JPH03145495A

JPH03145495A - コカルボキシラーゼの精製法

Info

Publication number: JPH03145495A
Application number: JP28582789A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Toyozumi; 豊住　政彦; Susumu Hakozaki; 箱崎　進; Nobuyuki Yamamoto; 信幸山本
Original assignee: Nippon Synthetic Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Nippon Synthetic Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1989-10-31
Publication date: 1991-06-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はチアミンをリン酸化して得られるコカルボキシ
ラーゼ含有溶液からコカルボキシラーゼを精製する方法
に関するものである。

［従来の技術］チアミンのリン酸化によりコカルボキシラーゼを製造し
た際に、該反応液中にはコカルボキシラーゼ（チアミン
ピロリン酸）以外にチアミンモノリン酸、チアミントリ
リン酸等の副成物が共存している。

これらの生成物はその性質が類似しているため、目的物
のコカルボキシラーゼを単離するのは容易ではなく、分
別沈澱法や各種イオン交換樹脂を用いる方法等が提案さ
れている。そのうち、イオン交換樹脂を用いる方法とし
ては、例えばＡｎｎ、ｄｅｒ　ｃｈｅ＠、６１８．２１
０　（１９５８）には、弱塩基性アニオン交換樹脂と弱
酸性カチオン交換樹脂を用いてコカルボキシラーゼを精
製している。該文献では、まず、コカルボキシラーゼ含
有溶液から弱塩基性アニオン交換樹脂を用いて溶液中に
存在するリン酸を系から除去し、更に該処理液から弱酸
性カチオン交換樹脂でチアミンやチアミンモノリン酸を
吸着除去し、コカルボキシラーゼを単離すると共に弱酸
性カチオン交換樹脂からチアミンモノリン酸を回収して
いる。

又、特開昭５０−６４４８５号公報には、強酸性陽イオ
ン交換樹脂のアミン塩型樹脂と強塩基性陰イオン交換樹
脂のカルボン酸塩型樹脂の双方を用い、コカルボキシラ
ーゼ以外のチアミンリン酸エステル類を吸着除去し、コ
カルボキシラーゼを精製している。即ち、コカルボキシ
ラーゼ、チアミンモノリン酸、チアミントリリン酸等の
うち強塩基性陰イオン交換樹脂にチアミントリリン酸等
のチアミンポリリン酸エステルを吸着させ系から除去し
、次の強酸性陽イオン交換樹脂で、チアミンモノリン酸
を吸着除去させて、コカルボキシラーゼを単離している
。

［発明が解決しようとする課題］しかし、従来のイオン交換樹脂を用いる方法では、溶出
液として多量の水を用いるため、分離後の液の濃縮に多
量の熱エネルギーを要し、工業的には好ましくない。

更に、本発明者等の検討によるとＡ　ｎｎ、ｄｅｒ　ｃ
ｈｅｍ、６１８゜２１０　（１９５８）の方法では、二
種のイオン交換樹脂を使うので操作が煩雑になり、かつ
コカルボキシラーゼの純度が８５〜９５％、コカルボキ
シラーゼ含有溶液からの単離収率が４５〜５５％、及び
チアミンモノリン酸の回収率が５５〜６５％といずれも
低い。コカルボキシラーゼの純度や収率が低いことは工
業的に不利であることば言うまでもなく、又、チアミン
モノリン酸の回収率が悪いことは、これがコカルボキシ
ラーゼの製造工程に再使用可能な化合物であることから
生産コストの低減化を妨げることになる。

また、特開昭５６−６４４８５号公報でも、上述の従来
法の欠点の他に、二種のイオン交換樹脂を使用するので
操作の煩雑さは避けられず、その上、アミン塩型強酸性
陽イオン交換樹脂に吸着したチアミンモノリン酸は、回
収の際に使用される塩酸水溶液により該樹脂から生成し
たアミン塩との分離が非常に難しく、単離回収が困難で
ある。

