KR950009318B1 - L-아미노산 함유 발효액으로 부터 l-아미노산을 회수하는 방법 - Google Patents

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Description

L-아미노산 함유 발효액으로 부터 L-아미노산을 회수하는 방법
제1도는 발효액 불순물에 의한 리신의결정 성장에 대한 효과를 도시한 것이고,
제2도는 pH의 함수로서 D-수지 및 활성탄의 탈색력을 도시한 것이며,
제3도는 착색 용액 공급 용량의 함수로서 활성탄, D-수지, 및 기타 수지에 대한 탈색곡선을 도시한 것이고,
제4도 및 제5도는 D-수지에 대한 탈색 곡선을 도시한 것이며,
제6도는 발효액중에서 발색에 관한 도해를 나타낸 것이다.
L-아미노산 발효액은 다량의 미생물 세포 및 가용성 단백질을 함유하는데, 이들은 아미노산 결정의 성장을 지연시키기 때문에 반드시 제거되어야 하며 그렇지 않으면 아미노산 생성물의 효율적 회수에 있어 역작용을 한다.
사용된 배양 배지 및 이용된 미생물의 대사로부터 유도된 매우 다양한 기타 불순물(무기염, 슈가, 색소 등)도 또한 발효액중에 함유되어 있으며, 이들은 또한 이온 교환, 활성탄 처리, 및 결정화와 같은 여러 가지 분리 및 정제 방법을 정교히 결합하여 제거해야만 한다.
종래에는, 아미노산을 함유하는 발효액으로부터 아미노산의 분리 및 이의 정제는 다음과 같이 수행되어졌다: 미생물 세포 및 기타 불용성 불순물을 먼저 원심분리, 여과, 응고 또는 침강법에 의해 제거하고, 생성된 용액의 pH를 정제될 아미노산이 양이온 형태가 되도록 조정하여, 형성된 양이온 아미노산을 강산성 양이온 교환 수지상에 흡착시킨다. 흡착된 아미노산은 묽은 알카리 용액으로 용출시키고, 그 용출액을 활성탄으로 탈색시켜 유리 아미노산 또는 이의 염을 농축, 냉각 또는 중화에 의해 결정형태로 분리시킨다. 이와같이 수득된 결정은 필요에 따라 재결정하여 추가로 정제시킬 수 있다. 아르기닌, 글루타민, 히스티딘, 이소투신, 리신, 프롤린, 트레오닌, 세린 및 발린을 포함한 다수의 아미노산이 본 공정을 기초하여 공업상 규모로 생산된다.
공업적 공정에서는, 원심분리 침강기, 노즐-배출형, 연속 원심분리기 및 바스켓-형 원심분리기를 미생물 세포 및 기타 불용성 불순물을 제거하는데 이용하나, 규조토의 예비 피복을 이용한 진공 및 가압 필터를 여과에 주로 사용한다.
그러나, 원심력으로 미생물 세포를 완전히 제거하기는 어렵고, 여과에 의해 가용성 단백질을 제거할 수는 없다. 이는 차후 단계중에 여러 가지 문제점을 제거한다 : 이온-교환 수지로 충전된 칼럼의 막힘(clogging), 아미노산 결정의 지연된 성장, 가열 및 농축중 변성된 단백질의 응고 등으로, 이들은 아미노산 결정을 오염시키고 순도 등을 매우 저하시키게 된다. 결과적으로 이온-교환수지 처리는 실상 그다지 유효지 못하며 목적하는 순도의 결정을 얻기 위하여는 반복하여 재결정화를 수행해야 한다.
한편, 불순물로서 함유된 음이온 물질, 색소 및 중합체도 또한 결정 성장을 지연시키는 요인이 될 뿐만 아니라, 분리된 결정의 순도 및 탈색을 저하시킨다. 음이온-교환수지, 양쪽성 이온-교환 수지 또는 흡착성 합성 수지를 사용하여 상기 불순물을 제거하는데 적용하였다. 이 경우, 또한 상기-언급된 가용 단백질은 이들 수지에 흡착되는 경향이 있으므로, 수지의 작용을 현저하게 감소시키고, 종종 비가역적 흡착의 결과로서 그의 재생을 불가능하게 한다.
선행 기술 방법의 상기 결점들에 대해서, 발효액으로 부터 고순도의 아미노산을 회수할 신규하고 개선된 방법이 요망되었다.
따라서, 아미노산을 생성하는데 사용된 발효액으로부터 미생물 세포 및 중합성 불순물 모두를 제거할 수 있는 방법을 개발하는 것이 본 발명의 목적이다.
결정 상정의 지연 및 분리된 아미노산 결정의 저순도의 원인이 되는 물질들을 제거하는 방법을 개발하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
이온 교환의 필요를 배제한 L-아미노산의 고순도의 결정을 회수할 간단한 방법을 확립시킴이 본 발명의 추가의 목적이다.
본 발명에 따라, 발효액 중에 함유된 불순물을, 한외여과막에 통과시킨 뒤 이온-교환 또는 흡착 수지에 통과시켜서, 생성된 유출액을 냉각 또는 농축시키는 경우, 간단한 공정으로 발효액으로부터 고순도의 아미노산 결정을 회수할 수 있다.
통상적 미생물의 세포 크기는 일반적으로 에스케리키아(Escherichia)속은 1.5내지 1.1㎛, 스타필로코커스(Staphylococcus)속은 1.0내지 0.5㎛, 및 슈도모나스(Pseudomonas)속은 1.0 내지 22㎛(이중 가장작다)으로 알려져 있다. 반면에, 예비 피복 필터의 배제 크기는 1.0㎛이다. 단백질에 대하여는, 분자량이 67,000인 알부민의 분자크기는 약 30Å(=0.003㎛)이고 분자량이 13,000인 사이토크롬 C의 분자크기는 약20Å(=0.002㎛)이다. 이들 불순물은 공업적 기준의 원심분리 침강법 또는 예비피복 여과로 완전히 제거 할 수 없음은 명백하다.
