CN113912508A - 一种从发酵液中分离纯化5-氨基乙酰丙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中分离纯化5‑氨基乙酰丙酸的方法,包括以下步骤:(1)将含有5‑氨基乙酰丙酸的发酵液的pH值调至3.5‑4.0,高温杀菌,然后进行陶瓷膜过滤,收集滤液;(2)将滤液直接进柱,正洗、反洗;(3)用氨水进行解析并收集洗脱液,当洗脱液pH为5‑7时收集为高流,并将高流的pH调节至2.5‑3.0;(4)将高流进行脱色、浓缩、结晶、离心、干燥,得到5‑氨基乙酰丙酸粗品;(5)将粗品用浓盐酸溶解,向溶解后的5‑氨基乙酰丙酸粗品溶液中加入无水乙醇进行再结晶,然后离心、干燥,得到5‑氨基乙酰丙酸精品。本发明的分离纯化5‑氨基乙酰丙酸的方法可以实现工业化生产,而且,5‑氨基乙酰丙酸的收率和纯度都了显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,具体涉及一种从发酵液中分离纯化5-氨基乙酰丙酸的方法。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)为一种氨基酮酸类化合物,可以作为生物合成卟啉、血红素、VB12等四吡咯类化合物的中间体,在农业和医药等领域有着极大的应用价值。在农业上,ALA可用作除草剂、杀虫剂、植物生长调节剂等;在医药上,ALA作为新一代光动力学药物可用于癌症治疗、肿瘤诊断、皮肤病的治疗等。
ALA广阔的应用前景引起了人们开发利用的浓厚兴趣。ALA的生产方法包括化学合成法和生物发酵法。和化学合成法相比,生物发酵法生产ALA的操作简单,成本低,且适应绿色化工和可持续发展的需要。目前采用重组大肠杆菌发酵法已经能够大幅提高发酵液中ALA的积累量,但由于ALA的理化性质很不稳定,固体状态下易吸潮,液体状态下易发生缩合反应,温度、pH等均会影响ALA的稳定性,这些性质给ALA的分离纯化带来了一定的困难。目前从发酵液中分离纯化ALA的研究却相对较少。
Okada等人使用阳离子交换树脂吸附5-氨基乙酰丙酸粗溶液中的5-氨基乙酰丙酸,然后用含有铵离子的水溶液洗脱,采用洗脱液的电导率或者pH的变化作为指标来指示回收起点和终点,将所得的5-氨基乙酰丙酸水溶液与氯离子溶液混合,生成5-氨基乙酰丙酸的盐酸盐。将ALA·HCl粗溶液蒸发浓缩或者二次经离子交换柱洗脱,提高产物浓度。将醇、酮等有机溶剂加入到浓缩液中,5-氨基乙酰丙酸盐酸盐析出,抽滤、烘干得到晶体,所得的5-氨基乙酰丙酸的纯度大于98%。
浙江大学的于晓采用离子交换法从重组大肠杆菌发酵液中分离提取ALA·HCl,其采用活性炭粉末HC-772对大肠杆菌发酵液进行脱色,脱色液上阳离子交换柱后用盐酸洗脱,优化离子交换工艺,采用离子交换柱对优化后的工艺进行放大,初步分离纯化所得的洗脱液中ALA的纯度为33.73%,回收率为71.93%。对洗脱液进行冷冻干燥得到ALA粗品。粗品经过乙醇洗杂,除去大部分可溶性杂质,对乙醇不溶物采用甲醇溶解,乙醚沉淀的方法进行精制,获得ALA产品,其纯度为90.16%。
浙江大学的张露露研究了发酵液中ALA的粗分离工艺,其采用中空纤维超滤膜组件处理带菌的发酵液,超滤过程ALA的回收率为86.5%,脱色率为54.4%;超滤透过液用反渗透的方法除水浓缩,收率为93.2%;采用优化后的工艺对反渗透浓缩液进行萃取-反萃取,ALA的总收率为79.8%。并探索了5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的精制纯化工艺,65℃下对反萃水相真空旋转蒸发浓缩,产品回收率为99.2%;浓缩液冷却结晶,一级结晶的收率为53.6%,两级结晶的总收率为80.1%;所得白色针状晶体中ALA·HCl的实际纯度为99.5%,重组大肠杆菌发酵液经膜分离、反应萃取和浓缩结晶后,ALA·HCl的总收率为50.8%。
上述ALA的分离纯化方法虽然各步骤有所差异,但普遍存在分离过程复杂、规模放大困难、不适宜工业化生产等问题。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的是提供一种从发酵液中分离纯化5-氨基乙酰丙酸的方法。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种从发酵液中分离纯化5-氨基乙酰丙酸的方法,包括以下步骤:
(1)将含有5-氨基乙酰丙酸的发酵液的pH值调至3.5-4.0,高温杀菌,然后进行陶瓷膜过滤,收集滤液,滤液用纯水进行稀释,稀释至滤液中的5-氨基乙酰丙酸浓度<1g/L;
(2)将稀释后的滤液直接进柱,当柱出口的pH为3.5-4.0时结束进料,树脂饱和吸附后,用1-1.5BV纯水正顶,再用纯水反洗,冲至溶液澄清,pH为5-6;
(3)用氨水进行解析并收集洗脱液,当洗脱液pH为5-7时收集为高流,并将高流的pH调节至2.5-3.0;当洗脱液pH为7-11时收集为后流,将后流的pH调节至3.5-4.0,重新进柱;
