JP2638971B2 - アミノ酸の回収方法 - Google Patents

アミノ酸の回収方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アミノ酸発酵液から菌体，高分子物質及び
色素等の不純物を除去する、アミノ酸を精製する技術に
関する。
〔従来の技術〕
Ｌ−アミノ酸発酵液には、多重の菌体や可溶性蛋白を
含有している。これらは、アミノ酸の結晶成長を阻害し
たり、さもなくばアミノ酸の収率低下をきたす為、あら
かじめ除去する必要がある。
また、培地や微生物の代謝由来の不純物である無機
塩，糖，色素等も発酵液中に含まれる。これらも、イオ
ン交換処理活性炭処理，晶析操作等の単離精製技術を適
切に組合せることにより除去しなければならない。
発酵液からのアミノ酸の単離精製は通常次のように行
われる。即ち、遠心分離，過・凝集沈降などにより菌
体及び不溶性成分を除去した後、目的アミノ酸が陽イオ
ンになるようにpHを調整し、強酸性陽イオン交換樹脂に
吸着させる。吸着されたアミノ酸は希アルカリ溶液で溶
出された後、活性炭で脱色され、濃縮・冷却・中和のい
ずれかの晶析法で遊離のアミノ酸又はその塩を分離す
る。必要に応じて再結を行って製品を得ることが出来
る。この方法に基づいて精製されるアミノ酸はアルギニ
ン，グルタミン，ヒスチジン，イソロイシン，リジン，
プロリン，スレオニン，セリン，バリンなど多数にのぼ
り、工業的に生産されている。
この中で、陽イオン交換樹脂処理法については、アミ
ノ酸のアミノ基の塩基性に基づいた優れた技術ではある
が、陽イオンになりうる物質は総て樹脂に吸着するた
め、選択性という意味では大変に乏しい。また陽イオン
交換樹脂はその骨格がスチレンとジビニルベンゼンの共
重合体が一般的であり、陽イオン交換基（スルホン酸
基）以外の部分は極めて疎水性が高く、色素やタンパク
類など疎水性の高い物質が吸着しやすい。そのうえ溶離
剤であるアルカリに接すると、これら吸着した陽イオン
物質や疎水性物質が、電荷の変化やイオン強度の変化に
よってほとんど溶出される。すなわち、吸着・溶離とい
う複雑な操作を行ない、酸やアルカルを大量に使用し、
薄い液や再生液など大量の排水を発生させたわりには、
実質的な不純物淘汰効果は少ないという好ましくない結
果となる。
一方、タンパク分解物からの抽出法と異なり、アミノ
酸発酵の利点は特殊な微生物を培養することにより培養
液中に一種類のアミノ酸だけが高濃度に蓄積される。特
に、最近の菌株育種技術は目ざましいものがあり、副生
物を極力減少させる努力がなされ、酵素法に至っては副
生物が全く無いという状況さえ生まれている。これらの
ことから、従来の古典的陽イオン交換法はその意義を化
学的、省エネルギー的、環境保全的見地から急速に失い
つつあるといえる。
次に、菌体及び不溶性成分の除去を目的とした工業的
装置としては、遠心分離を基本原理とした遠心沈降分離
機、ノズル排出型連続遠沈機、バスケット型遠心沈降機
など、又、ろ過ではケイソウ土をコートした減圧ろ過
機，圧搾ろ過機等がよく用いられている。
しかしながらこの従来技術では遠心重力によって菌体
を完全に除去することは難しく、又、過については菌
体は除去できるが、可溶性蛋白質などを除去することは
不可能である。
これにより、次工程のイオン交換樹脂カラムを閉塞さ
せたり、結晶化の際に成長を阻害したり、加熱，濃縮で
変性，析出し、結晶に混入して純度を著しく下げている
という問題点を有していた。
この結果、イオン交換樹脂処理は本来の性能を最大限
発揮することが出来ないばかりでなく、目的の結晶純度
を得る為に、再結晶工程を繰り返す傾向があった。
一方、陰イオン性物質，色素物質，高分子物質などが
結晶の成長阻害や、結晶の純度低下や着色褐変の一因と
なっている。これらを除去する手段として、陰イオン交
換樹脂，或は合成吸着樹脂などが考えられるが、上記可
溶性蛋白質は、これらの樹脂に吸着し、その効果を著し
く減らすと同時に、不可逆的吸着などにより樹脂再生不
能に陥る傾向があった。
以上の様な点から、発酵液からアミノ酸を回収する新
しい改良技術開発の必要性がせまられていた。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、発酵液中の菌体及び結晶の成長阻害や純度
低下をきたす物質を除去し、しかも、アミノ酸を高収率
で回収できる簡便な処理法を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、本課題に対し、長年研究を重ねた結果、新
たな知見を見い出し、本発明を完成するに至った。すな
わち、本発明は、発酵法または酵素法により得られたＬ
−アミノ酸溶液からＬ−アミノ酸を回収する際に、発酵
液、酵素液又はその濃縮液の限外濾過膜処理を行い、次