최근들어 수처리 및 치이즈 유장 정제에 적용하는 기술인 한외여과법은 보통 여과법과는 달리 주로 확산원리에 기초하므로, 상이한 세공 크기의 한외여과막을 사용하여 300,00내지 1,000범위의 분자량의 분획화에 적용가능하다. 이 기술은 또한 단백질의 정제 및 기타 목적으로 생화학분야에서 광범위하게 사용되며; 많은 보고서들에서 고순도 단백질 및 내독소제거의 공업적 제법에 대한 그의 용도를 기술하고 있다.
본 발명자들은 발효액중의 미생물 세포 및 가용성 단백질의 제거에 한외여과법의 적용을 시도하였다. 습윤-세포용적을 70 내지 80%까지 농축시킬 수 있고 그렇게 수득된 농축액을 물로 희석시키고 다시 한외여과시키면 아미노산과 같은 가용성, 저분자량 물질은 99.5%까지 회수할 수 있다. 한외여과막을 통한 여과로부터 얻은 여과액은 특정 색소가 제거되고 관측된 점도가 저하되어 투명하다.
통상적 여과법에 관련된 문제점중 하나는 사용된 필터가 막히기 때문에 여과중 속도가 점차 떨어지는 것이다. 한외여과법에서, 한편으로는, 그의 특정 수행 메카니즘(확산에 의한 투과) 때문에 막힐 성향이 덜하고 막 표면에 형성된 오염 물질들은 특정 유체 유동(처리된 용액의 교반 또는 고속순환)을 유지시켜 효과적으로 제거할 수 있으므로, 안정한 투과 속도를 보장할 수 있다. 막은 막 재료에 따라 적합한 통상적 클리너(예: 묽은 알카리, 묽은 차아염소산염 용액, 상업용 클리너 및 막 제조업체로부터 제공된 특정 세정제)로 세정할 수 있다. 따라서 95내지 98%의 회수율(순수한 물의 투과속도에 의해 평가)을 얻을 수 있다.
한외여과막은 어떠한 공지된 형태(예; 평 필름, 중공섬유, 관형 및 나선형)의 것도 사용할 수 있고 어떤 재료로도 만들 수 있다. 바람직한 재료는 폴리설폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리아크릴로니트릴 및 셀룰로즈이다. 가장 바람직한 것은 폴리설폰 또는 셀룰로즈로 된 평판형 또는 중공 섬유형이 한외여과막이다.
처리될 발효액의 pH 및 온도는 장치재료 및 사용된 한외여과막에 의해 다소 제한되나; 폴리설폰으로 만든 막은 실제적으로 아무 문제없이 광범위한 온도 및 pH(15 내지 80℃ 및 pH 1 내지 14)에서 사용할 수 있다. 바람직한 pH 범위는 2.5 내지 8.0이다. 바람직한 온도범위는 20 내지 70℃이다.
한외여과막 적용중 가하는 압력은 바람직하게는 4.0 내지 6.0바아(bar)(유입) 및 1.0 내지 2.0바아(유출)이다. 분획에 대한 분자량 범위는 바람직하게는 6,000 내지 50,000이다. 보다 바람직하게는 6, 000 내지 10,000이다. 유동량은 바람직하게는 701/㎡/h 내지 1501/㎡/h이다.
발효액중의 아미노산의 최적 농도는 다음과 같다 :
L-Ile : 20 내지 40g/l
L-Trp : 20 내지 21g/l
L-Ala : 95 내지 130g/l
L-Val : 40 내지 70g/l
L-Thr : 40 내지 90g/l
L-His : 15 내지 40g/l
L-Phe : 20 내지 30g/l
L-Gln : 30 내지 50g/l
그후, 한외여과막에 통과된 여과액은 차후 단계에서 잔여 불순물로부터 유리되어 결정화된다. 통상적 공정에 있어서, 불순물을 제거하는데 일반적으로 양이온-교환수지가 사용되고; 여과액의 pH는 정제될 아미노산이 양이온 형태로 전환되도록 조정한다. 그렇게 형성된 양이온 아미노산은 유출액으로서 불순물 제거할 강산성 양이온-교환 수지에 습착되고, 흡착된 아미노산은 알칼리 용액으로 용출시켜 회수한다.
이와 같은 방법은 아미노산중에 함유된 아미노 그룹의 염기도를 이용한 우수한 기술이나, 양이온으로 전환될 수 있는 물질이 분리될 아미노산과 함께 수지상에 흡착되기 때문에 선택성에 있어 불만족스럽다. 또한, 이 목적을 위해 통상적으로 사용되는 양이온-교환 수지는 스티렌-디비닐벤젠 공중합체 기본구조를 갖고, 이에 따라 양이온-교환 그룹(설폰산 그룹) 이외에 수지 분자 부위는 고도로 소수성이므로 색소 및 단백질과 같은 소수성 물질을 흡착하기 쉽다. 용출액(알칼리)과 접촉시, 이 흡착된양이온 및 소수성 물질은 전하 및 이온강도의 변화때문에 대부분 용출된다. 따라서 불순물을 제거하는 효과는 수행된 복잡한 조작(흡착 및 용출), 소모된 다량의 산 및 알칼리 및 배출되는 다량의 폐수 측면에서 다소 저하된다.
단백질 분해방법상의 아미노산 발효공정의 잇점은 특정 미생물을 배양시킴으로써 발효액중에 단지 한 유형의 아미노산만을 고농도로 축정시킬 수 있다는 것이다. 균주 증식 기술의 방법은 부산물의 형성을 현저하게 감소시켜온 결과로서 최근에 관심이 고조되어 있다. 특히 효소적 방법으로 특정 경우에 있어서는 부산물이 전혀 형성되지 않는다. 따라서, 통상적 양이온-교환 방법은 화학분야, 에너지-절약 및 환경적 분야에서 그의 중요성을 급격히 상실하고 있다.
