CN108431015A

CN108431015A - 一种nadph的纯化工艺

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Publication number: CN108431015A
Application number: CN201680016191.8A
Authority: CN
Inventors: 张琦; 张冬民; 傅荣昭
Original assignee: Jiangxi Bontac Green Biocatalysis Ecoindustrial Park Co ltd; Bontac Bio-Engineering (shenzhen) Co ltd
Current assignee: BONTAC BIO-ENGINEERING (SHENZHEN) Co.,Ltd.
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2036-12-14
Also published as: JP6510074B2; JP2019503334A; WO2018107377A1; US10765967B2; CN108431015B; US20190336887A1

Abstract

一种NADPH的纯化工艺，用于对生物催化法制备得到的NADPH粗产物进行纯化，旨在解决现有的离子交换树脂法所存在的收率低和纯化产物纯度低的技术问题。该纯化方法依次包括预处理、上离子柱、阳离子洗脱、前杂洗脱、产品洗脱和浓缩干燥等步骤，纯化后的NADPH的纯度高达98%以上，收率在达85%以上。

Description

一种 NADPH的纯化工艺技术领域

本发明涉及核苷酸类辅酶的纯化工艺的技术领域，特别涉及对生物催化法制备得到的 NADPH粗产物进行纯化的工艺。

背景技术

[0002] NADPH是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine

Dinucleotide Phosphate) 的英文缩写形式，它是存在于包括人类细胞在内的所有活细胞中的一种非常重要的生理物质，这种物质是很多可催化氧化 _还原反应的酶的辅助因子，被称为还原型辅酶 Π。

[0003] NADPH在生物体细胞内参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成，这些反应中需要 NADPH作为还原剂、氢负供体。另外， NADPH在生物体内除了作为氢转移的载体，还作为磷酸转移的媒介参与各种合成反应。如今， N ADPH被广泛应用于各类医药生化企业的产品制造之中，而随着对 NADPH在疾病的治疗和预防方面的深入研究， NADPH作为医药保健品的重要性日益凸显出来，市场需求量逐年增加。

[0004] 目前， NADPH的制备方法主要包括以下三种： 1、酵母菌发酵法； 2、化学合成法； 3、生物催化法。其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点；而酵母菌发酵法生产的 NADPH含一定有机溶剂残留；生物催化法因不含有机溶剂残留，也不存在手性问题且制备的 NADPH与机体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的 NADPH的制备方法。

[0005] 现有的制备 NADPH的生物催化法一般是以 NADP为底物，在脱氢酶的催化下制备。该方法制备得到的 NADPH粗产物还须进行进一步的纯化处理才能得到较为纯净的 NADPH成品，目前应用较为普遍的纯化处理方法包括液相色谱法和离子交换树脂法。液相色谱法具有纯化产物纯度高、收率高的优点，但是由于 NADP H本身所带官能团具有极强的极性和亲水性，因此在使用液相色谱法进行纯化处理的过程中会引入离子对试剂和缓冲盐，而离子对试剂较难分离，且在纯化过程中需要使用有机试剂，故而液相色谱法既会带来新的杂质又具有较高的成本，不适用于工业化生产。而目前行业内普遍采用的离子交换树脂法处理得到的 N ADPH的纯度最高只能达到 95%左右，而收率最高只有 60%左右，产能受到很大限制，不能满足市场的需求。

技术问题

[0006] 鉴于现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种收率高、产物纯度高的用于对生物催化法制备得到的 NADPH粗产物进行纯化处理的新的离子交换树脂法，旨在解决现有的离子交换树脂法所存在的收率低和纯化产物纯度低的技术问题。

问题的解决方案

技术解决方案

[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种 NADPH的纯化工艺，其特征在于：所述工艺依次包括以下步骤：

[0008] A、预处理：将生物催化法制备得到的 NADPH粗产物过微滤膜，所述微滤膜为 0.1-0.5μηι孔径的中空纤维膜。

[0009] 本发明提供的 NADPH的纯化工艺适用的处理对象为采用生物催化法制备 NADP H而得到的 NADPH粗产物，该生物催化法具体是指用生物酶催化底物转化成 NA DPH的方法，其中的生物酶是脱氢酶或者是脱氢酶和一种或者多种其他酶的联合使用，其中的底物可以是 NADP, 也可以是能够转化成 NADP的前体物质，所谓 NADPH粗产物即是指酶催化底物完全反应后所得到的未经任何处理的酶反应液。反应过程中的微生物以及固体催化剂会影响纯化的纯度及收率，所以通过微滤膜对 NADPH进行初步纯化，去掉反应过程的固体颗粒及微生物。选择的膜的孔径过大则会有部分固体或者微生物去除不干净，膜的孔径过小则导致 NADP H通透不过去。