に、得られた透過液を弱塩基性アニオン交換樹脂又は両
性イオン交換樹脂に通液し、得られた樹脂通過液からＬ
−アミノ酸を回収する方法に関するものである。
本発明を更に詳しく説明すると、以下の通りである。
一般に微生物のサイズとして、代表的なFscherichia
属で1.5〜1.1μｍ、Staphylococcus属で1.0〜0.5μｍ、
もっとも小さいPseudomonas属で1.0〜0.22μｍと考えら
れている。これに対して、プレコートフィルターの排除
サイズは、1.0μｍといわれている。更に、蛋白質につ
いては、分子量67,000のアルブミンで約30Å（＝0.003
μｍ），分子量13,000のチトクロムＣで約20Å（＝0.00
2μｍ）であり、工業的レベルの遠心沈降やプレコート
過で、これらの除去は不可能である。
しかしながら、近年、水処理やチーズホエーの精製に
応用されてきた、限外過膜は、通常の過と異なり、
拡散浸透を基本原理としており、そのポアサイズによっ
て分子量分画能力として、30万から1000まで対応でき
る。生化学分野では蛋白質の精製などに広く応用されて
おり、工業的にも純水の製造やエンドトキシン（発熱性
物質）の除去に関する報告が多い。
本発明者は、これを発酵液中の菌体の除去および可溶
性タンパクの除去に応用すべく検討した結果、湿菌体容
積として、70〜80％までも濃縮が可能で有り、更に濃縮
液に水を加え再度透過させることにより、アミノ酸など
低分子可溶性分を99.5％迄回収することができた。限外
過膜の透過液は澄明であり、若干の色素分子の淘汰及
び粘度の低下がみられた。
過については、過面の閉塞による過速度の低下
が問題であるが、限外過膜は拡散浸透であるため、膜
面の目づまりが比較的少ないうえ、液の撹はんや高速循
環により膜表面にある程度の液体線速を与えることによ
り、膜表面のファウリング物質を効果的に除去でき、安
定した透過速度が得られた。膜の洗浄は、膜の素材に適
した通常の洗浄剤でよく、例えば薄いアルカリ、薄い次
亜塩素酸ナトリウム溶液、市販の洗剤などの他、メーカ
ーから供給される膜専用の洗浄剤も効果がある。これに
よって純水を用いた透過速度測定で、95〜98％の回復率
が得られた。
限外過膜の形式としては、平膜型、中空糸型、チュ
ーブラー型、スパイラル型何れでもよい。膜の材質もポ
リスルホン、フッ化ポリビニリデン、ポリアクリロニト
リル、セルロース等いずれも可能である。
好ましくは、ポリスルホン又はセルロースの膜材質
で、平膜又は中空糸型の限外過膜が良い。
発酵液のpHおよび温度は装置の材質および膜の素材に
よりある程度制約を受けるが、ポリスルホンpH1〜14、
温度15〜80℃まで可能であり、実質的には問題ない。
好ましくは、pH2.5〜8.0,温度20〜70℃が良い。
又、限外過膜に適用する好ましい圧力は、入口圧4.
0〜6.0バール，出口圧1.0〜2.0バールが良い。限外過
膜の分画分子量は6,000〜50,000が良く、更に好ましく
は6,000〜10,000が良い。流速は70/m2/h〜150/m2/h
が適切である。
発酵液又は酵素液中のアミノ酸最適濃度は次の通りで
ある。
Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ile）:20〜40g/ Ｌ−トリプトファン（Ｌ−Trp）:20〜21g/ Ｌ−アラニン（Ｌ−Ala）:95〜130g/ Ｌ−バリン（Ｌ−Val）:40〜70g/ Ｌ−スレオニン（Ｌ−Thr）:40〜90g/ Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−His）:15〜40g/ Ｌ−アェニルアラニン（Ｌ−Phe）:20〜30g/ Ｌ−グルタミン（Ｌ−Gln）:30〜50g/ 次に、菌体を除去しただけの発酵液は、濃縮あるいは
冷却して晶析させても高純度の結晶が得られないという
問題点がある。例えば、トリプトファンでは、インドー
ル環が酸化的に分解重合した疎水性物質や色素物質が多
量に含まれている。これらは晶析の際に、トリプトファ
ンの結晶成長阻害を起こし、微細な結晶になると同時に
色素や濁り成分の取り込みが多く、再結晶しても容易に
淘汰されない。また、アラニンでは残存するアスパラギ
ン酸が晶析阻害を起こし、結晶が微細になる上、アスパ
ラギン酸が混入する現象がみられた。また、イソロイシ
ンやバリンでは濃縮中に濁りが発生し、結晶のすきまに
とりこまれ、著しく結晶の純度を下げている。
本発明者はこの原因について研究した結果、２つの要
因があることを見いだした。すなわち、第１の要因は、
可溶性蛋白質、核酸、多糖類など少なくとも分子量１万
以上の高分子物質である。これらは、濃縮時の加熱、pH
の変化、イオン強度の変化によって容易に変性、凝集、
溶解度の低下をきたし、不溶化して結晶表面に付着或は
