DE3827159A1

DE3827159A1 - Verfahren zur gewinnung von l-aminosaeuren aus fermentationsfluessigkeiten

Info

Publication number: DE3827159A1
Application number: DE3827159A
Authority: DE
Inventors: Shigenori Mori; Kinozo Iitani; Masaki Yamamoto; Masashi Miyazawa; Toyokazu Kaneko; Tetsuya Kaneko; Kenichi Yarita
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1987-08-10
Filing date: 1988-08-10
Publication date: 1989-03-30
Anticipated expiration: 2008-08-11
Also published as: JP2638971B2; FR2619380B1; JPH01112991A; FR2619380A1; DE3827159C2; US5017480A; KR950009318B1; KR890003956A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von L-Aminosäuren aus Fermentationsflüssigkeiten, die diese Aminosäuren enthalten.

Flüssigkeiten der fermentativen Herstellung von L-Amino säuren enthalten große Mengen mikrobieller Zellen und löslicher Proteine, die aus den Flüssigkeiten entfernt werden müssen, da sie das Wachstum von Aminosäure-Kri stallen verlangsamen und darüberhinaus auch in anderer Weise die effiziente Gewinnung der produzierten Aminosäu re negativ beeinflussen.

Eine Vielzahl anderer Verunreinigungen (anorganische Sal ze, Zucker, Pigmente und dgl.), die aus dem verwendeten Kulturmedium und dem Stoffwechsel der eingesetzten Mikro organismen stammen, sind ebenfalls in der Fermentations flüssigkeit enthalten. Diese müssen auch durch ausgeklü gelte Kombinationen verschiedener Isolations- und Reini gungstechniken entfernt werden. Dafür kommen beispiels weise Verfahren wie Ionenaustausch, Behandlung mit Aktiv kohle und Kristallisation infrage.

In der Vergangenheit wurde die Isolierung von Aminosäuren aus Fermentationsflüssigkeiten und deren Reinigung unter Einsatz der nachfolgenden Verfahrensschritte durchge führt: Bestandteile mikrobieller Zellen und andere unlös liche Verunreinigungen werden zuerst durch Zentrifuga tion, Filtration, Koagulation oder Sedimentation abge trennt. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wird dabei so eingestellt, daß die zu reinigende Aminosäure in kat ionischer Form vorliegt. Die in kationischer Form vorlie gende Aminosäure wird nachfolgend an ein stark saures Kationenaustauscher-Harz adsorbiert. Die adsorbierte Ami nosäure wird mit einer verdünnten alkalischen Lösung elu iert. Das Eluat wird mit Aktivkohle entfärbt, und die freie Aminosäure oder deren Salz wird dann in kristalli ner Form durch Konzentrieren, Kühlen oder Neutralisieren abgetrennt. Die so erhaltenen Kristalle können - sofern erforderlich - weiter durch Umkristallisieren gereinigt werden. Eine große Zahl von Aminosäuren wird in Verfah ren, die auf diesem Prozeß basieren, in industriellem Maßstab hergestellt. Darunter fallen Aginin, Glutamin, Histidin, Isoleucin, Lysin, Prolin, Threonin, Serin und Valin.

Bei Trennoperationen im industriellen Maßstab werden häu fig Zentrifugensedimentierer vom Düsenabscheider-Typ (centrifugal settlers, nozzle-discharge type), kontinu ierliche Zentrifugen-Trennabscheider und Siebmantel-Zen trifugen-Abscheider zur Entfernung mikrobieller Zellen und anderer unlöslicher Verunreinigungen verwendet. Vaku um-Filter und Druckfilter werden prinzipiell zur Filtra tion verwendet, wobei man ein Anschwemm-Filter aus Diato meen-Erde vorsieht.

Allerdings ist es schwierig, mikrobielle Zellen vollstän dig durch Zentrifugation zu entfernen. Darüberhinaus kön nen lösliche Proteine nicht auf dem Wege der Filtration entfernt werden. Dies verursacht in den nachfolgenden Verfahrensschritten verschiedene Probleme: So verstopfen die mit einem Ionenaustauscher-Harz gepackten Säulen; das Wachstum von Aminosäure-Kristallen wird verlangsamt; beim Erhitzen und Konzentrieren koagulieren denaturierte Pro teine, die nachfolgend die Kristalle der Aminosäure ver unreinigen und ihre Reinheit deutlich erniedrigen. Dies hat zur Folge, daß die Behandlung der Lösung mit einem Ionenaustauscher-Harz nicht so effizient ist, wie sie sein könnte. Zur Herstellung von Kristallen mit der ge wünschten Reinheit müssen daher die Aminosäuren wieder holt umkristallisiert werden.