상기의 관점에서, 드러난 문제점은 고순도 아미노산 결정을 단지 미생물 세포가 비함유된 발효액을 농축하거나 냉각시킴으로 얻을 수는 없다는 것이다. 예를 들어 트립토판 발효액은 인돌환의 산화적 분해 및 중합화에 의해 형성된 다량의 소수성 물질 및 색소를 함유하며, 이들은 생성된 결정의 성장에 영향을 줄 뿐만 아니라(그에 따라 미세결정이 됨) 분리된 결정에 혼입되어 재결정화에 의해 효율적으로 분리될 수 없다. 알라닌 발효액에서는, 불순물로서 잔여하는 아스파르트산이 결정의 성장에 영향을 주며 미세결정을 생성하고 이는 분리된 알라닌 결정중에 혼입된다. 이소루신 및 발린 발효액에 대해서도 동일하게 적용되어 농축중 혼탁해지며; 형성된 불순물은 분리된 결정중에 혼입되고, 따라서 순도를 크게 감소시킨다.
본 발명가들은 두 그룹의 물질이 이러한 아미노산-결정 오염의 원인이 된다고 밝혀내었다. 한 그룹은 가용성 단백질, 핵산 및 다당류와 같은 분자량 10,000이상의 중합체 물질을 포함한다. 이들 중합체 물질은 가열 및 pH와 이온 농도의변화에 따른 변성 및 응고를 통해 쉽게 불용성이 되므로, 표면에 축적되거나 아미노산 결정을 오염시키고 그의 순도를 현저하게 저하시킨다. 이들 불순물로는 2-아세틸-피롤, 2, 5-디메틸 테트라하이드로푸란, 2-하이드록시메틸이미다졸, 2-n-부틸 테트라하이드로푸란, 푸르푸랄 알코올, 인돌, 부티로락탐, 트리메틸 히드라진, 아세트산, 아세톤, 부틸아민, 및 프로피온산을 포함한다. 이들 불순물의 대개가 280 내지 340㎚의 파장범위에서 UV를 흡수하는 색 전구체이다.
다른 그룹으로는 저 분자량의 색소 및 소수성 물질을 포함하며, 이는 아미노산의 결정화중 그성장 표면에 흡착되어 결정 성장을 지연시키고, 그에 따라 미세하고, 편평하며 응축된 결정을 생성한다. 이렇게 생성된 결정은 다량의 모액을 함유하며, 용매 세정이 비효율적이 되게 하고 그에 따라 최종 산물의 순도를 저하시킨다. 이러한 그룹의 물질들은 발효액중에 소량으로 함유되지만, 결정 성장에는 결정적인 작용을 한다.
본 발명의 방법은 두가지 유형의 불순물의 제거를 설명한다. 상기 언급한 바와 같이, 제1그룹의 물질(중합체물질)은 한외여과법을 이용해 쉽게 제거할 수 있다. 제2그룹의 물질(결정-성장 억제 물질)은 소량 존재하며 양이온-교환 방법으로는 제거할 수 없다. 그후에 특정 작용기 수지상에 선택적 흡착으로 불순물을 제거하고, 단일 결정화 단계를 통해 생성된 유출액으로부터 고-순도의 아미노산 결정을 수득하고자 하는 시도가 있어 왔다.
결정-성장 억제 물질들은 본질상 고도로 소수성이므로 적합한 흡착수지를 통해 이들을 함유하는 상기 액을 통과시켜 제거할 수 있다. 약 염기성 음이온-교환수지 및 양쪽성 이온-교환 수지는 일반적으로 탈색용 흡착제 수지로 공지되어 있다. 본 발명자들은 하기의 토의에서 이 수지들은 탈색작용외에 발효액의 예비처리용 사용되었을 때 뛰어난 효과를 나타냄을 밝혀내었다. 본 발효액의 탈색 활성은 본원에 사용된 수지를 사용할 때 탁월하다.
약 염기성 음이온-교환 수지는 공지된 4개의 유형중 어느 것일 수도 있다 : 폴리스티렌, 폴리페놀산, 에폭시 또는 폴리아크릴레이트, 이중, 폴리스티렌 및 폴리아크릴레이트 타입이 바람직하다. 이들 수지는 이에 일반적으로 1급, 2급 또는 3급 아미노 그룹, 즉 -NH2, NHR 또는 -NR2[여기에서, R은 치환된 알킬 그룹(바람직하게는 C6-12)를 포함하는, 어떠한 알킬 그룹(바람직하게는 C1-10)도 가능하다]을 부착한다. 이들은 암벨라이트
Figure kpo00001
(Amberlite
Figure kpo00002
) RA 계열(Rohm ＆ Hass), 듀오라이트(Duolite) A 300 계열(Duolite) 및 다이아이온(DLAION WA)계열(Mitsubish Chemical Industries)을 예로 들 수 있다. 두가지의 특히 바람직한 약 염기 수지는 이오낙
Figure kpo00003
(Ionac
Figure kpo00004
) A-365(아크릴레이트 유형) 및 암벨라이트 IRA이다. 이오낙
Figure kpo00005
A-365[참조 : Ionac의 지사인 Sybron에 의해 제조됨]는 다공성 젤루라(gelular) 비이드(bead) 구조를 갖는 약 염기성 폴리 아크릴레이트계 음이온 교환 수지이다. 암벨라이트
Figure kpo00006
IRA-68은 3급 아민 그룹만 함유한 약 염기성, 젤루라, 아크릴, 음이온 교환 수지이다.
양족성 이온-교환 수지는 표면에 아미노 및 페놀성 하이드록실 그룹을 갖는 다공성 방향족 중합체이며 HS 및 KS수지(Hokuetsu Carbon Industries)로써 예시된다.