混入して結晶の純度を著しく下げていた。これらの不純
物として、２−アセチル−ピロール、2,5−ジメチルテ
トラヒドロフラン、２−ヒドロキシメチルイミダゾー
ル、２−ｎ−ブチルテトラヒドロフラン、フルフリルア
ルコール、インドール、ブチロラクタム、ブチルアミン
やプロピオン酸などが含まれる。これらの大部分は、28
0〜340nmのUV領域に吸収をもつ色素前駆体である。
第２の要因は、低分子量の色素及び疎水性の物質であ
る。これらは、アミノ酸の結晶化の際にその成長表面に
吸着し、その成長を妨げることにより結晶の微細化、偏
平化、集合化を引き起こし、分離の際、付着母液が膨大
になり洗浄効果も上がらず相対的に結晶の純度を下げて
いた。これらの物質は何れも量的には微量であるが、結
晶成長に絶大な影響を及ぼした。
本発明者は、これらの不純物要因を除去する為に以下
に述べる精製法で解決できることが判明した。
即ち、第１の要因については限外過膜を使用するこ
とにより、容易にこれを除去できることは既に述べた。
第２の要因については前述のごとく陽イオン交換法では
その除去が望めず、また結晶成長阻害物質が量的に微量
であることから、何等かの機能性物質にこれらを選択的
に吸着させ、アミノ酸を素通りさせることにより発酵液
を精製し、一回の晶析操作で高純度の結晶を取得するこ
とを考えた。
結晶成長阻害物質は、その性質上、疎水性が高いこと
から、吸着性を持つ樹脂に通液することにより目的を達
することができる。一般に、弱塩基性陰イオン交換樹脂
や両性イオン交換樹脂は、脱色を目的とした樹脂として
知られている。しかしながら、これらの樹脂が単に脱色
という公知の機能の他に本願発明で述べるところの発酵
液の前処理として使用することで驚くべき効果を発揮す
ることを発見し、本願発明を完成した。
弱塩基性アニオン交換樹脂の母体は、公知であるポリ
スチレン，ポリフェノリック，エポキシ及びポリアクリ
レイトのいずれを含むものでも良い。これらのうち、好
ましくは、ポリスチレンとポリアクリレートである。一
般に、これらのイオン交換樹脂は、母体に少なくとも第
１〜第３級アミノ基（−NH2,−NHR,−NR2）のいずれか
が結合したものである。ここで、Ｒは、アルキル基（好
ましくはC1〜C10）や置換したアルキル基（好ましく
は、C6〜C12）である。例えば、アンバーライトIRAシリ
ーズ（ローム＆ハース社），デュオライトA300シリーズ
（デュオライト社），ダイヤオンWAシリーズ（三菱化成
社）などがある。これらのうち、特に好ましいイオン交
換樹脂は、イオナックＡ−365（アクリレイト型）とア
ンバーライトIRAである。イオナックＡ−365は、イオナ
ック社の一部門であるシブロンによって製造されてお
り，これは、多孔性ビーズ構造を有した弱塩基性ポリア
クリレイト型アニオン交換樹脂である。アンバーライト
IRA−68は、第３級アミノ基だけを有する多孔性アクリ
ルアニオン交換樹脂である。
両性イオン交換樹脂は、多孔性芳香族ポリマーの表面
にアミノ基とフェノール性水酸基が共存したもので、例
えば、HS樹脂、KS樹脂（北越炭素工業（株））である。
Ｄ剤は、多孔性フェノール樹脂の表面にアミンとフェ
ノール基を有する両性イオン交換樹脂として好ましいも
のである。この樹脂は、強酸又は強アルカリの塩を分離
することはできない。しかしながら、Ｄ剤は、弱酸又は
弱アルカリ物質を吸着することができる。Ｄ剤への吸着
は、酸性又は中性pH領域で処理される。そして、吸着物
質は、アルカリ溶液で溶出される。
樹脂処理工程での好ましいpH領域は2.5〜8.0である。
又は、温度は、20〜70℃が好ましい。樹脂への通液流速
は、SV3〜５（樹脂/hr）、更に好ましくは、SV4が良
い。各種アミノ酸の好ましい樹脂に対する負荷量は、次
の通りである。
しかしながら、直接、発酵液にこれらの樹脂を使用し
た場合、蛋白質、色素、核酸、オイルなどが不可逆的に
吸着或は沈着し、樹脂の活性表面を被覆してしまい、著
しく能力を減じ、また再生剤として酸、アルカリやアル
コール類を用いると、汚染物質は変性、凝集して樹脂に
詰まり、しばしば再生不能に陥ることもあった。
そこで、本発明者は、限外過膜を透過させた発酵液
を、これらの樹脂に通液したところ、非常に効率よく脱
色あるいは疎水性物質の除去が可能なことを見いだし
た。樹脂通液前後の液性を比較してみると、UVスペクト
ルでは近紫外域280〜350nm付近の吸収が大幅に減少して
いた。また、ゲルクロマトグラフィーでは分子量1000〜
3000程度の物質の除去が示されていた。また、メタノー
ルグラジュエントを用いた疎水性クロマトグラフィーで
は、メタノール濃度30〜50％程度で溶出する非常に疎水
性の高い物質が除去されていることを示していた。同時
に、螢光を発する物質も著しく減少していることから、
ベンゼン環やプリン環などを持った疎水性物質が効果的