Andererseits sind auch anionische Substanzen, Pigmente und Polymere, die als Verunreinigungen in den Fermenta tionsflüssigkeiten enthalten sind, verantwortlich für die Verlangsamung des Kristallwachstums, die Verringerung der Reinheit und die Verfärbung der abgetrennten Kristalle. Zur Entfernung derartiger Verunreinigungen wurden Maßnah men wie die Verwendung eines Anionenaustauscher-Harzes, eines amphoteren Ionenaustauscher-Harzes oder eines ad sorbierenden synthetischen Harzes ergriffen. Auch in die sem Fall neigen die oben erwähnten löslichen Proteine da zu, an diese Harze adsorbiert zu werden. Dadurch wird deren Adsorptionsaktivität deutlich vermindert und es oft unmöglich gemacht, derartige Harze zu regenerieren, da solche Verunreinigungen irreversibel adsorbiert werden.

Im Hinblick auf die oben geschilderten Nachteile der Ver fahrensweisen des Standes der Technik besteht weiterhin ein Bedarf für neue und verbesserte Verfahren zur Gewin nung hochreiner Aminosäuren aus Fermentationsflüssigkei ten.

Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Er findung, eine Verfahrenstechnik zu entwickeln, mit der sowohl mikrobielle Zellen als auch polymere Verunreini gungen aus Fermentationsflüssigkeiten, die zur Herstel lung von Aminosäuren verwendet werden, entfernt werden können.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Verfahrenstechnik zur Entfernung von solchen Stoffen aus Fermentationsflüssigkeiten zu entwickeln, die verantwortlich sind für die Verlangsamung des Kristall wachstums und die geringe Reinheit der abgetrennten Ami nosäure-Kristalle.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches Verfahren zur Gewinnung hochreiner Kri stalle von L-Aminosäuren bereitzustellen, das die Notwen digkeit der Verwendung eines Ionenaustauschers entfallen läßt.

Die Erfindung betrifft also ein Verfahren zur Gewinnung einer hochreinen L-Aminosäure aus einer Fermentations flüssigkeit, die im Rahmen der fermentativen Herstellung der Aminosäure oder bei einem enzymatischen Verfahren er halten wird, wobei das Verfahren folgende Verfahrens schritte umfaßt:

- Entfernen der in der Fermentationsflüssigkeit enthal tenen Verunreinigungen dadurch, daß man die Fermenta tionsflüssigkeit eine Ultrafiltrationsmembran und an schließend ein Ionenaustauscher-Harz oder ein Adsor ber-Harz passieren läßt,
- Konzentrieren oder Kühlen des so erhaltenen Ultrafil trates unter Kristallisieren der L-Aminosäure und
- Isolieren der kristallinen L-Aminosäure aus der Fer mentationsflüssigkeit.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung können hochreine Kristalle einer Aminosäure aus Fermentationsflüssigkeiten durch ein einfaches Verfahren gewonnen werden, wenn die in den Flüssigkeiten enthaltenen Verunreinigungen dadurch beseitigt werden, daß man die Fermentationsflüssigkeiten eine Ultrafiltrationsmembran und anschließend ein Ionen austauscher-Harz oder ein Adsorber-Harz passieren läßt. Das so erhaltene Ultrafiltrat wird anschließend konzen triert oder gekühlt.

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt die Auswirkung der Gegenwart von Verunrei nigungen in der Fermentationsbrühe auf das Wachstum von Lysin-Kristallen.

Fig. 2 zeigt die Entfärbungsfähigkeit von D-Harz und Aktivkohle als Funktion des pH-Wertes.

Fig. 3 zeigt die Entfärbungkurven für Aktivkohle, D-Harz und andere Harze als Funktion der Volumenmenge zugeführ ter gefärbter Lösung.

Fig. 4 und 5 zeigen Entfärbungskurven für das D-Harz.

Fig. 6 zeigt ein Flußdiagramm über die Bildung von Farb stoffen in Fermentationsbrühen.

Nach allgemeiner Auffassung liegt die Zellgröße typischer Mikroorganismen der Gattung Escherichia bei 1,5 bis 1,1 µm, der Gattung Staphylococcus bei 1,0 bis 0,5 µm und der Gattung Pseudomonas, der kleisten von allen genann ten, bei 1,0 bis 0,22 µm. Andererseits liegt die Aus schlußgrenze der Teilchengröße bei der Verwendung von Anschwemmfiltern allgemein bei 1,0 µm. Bei Proteinen liegt die Molekülgröße beispielsweise von Albumin mit einem Molekulargewicht von 67 000 bei etwa 30 A (= 0,003 µm) und bei Cytochrom C mit einem Molekulargewicht von 13 000 bei etwa 20 A (=0,002 µm). Es ist offensichtlich, daß diese Verunreinigungen im industriellen Maßstab nicht vollständig unter Verwendung von Zentrifugen-Sedimenta tion oder Filtrationsverfahren mit einem Anschwemmfilter beseitigt werden können.

