetrahydrat die volle Cocarboxylasewirksamkeit, so daß, besonders
auch im Hinblick auf seinen günstigen p-Wert, es für eine direkte therapeutische
Anwendung sehr geeignet ist.
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Darüber hinaus besitzt Cocarboxylase-Tetrahydrat, weil es kaum zur
Hydrolyse neigt, eine wesentlich bessere Haltbarkeit als Cocarboxylase-Hydrochlorid,
welches das heutige Handelsprodukt für Cocarboxylase darstellt.
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Aus dem Cocarboxylase-Tetrahydrat lassen sich auf einfache Weise
durch Umsetzung mit wäßrigen, alkoholischen, acetonischen oder anderen Lösungen
von Säuren in organischen Lösungsmitteln die entsprechenden Salze oder Cocarboxylase
in guten Ausbeuten herstellen.
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Die Salzbildung gelingt mit anorganischen und organischen Säuren.
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Die Ausbeuten an Cocarboxylasesalzen, die durch Umsetzung von kristallinem
Cocarboxylase-Tetrahydrat mit Säuren erhalten werden, sind wesentlich besser als
die bei der Herstellung der Salze durch Umsetzung von Säuren mit wäßriger Cocarboxylaselösung
erzielten. Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Salze
der Cocarboxylase sind analysenrein und brauchen nicht mehr umkristallisiert zu
werden. Zweckmäßig legt man die Lösung einer Säure in einem organischen Lösungsmittel
gegebenenfalls in Gegenwart von Wasser vor und gibt das Cocarboxylase-Tetrahydrat
in kristalliner Form zu. Nach Ausscheidung des gebildeten Salzes der Cocarboxylase
(was in der Regel nach wenigen Minuten der Fall ist) trennt man unter Anwendung
der üblichen Methoden, z. B. durch Absaugen oder Abfiltrieren die gebildeten Cocarboxylasesalze,
ab.
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Auf diesem Wege wurden die folgenden Salze der Cocarboxylase hergestellt,
von denen bisher nur das Cocarboxylase-Hydrochlorid bekannt war.
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Cocarboxylase-Hydrochlorid .... Zersetzungspunkt 240"C Cocarboxylase-Hydrobromid
Zersetzungspunkt 246 bis 248"C Cocarboxylase-Hydrojodid Zersetzungspunkt 205 bis
207"C
Cocarboxylasenitrat Zersetzungspunkt 208 bis 210"C Cocarboxylasesulfat
Zersetzungspunkt 120"C Cocarboxylasesulfanilat ....... Zersetzungspunkt 228 bis
230"C Cocarboxylasenaphthalin-ß-sulfonat . Zersetzungspunkt 198 bis 200"C Umgekehrt
kann man das Cocarboxylase-Tetrahydrat auch gewinnen, indem man Salze der Cocarboxylase
über einen geeigneten Ionenaustauscher wie Permutit ES, Amberlite IR 45, IRA 400,
IRA 401 oder IRA 410 laufen läßt. Auf diese Weise wurde das Cocarboxylase-Tetrahydrat
z. B. aus Cocarboxylase-Hydrochlorid hergestellt.
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Nach Teruo Tan asa (vgl. »Journal of the Pharmaceutical Society Japan«,
Bd. 76 [1956], S. 1314 bis 1318, referiert in »Chemical Abstracts«, Brd. 51 [1957],
S. 3607) gelangt man zum Cocarboxylase-Hydrochlorid, indem man das bei der Phosphorylierung
von Vitamin B1 mit Polyphosphorsäure erhaltene Gemisch nach mehrmaligem Umfällen
aus Wasser mit Äthanol wieder in Wasser löst, mit N H4 OH auf pH 7 einstellt und
über eine mit dem »Dowex-l X8«-Austauscher gefüllte Säule laufen läßt.
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Hierauf wird Aneurin-orthophosphorsäureester, der als Nebenprodukt
im Gemisch vorliegt, mit Wasser eluiert und anschließend durch Eluieren mit 0,005molarer
wäßriger HC1 eine wäßrige Lösung von Cocarboxylase-Hydrochlorid erhalten, die eingeengt
und durch Versetzen mit Äthanol auf kristallisiertes Cocarboxylase-Hydrochlorid
aufgearbeitet wird. Diese Methode liefert, abgesehen von der schlechten Ausbeute,
nur ein Cocarboxylase - Hydrochlorid vom Zersetzungspunkt 215 bis 216"C. Dieses
Cocarboxylase-Hydrochlorid muß demnach noch einen erheblichen Prozentsatz an Verunreinigungen,
wie Orthophosphorsäureester, enthalten. Demgegenüber wird nach dem vorliegenden
Verfahren Cocarboxylase-Hydrochlorid in wesentlich besserer Ausbeute und in höchster
Reinheit erhalten (der Zersetzungspunkt des nach dem vorliegenden Verfahren gewonnenen
Cocarboxylase -Hydrochlorids liegt bei 240° C) . Durch Umkristallisation aus wäßrig-alkoholischer
Lösung läßt sich Cocarboxylase-Hydrochlorid zwar etwas reinigen, man muß dabei jedoch
große Ausbeuteverluste in Kauf nehmen, weil das Cocarboxylase-Hydrochlorid durch
Hydrolyse zu einem erheblichen Prozentsatz in das Orthophosphat bzw. des Aneurin
- orthophosphorsäureesters übergeht.