に除去されているものと考えられる。これらに付随した
効果として濃縮時の発泡が大変少なくなり、濃縮操作が
非常に容易となった。すなわち、限外濾過膜処理した
後、弱塩基性イオン交換樹脂または両性イオン交換樹脂
に通液処理を行うという、非常に簡単なプロセスでアミ
ノ酸の高純度結晶化が可能になった。
〔実施例〕
以下、本発明に基づき実施例で詳細に説明する。
（実施例１） Ｌ−Alaを含有する発酵液は、撹拌装置付きの反応槽
において、Ｌ−Aspを基質として、Ｌ−アスパルテート
β−カルボキシラーゼ活性（EC4.1.1.12）を有するシュ
ードモナスNo.618（ATCC19121）を用いた酵素反応によ
り調製された。
この発酵液を市水で希釈し、Ｌ−Ala濃度を99g/と
した（残存Ｌ−Aspは0.13g/であった）。次に、これ
を95％硫酸でpH3.3に調製後、再生洗浄済のセルロース
限外過膜（公称分画分子量10,000）を用いて過し、
懸濁物質，油状成分、高分子物質を除去した。
これにより得られた清澄液を弱塩基性陰イオン交換樹
脂であるOH型のアンバーライトIRA−68を充填したカラ
ムに通液して残存Ｌ−Asp、その他のアニオン及び色素
成分を除去した。この時のＬ−Alaの樹脂への総負荷量
は、600g/−樹脂であった。
カラムから溶出された目的画分は、35％塩酸で中和し
てpH6.0とした後、減圧濃縮してＬ−Ala濃度を110g/
とした。そして、更にこの濃縮液を撹拌型カランドリア
で減圧下、75℃で濃縮して、Ｌ−Ala濃度を620g/とし
た。得られたこのスラリーを撹拌機付きジャケット型晶
析缶に移し、10℃まで冷却して、過飽和のない状態まで
晶析させた。このスラリーをバスケット型遠心分離機に
チャージし、母液を分別した。次に、バスケット内の結
晶ケーキを、Ｌ−Ala100kg当たり11.8の市水で遠心洗
浄した。こうして得られたＬ−Ala結晶（１番結晶）の
純度は、99％以上であり、Ｌ−Asp含量は0.01％以下で
あった。この結晶1gを脱イオン水100mlに溶解した液の
透過率は97％であった。
上記のバスケット型遠心分離機により分別除去された
母液は、Ｌ−Alaを136g/含有しており、これを、撹拌
型カランドリアで減圧下75℃で濃縮晶析を行ない、Ｌ−
Ala550g/とした。そのスラリーを撹拌機付きジャケッ
ト型晶析缶にて、10℃で冷却晶析した。こうして得られ
た結晶は、バスケット型遠心分離機で母液を分別し、結
晶ケーキをＬ−Ala100kg当たり26.1の市水で遠心洗浄
した。（２番結晶） １番結晶と２番結晶を合わせたＬ−Ala収率は、発酵
液中のＬ−Ala総量に対して94.3％であった。
（比較例1a） 実施例１で示した方法で調製された発酵液の上澄液を
pH6.0に調整した。次に、これをイオン交換樹脂処理を
せずに、直接、実施例１に記載した如く、濃縮、冷却晶
析した。得られた結晶の純度は、98.7％で、Ｌ−Asp含
量は0.08％であった。この結晶1gを脱イオン水100mlで
溶解した液の透過率は、91.9％であった。
また、１番結晶と２番結晶を合わせたＬ−Ala収率は9
1.9％であった。
これらの結晶の粒度は共に実施例１の結晶と比較して
小さかった。これは、多分、Ｌ−Aspによる結晶成長速
度の遅滞によるものと考えられる。
（実施例２） Ｌ−Ile21g/を含有する発酵液を35％塩酸を用いてp
H3.0に調整した。pH調整ブロスを限外過膜（公称分画
分子量6000）を用いて、過を行い、菌体、高分子物質
の除去を行った。限外過膜によって得られた、澄明な
透過液を、Ｄ剤を充填したカラムに通液しブロス中に含
有する色素成分、VU物質をＤ剤に吸着して除去した。Ｄ
剤に対する通算負荷量はＬ−Ile720g/−樹脂であっ
た。
脱色した貫流液をロータリーエバポレーターで減圧下
50℃で濃縮晶析を行い、仕上げのＬ−Ile濃度は200g/
であった。濃縮スラリーを27％苛性ソーダでpH5.6に調
整したのち、撹拌機付き晶析槽に移しプログラムコント
ロールにより50℃から20℃まで冷却晶析を行う。このス
ラリーをバスケット型遠心分離機により結晶と母液に分
離した。
結晶のケーキをバスケット内で300g L−Ile当り600ml
の市水で遠心洗浄した。結晶の純度はＬ−Ile95％であ
り、又、溶液の透過率は94％であった。最初の晶析母液
はＬ−Ile34g/含有しており、これを減圧下濃縮晶析
を行い、Ｌ−Ile濃度100g/とした。そのスラリーを撹
拌機付き晶析槽に移し、10℃まで冷却晶析を行った。そ
の２番結晶スラリーをバスケット型遠心分離機で母液か
ら分離しさらに結晶ケーキ30g L−Ile当り10mlの市水で
遠心洗浄した。
１番結晶と２番結晶の合計Ｌ−Ile収率はブロス中の
Ｌ−Ile含有量に対して、94.3％であった。