Die Ultrafiltration beruht, anders als die übliche Fil tration, vom Grundsatz her auf Diffusionsvorgängen. Sie kann daher bei Fraktionierungsproblemen bei Teilchen mit einem Molekulargewichtsbereich von 300 000 bis 1000 eingesetzt werden. Man bedient sich Ultrafiltrationsmem branen mit unterschiedlichen Porengrößen. Jüngst wurde diese Technik zur Behandlung von Wasser und zur Reinigung von Molke bei der Käseherstellung eingesetzt. Diese Ver fahrensweise wird außerdem auf dem Gebiet der Biochemie zur Reinigung von Proteinen und für andere Zwecke umfas send eingesetzt. Viele wissenschaftliche Berichte haben die Verwendung der Ultrafiltration zur chemischen Her stellung hochreiner Proteine und zur Entfernung von Endotoxinen offenbart.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde versucht, die Ultrafiltration auf das Problem der Entfernung mikrobi eller Zellen und löslicher Proteine anzuwenden, die in Fermentationsflüssigkeiten enthalten sind. Es wurde ge zeigt, daß das Naß-Zell-Volumen auf 70 bis 80% konzen triert werden kann und daß bis 99,5% löslicher, nieder molekularer Substanzen, wie beispielsweise Aminosäuren, gewonnen werden können, wenn das Konzentrat, das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, mit Wasser verdünnt und anschließend nochmals ultrafiltriert wird. Das bei der Filtration durch eine Ultrafiltrationsmembran resultierende Ultrafiltrat ist transparent. Es wurde die Abscheidung einiger Pigmente und eine Erniedrigung der Viskosität beobachtet.

Ein bei den herkömmlichen Filtrationsverfahren immer wie der auftretendes Problem ist der stufenweise Rückgang der Filtrationsgeschwindigkeit aufgrund einer Verstopfung des verwendeten Filters. Bei der Durchführung der Ultrafil tration hat die verwendete Membran andererseits nur eine geringere Tendenz zur Verstopfung. Dies ist auf die spe zielle Arbeitsweise der Verfahrens (Permeation durch Diffusion) zurückzuführen. Verunreinigende Stoffe, die sich an der Membran-Oberfläche ansammeln, können effi zient dadurch beseitigt werden, daß man immer fur einen Flüssigkeitsstrom einer bestimmten Stärke sorgt. Dies kann durch Rühren der zu behandelnden Lösung oder Hochge schwindigkeits-Umwälzung bewirkt werden. So wird zu jeder Zeit eine stabile Geschwindigkeit der Permeation sicher gestellt. Die Membranen können außerdem mit üblichen Rei nigern gereinigt werden, die dem Membran-Material ange paßt sind. Infrage kommen verdünnte alkalische Lösungen, verdünnte Lösungen von Natriumhypochlorit, im Handel er hältliche Reiniger und spezifische Reinigungsmittel, die von den Membranherstellern geliefert werden. Ein Gewin nungsgrad von 95 bis 98%, bewertet nach der Permeations geschwindigkeit reinen Wassers, kann auf diesem Wege erzielt werden.

Ultrafiltrationsmembranen können in jeder bekannten Form eingesetzt werden. Darunter fallen Membranen in Form eines ebenen Filmes, einer Hohlfaser, einer Hohlröhre oder einer Spirale. Die Membranen können auch aus jedem beliebigen Material bestehen. Bevorzugte Materialien sind Polysulfon, Polyvinylidenfluorid, Polyacrylnitril und Cellulose. Am meisten bevorzugt als Ultrafiltrationsmem branen sind flache Membranen oder Membranen vom Hohlfa ser-Typ aus Polysulfon oder Cellulose.

Der pH-Wert und die Temperatur der zu behandelnden Fer mentationsflüssigkeit sind in gewisser Weise beschränkt durch die Materialien der Geräte und der verwendeten Ultrafiltrationsmembran. Aus Polysulfon bestehende Mem branen können allerdings über einen breiten Bereich der Temperatur und des pH-Wertes, beispielsweise von 15 bis 80°C und in einem pH-Wert-Bereich von 1 bis 14, verwen det werden und zeigen daher in der Praxis keine Probleme. Ein bevorzugter pH-Wert-Bereich liegt bei 2,5 bis 8,0. Ein bevorzugter Temperaturbereich liegt bei 20 bis 70°C.

Der während des Betriebs der Ultrafiltrationsmembran auf gebrachte Druck liegt bevorzugt bei 4,0 bis 6,0 bar am Einlaß und bei 1,0 bis 2,0 bar am Auslaß. Bei der Frak tionierung liegt der Molekulargewichts-Bereich vorzugs weise bei 6000 bis 50 000, noch mehr bevorzugt bei 6000 bis 10 000. Die Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit liegt im Bereich von 70 bis 150 l/m²×h.