[0010] B、上离子柱：将步骤 A微滤后的 NADPH粗产物上阴离子交换树脂柱；

[0011] NADPH粗产物上阴离子交换树脂柱主要是使 NADPH以离子键的方式吸附在离子交换树脂上，再通过不同的洗脱条件将杂质和 NADPH分别洗脱下来而得到比较纯的产品。 [0012] C、阳离子洗脱：上样完成后用纯水淋洗离子柱至洗脱液中不含阳离子；

[0013] NADPH粗产物中含有金属离子以及有机阳离子，阳离子本身不易被阴离子交换树脂吸附，但阴离子交换树脂吸附 NADPH后易与阳离子产生亲吸附，不洗脱阳离子会造成产品含量和纯度较低。

[0014] D、前杂洗脱：用 0.07-0.5mol/L氯化钠溶液淋洗离子柱至洗脱液中不含在 260η m波长处有紫外吸收的物质；

[0015] NADPH粗产物中含有包括原料及一些反应副产物在内的杂质，这些杂质的点电荷不一样，根据点电荷的差异，用浓度较低的氯化钠溶液可以洗脱离子键较弱的杂质，使用过程中氯化钠溶液浓度不宜过高，过高则会将 NADPH洗脱下来而造成收率降低。氯化钠溶液浓度也不宜过低，过低则离子键较弱的杂质洗脱不下来而造成 NADPH纯度较低而达不到要求。 NADPH和杂质都在 260nm波长下有紫外吸收，因此选择 260nm波长作为检测波长。

[0016] E、产品洗脱：用含有 0.5mol/L氯化钠、 Ί% 乙醇的水溶液淋洗离子柱

，收集在 340nm波长处有紫外吸收的洗脱液；

[0017] 产品的洗脱浓度选择为 0.5mol/L氯化钠、 Ί% (V/V%) 乙醇的水溶液，如果降低洗脱条件会造成产品拖尾或者洗脱不完全而导致产品收率过低；如果再增加氯化钠的浓度或者乙醇浓度则会将一些离子键较强的杂质洗脱到产品中而造成纯度降低。产品在 340nm波长下有紫外吸收，而杂质在 340nm波长下没有紫外吸收，因此，选择在 340nm波长下收集产品。

[0018] F、步骤 E的洗脱液经浓缩、干燥处理后即得纯化后的 NADPH成品。

[0019] 优选地，所述阴离子交换树脂为大孔型苯乙烯系季胺 I型强碱性阴离子交换树脂。发明人经过对大量阴离子交换树脂进行实验筛选后，发现大孔型苯乙烯系季胺 I型强碱性阴离子交换树脂对 NADPH的载量很高，并且应用于该纯化工艺中所获得的 NADPH成品的收率较高，纯度可达 98%以上，实际工艺操作及树脂再生处理也较为简单。

[0020] 更优选地，所述 NADPH粗产物的上样量以 NADPH计为 9-15g/g大孔型苯乙烯系季胺 I型强碱性阴离子交换树脂。

[0021] 当所述 NADPH粗产物的 pH值较低吋，所述工艺优选还包括：在步骤 A之前，将所述 NADPH粗产物的 pH值调至 8.0-11.0，以保持产物的稳定性。更优选地，将所述 NADPH粗产物的 pH值调至 9.0- 10.0。

[0022] 由于 NADPH在碱环境下较为稳定，优选地，所述工艺还包括对所述阴离子交换树脂的如下预处理步骤：用氢氧化钠溶液浸泡所述阴离子交换树脂，使树脂由 C1 -转型为 OH -

，然后用纯水淋洗至偏中性。其中氢氧化钠溶液的浓度优选为 0.1-0.5mol/L。

[0023] 为使阴离子交换树脂循环使用，以降低生产成本，优选地，所述工艺还包括将所述阴离子交换树脂再生的步骤，再生过程中所使用的再生液为含有 l.Omol/L氯化钠、 O.lmol/L盐酸的水溶液，淋洗速度为 0.8-1.5BV/H, 再生液用量为 2.0BV, 再生后用纯水冲洗树脂至偏中性。