尚、限外過処理のみでＤ剤貫流をしない場合の結晶
純度は92％、収率89％、溶液の透過率34％であった。
又、遠心分離型除菌液をＤ剤貫流した場合の結晶純度
は87％、収率90％、溶液の透過率72％であった。
（比較例2a） 実施例２で示した方法で調製された発酵液の上澄液を
強酸性カチオン交換樹脂（Na型）を充填したカラムに通
液し、Ｌ−Ileを吸着させた。次に、Ｌ−Ileを0.5N水酸
化ナトリウム溶液で溶出した。この溶出液を実施例２と
同じ濃縮及び晶析方法で処理した。得られた結晶純度
は、Ｌ−Ile92％で、透過率は49％であった。
（比較例2b） 実施例２で示した方法で調製された発酵液の上澄液を
27％水酸化ナトリウム溶液を使ってpH5.5に調整した。
次に、イオン交換樹脂処理をせずに実施例２に示した濃
縮及び晶析方法で直接処理した。こうして得られた結晶
純度は、Ｌ−Ile87％で、透過率は12％であり、又、結
晶の粒度は小さい為、分離が困難であった。
（比較例2c） 実施例２で示した方法で調製された発酵液をpH調整し
た後、菌体を連続遠心分離機で除去した。これにより透
明でない上澄液が得られた。この上澄液を実施例２と同
様にして、HS樹脂カラムに通液した。この際、樹脂カラ
ムの上層に沈降物がたまった為、流速が徐々に低下し
た。従って、逆洗する必要が生じた。こうして得られた
カラムからの溶出液は、実施例２に記載した方法と同様
にして濃縮及び晶析をした。取得した結晶純度は、Ｌ−
Ile82％、透過率は67％であった。
（実施例３） Ｌ−Thr50g/を含有する発酵液を35％塩酸を用いてp
H3.0に調整した。pH調整ブロスを限外過膜（公称分画
分子量6000）を用いて過を行い菌体、高分子物質の除
去を行った。
限外過膜によって得られた澄明な透過液をＤ剤を充
填したカラムに通液し、ブロス中に含有する色素成分、
UV物質をＤ剤に吸着除去した。Ｄ剤に対する通算負荷量
は、Ｌ−Thr1,000g/樹脂であった。
脱色された、貫流液を27％苛性ソーダを用いてpH5.6
に調整したのち、ロータリーエバポレーターで減圧下50
℃で濃縮を行いＬ−Thr濃度120g/で、種晶10％（対Th
r）をシードし、更に晶析しながら、濃縮を行い、仕上
げのＬ−Thr濃度は350g/であった。濃縮スラリーを撹
拌機付き晶析槽に移し、プログラムコントロールによ
り、50℃から10℃まで冷却晶析を行った。このスラリー
をバスケット型遠心分離機により結晶と母液に分離し
た。結晶のケーキをバスケット内で300g L−Thr当り150
mlの市水で遠心洗浄を行った。
結晶の純度はＬ−Thr97％以上であり、ホモセリン２
％であった。Ｌ−Thr収率は、ブロス中のＬ−Thr含量に
対して83％であった。
（実施例４） Ｌ−Val65g/を含有する発酵液を35％塩酸を用いてp
H3.0に調整した。pH調整ブロスを限外過膜（公称分画
分子量6000）を用いて過を行い、菌体、高分子物質の
除去を行った。
限外過膜によって得られた澄明な透過液をＤ剤を充
填したカラムに通液しブロス中に含有する色素成分、UV
物質をＤ剤に吸着して除去した。Ｄ剤に対する通算負荷
量は、Ｌ−Val1,200g/−樹脂であった。
脱色した貫流液をロータリーエバポレーターで減圧下
50℃で濃縮晶析を行い、仕上げのＬ−Val濃度は200g/
であった。濃縮スラリーを27％苛性ソーダでpH5.6に調
整したのち、撹拌機付き晶析槽に移しプログラムコント
ロールにより50℃から10℃まで冷却晶析を行う。このス
ラリーをバスケット型遠心分離機により結晶と母液に分
離した。
結晶のケーキをバスケット内で240g L−Val当り50ml
の市水で遠心洗浄した。結晶の純度はＬ−Val96％以上
であった。
最初の晶析母液はＬ−Val51g/含有しており、これ
を減圧下50℃濃縮晶析を行い、Ｌ−Val100g/とした。
そのスラリーを撹拌機付き晶析槽に移し10℃まで冷却晶
析を行った。その２番結晶スラリーをバスケット型遠心
分離機で母液から分離し、更に結晶ケーキ30g L−Val当
り10mlの市水で遠心洗浄した。
１番結晶と２番結晶合計のＬ−Val収率はブロス中の
Ｌ−Val含有量に対して、91.3％であった。
（実施例５） Ｌ−His23g/を含有する発酵液を35％塩酸を用いてp
H3.0に調整した。pH調整ブロスを限外過膜（公称分画
分子量6000）を用いて過を行い菌体、高分子物質の除
去を行った。
限外過膜によって得られた澄明な透過液をＤ剤を充
填したカラムに通液しブロム中に含有する色素成分、UV
物質をＤ剤に吸着除去した。Ｄ剤に対する通算負荷量
は、Ｌ−His900g/−Ｒであった。
脱色された貫流液をロータリーエパポレーターで減圧
下50℃で濃縮を行い、仕上げのＬ−His濃度は250g/で
あった。
濃縮スラリーを撹拌付き晶析槽に移し、プログラムコ