Optimale Konzentrationen der Aminosäuren in der Fermenta tionsbrühe sind die folgenden:

L-Ile:
20 bis 40 g/l
L-Trp:	20 bis 21 g/l
L-Ala:	95 bis 130 g/l
L-Val:	40 bis 70 g/l
L-Thr:	40 bis 90 g/l
L-His:	15 bis 40 g/l
L-Phe:	20 bis 30 g/l und
L-Gln:	30 bis 50 g/l

Das die Ultrafiltrationsmembran passierende Filtrat wird anschließend im Folgeschritt von den darin verbliebenen Verunreinigungen befreit. Es folgt dann die Kristallisa tion. In herkömmlichen Verfahren wird im allgemeinen ein Kationenaustauscher-Harz für die Abtrennung der Verunrei nigungen verwendet. Der pH-Wert des Filtrats wird so ein gestellt, daß die der Reinigung unterzogene Aminosäure in die kationische Form überführt wird. Die auf diesem Wege gebildete, in kationischer Form vorliegende Aminosäure wird an ein stark saures Kationenaustauscher-Harz adsor biert, um mit der auslaufenden Flüssigkeit die Verunrei nigungen zu entfernen. Die adsorbierte Aminosäure wird durch Elution mit einer alkalischen Lösung gewonnen.

Dieses Verfahren stellt eine ausgezeichnete Verfahrens weise dar, die die Basizität der Aminogruppe der Amino säure ausnutzt. Das Verfahren ist jedoch unbefriedigend hinsichtlich seiner Selektivität, da alle Stoffe, die in Kationen überführt werden können, zusammen mit der zu isolierenden Aminosäure an das Harz adsorbiert werden. Darüberhinaus hat das für diesen Zweck üblicherweise ver wendete Kationenaustauscher-Harz eine aus einem Styrol- Divinylbenzol-Copolymer-Grundgerüst bestehende Struktur und neigt daher dazu, hydrophobe Stoffe, beispielsweise Pigmente und Proteine, zu adsorbieren. Dies beruht dar auf, daß der Teil des Harz-Moleküls, der nicht aus Kat ionenaustauscher-Gruppen (Sulfonsäure-Gruppen) besteht, stark hydrophob ist. Bei Kontakt mit einem Eluens, bei spielsweise einer alkalischen Lösung, werden diese adsor bierten kationischen und hydrophoben Stoffe aufgrund des Wechsels in der elektrischen Ladung und der Ionenstärke größtenteils eluiert. Daher ist die Wirkung in der Besei tigung von Verunreinigungen ziemlich niedrig, wenn man in Relation dazu die umständlichen Verfahrensschritte, die durchgeführt werden (Adsorption und Elution), die großen Mengen verbrauchter Säuren und alkalischer Lösungen und das riesige Volumen abfließendes Abwasser betrachtet.

Der Vorteil des fermentativen Aminosäure-Herstellungsver fahrens über den Weg des Protein-Abbaus liegt darin, daß nur eine Art von Aminosäure durch Kultivieren des spezi fischen Mikroorganismus in hoher Konzentration in der Fermentationsflüssigkeit gebildet werden kann. Der Fort schritt in den Techniken der Züchtung von Mikroorganis men-Stämmen ist in den vergangenen Jahren bemerkenswert gewesen. Es ist ein Resultat dieses Fortschritts, daß die Bildung von Nebenprodukten in fermentativen Prozessen deutlich abgenommen hat. Insbesondere wird bei Einsatz enzymatischer Methoden ein Nebenprodukt in einigen Fällen überhaupt nicht gebildet. Folglich verliert das herkömm liche Verfahren unter Verwendung eines Kationenaustau scher-Harzes schnell seine Bedeutung im Hinblick auf den chemischen Verfahrensablauf, die Einsparung von Energie und die Belastung der Umwelt.

Unter Berücksichtigung der oben genannten Fakten ergibt sich das Problem, daß hochreine Kristalle einer Aminosäu re nicht dadurch erhalten werden können, daß man die Flüssigkeit der fermentativen Herstellung dieser Amino säuren, nachdem sie gerade von mikrobiellen Zellen be freit wurde, konzentriert oder abkühlt. Beispielsweise enthält die Fermentationsflüssigkeit der Tryptophan-Her stellung große Mengen an hydrophoben Stoffen und Pigmen ten, die durch den oxidativen Abbau und die Polymerisa tion des Indol-Rings gebildet werden. Diese beeinträchti gen nicht nur das Wachstum der Kristalle, so daß nur fei ne Kristalle entstehen, sondern werden auch in die abge trennten Kristalle eingebaut und können auch durch Umkri stallisieren nicht effizient entfernt werden. In Fermen tationsflüssigkeiten der Alanin-Herstellung bleibt Aspa raginsäure als Verunreinigung zurück und beeinträchtigt das Wachstum der Kristalle, so daß nur sehr feine Kri stalle entstehen. Außerdem wird Asparaginsäure in die abgetrennten Alanin-Kristalle eingebaut. Das gleiche trifft auf Fermentationsflüssigkeiten der Isoleucin- und Valin- Herstellung zu. Beim Konzentrieren wird die Flüs sigkeit trüb. Die gebildeten Verunreinigungen werden in die abgetrennten Kristalle eingebaut, wodurch sich deren Reinheit stark erniedrigt.