[0024] 优选地，上述纯化工艺中的步骤 C和步骤 D中全程采用核酸蛋白检测仪进行检测，所述洗脱液的收集方式为从所述核酸蛋白检测仪的读数幵始上升吋幵始收集，待读数幵始下降吋停止收集。

[0025] 上述纯化工艺中步骤 E中的浓缩处理可以采用本领域已知的任何适用的浓缩方式。优选地，所述浓缩处理依次包括微滤、超滤和纳滤。产品纯化后得到的收集液含量较低，含有大量的水、盐、乙醇，通过纳滤去掉盐和乙醇以及达到浓缩效果。其中，所述微滤处理使用 0.1-0.5μηι孔径的中空纤维膜，目的在于去除固体颗粒及一些微生物。所述超滤处理使用截留分子量为 10K的超滤膜，目的在于去除内毒素及微生物。所述纳滤处理使用截留分子量为 100-400的卷式膜，目的在于去除小分子杂质。

[0026] 上述纯化工艺中步骤 Ε中的干燥处理可以采用本领域已知的任何适用的干燥方式。优选地，所述干燥处理为真空冷冻干燥。

发明的有益效果

有益效果

[0027] 与现有技术相比，本发明提供的 NADPH的纯化工艺具有收率高和纯化产物纯度高的优点.经工业实践证实，该纯化工艺的收率可达 85%以上，而纯化后的 NA DPH的纯度高达 98%以上。并且该工艺不使用有毒有害有机溶剂、绿色环保、工艺简单易操作、生产成本较低，使得纯化后的产品极具市场竞争力。该工艺对于采用生物催化法制备 NADPH所获得的 NADPH粗产物的纯化具有普遍适用性。

本发明的实施方式

[0028] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。

[0029] 实施例 1

[0030] 处理对象：邦泰生物工程（深圳）有限公司采用生物酶催化法（以 NADP为底物，用脱氢酶催化制备 NADPH) 制备得到的四批 NADPH粗产物溶液，测得这四批 NADPH粗产物溶液中 NADPH的含量如表 1所示。

[0031] 对上述四批 NADPH粗产物溶液的纯化过程如下：

[0032] 1、树脂预处理：将大孔型苯乙烯系季胺 I型强碱性阴离子交换树脂装填入离子柱中，加入 0.1-0.5mol/L氢氧化钠溶液进行浸泡，然后用纯水淋洗至偏中性；

[0033] 2、 NADPH粗产物预处理：将生物催化法制备得到的 NADPH粗产物的 pH值调至 9.0-10.0，然后将调好 pH值的 NADPH粗产物过孔径为 0.45μηι的中空纤维膜进行微滤处理；

[0034] 3、上离子柱：将步骤 2微滤后的 NADPH粗产物上样到步骤 1预处理后的离子柱中，上样速度为 0.8-1.5BV/H, 上样量为 9-15g/g阴离子交换树脂；

[0035] 4、阳离子洗脱：上样完成后用纯水淋洗离子柱，淋洗速度为 0.5-2.0BV/H, 全程采用硬水指示剂对洗脱液进行在线检测，淋洗至硬水指示剂不变色后停止淋洗（硬水指示剂由蓝色变为红色说明阳离子为除尽，蓝色不变化说明无高价阳离子）；

[0036] 5、前杂洗脱：用 0.3mol/L氯化钠溶液淋洗离子柱，全程采用核酸蛋白检测仪对洗脱液进行在线检测，检测波长为 260nm，注意观察核酸蛋白检测仪的读数变化，读数先上升后下降，待读数不再变化吋停止淋洗；

[0037] 6、产品洗脱：用含有 0.5mol/L氯化钠、 Ί% (V/V%) 乙醇的水溶液淋洗离子柱，全程采用核酸蛋白检测仪对洗脱液进行在线检测，检测波长为 340nm，注意观察核酸蛋白检测仪的读数变化，待读数幵始上升吋收集洗脱液，待读数幵始下降吋停止收集，收集完洗脱液后将离子柱进行再生处理； [0038] 7、后续处理：步骤 6收集得到的洗脱液依次经过微滤、超滤和纳滤处理，浓缩至 100- 150g/L后，用真空冷冻干燥机干燥即得 NADPH成品，其中微滤过程使用 0.