ントロールにより、50℃から10℃まで冷却晶析を行っ
た。このスラリーをバスケット型遠心分離機によりＬ−
His・HCl・H2O結晶と母液に分離した。
結晶のケーキをバスケット内で400g L−His・HCl・H2
O当り80mlの市水で遠心洗浄した。
結晶の純度はＬ−His99％以上であり、Ｌ−His収率は
ブロス中のＬ−His含量に対し82％であった。
（実施例６） Ｌ−Trpを20g/含有する発酵液を60％H2SO4を用いて
pH4.0に調整後、限外過膜（公称分画分子量6,000,ポ
リスルホン酸）を用いて過し、菌体、高分子物質の除
去を行なった。
限外過によって得た澄明な透過液を、Ｄ剤（メタフ
ェニレンジアミンとレゾルシンをホルマリンで縮合した
両性イオン交換樹脂。）を充填したカラムに通液し、Ｌ
−Trp関連成分の着色物質の除去を行なった。この際
に、Ｌ−Trpの一部が吸着されるが脱イオン水で回収を
行なった。Ｌ−Trpの通算負荷量は500g/−樹脂であっ
た。
樹脂処理された貫流液と水押液を合せて５％NaOHを用
いてpH4に調整後、撹拌機つきカランドリヤ型濃縮缶で
減圧下45℃で150g/まで濃縮晶析を行なった。濃縮ス
ラリーを撹拌機つきジャケット型晶析缶に移し、45℃か
ら５℃まで冷却晶析した。
冷却スラリーをバスケット型遠心分離機で結晶と母液
に分離した。結晶ケーキはバスケット内でＬ−Trp100kg
当り90の脱イオン水で遠心洗浄した。かき取った結晶
をＬ−Trp100kg当り400の脱イオン水で、撹拌機つき
ジャケット型晶析缶でスラリー化し、20℃で１時間撹拌
後バスケット型遠心分離機で結晶と母液に分離した。結
晶ケーキはバスケット内でＬ−Trp100kg当り90の脱イ
オン水で遠心洗浄した。かき取った結晶は棚段型乾燥器
で減圧下40℃で乾燥した。収率は72％であった。Ｌ−Tr
pの含量は99.9％で、他のアミノ酸類は0.01％以下であ
った。結晶1gを脱イオン水100mlに溶解した液の透過率
は93％であった。
（比較例6a） Ｌ−Trpを20g/含有する発酵液を60％H2SO4を用いて
pH4.0に調整後、限外過膜（公称分画分子量6,000,ポ
リスルホン膜）を用いて過し、菌体、高分子物質の除
去を行なった。
限外過によって得た澄明な透過液を撹拌機つきカラ
ンドリヤ型濃縮缶で減圧下45℃で100g/まで濃縮晶析
を行った。濃縮スラリーを撹拌機つきジャケット型晶析
缶に移し、45℃から５℃まで冷却晶析した。
このスラリーをバスケット型遠心分離機で結晶と母液
に分離した。結晶ケーキはバスケット内でＬ−Trp100kg
当り90の脱イオン水で遠心洗浄した。かき取った結晶
をＬ−Trp100kg当り400の脱イオン水で、撹拌機つき
ジャケット型晶析缶でスラリー化し、20℃で１時間撹拌
後バスケット型遠心分離機で結晶と母液に分離した。結
晶ケーキはバスケット内でＬ−Trp100kg当り90の脱イ
オン水で遠心洗浄した。かき取った結晶は棚段型乾燥器
で減圧下40℃で乾燥した。収率は66％であった。Ｌ−Tr
pの含量は98.2％で、他のアミノ酸類は0.1％以下であっ
た。結晶1gを脱イオン水100mlに溶解した液の透過率は
9.2％であった。
更に以下の精製を行なった。リスラリー洗浄した結晶
をＬ−Trp100kg当り1,000の脱イオン水でスラリー化
後35℃まで加熱し、60％H2SO4でpH2.0に調整溶解した。
溶解液に活性炭をＬ−Trp100kg当り20kg添加して１時間
撹拌を続けた。その後、過し活性炭ケーキと液に
別した。液は35℃に加熱しながら10％NaOHで徐々にpH
6.0まで中和して結晶を析出させた。引き続きスラリー
を５℃まで冷却した。
冷却スラリーをバスケット型遠心分離機で結晶と母液
に分離した。結晶ケーキはバスケット内でＬ−Trp100kg
当り、90の脱イオン水で遠心洗浄した。かき取った結
晶をＬ−Trp100kg当り400の脱イオン水で、撹拌機つ
きジャケット型晶析缶でスラリー化し、20℃で１時間撹
拌後バスケット型遠心分離機で結晶と母液に分離した。
結晶ケーキはバスケット内でＬ−Trp100kg当り90の脱
イオン水で遠心洗浄した。かき取った結晶は棚段型乾燥
器で減圧下40℃で乾燥した。収率は76％であった。Ｌ−
Trpの含量は99.1％であった。他のアミノ酸類は0.05％
以下であった。結晶1gを脱イオン水100mlに溶解した液
の透過率は20.5％であった。
（比較例6b） Ｌ−Trp20g/を含有する発酵液を60％H2SO4を用いて
pH4.0に調整後、遠心沈降分離機で菌体を遠心沈降分離
した。除菌液をカチオン交換樹脂（CER,架橋度４％,Na
型）を充填したカラムにＬ−Trpの通算負荷が150g/L−
Ｒになるまで通液してＬ−Trpの吸着を行なった。吸着
したＬ−Trpは、溶離槽のpHを27％NaOHでpH12.5から13.