Es wurde nun gefunden, daß zwei Gruppen von Stoffen für eine derartige Verunreinigung der Aminosäure-Kristalle verantwortlich sind. Eine Gruppe betrifft polymere Stoffe mit einem Molekulargewicht von 10 000 und darüber, bei spielsweise lösliche Proteine, Nucleinsäuren und Polysac charide. Es wurde gezeigt, daß diese polymeren Stoffe durch Denaturierung und Koagulation als Ergebnis von Er hitzen oder Wechsel des pH-Wertes und der Ionenstärke leicht unlöslich werden. Dadurch lagern sie sich auf der Kristalloberfläche ab oder verunreinigen die Aminosäure- Kristalle in anderer Weise und erniedrigen damit signifi kant deren Reinheit. Unter diese Klasse von Verunreini gungen fallen beispielsweise 2-Acetyl-Pyrrol, 2,5-Dime thyltetrahydrofuran, 2-Hydroxymethylimidazol, 2-n-Butyl tetrahydrofuran, Furfurylalkohol, Indol, Butyrolactam, Trimethylhydrazin, Essigsäure, Aceton, Butylamin und Propionsäure. Die Mehrheit dieser Verunreinigungen sind Vorstufen für Farbstoffe, die eine UV-Absorption im Wel lenlängenbereich von 280 bis 340 nm zeigen.

Unter die andere Gruppe von Substanzen, die verantwort lich für die Verunreinigung der Aminosäure-Kristalle sind, fallen Pigmente und hydrophobe Stoffe mit niedrigen Molekulargewichten, die während einer Kristallisation einer Aminosäure an die wachsenden Kristalloberflächen adsorbiert werden und damit das Kristallwachstum verlang samen. Dadurch werden feine, flache und zusammengewachse ne Kristalle gebildet. Die entsprechenden gebildeten Kri stalle enthalten eine sehr große Volumenmenge Mutterlau ge. Dadurch wird das Waschen mit einem Lösungsmittel in effizient gemacht und die Reinheit der Endprodukte ernie drigt. Die Stoffe aus dieser Gruppe sind in den Fermenta tionsflüssigkeiten in winzigen Mengen vorhanden, haben jedoch einen kritischen Effekt auf das Kristallwachstum.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung hatte sich zur Aufgabe gemacht, beide Arten von Verunreinigungen zu ent fernen. Wie oben ausgeführt, können Stoffe der ersten Gruppe (polymere Stoffe) leicht durch die Anwendung der Ultrafiltrations-Technik entfernt werden. Stoffe der zweiten Gruppe (das Kristallwachstum inhibierende Stoffe) sind in winzigen Mengen in den Fermentationsflüssigkeiten enthalten und können durch Kationenaustausch-Verfahren nicht entfernt werden. Es wurde daher versucht, diese Verunreinigungen durch selektive Adsorption an ein be stimmtes funktionelles Harz zu entfernen und hochreine 15 Aminosäure-Kristalle aus der entstehenden Auslaufflüssig keit durch einen einzigen Kristallisationsschritt zu er halten.

Die das Kristallwachstum inhibierenden Stoffe sind hin sichtlich ihrer chemischen Natur stark hydrophob und könnten dadurch entfernt werden, daß man die derartige Stoffe enthaltende Flüssigkeit ein geeignetes Adsorber- Harz passieren läßt. Schwach basische Anionenaustauscher- Harze und amphotere Ionenaustauscher-Harze sind allgemein als Adsorber-Harze für die Entfärbung bekannt. Es wurde gefunden, daß diese Harze zusätzlich zu ihrer entfärben den Wirkung auch eine hervorragende Wirkung zeigen, wenn sie zur Vorbehandlung der zur Diskussion stehenden Fer mentationsflüssigkeiten eingesetzt werden. Die Entfärbe- Aktivität der zur Entfärbung eingesetzten Harze in den verschiedenen Fermentationsflüssigkeiten ist ausgezeich net.

Die schwach basischen Anionenaustauscher-Harze können Harze aus einer der nachfolgend genannten, an sich be kannten vier Gruppen sein: Polystyrol-Harze, Polyphenol- Harze, Epoxyharze oder Polyacrylat-Harze. Von den genann ten Harzen sind diejenigen des Polystyrol-Typs und Poly acrylat-Typs bevorzugt. Im allgemeinen sind an diese Har ze primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, also -NH₂ -, -NHR - oder -NR₂ - Gruppen, gebunden, worin R eine beliebige Alkylgruppe, bevorzugt eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 C-Atomen, einschließlich substituierter Al kylgruppen, die bevorzugt 6 bis 10 C-Atome tragen, sein kann. Beispielhaft für derartige Harze sind Harze aus der Amberlite® RA - Serie (Hersteller: Röhm & Haas), Harze aus der Duolite® A 300 - Serie (Hersteller: Duolite) und Harze aus der DIAION® WA - Serie (Hersteller: Mitsubishi Chemical Industries). Zwei besonders bevorzugte schwach basische Harze sind Ionac® A-365 (ein Harz des Acrylat- Typs) und Amberlite® IRA. Ionac® A-365 wird von der Firma Sybron, einer Abteilung von IONAC, hergestellt und ist ein schwach basisches Anionenaustauscher-Harz auf Polyacrylat-Basis mit einer porösen, gelartigen Kugel- Struktur. Amberlite® IRA-68 ist ein schwach basisches, gelartiges Acryl-Anionenaustauscher-Harz, das nur terti äre Aminogruppen enthält.