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Ähnliche Nachteile weisen die in den belgischen Patentschriften 548
447 und 550 722 beschriebenen Verfahren zur Herstellung bzw. Reinigung von Cocarboxylase-Hydrochlorid
auf. Nach dem Verfahren gemäß der belgischen Patentschrift 548447 wird das bei der
Phosphorylierung von Vitamin B1 erhaltene Phosphorylierungsgemisch mit Hilfe eines
Anionenaustauschers aufgetrennt und die Cocarboxylase enthaltende Eluatfraktion
anschließend mit Säuren zu den entsprechenden Salzen (angegeben ist lediglich Cocarboxylase-Hydrochlorid)
umgesetzt. Verständlicherweise ist die dabei erzielte Ausbeute außerordentlich gering,
weil es sich nicht vermeiden läßt, daß sichCocarboxylase-Hydrochlorid in wäßrigem
Medium stark hydrolytisch zersetzt. Es bildet sich z. B. das Orthophosphat oder
das Chlorid des Aneurin-orthophosphorsäureesters. Dieses Verfahren ist deswegen
wirtschaftlich uninteressant. Auch das in der belgischen Patentschrift 550 722 beschriebene
Reinigungs verfahren vermeidet diese Kalamität nicht. Nach dem dort beschriebenen
Verfahren wird Cocarboxylase-Hydrochlorid ebenfalls durch Fällung mit wäßriger Salzsäure
aus wäßriger Cocarboxylaselösung erhalten. Die hierbei auftretenden Nachteile sind
dieselben wie oben beschrieben.
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Demgegenüber bedeutet das vorliegende Verfahren einen wesentlichen
technischen Fortschritt, weil es den Reinigungsprozeß vom jeweiligen Salz der Cocarboxylase
auf das Cocarboxylase-Tetrahydrat verlegt und dadurch Umkristallisationen der aus
dem Cocarboxylase-Tetrahydrat hergestellten Salze überflüssig werden. Darüber hinaus
ist das neue Cocarboxylase-Tetrahydrat selbst eine therapeutisch wichtige Anwendungsform
der Cocarboxylase und bildet gleichzeitig die Schlüsselsubstanz für viele daraus
herstellbare physiologisch wirksame Salze der Cocarboxylase.
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Beispiel 1 2 kg Vitamin B1 werden auf die übliche Weise phosphoryliert,
die Phosphorylierungsschmelze in 6 bis 81 Eiswasser unter starkem Rühren bei einer
Temperatur unterhalb 10°C gelöst, die wäßrige Lösung in 1001 96 0igen Alkohol eingerührt
und über Nacht zum Absitzen stehengelassen. Das überstehende Lösungsmittel wird
von einem ausgeschiedenen Sirup abdekantiert, letzterer in 41 Wasser aufgenommen.
Die so erhaltene Lösung wird je nach der Menge der darin enthaltenen Phosphorsäure
über 20 bis 301 Amberlite IRA 45 laufen gelassen. Anschließend wird so lange mit
Wasser nachgewaschen, bis das ablaufende Eluat keine Reaktion mehr auf Thiamin zeigt.
Es fallen etwa 251 einer Lösung an, die bei 30"C und 12 Torr auf 6 1 konzentriert
werden.
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Der eingeengte Rückstand wird zur Trennung des Thiamin-orthophosphorsäureesters
von dem Thiaminpyrophosphorsäureester auf 20 bis 301Amberlite IRC 50 gegeben und
mit Wasser nachgespült, bis das Eluat thiaminfrei ist. Es werden 70 bis 80 1 einer
Lösung erhalten. die im Umlaufverdampfer bei 30"C und 12 Torr auf 1,51 eingeengt
wird. Zu dem Konzentrat werden langsam unter Rühren 7,51 96 0!0iger Alkohol zugegeben.