45μηι孔径的中空纤维膜，超滤过程使用截留分子量为 10K的超滤膜，纳滤过程使用截留分子量为 100-400的卷式膜。

[0039] 采用高效液相色谱法检测这四批纯化后的 NADPH成品的含量及纯度，并计算收率，其结果如表 i所示。

[0040] 表 1

[]

[0041] 实施例 2

[0042] 离子柱的再生过程如下：

[0043] 1、冲洗：用大量的纯水将残留在树脂中的副产物冲洗出来，直至核酸蛋白检测仪的读数下降至 0.5以下；

[0044] 2、再生：配制含有 1.0mol/L氯化钠、 0.1mol/L盐酸的水溶液作为再生液，旋幵再生阀，打幵再生泵，用再生液淋洗离子柱，淋洗速度为 0.8- 1.5BV/H , 再生液用量为 2.0BV;

[0045] 3、水洗：再生液再生完后，用 2-3柱体积的纯水冲洗离子柱至偏中性，则该离子柱即可用于下一次的纯化处理，吸附性良好。

Claims

权利要求书

[权利要求 1] 一种 NADPH的纯化工艺，其特征在于：所述工艺依次包括以下步骤

A、预处理：将生物催化法制备得到的 NADPH粗产物过微滤膜，所述微滤膜为 0.1-0.5μηι孔径的中空纤维膜。

Β、上离子柱：将步骤 Α微滤后的 NADPH粗产物上阴离子交换树脂柱

C、阳离子洗脱：上样完成后用纯水淋洗离子柱至洗脱液中不含阳离子；

D、前杂洗脱：用 0.07-0.5mol/L氯化钠溶液淋洗离子柱至洗脱液中不含在 260nm波长处有紫外吸收的物质；

E、产品洗脱：用含有 0.5mol/L氯化钠、 Ί% (V/V%) 乙醇的水溶液淋洗离子柱，收集在 340nm波长处有紫外吸收的洗脱液；

F、步骤 E的洗脱液经浓缩、干燥处理后即得纯化后的 NADPH成品。

[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于：所述阴离子交换树脂为大孔型苯乙烯系季胺 I型强碱性阴离子交换树脂。

[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于：所述 NADP

H粗产物的上样量以 NADPH计为 9-15g/g阴离子交换树脂。

[权利要求 4] 根据权利要求 1或 2所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于，当所述

NADPH粗产物的 pH值较低吋，所述工艺还包括：在步骤 A之前，将所述 NADPH粗产物的 pH值调至 8.0-11.0。

[权利要求 5] 根据权利要求 4所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于，当所述 NA

DPH粗产物的 pH值较低吋，所述工艺还包括：在步骤 A之前，将所述

NADPH粗产物的 pH值调至 9.0-10.0。

[权利要求 6] 根据权利要求 1或 2所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于，所述工艺还包括对所述阴离子交换树脂的如下预处理步骤：用氢氧化钠溶液浸泡所述阴离子交换树脂，然后用纯水淋洗至偏中性。

[权利要求 7] 根据权利要求 1或 2所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于：所述工艺还包括将所述阴离子交换树脂再生的步骤，再生过程中所使用的再生液为含有 1.0mol/L氯化钠、 O.lmol/L盐酸的水溶液，淋洗速度为 0.8- 1.5BV/H, 再生液用量为 2.0BV, 再生后用纯水冲洗树脂至偏中性。

[权利要求 8] 根据权利要求 1或 2所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于：步骤 C 和步骤 D中全程采用核酸蛋白检测仪进行检测，所述洗脱液的收集方式为从所述核酸蛋白检测仪的读数幵始上升吋幵始收集，待读数幵始下降吋停止收集。

[权利要求 9] 根据权利要求 1或 2所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于：所述浓缩处理依次包括微滤、超滤和纳滤，所述微滤处理使用 0.1-0.5μηι孔径的中空纤维膜，所述超滤处理使用截留分子量为 10K的超滤膜，所述纳滤处理使用截留分子量为 100-400的卷式膜。

[权利要求 10] 根据权利要求 1或 2所述的 NADPH的纯化工艺，其特征在于：所述干燥处理为真空冷冻干燥。