Die amphoteren Ionenaustauscher-Harze sind poröse aroma tische Polymere mit Aminogruppen und phenolischen Hydr oxy-Gruppen auf der Oberfläche. Beispiele dafür sind HS und KS-Harze (Hersteller: Hokuetsu Carbon Industries).

Das D-Harz ist ein bevorzugtes amphoteres Ionenaustau scher-Harz, das sowohl Aminogruppen als auch phenolische Gruppen auf der Oberfläche eines porösen, phenolischen Harzes enthält. Dieses Harz ist nicht in der Lage, Salze starker Säuren oder Basen zu spalten. Allerdings kann das D-Harz Stoffe adsorbieren, die schwach sauer oder schwach basisch sind. Das D-Harz arbeitet bei der Adsorption im Bereich saurer oder neutraler pH-Werte. Die Elution der adsorbierten Stoffe erfolgt in alkalischer Lösung.

Ein bevorzugter pH-Wert-Bereich für den Schritt der Be handlung mit dem Harz liegt bei 2,5 bis 8,0. Der bevor zugte Bereich der Temperatur liegt bei 20 bis 70°C. Die bevorzugte Zufuhr-Geschwindigkeit der Lösung liegt bei 3 bis 5, noch mehr bevorzugt bei 4, Liter pro Volumenteil Harz (1) pro Stunde (resin vol(l)/h).

Für die einzelnen Aminosäuren liegen die bevorzugten zugeführten Volumenmengen bei folgenden Werten:

Wenn eine unbehandelte Fermentationsflüssigkeit unmittel bar mit diesen Harzen in Kontakt gebracht wird, schlagen sich Proteine, Pigmente, Nucleinsäuren und Öle irreversi bel darauf nieder bzw. werden adsorbiert. Die Stoffe be decken die aktive Oberfläche der Harze und erniedrigen dadurch signifikant deren Aktivität. Wenn darüberhinaus eine Säure, eine alkalische Lösung oder ein Alkohol als Mittel zur Regeneration der Harze verwendet werden, koa gulieren diese Verunreinigungen, da sie denaturiert wer den, und verstopfen das Harz. Häufig wird eine Regenera tion des Harzes dadurch unmöglich gemacht.

Erfindungsgemäß läßt man eine eine Aminosäure enthaltende Fermentationsflüssigkeit eine Ultrafiltrationsmembran passieren und behandelt anschließend das resultierende Ultrafiltrat mit den oben genannten Harzen. Es wurde ge funden, daß eine Entfärbung oder eine Entfernung der hydrophoben Stoffe sehr effizient bewirkt werden kann.

Ein Vergleich der Eigenschaften der Fermentationsflüssig keiten vor und nach der Behandlung mit dem Harz zeigte einen scharfen Abfall des Wertes der UV-Absorption bei etwa 280 bis 350 nm (nahes Ultraviolett) und eine Besei tigung von Stoffen mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis 3000 (Gelchromatographie). Chromatographie aufgrund der Hydrophobie (Verfahren unter Verwendung eines Methanol-Gradienten) ergab, daß stark hydrophobe Stoffe, die bei Methanol-Konzentrationen von etwa 30 bis 50% eluiert werden, beseitigt worden waren. Zudem zeigte sich ein starker Rückgang der Konzentration an fluores zierenden Stoffen, woraus sich ergibt, daß auch hydropho be Stoffe entfernt worden waren, die Benzol- oder Purin Ringe enthalten. Als ein Nebeneffekt ergab sich, daß das Ausmaß des Schäumens beim Konzentrieren der Lösung deut lich verringert wurde. Dies erleichterte den Konzentra tionsschritt deutlich. Auf diesem Wege konnten also er folgreich hochreine Kristalle von Aminosäuren durch ein einfaches Verfahren erhalten werden. Dieses schließt als Vorbehandlungs-Schritte einen Ultrafiltrationsschritt und die Behandlung mit einem Adsorber-Harz ein.

Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung folgt nun zum besseren Verständnis derselben eine weitere detail lierte Beschreibung unter Bezugnahme auf die nachfolgen den speziellen Beispiele. Diese dienen nur der Erläute rung der Erfindung und dienen nicht zu deren Beschrän kung.