D-수지는 다공성 유형의 페놀성 수지의 표면에 아민 및 페놀 그룹 모두를 함유한 바람직한 양족성 이온-교환 수지이다. 이 수지는 강산 또는 염기의 염을 분리할 수는 없다. 그러나, D-수지는 약산 또는 염기인 물질을 흡착할 수 있다. D-수지는 산성 또는 중성 pH 조건에서 흡착에 대해 유효하다. 흡착된 물질의 용출은 알칼리 용액중에서 수행된다.
수지 처리 단계에 대한 바람직한 pH는 2.5 내지 8.0이다. 바람직한 온도범위는 20 내지 70℃이다. 바람직한 공급율은 3 내지 5, 더욱 바람직하게는 4수지 용적(ℓ)/hr이다. 바람직한 공급 용적은 다음과 같다.
Figure kpo00007
비처리 발효액을 직접 이들 수지로 처리하면, 단백질, 색소, 핵산 오일로 비가역적으로 침착되거나 활성표면을 덮도록 흡착되어 그의 활성을 상당히 감소시킨다. 그외에, 산, 알칼리 또는 알코올을 재생제로서 사용한 경우 이들 오염물질은 변성의 결과로서 응고하여 수지를 막히게 하여 종종 그의 재생을 불가능하게 한다.
본 발명자들은 아미노산 발효액을 한외여과막에 통과시킨 뒤 생성된 유출액을 이들 수지로 처리하여, 소수엄 물질의 탈색 또는 제거를 매우 효율적으로 수행할 수 있다고 밝혀내었다. 수지 처리 전후 발효액의 성질을 비교하면 약 280 내지 350㎚(근자외선 영역)에서의 UV흡수가 급격히 떨어짐과 겔 크로마토그라피시 분자량 약1,000 내지 3,000인 물질의 제거를 알 수 있다. 소수성 크로마토그래피(메탄을 구배 기술)도 또한 약 30 내지 50%의 메탄올 농도에서 용출된 고 소수성 물질의 제거는 물론 형광물질의 현격한 감소를 보여주며, 이는 벤젠 또는 푸린환을 함유하는 소수성 물질의 유효한 제거를 나타낸다. 부수적 효과로서, 농축중 비등의 현격하게 감소되어, 농축조작을 훨씬 용이하게 한다. 따라서 발명자들은 예비처리로서 한외여과 및 흡착성 수지로의 처리를 포함한 단순한 공정에 의해 고-순도의 아미노산 결정을 얻는데 성공했다.
이제까지 본 발명은 일반적으로 기술되었으며, 단지 본 발명을 설명하기 위함이며 특별한 언급이 없는 한 본 발명 또는 이의 어떠한 양태도 제한하는 것은 아닌 특정 실시예를 참조하여 더욱 잘 이해될 수 있다.
[실시예]
[실시예1]
본 실시예중에 사용된 L-알라닌(L-Ala) 함유 발효액은 기질로서 L-아스파르트산(L-Asp)을 사용하여 교반기가 장치된 반응 탱크중에서 효소적 반응으로 수득한다. 본 반응은 높은 L-아스파르테이트β-카복실라제 활성(EC 4.1, 1,12)을 갖는 슈도모나스 균주 제618번(ATCC 19121)에 의해 촉매화 된다.
발효액을 수돗물로 L-Ala 농도를 99g/l(반응되지 않은 L-Ala : 0.13g/l)로 희석시키고, 95% 황산으로 pH를 3.3으로 조정하고, 재생-셀룰로즈 한외여과막(공칭 분획 분자량 : 10,000)에 통과시켜 현탁된 고형물, 오일 및 중합체 물질들을 제거한다.
그렇게 수득된 맑은 용액을 OH-형 암벨라이트 IRA-68로(약염기성 음이온-교환수지) 충전된 칼럼에 통과시켜 잔여 L-Asp, 기타 음이온 및 색소를 제거한다. L-Ala의 총 부하는 600g/l·수지이다.
칼럼으로부터의 유출액은 35% 염산으로 pH 6.0으로 중화시키고 감압하에서 110g/l의 L-Ala농도까지 농축시킨다. 생성된 용액은 감압하에 75℃에서 교반기가 장치된 카란트리아 증발기에서 최종 L-Ala 농도가 620g/l로 되도록 추가로 농축시킨다. 이렇게 수득된 농축 슬러리를 교반기가 장치된 재킷결정화기에 옮겨 넣고, 여기서 10℃로 냉각시켜 결정화를 완료한다. 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 넣어 결정과 모액으로 분리한다. 결정 케이크를 바스켓중에서 수돗물 (L-Ala 100㎏에 대해 11.8ℓ)을 사용하여 원심세정을 한다. 이로써 수득된 L-Ala 결정의 순도는 99% 이상이며(L-Asp의 함량 : 0.01%미만) 결정 수용액의 투과율은 97%이다.
상기의 분리된, L-Ala 135g/l를 함유한 모액을 감압하의 75℃에서 교반기가 장착된 카란드리아 증발기에서 136g/l의 L-Ala 농도까지 농축시키고 생성된 슬러리를 교반기가 장치된 재킷 결정화기에서 10℃까지 냉각시키고 그렇게 형성된 제2의 결정을 바스켓-형 원심분리기 중에서 모액으로부터 분리시키고, 결정 케이크를 수돗물 (100㎏의 L-Ala에 대하여 26.1ℓ)을 사용하여 원심 세정시킨다.
L-Ala의 총 수득율(제1 및 제2결정의 합)은 원액에 함유된 양을 기준으로 94.3%이다.
[비교 실시예 la] 　
실시예 1에서 기술한 L-Ala의 동일한 효소 반응액을 사용하여, 맑은 투과액을 pH 6.0으로 조정하고; 수지 처리 없이 직접 농축시키고, 제1결정을 실시예1에서와 동일한 방법으로 수득한다. 결정의 순도는L-Asp를 0.08% 포함한 98.7%이며, 광선 투과율은 91.9%이다. 제1 및 제2결정을 포함한 L-Ala의 총 수득율은 91.9%이며; 두가지 결정모두 실시예 1과 비교하여 미세 결정이다. 이런 결과는 L-Asp로부터 유도된 결정의 지연 성장에 의해 유발된 것으로 추측된다.