このように、コカルボキシラーゼを精製する際の操作性
、コカルボキシラーゼの単離、更にはチアミンモノリン
酸の回収をいずれも効率よく行える改良された方法が求
められているのが実情である。

［課題を解決するための手段］そこで、本発明者等はコカルボキシラーゼの精製法にお
けるイオン交換樹脂の種類や精製条件について鋭意検討
した結果、特定のアニオン交換樹脂と特定の溶出液を用
いることにより、かかる目的を達成できることを見出し
、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、「　チアミンをリン酸化して得られるコカルボキシラー
ゼ含有溶液をアニオン交換樹脂層に接触させ、炭素数１
〜３の有機酸水溶液を溶出剤として分離を行い、ｐＨが
５．５以下の溶出留分からコカルボキシラーゼを収得し
、ｐＨが５，５以上の溶出留分からチアミンモノリン酸
塩を回収することを特徴とするコカルボキシラーゼの精
製法。」である。

本発明の特徴点は、アニオン交換樹脂による精製時に炭
素数１〜３の有機酸水溶液を溶出剤として用いる点にあ
る。これにより一度のイオン交換樹脂の使用だけで、高
純度、高収率でコカルボキシラーゼを単離し得、かつ、
チアミンモノリン酸も高収率で回収することが可能にな
るのである。

アニオン交換樹脂としては、三次元に重縮合した高分子
基体に交換基として４級アンモニウム基〔−ＮＲ，”）
を結合させた強塩基性アニオン交換樹脂と、交換基とし
て１〜３級アミンＣ−ＮＨｔ、　　ＮＨＲ，−ＮＨＲ＊
）を結合させた弱塩基性アニオン交換樹脂があり、いず
れら使用可能である。

強塩基性アニオン交換樹脂の代表的な実例としては、ア
ンバーライト（商標名：ロームアンドハース社製）ＩＲ
Ａ−４００，ＩＲＡ−４１０、ダイヤイオン（商標名：
三菱化成工業社製）ＳＡＩ　ＯＡ、ＳＡ２　ＯＡ、レバ
チット（商標名；バイエル社製）Ｍ−５００，Ｍ−６０
０等が挙げられる。

また、弱塩基性アニオン交換樹脂の代表的な実例として
は、アンバーライト（商標名）ｒＲＡ−９４，ＴＲＡ−
９９、ダイヤイオン（商標名）ＷＡＩＯ，ＷＡ２０ＷＡ
３０、レバチット（商標名）ＭＰ−６２，ＭＰ−６４等
が挙げられる。

これらの樹脂の粒度については特に制限はないが、再生
等の作業性の点から２０〜５０メツシユが適当である。

本発明の有機酸水溶液における有機酸としては、炭素数
１〜３のものを使用することが必要である。かかる酸と
しては蟻酸、酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸が例示
される。またこの酸の使用量は、使用するイオン交換樹
脂の総イオン交換容量相当量の有機酸があれば充分で、
下記式（１）で表される。

有機酸量（当量）≧総イオン交換容量（当量／ｍ１）Ｘ
イオン交換樹脂量（１１１１）−Ａ（当量）・・・・・
・・・・（１）ここでＡ（当量）はコカルボキシラーゼ
含有溶液中のリン酸、チアミントリリン酸、塩酸のそれ
ぞれの当量数を合計したものである。

本発明の有機酸水溶液の濃度としては１〜５０重量％、
好ましくは１０〜３０重量％が適当である。

本発明では、かかる酸の使用によって工業的に有利に効
率良く目的物の収得が可能となるわけで、水等の溶出剤
と比べてその使用量も著しく少量で済み、溶出液の後処
理による目的物の単離も容易である。