0にコントロールしつつ、カラム下部から樹脂を適度に
流動させながら通液し、溶離液はカラム上部から引抜き
溶離槽へ戻しつつ２時間循環して溶離を行なった。循環
終了後0.5％NaOHで押液を行なった。
Ｌ−Trpを高濃度に含有する溶離液部を撹拌機つきジ
ャケット型晶析缶に移し、45℃に加熱後60％H2SO4を用
いて中和晶析を行ない更に５℃まで冷却晶析した。
冷却スラリーをバスケット型遠心分離機で結晶と母液
に分離した。結晶ケーキはバスケット型遠心分離機内で
Ｌ−Trp100kg当り90の脱イオン水で遠心洗浄した。か
き取った結晶をＬ−Trp100kg当り400の脱イオン水
で、撹拌機つきジャケット型晶析缶でスラリー化し、20
℃で１時間撹拌後バスケット型遠心分離機で結晶と母液
に分離した。結晶ケーキはバスケット内でＬ−Trp100kg
当り90の脱イオン水で遠心洗浄した。かき取った結晶
は棚段型乾燥器で減圧下40℃で乾燥した。収率は62％で
あった。Ｌ−Trpの含量は99.0％であった。他のアミノ
酸類は0.05％以下であった。結晶1gを脱イオン水100ml
に溶解した液の透過率は15％であった。更に常法により
精製しても透過率はほとんど向上しなかった。
表−１に実施例−1,2,3の透過率の一覧表を示した。U
F−Ｄ剤の組合せによる透過率の改善効果が一目瞭然で
ある。
（実施例７） Ｌ−Val55g/を含有する発酵液3.84（Ｌ−Val211g
含有）を再生洗浄済の限外過膜（公称分画分子量10,0
00）を用いて過し、菌体及び高分子物質を除去した。
得られた清澄液はpH7.5であり、これを、弱塩基性イ
オン交換樹脂イオナックＡ−365 1.0を充填したカラ
ムに通液し、アニオン不純物を除去した。Ｌ−Valの樹
脂に対する通算負荷量は205g/−樹脂であった。カラ
ムからの貫流液のpHは8.2であった。
次に、この貫流液をロータリーエバポレータで減圧下
50℃で濃縮し、アンモニアを除去した。この操作により
Ｌ−Val濃度は75g/となった。
この濃縮液に35％塩酸を加えてpH1.0に調整し、これ
を、再度ロータリーエバポレータで減圧下70℃で680ml
の溶液量まで濃縮し、Ｌ−Val濃度が300g/,L−Val量
として204gを得た。
次に、この濃縮液を撹拌機付き晶析缶に入れた後、Ｌ
−Val・HCl・H2Oとして晶析する為に、35％塩酸204mlを
徐々に添加した。塩酸添加終了後、温度を70℃から10℃
にして、その冷却速度をコントロールしつつ晶析した。
得られたスラリーを、バスケット型遠心分離機にチャ
ージし、結晶と母液を分離した。結晶ケーキは、20％塩
酸水溶液51ml（Ｌ−Val100g当たり31.5ml）を用いて遠
心洗浄した。
得られたＬ−Val・HCl・H2O結晶量は、ウェット量で2
88.8g,L−Val換算で179.3gであった。発酵液からの回収
率は、85％となった。
（実施例８） Ｌ−Ile24g/を含有する発酵液3.55（Ｌ−Ile85g
含有）を、再生洗浄済のセルロース限外過膜（公称分
画分子量10,000）を用いて過をし、菌体及び高分子物
質を除去した。
得られた清澄液はpH7.4であり、これを弱塩基性イオ
ン交換樹脂イオナックＡ−365 1.0gを充填したカラムに
通液し、アニオン不純物を除去した。Ｌ−Ileの樹脂に
対する通算負荷量は、139g/−樹脂であった。カラム
からの貫流液はpH8.2であった。
次に、この貫流液をロータリーエバポレータで減圧下
50℃で濃縮し、アンモニアを除去した。この操作により
Ｌ−Ile濃度は40g/となった。
この濃縮液に35％塩酸を加えてpH1.0に調整し、これ
を再度ロータリーエバポレータで減圧下70℃で340mlの
溶液量まで濃縮し、Ｌ−Ile濃度が240g/,L−Ile量と
して82gを得た。
次に、この濃縮液を撹拌機付き晶析缶に入れた後、Ｌ
−Ile・HCl・H2Oとして晶析する為に35％塩酸204mlを徐
々に添加した。塩酸添加終了後、70℃から10℃にして、
その冷却速度をコントロールしつつ晶析した。
得られたスラリーをバスケット型遠心分離機にチャー
ジし、結晶と母液を分離した。結晶ケーキは、20％塩酸
水溶液30ml（Ｌ−Ile100g当たり42ml）を用いて遠心洗
浄した。
得られたＬ−Ile・HCl・H2O結晶量は、ウェット量で1
34.7g,L−Ile換算で71.4gであった。発酵液からの回収
率は、84％となった。
（実施例９） Ｌ−Gln42g/含有する発酵液を35％塩酸を用いてpH
5.6に調整した。これを平膜型限外過膜（公称分画分
子量6000）を用いて過を行い、菌体及び高分子物質の
除去を行なった。得られた澄明な透過液を、弱塩基性ア
ニオン交換樹脂（アンバーライトIRA−68）を充填した