[실시예 2]
L-이소루신(L-Ile) 21g/l 함유 발효액을 35% 염산으로 pH 3.0으로 조정하고, 한외여과막(공칭 분획 분자량 : 6,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다.
이로써 수득된 맑은 용액을 시약 C로 충전된 칼럼에 통과시켜 색소 및 형광 물질을 제거한다. L-Ile의 총 부하는 720g/l·수지이다.
컬럼으로부터 탈색된 유출액을 감압하의 50℃에서 회전증발기중에서 200g/l의 최종 L-Ile농도까지 농축시킨다. 농축된 슬러리를 27% 가성 소다 용액으로 pH 5.6으로 중화시키고 교반기가 장치된 결정화기에 옮겨넣고, 프로그램된 제어하에 50에서 20℃로 냉각시켜 결정화를 수행한다. 이로써 수득된 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 넣고 결정 및 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 수돗물 (L-Ile 300g에 대해 60㎖)을 사용하여 바스켓 중에서 원심 세정시킨다. 수득된 L-Ile 결정의 순도는 95%이며 그 결정의 수용액의 투과율은 94%이다.
L-Ile 34g/l를 함유한 상기 분리된 모액은 감압하에 L-Ile 농도를 100g/l까지 농축시키고, 생성된 슬러리를 교반기가 장치된 결정화기중에서 10℃까지 냉각시키며, 이렇게 형성된 제2결정을 수돗물(30g의 L-Ile에 대하여 10㎖)을 사용하여 바스켓-형 원심 세정중에서 모액으로부터 분리시킨다.
L-Ile의 총 수율(제1 및 제2결정의 합)은 원액중에 함유된 양을 기준으로 94.3%이다.
원 발효액을 한외여과로만 예비처리하였을 때(시약 D를 제외시켜 처리함), 최종 결정의 순도는 92%, 수율은 89%이며 수성 용액의 투과율은 34%이다.
원심분리하여 된 발효액에서 미생물 세포를 분리시킨 후 시약 D로 처리한 경우, 최종 결정의 순도는 87%, 수율은 90%이며 수성 용액의 투과율은 72%이다.
[비교 실시예 2a]
실시예 2에 기술한 바와 동일한 L-Ile 발효액을 사용하여, 강산성 양이온 교환수지(Na형)로 충전된 칼럼에 맑은 투과액을 통과시켜 양이온으로서 L-Ile을 흡착시키고 L-Ile을 0.5N-수산화나트륨 용액으로 용출시킨다. 칼럼으로부터의 용출액을 실시예 2에서와 동일한 방법으로 농축 및 결정화 시킨다. 이로써 수득된 결정의 순도는 92%(L-Ile)이며; 광선 투과율은 49%이다.
[비교 실시예 2b]
실시예 2에서 기술한 동일 L-Ile발효액을 사용하여, 맑은 투과액을 27% 수산화나트륨 용액으로 pH 5.3으로 조정한 후, 수지 처리시키지 않고 실시예 2에서와 동일한 방법을 사용하여 직접 농축 및 결정화시킨다. 생성된 결정의 순도는 87% L-Ile이며; 광선 투과율은 12%이다. 이들 결정은 너무 미세하여 거의 분리할 수가 없다.
[비교 실시예 2c]
실시예 2에서 기술한 L-Ile의 동일한 발효액을 사용하여, pH 조정후, 연속 원심분리기로 미생물 세포를 분리하고, 맑지 않은 상등 부유액을 수득한다. 본 액을 실시예 2에서와 같이 HS 수지로 충전된 칼럼에 통과시킬 때, 침전물은 수지의 상층에서 융착되어, 유동율은 점점 감소된다. 따라서, 역세척이 필요하다. 칼럼으로부터의 유출액을 실시예 2에서 기술한 바와 동일 방법으로 농축 및 결정화시킨다. 그렇게 수득된 결정의 순도는 82% L-Ile이고; 광선 투과율은 67%이다.
[실시예 3]
L-트레오닌(L-Thr) 50g/l 함유 발효액을 35% 염산을 사용 pH 3.0으로 조정하고, 한외여과막(공칭분획 분자량; 6,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거시킨다.
이로써 수득된 맑은 용액을 시약 D로 충전된 칼럼에 통과시켜 색소 및 형광물질을 제거한다. L-Thr의 총 부하는 1,000g/l·수지이다.
컬럼으로부터의 탈색된 유출액을 감압하에 27% 가성 소오다 용액으로 pH 5.6까지 중성화시킨 후 L-Thr 농도가 120g/l로 되도록 감압하에 50℃에서 회전 증발기 상에서 농축시킨다. 시드(seed) 결정(10%)을 가하고 350g/l의 최종 농도까지 더욱 농축시킨다. 농축된 슬러리를 교반기가 장치된 결정화기에 이동시켜, 프로그램된 제어하에 50에서 20℃로 냉각하여 결정화한다. 수득된 슬러리를 바스켓-형 원심 분리기에 넣어 결정과 모액으로 분리한다. 결정 케이크를 수돗물(L-Thr 300g에 대해 150㎖)을 사용하여 바스켓중에서 원심세정해준다. 이로써 수득된 L-Thr 결정의 순도는 97%(효모세린 함량 : 2%) 이상이며 수율은 원 발효액에 함유된 함량을 기준하여 83%이다.
[실시예 4]
L-발린(L-Val) 65g/l을 함유하는 발효액을 35% 염산으로 pH 3.0으로 조정하고, 한외여과막(공칭 분획 분자량 ; 6,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다.
이로써 수득된 맑은 용액을 시약 D로 충전된 칼럼에 통과시켜 색소 및 형광물질을 제거한다. L-Val의 총 부하는 1,200g/l·수지이다.