本発明ではかかる有機酸水溶液を溶出剤としてイオン交
換分離を行い、ｐＨが５．５以下の留分と５．５以上の
留分にわける。まず、ｐＨが５，５以下の留分からは反
応生成物であるコカルボキシラーゼが純度９０〜９９％
でコカルボキシラーゼ含有溶液中のコカルボキシラーゼ
に対して８０〜９５％の収率で単離でき、ｐＨ５，５以
上の留分からは、再び原料として再使用可能なチアミン
モノリン酸塩が、純度８０〜９０％、コカルボキシラー
ゼ含有溶液中のチアミンモノリン酸に対して、回収率７
４〜８９％で分離できる。

本発明の方法はカラム法、バッチ法のいずれでも実施可
能であるが、カラム法の方が操作的に容易である。

カラム法で実施する場合には、アニオン交換樹脂をカラ
ムに充填後、このカラムにコカルボキシラーゼ含有溶液
を導通し、その後所定の有機酸水溶液を導通し、流出液
をｐ　Ｈ５、５以上のチアミンモノリン酸含有留分とｐ
Ｈ５，５以下のコカルボキシラーゼ含有留分とにわける
。

これらの留分はいずれも濃縮後、塩酸を加え、それぞれ
の成分を塩酸塩にする。チアミンモノリン酸塩酸塩を含
有する留分には、アセトン等の有機溶媒を加え、結晶と
して析出させ、単離する。また、コカルボキシラーゼ塩
酸塩を含有する留分には、エタノール等の有機溶媒を加
え、結晶として析出させ、単離する。

このようにして精製単離されたコカルボキシラーゼは、
脳動脈硬化症、脳血管障害後遺症、糖尿病、肝疾患、ア
レルギー性疾患等の治療薬として使用されている。

［作　　用」本発明の炭素数１〜３の有機酸水溶液は、チアミンをリ
ン酸化して得られるコカルボキシラーゼ含有液をアニオ
ン交換樹脂層に接触させた後、溶出剤として使用される
ことにより、コカルボキシラーゼ成分とチアミンモノリ
ン酸塩成分を分離する作用を有する。

［実施例］次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

コカルボキシラーゼ含有溶液の製造８９％オルトリン酸５６．３９Ｃ０，５１モル）と五酸
化リン４３．８ｙ（０，３１モル）を混合後、撹拌しな
がら１００℃まで昇温し、均一溶液とした。かかる系の
溶液にチアミン塩酸塩２５ｇ（０，０７４モル）を加え
、更に１００℃で！時間反応させた。

冷却後、５０℃以下に保ったまま７５ｇの水を加えた後
、これをエタノール１２５０ｍ１に加え、−晩装置した
。傾瀉して上層を取り除き、残ったシロップ層に６２．
５ｇの水を加え、溶解してコカルボキシラーゼ含有溶液
】２５９とした。かかる溶液の組成はチアミン　　　　　　　　　　　　０．４重量％チアミ
ンモノリン酸　　　　　　１３．９重量％コカルボキシ
ラーゼ　　　　　　　７，２重量％チアミントリリン酸
　　　　　　　０．６重量％であった。

実施例１強塩基性アニオン交換樹脂を充填したカラム（ダイヤイ
オン　５Ａ１０Ａ、樹脂量５００ｍ１．カラム長さ３０
ｃｍ１直径５．０ｃｍ）に、前記のコカルボキシラーゼ
含有溶液１２５９を流し、その後２００ｇの水を通した
。更に７５重量％酢酸水溶液５００ｇを通した後、２０
０ｇの水で水洗した。流出液をｐＨ５，５以上の留分と
ｐＨ５，５以下の留分とに分け、それぞれ濃縮した後、
７．７９の濃塩酸を加えた。

ｐＨ５，５以上の留分の濃縮液をアセトン３００ｍ１に
加え、晶析、濾過後乾燥して１３．１ｇのチアミンモノ
リン酸塩酸塩を得た。回収率は７５，３％であった。

ｐＨ５，５以下の留分の濃縮液をエタノール２６５ｍ１
に加え、晶析、濾過後乾燥して７．７９９のコカルボキ
シラーゼ塩酸塩を得た。純度は９６．８％で、単離収率
は８６．５％であった。