(4)将高流进行脱色、浓缩、结晶、离心、干燥,得到5-氨基乙酰丙酸粗品;
(5)将5-氨基乙酰丙酸粗品用浓盐酸溶解,向溶解后的5-氨基乙酰丙酸粗品溶液中加入无水乙醇进行再结晶,然后离心、干燥,得到5-氨基乙酰丙酸精品。
优选的,步骤(1)中,在70-80℃温度条件下进行高温灭菌。
优选的,步骤(1)中,所述陶瓷膜的孔径为100nm,压力0.5MPa。
优选的,步骤(2)中,进料流速为1BV/h。
优选的,步骤(3)中,氨水的浓度为1mol/L,流速为1BV/h。
优选的,步骤(4)中,采用活性炭进行脱色,脱色条件为:向高流中加入活性炭,活性炭的加入量为高流重量的1-2%,升温至60℃,脱色30min。
优选的,步骤(4)中,所述结晶具体为:向浓缩液加入3倍体积95%乙醇,降至8℃结晶。
本发明的有益效果:
本发明将陶瓷膜过滤、柱纯化、脱色、结晶、酸溶后再结晶等技术手段有机的结合在一起,将5-氨基乙酰丙酸从发酵液中分离纯化出来。本发明的分离纯化5-氨基乙酰丙酸的方法可以实现工业化生产,而且,5-氨基乙酰丙酸的收率和纯度都了显著提高。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语说明:
本发明中所用的“纯水”,未标明其他要求时,均符合GB 6682-2008中要求的化验室用水。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料,如无特殊说明,均可通过商业渠道购买得到。
本发明的方法可以适用于任意菌株发酵生产得到的含有5-氨基乙酰丙酸的发酵液的分离纯化。其中,本发明实施例和对比例中所使用的“含有5-氨基乙酰丙酸的发酵液”,其是以重组大肠杆菌为发酵菌,在同一发酵罐中进行发酵生产,放罐后的发酵液。发酵液中5-氨基乙酰丙酸的浓度为5g/L。
实施例1:从发酵液中分离纯化5-氨基乙酰丙酸
具体步骤如下:
(1)含有5-氨基乙酰丙酸的发酵液用磷酸调节pH3.8,然后70℃高温杀菌后,进行陶瓷膜过滤,陶瓷膜的孔径为100nm,压力0.5MPa,收集陶清液(即滤液)。向陶清液加入纯水进行稀释,稀释至陶清液中5-ALA浓度<1g/L。
(2)进柱:稀释后的陶清液直接进柱(离子交换树脂,型号001×8),进柱时注意使树脂饱和吸附,陶清液pH一般为4.0左右,控制柱出口pH4.0结束进料。流速为1BV/h。
(3)正洗:树脂饱和吸附后,用1.5倍纯水正顶。
(4)反洗:用纯水冲至溶液澄清,pH5-6。
(5)解析:用1mol/L氨水解析,流速1BV/h。当pH5-7时收集为高流,并及时用磷酸调pH2.5。当pH7-11时收集为后流,并及时用磷酸调pH4.0。后流下一批进柱用。
(6)脱色:向高流加入活性炭,活性炭的加入量为高流重量的1%,升温至60℃,脱色30min,过滤。
(7)浓缩:脱色液采用旋蒸法浓缩至5-ALA的浓度为600-650g/L。
(8)一次结晶:浓缩液加入3倍体积95%乙醇,降至8℃结晶。
(9)离心:4000r/min离心,至没有母液流出为止,分离得到湿品晶体,并用2倍湿品晶体体积的95%乙醇洗晶。洗晶后的乙醇回收利用。
(10)干燥:湿品晶体置于烘箱中60℃烘干,水分<1%,得到5-氨基乙酰丙酸粗品。
(11)酸溶:称取3000g的5-氨基乙酰丙酸粗品,加入1300ml浓盐酸,70-80℃加热溶解,务必使其全部溶解。
(12)二次结晶:加入3倍体积酸溶液的无水乙醇,降至8℃结晶。
(13)离心:4000r/min离心,至没有母液流出为止,分离得到湿品晶体,并用2.5倍湿品晶体体积的无水乙醇洗晶。洗晶后的乙醇回收利用。
(14)干燥:湿品晶体置于烘箱中60℃烘干,水分<1%,得到精品5-氨基乙酰丙酸。其为白色结晶性粉末,干燥失重≤1.0%。
对比例1:
(1)含有5-氨基乙酰丙酸的发酵液用磷酸调节pH3.8,然后70℃高温杀菌后,进行陶瓷膜过滤,收集陶清液,向陶清液加入纯水进行稀释,稀释至陶清液中5-ALA浓度<1g/L。
(2)向稀释后的陶清液中加入1%的活性炭,升温至60℃,脱色30min,过滤,得到脱色液。
(3)进柱:脱色液直接进柱(离子交换树脂,型号001×8),进柱时注意使树脂饱和吸附,陶清液pH一般为4.0左右,控制柱出口pH4.0结束进料。流速为1BV/h。
(3)正洗:树脂饱和吸附后,用1.5倍纯水正顶。
(4)反洗:用纯水冲至溶液澄清,pH5-6。
(5)解析:用1mol/L氨水解析,流速1BV/h。当pH5-7时收集为高流,并及时用磷酸调pH2.5。
(6)将高流浓缩至600-650g/L,后续的一次结晶、离心、干燥、酸溶、二次结晶、离心、干燥等步骤同实施例1。
对比例2:
将实施例1的步骤(11)酸溶的步骤省略,将5-氨基乙酰丙酸粗品用水溶解后再进行二次结晶。其余步骤同实施例1。
对比例3:
将实施例1的步骤(1)中的“向陶清液加入纯水进行稀释,稀释至陶清液中5-ALA浓度<1g/L”这一步骤省略,将陶清液直接进柱。其余步骤同实施例1。