칼럼으로부터의 탈색된 유출액을 50℃에서 환류증발기중에서 최종 L-Val농도가 200g/l가 될 때까지 농축시킨다. 농축된 슬러리를 27% 가성 소다 용액으로 pH 5.6까지 중화시키고 교반기가 장치된 결정화기에 옮겨서, 프로그램된 제어하에 50에서 10℃로 냉각시켜 결정화를 수행한다. 그렇게 수득된 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 넣어 결정 및 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 수돗물(L-Val 240g에 대해 50㎖)을 사용하여 원심 세정시킨다. 그렇게 수득된 L-Val 결정의 순도는 96%이상이다.
L-Val 50g/l를 함유한 상기 분리된 모액을 감압하의 50℃에서 L-Val 농도가 106g/l로 되도록 농축시킨다. 그와 같이 수득된 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에서 결정 및 모액으로 분리시킨 후, 생성된 제2결정의 케이크를 수돗물 (L-Val 30g에 대해 10㎖)로 원심세정시킨다.
L-Val의 총 수율(제1 및 제2결정의 합)은 원 발효액에 함유된 양을 기준으로 91.3%이다.
[실시예 5]
L-히스티딘(L-His) 23g/l 함유하는 발효액을 35% 염산으로 ph 3.0으로 조정하고, 한외여과막(공칭분획 분자량 : 6,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다.
이로써 수득된 맑은 용액을 시약 D로 충전된 칼럼에 통과시켜 색소 및 형광 물질을 제거한다. L-His 총 부하는 900g/l·수직이다.
컬럼으로부터의 탈색된 유출액을 감압하 50℃에서 회전 증발기상에서 최종 L-His 농도가 250g/l/가 되도록 농축시킨다. 농축된 슬러리를 교반기가 장치된 결정화기에 옮겨서, 프로그램된 제어하에 50 내지 10℃로 냉각시켜 결정화를 수행한다. 수득된 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 넣고 L-His·HCL·H2O의 결정 및 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 수돗물 (L-His·HCL·H2O 400g에 대해 80㎖)을 사용하여 바스켓 중에서 원심세정시킨다. 그렇게 수득된 결정의 순도는 99% 이상이고 수율은 원발효액 중에 함유된 총량을 기준으로 82%이다.
[실시예 6]
L-트립토판(L-Trp) 20g/l 함유하는 발효액을 60% 황산을 사용하여 pH 4.0으로 조정하고, 한외여과막(폴리설폰 : 분획 분자량 : 6,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다.
이로써 수득된 맑은 용액을 시약 D(m-페닐렌디아민과 레졸시놀의 축합에 의해 제조된 양족성 이온-교환 수지)로 충전된 칼럼에 통과시켜 L-Trp로부터 유도된 색소를 제거한다. L-Trp부분은 본 조작중 시약제 D에 흡착시켜, 이는 탈이온수를 칼럼에 통과시켜 회수한다. L-Trp의 총 부하는 500g/l·수지이다.
흡착된 L-Trp를 회수하기 위해 세정된 수성 용액을 주 유출액과 혼합하고, 혼합된 용액을 5% 가성 소다 용액으로 pH 4.0까지 증화시키고 감압하의 45℃에서 교반기가 장치된 카란드리아 증발기상에서 L-Trp농도가 150g/l가 될 때까지 농축시킨다. 농축된 슬러리를 교반기가 장치된 재킷 결정화기에 넣고 45에서 5℃로 냉각시켜 완전히 결정화시킨다.
그렇게 수득된 냉각 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 충전시키고, 결정 및 모액으로 분리한다. 결정 케이크를 탈이온수(L-T 100㎏에 대하여 90ℓ)를 사용하여 바스켓 중에서 원심세정시킨다. 수집한 결정을 교반기가 부착된 결정화기 중에서 탈이온수(결정 100㎏에 대하여 400ℓ)로 슬러리화하여 슬러리를 20℃에서 한시간 동안 교반시킨후, 바스켓-형 원심분리기에서 결정 및 모액으로 분리한다. 결정 케이크를 다시 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대하여 90ℓ)를 사용하여 바스켓중에서 원심세정시킨후 감압하 40℃에서 트레이 건조기내에서 건조시킨다. 수율은 72%이며 결정의 순도는 99.9%(기타 아미노산 함량 : 0.01%미만)이다. 탈이온수 100㎖중의 결정1g 용액의 투과율은 93%이다.
[비교 실시예 6a]
L-트립토판(L-Trp) 20g/l 함유하는 발효액을 60% 황산으로 pH 4.0까지 조정하고, 한외여과막(폴리설폰 ; 분획 분자량 : 6,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다.
그렇게 수득된 막은 용액을 감압하 45℃에서 교반기가 장치된 카란드리아 증발기중에서 L-Trp 농도가 100g/l가 될 때까지 농축시키고 농축된 슬러리를 교반기 장치된 재킷 결정화기에 옮겨서, 45에서 5℃로 냉각시켜 완전히 결정화시킨다.
수득된 슬러리를 바스켓-형 원심분리기중에서 결정 및 모액으로 분리시키고, 결정 케이크를 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대해 90ℓ)로 바스켓중에서 원심 세정시킨다. 수집된 결정을 교반기 장치된 재킷 결정회기 중에서 탈이온수(결정 100㎏에 대해 400ℓ)로 슬러리화한 후, 그 슬러리를 0℃에서 1시간 동안 교반시키고 나서 바스켓-형 원심분리기중에서 결정과 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 다시 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대해 90ℓ)로 바스켓 중에서 원심 세정시킨후 감압하 40℃에서 트레이 건조기중에서 건조시킨다. 수율은 66%이며 결정의 순도는 98.2%(기타 아미노산의 함량 : 0.1%미만)이다. 탈이온수 100㎖중 결정 1g 용액의 투과율은 9.2%이다.