カラムに通液し、発酵液中に存在する色素物質、Ｌ−Gl
n,PCA及びその他の陰イオンを吸着除去した。樹脂に対
する負荷量は樹脂１あたりＬ−Gln500gであった。樹
脂処理された貫流液を、ロータリーエバポレーターで減
圧下45℃で濃縮晶析を行った。濃縮後のＬ−Gln濃度は2
80g/であった。濃縮スラリーを撹拌機付きの晶析槽に
移し45℃から10℃まで冷却晶析を行い、このスラリーを
バスケット型遠心分離機により母液と分離した。結晶の
ケーキをバスケット内で100gの結晶に対し、50mlの市水
で遠心洗浄した。
この結晶の純度はＬ−Gln97％であり、発酵液からの
回収率は87.5％であった。
〔発明の効果〕
以上、述べた如く、本発明によれば、発酵液，酵素液
又はその濃縮液の限外過膜処理次いで、イオン交換樹
脂又は吸着樹脂処理という簡便な処理フローで容易にＬ
−アミノ酸を回収できることから、産業上の利用価値が
高いものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、結晶成長に関する発酵液中の不純物の影響を
示したものである。この図は結晶成長は、発酵液中の不
純物によって阻害されることを示している。 第２図は、Ｄ剤と活性炭のpHに対する脱色性能を示した
ものである。 第３図は、吸着剤の着色溶液の通液量に対する脱色曲線
である。 第４図及び第５図は、Ｄ剤の脱色曲線である。 第６図は、発酵液中における色素物質の形成フローであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金児 豊一 神奈川県相模原市二本松４―28―３ (72)発明者 金子 哲也 神奈川県川崎市幸区神明町２―89 (72)発明者 鑓田 兼逸 神奈川県横浜市磯子区栗木２―８―１ 審査官 植野 浩志 (56)参考文献 特開 昭60−207593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−895（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−14794（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−67093（ＪＰ，Ａ) アミノ酸核酸集談会編「アミノ酸発酵 （上）総論」共立出版株式会社（昭47年 ２月20日発行）第346〜350頁，第338頁

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】発酵法または酵素法により得られたＬ−ア
    ミノ酸溶液からＬ−アミノ酸を回収する際に、発酵液、
    酵素液又はその濃縮液を、 （１）限外濾過膜処理を行い、 次に、得られた透過液を （２）弱塩基性アニオン交換樹脂又は両性イオン交換樹
    脂に通液し、 得られた樹脂通過液からＬ−アミノ酸を回収することを
    特徴とするＬ−アミノ酸の回収方法。
  2. 【請求項２】Ｌ−アミノ酸の発酵液、酵素液又はその濃
    縮液のＬ−アミノ酸濃度が下記の範囲である請求項１記
    載の方法。 Ｌ−Ile:20−40g/ Ｌ−Trp:20−21g/ Ｌ−Ala:95−130g/ Ｌ−Val:40−70g/ Ｌ−Thr:40−90g/ Ｌ−His:15−40g/ Ｌ−Phe:20−30g/ Ｌ−Gln:30−50g/
  3. 【請求項３】限外濾過工程における条件が、pH2.5〜8.
    0、温度20〜70℃、流束70〜150l/m2h、入口圧4.0〜6.0
    バール、出口圧1.0〜2.0バールである請求項１記載の方
    法。
  4. 【請求項４】弱塩基性アニオン交換樹脂又は両性イオン
    交換樹脂に通液する条件が、pH2.5〜8.0、温度20〜70
    ℃、空間速度SV3〜５である請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】弱塩基性アニオン交換樹脂又は両性イオン
    交換樹脂に通液する工程におけるＬ−アミノ酸の樹脂負
    荷量が下記の範囲である請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】弱塩基性陰イオン交換樹脂が、第１、第２
    又は第３級のアミノ基を有するポリスチレン又はポリア
    クリロニトリルを母体とした樹脂のいずれか若しくは混
    合物を含むものであり、両性イオン交換樹脂がメタフェ
    ニレンジアミンとレゾルシンをホルマリンで縮合したも
    のであることを特徴とする請求項１記載の方法。
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