对本实施例1和对比例1-2纯化得到的5-氨基乙酰丙酸的收率和纯度进行测定。其中,收率是先直接测定发酵液中5-氨基乙酰丙酸的浓度,计算出应得5-氨基乙酰丙酸的量;再进行提纯,得到精品5-氨基乙酰丙酸后,按如下公式计算收率:
收率=(精品5-氨基乙酰丙酸的量/应得5-氨基乙酰丙酸的量)*100%。
纯度是产品中5-氨基乙酰丙酸占产品的百分比。
5-氨基乙酰丙酸含量的测定采用高效液相色谱法。液相色谱条件如下:
流动相:
A相:水:0.1%甲酸水溶液=90:10(V/V)比例配制混合溶液;
B相:乙睛:水=70:30(V/V)比例配制混合溶液;
色谱条件:
色谱柱:4.6*150mm C18
流速:1.0mL/min
柱温:30℃
进样体积:20μL
检测波长:256nm
梯度洗脱:
时间 | A相 | B相 |
0min | 95 | 5 |
8min | 20 | 80 |
20min | 95 | 5 |
30min | 95 | 5 |
先用A相冲柱0.5-2小时,流速0.5ml/min,基线稳定后,按照梯度设置流动相比例,以初始比例,流速1ml/min,冲柱稳定后,进样,检测。
结果计算:外标法
经测定,实施例1和对比例1-3纯化得到的5-氨基乙酰丙酸的收率和纯度结果如下:
表1:
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种从发酵液中分离纯化5-氨基乙酰丙酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将含有5-氨基乙酰丙酸的发酵液的pH值调至3.5-4.0,高温杀菌,然后进行陶瓷膜过滤,收集滤液,滤液用纯水进行稀释,稀释至滤液中的5-氨基乙酰丙酸浓度<1g/L;
(2)将稀释后的滤液直接进柱,当柱出口的pH为3.5-4.0时结束进料,树脂饱和吸附后,用1-1.5BV纯水正顶,再用纯水反洗,冲至溶液澄清,pH为5-6;
(3)用氨水进行解析并收集洗脱液,当洗脱液pH为5-7时收集为高流,并将高流的pH调节至2.5-3.0;当洗脱液pH为7-11时收集为后流,将后流的pH调节至3.5-4.0,重新进柱;
(4)将高流进行脱色、浓缩、结晶、离心、干燥,得到5-氨基乙酰丙酸粗品;
(5)将5-氨基乙酰丙酸粗品用浓盐酸溶解,向溶解后的5-氨基乙酰丙酸粗品溶液中加入无水乙醇进行再结晶,然后离心、干燥,得到5-氨基乙酰丙酸精品。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,在70-80℃温度条件下进行高温灭菌。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述陶瓷膜的孔径为100nm,压力0.5MPa。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,进料流速为1BV/h。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,氨水的浓度为1mol/L,流速为1BV/h。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,采用活性炭进行脱色,脱色条件为:向高流中加入活性炭,活性炭的加入量为高流重量的1-2%,升温至60℃,脱色30min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述结晶具体为:向浓缩液加入3倍体积95%乙醇,降至8℃结晶。
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---|---|---|---|---|
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CN101624350A (zh) * | 2009-08-06 | 2010-01-13 | 浙江大学 | 一种5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的结晶方法 |
CN102702002A (zh) * | 2005-09-21 | 2012-10-03 | 克斯莫石油株式会社 | 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐的制造方法 |
CN103265444A (zh) * | 2013-04-24 | 2013-08-28 | 浙江大学 | 一种5-氨基乙酰丙酸磷酸盐的结晶方法 |
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2021
- 2021-08-31 CN CN202111018196.3A patent/CN113912508A/zh active Pending
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