다음과 같이 추가로 계속 정제한다 : 상기 수득된 결정을 다시 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대해 1,000ℓ)로 슬러리화시키고, 그 슬러리를 35℃까지 가열하여 용액을 60% 황산으로 pH 2.0으로 조정한다. 활성탄(L-Trp 100㎏에 대해 20㎏)을 용액에가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반시키고 여과한다. 그 여과액을 35℃로 유지시키면서 10% 가성 소다 용액을 서서히 가하여 pH 6.0으로 중화시켜 결정화를 수행하도록 하며, 생성된 슬러리를 5℃ 이하로 냉각시킨다.
그와 같이 수득된 냉각 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 넣고 결정 및 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대해 90ℓ)를 사용해 바스켓 중에서 원심세정 시킨다. 수집된 결정을 교반기가 장치된 재킷 결정화기내에서 탈이온수(결정 100㎏에 대해 400ℓ)로 슬러리화한 후, 그 슬러리를 20℃에서 1시간 동안 교반시킨 뒤 바스켓-형 원심분리기중에서 결정 및 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 다시 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대하여 90ℓ)로 바스켓중에서 원심 세정시킨 후 감압하 40℃에서 트레이 건조기내에서 건조시킨다. 수율은 76%이며 결정의 순도는 99.1%(기타 아미노산 함량 : 0.05% 미만)이다.
100㎖ 탈이온수중의 결정 1g 용액의 투과율은 20.5%이다.
[비교 실시예 6b]
L-트립토판(L-Trp) 20g/l을 함유하는 발효액을 60% 황산으로 pH 4.0으로 조정하고, 원심분리기에서 처리하여 미생물 세포를 제거한다.
부유액을 양이온-교환 수지(가교 결합도 : 4% : Na염형)로 충전된 칼럼에 통과시켜 총 L-Trp 부하가 150g/l·수지가 되게 L-Trp를 흡착시킨다. 흡착된 L-Trp는 27% 가성 소다 용액으로 pH 12.5 내지 13.0으로 유지시킨 용출액을 칼럼 바닥에서 칼럼에 도입하며 수지를 적당한 유동성으로 만들고 유출액을 칼럼 최상부로부터 용출 탱크로 되돌아가게 하여 용출시킨다. 이 수행을 2시간 동안 계속하고, 칼럼을 그후 0.5% 가성 소다 용액으로 처리한다. 수득된 고-농도 L-Trp 함유 용출액을 교반기 장치된 재킷 결정화기에 옮겨서, 45℃까지 가열하고 60% 황산으로 중화하여 결정화를 수행하며 냉각시켜 결정화를 완결시킨다.
수득된 냉각 슬러리를 바스켓-형 원심 분리기에 넣어 결정 및 모액으로 분리한다. 결정 케이크를 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대해 90ℓ)를 사용하여 바스켓상에서 원심 세정시킨다. 수집된 결정을 교반기 장치된 재킷 결정화기 중에서 탈이온수(결정 100㎏에 대해 400ℓ)로 슬러리화시켜, 그 슬러리를 20℃에서 1시간동안 교반시킨 뒤 바스켓-형 원심분리기 중에서 결정 및 모액으로 분리한다. 결정 케이크를 다시 탈이온수(L-Trp 100㎏에 대해 90ℓ)를 사용하여 바스켓중에서 원심세정시킨 뒤 감압하 40℃에서 트레이 건조기 중에서 건조시킨다. 수득율은 62%이며 결정의 순도는 99.9%(기타 아미노산의 함량 : 0.05% 미만)이다. 탈이온수 100㎖중의 결정 1g용액의 투과율은 15%이다. 생성물을 통상적 방법으로 추가로 정제시킨후 인지할만한 투과율 증가가 성취되지 않았다.
표 1에서 실시예 6-1, -2 및 -3중 수득된 결정에 대하여 투과율 및 기타 데이터를 나타낸다. 한외여과(UF) 처리와 시약 D를 혼용하여 얻어진 효과는 다음 표로부터 명백하다.
[표 1]
Figure kpo00008
[실시예 7]
L-발린(L-Val) 55g/l을 함유하는 발효액을 재생 셀룰로즈 한외여과막(공칭 분획 분자량 : 10,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다. 발효액의 용량은 3.84ℓ이고, 총 211g의 L-Val을 함유한다.
pH 7.5인 생성된 맑은 용액을 이오낙 A-365 약 염기성 이온 교환수지로 충전된 칼럼에 통과시켜 음이온성 불순물을 제거한다. 수지의 충전 용량은 1.0ℓ이고, 수지는 유리 염기 형태로 존재한다. L-Val의 총부하는 205g/l·수지이다. 칼럼으로부터의 유출액 pH는 8.2이다.
컬럼으로부터의 유출액을 감압하의 50℃에서 회전증발기상에서 농축시켜 암모니아를 제거한다. 최종 L-Va 농도는 75g/l이다.
농축된 용액의 pH를 35% 염산을 사용, 1.0으로 조정한다. 이후 pH 1.0에서 액체를 감압하에서 회전 증발기중 70℃에서 추가로 농축시켜 최종 L-Trp 농도가 300g/l가 되도록한다. 농축후, 용액은 680㎖의 용량을 가지며, L-Val 204g을 함유한다.
농축된 용액을 교반기가 장치된 결정화기에 옮긴 후 35% 염산 204㎖를 서서히 가하여 L-Val·HCL·H2O의 결정화를 수행한다. 염산의 첨가 완료후, 제어된 속도로 70℃에서 10℃로 냉각시켜 계속 결정화시킨다.
수득된 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 넣고, 결정 및 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 바스켓내에서 20% 염산 수용액 51㎖(L-Val 100g당 31.5㎖)를 사용하여 원심 세정시킨다.
L-Val·HCL·H2O 결정의 수율은 288.8g(습식 중량)(L-Val 유리 염기로서 179.3g)이다. 총 수율은 원 발효액 함량을 기준으로 85%이다.