Beispiel 1

Die in diesem Beispiel verwendete, L-Alanin (L-Ala) ent haltende Fermentationsflüssigkeit entstammte einer enzy matischen Reaktion in einem Reaktionstank mit einem Rüh rer. Als Substrat wurde L-Asparaginsäure (L-Asp) verwen det. Die Reaktion wird katalysiert durch Pseudomonas Stamm Nr. 618 (ATCC 19121) mit hoher L-Aspartat-β-Carb oxylase-Aktivität (E.C. 4.1.1.12).

Die Fermentationsflüssigkeit wurde mit Leitungswasser bis auf eine L-Ala-Konzentration von 99 g/l verdünnt (unumge setztes L-Ala: 0,13 g/l), mit 95%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,3 eingestellt und unter Druck durch eine Ultrafiltrationsmembran aus regenerierter Cellulose gegeben, die eine nominelle Ausschlußgrenze des Moleku largewichts von 10 000 aufwies. Dabei wurden suspendierte Feststoffe, Öl und polymere Stoffe entfernt.

Die so erhaltene klare Lösung ließ man eine Säule passie ren, die mit Amberlite® IRA-68 (OH-Form; schwach basi sches Anionenaustauscher-Harz) gepackt war, um überschüs sige L-Asp, andere Anionen und Pigmente zu entfernen. Die insgesamt aufgegebene Menge an L-Ala lag bei 600 g/l Harz.

Die aus der Säule auslaufende Flüssigkeit wurde mit 35%iger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 6,0 neutralisiert und unter vermindertem Druck bis auf eine L-Ala-Konzentration von 110 g/l konzentriert. Die resul tierende Lösung wurde in einem Calandria-Verdampfer mit einem Rührer bei 75°C unter vermindertem Druck weiter bis auf eine L-Ala-Konzentration von 620 g/l konzen triert. Die so erhaltene konzentrierte Aufschlämmung wur de in ein mit einem Rührer und einem Kühlmantel versehe nes Kristallisationsgefäß überführt, worin es zur voll ständigen Kristallisation auf eine Temperatur von 10°C abgekühlt wurde. Die Aufschlämmung wurde dann in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge aufgetrennt. Der Kristallkuchen wurde in dem Siebmantel-Zentrifugenabscheider mit Leitungswasser (11,8 l auf 100 kg L-Ala) gewaschen und zentrifugiert. Die Reinheit der so erhaltenen Kristalle von L-ALa lag bei 99% und höher (L-Asp-Gehalt: 0,01% oder niedriger). Der Lichtdurchlaßgrad einer wäßrigen Lösung der Kristalle lag bei 97%.

Die wie oben beschrieben abgetrennte Mutterlauge, die noch 135 g/l L-Ala enthielt, wurde in einem mit einem Rührer versehenen Calandria-Verdampfer bei 75°C unter vermindertem Druck bis auf eine L-Ala-Konzentration von 136 g/l konzentriert. Die entstehende Aufschlämmung wurde in einem mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehe nen Kristallisationsgefäß auf 10°C abgekühlt. Die so ge bildete zweite Charge von Kristallen wurde in einem Sieb mantel-Zentrifugenabscheider von der Mutterlauge ge trennt. Der Filterkuchen aus Kristallen wurde mit Lei tungswasser (26,1 l auf 100 kg L-Ala) gewaschen und zentrifugiert.

Die Gesamt-Ausbeute an L-Ala (Gesamtmenge der bei der ersten und zweiten Kristallisation erhaltenen Kristalle) lag bei 94,3%, bezogen auf die Menge, die anfänglich in der Fermentationsflüssigkeit enthalten war.

Vergleichsbeispiel 1

Ausgehend von der gleichen, einer enzymatischen Reaktion zur L-Ala-Herstellung entstammenden Reaktionsflüssigkeit, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde das klare Permeat auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und danach ohne Behandlung mit dem Harz unmittelbar konzentriert. Die erste Charge von Kristallen wurde wie in Beispiel 1 erhalten. Die Reinheit der Kristalle betrug 98,7%; die Kristalle enthielten 0,08% L-Asp. Der Lichtdurchlaßgrad der wäßrigen Lösung lag bei 91,9%.

Die Gesamtausbeute der Kristalle der ersten und zweiten Charge lag bei 91,9%, und die Kristalle wiesen im Ver gleich zu den gemäß Beispiel 1 erhaltenen eine viel höhe re Feinheit auf. Dieses Ergebnis wurde wahrscheinlich durch die Verlangsamung des Kristallwachstums aufgrund des L-Asp-Gehalts verursacht.

Beispiel 2

Eine 21 g/l L-Isoleucin (L-Ile) enthaltende Fermenta tionsflüssigkeit wurde mit 35%iger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und unter Druck durch eine Ultrafiltrationsmembran (nominelle Ausschluß grenze des Molekulargewichts: 6000) gegeben, um mikrobi elle Zellen und polymere Stoffe zu entfernen.

Die so erhaltene klare Lösung ließ man eine Säule passie ren, die mit "Agent D" gepackt war, um Pigmente und fluo reszierende Stoffe zu entfernen. Die insgesamt aufgegebe ne Menge an L-Ile betrug 720 g/l Harz.