実施例２弱塩基性アニオン交換樹脂を充填したカラム（アンバ−
ライト　ＩＲＡ−９４、樹脂、ｌ１５００ｍｌ、カラム
長さ３０ｃｍ、直径５　、　Ｏａｍ）に、前記のコカル
ボキシラーゼ含有溶液１２５ｇを流し、その後２００９
の水を通した。

更に７．８重量％酢酸水溶液５００ｇを通した後、２０
０ｇの水で水洗した。流出液をｐＨ５，５以上の留分と
ｐｔ−ｉ５．５以下の留分とに分け、それぞれ濃縮した
後、７，７？の濃塩酸を加えた。

以下、実施例１と同様にして実験を行い、ｐＨ５，５以
上の留分からは１５．５９のチアミンモノリン酸塩酸塩
を得た。回収率は８９．１％であった。

また、ｐＨ５，５以下の留分からは８，６ｇのコカルボ
キシラーゼ塩酸塩を純度９５．０％で得た。単離収率は
９５．５％であった。

実施例３実施例１において酢酸水溶液のかわりに５．０重量％の
蟻酸水溶液５００ｇを使用する以外は、同例と同様に実
験を行った。

ｐＨ５，５以上の留分からは１４．７９のチアミンモノ
リン酸塩酸塩を得た。回収率は８４．５％であった。

また、ｐＨ５，５以下の留分からは８．２９のコカルボ
キシラーゼ塩酸塩を純度９５．５％で得た。単離収率は
９１．１％であった。

実施例４実施例１において酢酸水溶液のかわりに９．３重量％の
プロピオン酸水溶液５００ｇを使用する以外は、同例と
同様に実験を行った。

ｐＨ５，５以上の留分からは１３．０９のチアミンモノ
リン酸塩酸塩を得た。回収率は７４．７％であった。

また、ｐＨ５，５以下の留分からは７．３ｇのコカルボ
キシラーゼ塩酸塩を純度９５．０％で得た。単離収率は
８１．１％であった。

対照例実施例１において酢酸水溶液のかわりに多量の水（全部
で３６００９）をカラムに通じることにより流出液をｐ
Ｈ５，５以上の留分とｐＨ５，５以下の留分に分ける以
外は、同例と同様に実験を行った。

ｐＨ５，５以上の留分からは１０．８ｇのチアミンモノ
リン酸塩酸塩を得た。回収率は６２」％であった。

また、ｐＨ５，５以下の留分からは４，７９のコカルボ
キシラーゼ塩酸塩を純度９１．０％で得た。単離収率は
５２．２％であった。

○　計算方法［効　　果コチアミンをリン酸化して得られるコカルボキシラーゼ含
有溶液をアニオン交換樹脂層に接触させ、炭素数ｌ〜３
の有機酸水溶液を溶出剤としてイオン交換分離すること
により、ｐＨ５，５の前後で分離されたそれぞれの溶出
留分から、簡便にコカルボキシラーゼとチアミンモノリ
ン酸塩を分離でき、更にコカルボキシラーゼの純度、収
率、チアミンモノリン酸の回収率等がいずれも優れてい
るので、産業上極めて有用である。

Claims

【特許請求の範囲】

チアミンをリン酸化して得られるコカルボキシラーゼ含
有溶液をアニオン交換樹脂層に接触させ、炭素数１〜３
の有機酸水溶液を溶出剤として分離を行い、ｐＨが５．
５以下の溶出留分からコカルボキシラーゼを収得し、ｐ
Ｈが５．５以上の溶出留分からチアミンモノリン酸塩を
回収することを特徴とするコカルボキシラーゼの精製法
。