[실시예 8]
L-이소루신(L-Ile) 24g/l을 함유하는 발효액을 재생 셀룰로즈 한외여과막(공칭 분획 분자량 : 10,000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다. 발효액의 용량은 3.55ℓ이고, 총85g의 L-Ile을 함유한다.
pH 7.4인 생성된 맑은 용액을 이오낙 A-365 약염기성 이온 교환 수지로 충전된 칼럼에 통과시켜 음이온성 불순물을 제거한다. 충전된 수지의 용량은 1.0ℓ이고, 수지는 유리 염기형태로 존재한다. L-Ile 총 부하는 139g/l·수지이다. 칼럼으로부터의 유출액은 pH 8.2이다.
컬럼으로부터의 유출액을 감압하의 50℃에서 환류 증발기상에서 농축시켜 암모니아를 제거한다. 최종 L-Ile농도는 40g/l이다.
농축된 용액의 pH를 35% 염산을 사용, 1.0으로 조정한다. 이후 pH 1.0에서 액체를 감압하에 회전 증발기중 70℃에서 추가로 농축시켜 최종 L-Ile 농도가 240g/l가 되도록 한다. 농축 후, 용액은 340㎖의 용량을 가지며, L-Val 82g을 함유한다.
농축된 용액을 교반기가 장치된 결정화기에 옮긴후 35% 염산 120㎖를 서서히 가하여 L-Ile·HCL·H2O의 결정화를 수행한다. 염산의 첨가 완료후, 제어된 속도로 70℃ 내지 10℃로 냉각시켜 계속 결정화시킨다.
수득된 슬러리를 바스켓-형 원심분리기에 넣고, 결정 및 모액으로 분리시킨다. 결정 케이크를 바스켓 내에서 20% 염산 수용액 30㎖(L-Ile 100g당 42㎖)를 사용하여 원심세정시킨다.
L-Ile·HCL·H2O 결정의 수율은 134.7g(습식 중량)(L-Ile 유리 염기로서 71.4g)이다. 총 수율은 원발효액중의 함량을 기준으로 84%이다.
상기 기술에 비추어 많은 본 발명의 개량 및 변경이 가능하다. 그러므로, 청구 범위내에서, 본 발명은 특정적으로 기술한 바와 다른 방법으로도 수행가능하다.
[실시예 9]
L-글루타민(L-Gin) 42g/l 함유 발효액의 pH를 35% 염산을 사용하여 5.6으로 조정한다. 이 액체를 평형 한외여과필름(공칭 분획 분자량 : 6000)에 통과시켜 미생물 세포 및 중합체 물질을 제거한다. 수득된 맑은 투과 액체를 그후, 약염기성 음이온 교환수지(암벨레아트 1RA-68)로 충전된 칼럼에 통과시켜 발효액중에 존재하는 색소, L-Glu(글루탐산), 피롤리돈 카복실산, 및 기타 음이온을 흡착시켜 제거한다.
수지상의 부하인자는 L-Gln 500g/l·수지이다. 수지로 처리된 삼투액을 감압하 45℃에서 회전 증발기로 농축시켜 결정화시킨다. 농축후 L-글루타민 농도는 280g/l이다. 슬러리를 교반기가 장치된 결정화 탱크에 붓고 45℃에서 10℃로 냉각시켜 결정화하여 바스켓-형 원심 분리기로 모액으로부터 분리시킨다. 생성된 결정 케이크를 바스켓 중에서, 결정 100g당 탈이온수 50㎖를 사용하여 원심세정시킨다. 본 결정의 순도는 L-글루타민 97%이고 발효액으로부터의 수율은 87.5%이다.

Claims (10)

  1. 발효 또는 효소적 방법에 의해 수득된 발효액을 한외여과막에 통과시킨후, 약염기성 음이온 교환 수지 및 양쪽성 이온 교환 수지로 이루어진 그룹 중에서 선택된 흡착성 수지내로 통과시켜 발효액중에 함유된 불순물을 제거하는 단계; 이로써 생성된 유출액을 농축하거나 냉각시켜, L-아미노산을 결정화하는 단계; 및 이러한 결정성 L-아미노산을 상기 발효액으로부터 분리하는 단계들을 포함하며, 발효 또는 효소적 방법에 의해 수득된 상기 발효액으로부터 고순도의 L-아미노산을 회수하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 한외여과막이 평 필름, 중공 섬유(hollow fiber), 관형 및 나선형 섬유로 이루어진 그룹중에서 선택된 형태를 갖는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 한외여과막이 폴리설폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리아크릴로니트릴, 및 셀룰로즈로 이루어진 그룹중에서 선택된 물질로 제조되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 한외여과막이 재생 셀룰로즈 또는 풀리설폰으로 제조되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 한외여과막이 6000 내지 50,000의 공칭 분획 분자량(nominal fractionating molecular weight)을 갖는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 약염기성 음이온-교환 수지가 각기 1급, 2급 또는 3급 아미노 그룹을 함유하는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴로니트릴로 제조되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 한외여과 단계를 pH 2.5 내지 8.0, 2.0 내지 70℃의 온도하에서, 4.0 내지 6.0바아(bar)의 유입 압력 및 1.0 내지 2.0바아의 유출 압력, 및 70ℓ/㎡/h 내지 150ℓ/㎡/h의 유량에서 수행하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 한외여과시키기 위한 아미노산 및 이의 농축액이 하기 그룹중에서 선택되는 방법.
    L-Ile : 20 내지 40g/l
    L-Trp : 20 내지 21g/l
    L-Ala : 95 내지 130g/l
    L-Val : 40 내지 70g/l
    L-Thr : 40 내지 90g/l
    L-His : 15 내지 40g/l
    L-Phe : 20 내지 30g/l
    L-Gln : 30 내지 50g/l
  9. 제1항에 있어서, 흡착성 수지를 이용하는 단계를 pH 2.5 내지 8.0, 2.0 내지 70℃의 온도, 및 수지 3 내지 5ℓ/hr의 공급 속도하에 수행하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 흡착성 수지를 이용하는 단계에 사용하기 위한 아미노산의 공급 용량이 하기 그룹으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
    Figure kpo00009
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