Das Cocarboxylase-Tetrahydrat scheidet sich in Form feiner Stäbchen aus. Die Ausbeute
beträgt 530 g eines Produktes mit einem Schmelzpunkt von 220 bis 225"C unter Zersetzung
(Sintern unter Wasserabgabe bei 140°C). Der Thiamin-orthophosphorsäureester, der
im Kationenaustauscher haftet, wird durch Auswaschen mit 10 obiger Salzsäure abgelöst,
die wäßrige salzsaure Lösung (etwa 50 bis 60 1) auf 3 1 bei 40 bis 45"C und 12 Torr
eingedampft und der Rückstand mit der 5fachen Menge Alkohol gefällt.
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Es scheiden sich 1,3 kg Thiamin-orthophosphorsäureesterchlorid-Hydrochlorid
ab. Aus 2 kg Vitamin B1 entstehen demnach: 530 g Cocarboxylase-Tetrahydrat und 1,3
kg Thiamin - orthophosphorsäureesterchlorid - Hydrochlorid.
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Das Cocarboxylase-Tetrahydrat besitzt das UR-Spektrum I (gemessen
in KBr).
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Beispiel 2 2 kg Vitamin B1 werden wie im Beispiel 1 phosphoryliert,
gelöst und das erhaltene Phosphorsäureestergemisch durch Fällen mit Alkohol von
der Hauptmenge Phosphorsäure befreit. Der Sirup wird in 5 1 Wasser aufgenommen,
die gesamte Lösung auf einmal über 25 1 des stark basischen Austauschers Permutit
ES gegeben und mit Wasser nachgewaschen. Es werden drei Fraktionen abgetrennt. Vom
pn-Wert 6,6 bis 6,0 läuft im Aluat Thiamin-orthophosphorsäureester ab. Als zweite
Fraktion folgt vom pH-Wert 6,0 bis 5,4 Cocarboxylase-Tetrahydrat verunreinigt mit
etwa 25 bis 300/o Thiamin-orthophosphorsäureester. Zum Schluß wird eine Fraktion
vom pH-Wert 5,4 bis 2 erhalten, die praktisch reines Cocarboxylase-Tetrahydrat enthält.
Die erste Fraktion wird bei 12 Torr und 35"C eingedampft und der Thiamin-orthophosphorsäureester
durch Fällung des Konzentrats mit Alkohol zur Kristallisation gebracht. Aus der
zweiten Fraktion
werden auf die gleiche Weise 746 g eines Estergemisches
auskristallisiert, das durch Lösen in 1,5 1 Wasser und unter Zusatz von 3,51 Alkohol
umkristallisiert wird. An reinem Cocarboxylase-Tetrahydrat werden 412 g erhalten.
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In der Mutterlauge ist der Thiamin-orthophosphorsäureester enthalten,
der auf bekannte Weise isoliert wird.
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Durch Einengen der dritten Fraktion und Fällen mit Alkohol werden
nochmals 81 g Cocarboxylase-Tetrahydrat gewonnen.
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Insgesamt ergibt dieser Ansatz 493 g Cocarboxylase-Tetrahydrat und
1,0 kg Thiamin-orthophosphorsäureester.
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Beispiel 3 Ein Gemisch von 20 g Thiamin-orthophosphorsäureesterphosphat
(hergestellt nach 0. Zima, G. Göttmann, A. Hoffmann, L. Hepding, R. Hotovy: »E.
Merckes Jahresberichte«, Bd. 67, S. 1 ff. [1953]), 20 g Cocarboxylase-Tetrahydrat
und 20 g Orthophosphorsäure werden in 100 ccm Wasser gelöst, über 300 ccm eines
schwach basischen Austauschers Merck II geschickt und mit Wasser nachgewaschen.
In der Hauptfraktion vom pe-Wert 6,7 bis 6,3 fällt eine Lösung an, die ein Gemisch
des Thiamin-ortho- und -pyrophosphorsäureesters enthält (30 g), das nach Beispiel
2 aufgearbeitet wird. Im p-Bereich von 6,3 bis 4,9 läuft ein Eluat ab, das reines
Cocarboxylase-Tetrahydrat enthält und wie im Beispiel 2 isoliert wird (3 g).
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Beispiel 4 Ein Gemisch nach Beispiel 3 wird mit Hilfe der schwach
basischen Ionenaustauscher Amberlite IRA 410 bzw.
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Merck II von der Phosphorsäure befreit, mit Wasser nachgewaschen und
das Eluat, das sowohl den Thiamin-orthophosphorsäureester als auch Cocarboxylase
enthält, eingedampft. Das Konzentrat von etwa 200 ccm läuft anschließend über 250
ccm des stark basischen Austauschers Permutit ES, in dem die Trennung nach Beispiel
2 vorgenommen wird.
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Beispiel 5 298 g Cocarboxylase-Hydrochlorid werden in 21 Wasser gelöst,
über 2,5 1 mit Orthophosphorsäure beladenen und auf einen pn-Wert von 4,5 eingestellten
Anionenaustauscher Permutit ES gegeben. Es wird mit Wasser nachgewaschen, bis der
Ablauf thiaminfrei ist. Das Eluat wird bei 30"C und 12 Torr eingeengt und mit der
2,5-fachen Menge Aceton gefällt. Die Ausbeute beträgt 292 g Cocarboxylase-Tetrahydrat.
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Beispiel 6 10 g Cocarboxylase-Tetrahydrat werden in 25 ccm 5 0/»iger
wäßriger Salzsäure gelöst und unter Rühren 75 ccm Aceton eingetropft. Das abgeschiedene
Hydrochlorid der Cocarboxylase wird abgesaugt. Die Ausbeute beträgt 9,5 g. Die Substanz
schmilzt bei 240"C unter Zersetzung.
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An Stelle von wäßriger Salzsäure kann vorteilhafter methanolische
Salzsäure verwendet werden. Dabei geht das Tetrahydrat zunächst in Lösung und scheidet
sich nach einigen Minuten als Chlorid in der gleichen Ausbeute und derselben Reinheit
wie aus der wäßrigen Lösung aus.
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Cocarboxylase-Hydrochlorid besitzt das UR-Spektrum II (gemessen in
KBr).
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Beispiel 7 10 g Cocarboxylase-Tetrahydrat werden in einer Mischung
von 7 ccm 48 zeiger Bromwasserstoffsäure und 18 ccm Wasser gelöst und wie im Beispiel
6 mit Aceton gefällt. Es werden 9,8 g Cocarboxylase-Hydrobromid vom
Schmelzpunkt
246 bis 248"C (unter Zersetzung) erhalten.
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Cocarboxylase-Hydrobromidbesitzt das UR-SpektrumIII (gemessen in KBr).
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Beispiel 8 10 g Cocarboxylase-Tetrahydrat werden in 10 ccm 57°/Oiger
Jodwasserstoffsäure und 15 ccm Wasser gelöst und wie im Beispiel 6 gefällt. Es werden
10,5 g Cocarboxylase-Hydrojodid vom Schmelzpunkt 205 bis 207"C (unter Zersetzung)
erhalten. Diese Substanz enthält 1 Mol Kristallwasser.
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Cocarboxylase-Hydroj odid besitzt das UR-Spektrum IV (gemessen in
KBr).
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Beispiel 9 10 g Cocarboxylase-Tetrahydrat werden in 10 ccm 250/,iger
Salpetersäure und 15 ccm Wasser gelöst. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 6.
Als Ausbeute werden 9,5 g Cocarboxylasenitrat vom Schmelzpunkt 208 bis 210"C (unter
Zersetzung) erhalten. Das Nitrat enthält 1 Mol Kristallwasser.
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Cocarboxylasenitrat besitzt das UR-Spektrum V (gemessen in KBr).
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Beispiel 10 10 g Cocarboxylase-Tetrahydrat löst man in 30 ccm 10
obiger Schwefelsäure und versetzt die Lösung wie im Beispiel 6 mit Aceton. Isoliert
werden 10,0 g Cocarboxylasesulfat vom Schmelzpunkt 120"C (unter Zersetzung). Das
Sulfat enthält 1 Mol Kristallwasser.
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Cocarboxylasesulfat besitzt das UR-Spektrum VI (gemessen in KBr).
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Beispiel 11 5 g Cocarboxylase-Tetrahydrat werden in einer Lösung
von 2,2 g Sulfanilsäure in 80 ccm 60 bis 70"C heißem Wasser gelöst, auf Zimmertemperatur
abgekühlt und wie im Beispiel 6 mit Aceton gefällt. Die Ausbeute beträgt 6 g Cocarboxylasesulfanilat
vom Schmelzpunkt 228 bis 230"C (unter Zersetzung).
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Cocarboxylasesulfanilat besitzt das UR-Spektrum VII (gemessen in
KBr).
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Beispiel 12 5 g Cocarboxylase-Tetrahydrat werden in einer Lösung
von 2,5 g ß-Naphthalinsulfonsäure in 30 ccm Wasser gelöst und nach Beispiel 6 aufgearbeitet.
Es entstehen 6,4 g Cocarboxylase-naphthalin-ß-sulfonat vom Schmelzpunkt 198 bis
200"C unter Zersetzung. Das Sulfonat enthält 1 Mol Kristallwasser.