Die entfärbte Säulenauslauf-Flüssigkeit wurde in einem Rotationsverdampfer bei 50°C unter vermindertem Druck bis auf eine L-Ile-Konzentration von 200 g/l konzen triert. Die konzentrierte Aufschlämmung wurde mit 27%iger kaustischer Sodalösung auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt und in ein mit einem Rührwerk versehenes Kristallisationsgefäß überführt, worin die Kristallisa tion unter programmiert kontrollierter Kühlung von 50 auf 20°C durchgeführt wurde. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristall kuchen wurde mit Leitungswasser (60 ml auf 300 g L-Ile) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert. Die Rein heit der so erhaltenen L-Ile-Kristalle betrug 95%, und der Lichtdurchlaßgrad einer wäßrigen Lösung der Kristalle war 94%.

Die wie oben beschrieben abgetrennte Mutterlauge, die noch 34 g/l L-Ile enthielt, wurde unter vermindertem Druck bis auf eine L-Ile-Konzentration von 100 g/l kon zentriert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde in einem mit einem Rührwerk versehenen Kristallisationsgefäß auf 10°C abgekühlt, und die dabei gebildeten Kristalle der zweiten Charge wurden in einem Siebmantel-Zentrifugenab scheider von der Mutterlauge getrennt. Danach wurden sie darin mit Leitungswasser gewaschen (10 ml Wasser auf 30 g L-Ile) und zentrifugiert.

Die Gesamtausbeute (Gesamtmenge der bei der ersten und zweiten Kristallisation erhaltenen Kristalle) betrug 94,3%, bezogen auf die in der anfänglich in der Fermen tationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Ile.

Wenn die Ausgangs-Fermentationsflüssigkeit nur ultrafil triert wurde (unter Weglassung der Behandlung mit "Agent D"), waren die Kristalle sehr fein, und ihre Reinheit betrug 92%. Die Ausbeute lag dann bei 89%, und der Lichtdurchlaßgrad einer wäßrigen Lösung der Kristalle war 34%.

Wenn die Ausgangs-Fermentationsflüssigkeit nur durch Zen trifugation von mikrobiellen Zellen befreit worden und anschließend mit "Agent D" behandelt worden war, lag die Reinheit der erhaltenen Kristalle bei 87%. Die Ausbeute war dann 90%, und der Lichtdurchlaßgrad einer wäßrigen Lösung der Kristalle lag bei 72%.

Vergleichsbeispiel 2

Ausgehend von der in Beispiel 2 beschriebenen Fermenta tionsflüssigkeit der L-Ile-Herstellung wurde das klare Permeat durch eine Säule gegeben, die mit einem stark sauren Kationenaustauscher-Harz (Na-Typ) gepackt war, um L-Ile als Kation an das Harz zu adsorbieren. L-Ile wurde dann mit einer 0,5 N-Natronlauge eluiert. Das Eluat wurde auf demselben Wege wie in Beispiel 2 beschrieben konzen triert und kristallisiert. Die Reinheit der erhaltenen Kristalle von L-Ile betrug 92%; der Lichtdurchlaßgrad einer wäßrigen Lösung der Kristalle war 49%.

Vergleichsbeispiel 3

Ausgehend von der in Beispiel 2 beschriebenen Fermenta tionsflüssigkeit der L-Ile-Herstellung wurde das klare Permeat mit 27%iger Natronlauge auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und anschließend unmittelbar konzentriert und kristallisiert, wobei die gleichen Verfahrensschritte wie in Beispiel 2 angewandt wurden, ohne daß eine Behand lung mit einem Harz stattfand. Die Reinheit der erhalte nen Kristalle von L-Ile betrug 87%; der Lichtdurchlaß grad einer wäßrigen Lösung der Kristalle war 12%. Die Kristalle waren so fein, daß sie nur sehr schwer abge trennt werden konnten.

Vergleichsbeispiel 4

Ausgehend von der in Beispiel 2 beschriebenen Fermenta tionsflüssigkeit der L-Ile-Herstellung wurden nach Ein stellung des pH-Wertes die mikrobiellen Zellen mit einem kontinuierlichen Zentrifugenabscheider abgetrennt, wobei eine nicht klare überstehende Lösung erhalten wurde. Als diese Flüssigkeit durch eine mit einem HS-Harz entspre chend Beispiel 2 gepackte Säule gegeben wurde, sammelte sich das Sediment als Verstopfung der oberen Schicht des Harzes, so daß die Fließgeschwindigkeit schrittweise sank. Es war daher erforderlich, die Säule durch Waschen in umgekehrter Richtung (back washing) freizumachen. Die aus der Säule auslaufende Flüssigkeit wurde unter Anwen dung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrensschritte konzentriert und einem Kristallisationsschritt unterwor fen. Die Reinheit der erhaltenen L-Ile-Kristalle lag bei 82%, und der Lichtdurchlaßgrad einer wäßrigen Lösung der Kristalle war 67%.

Beispiel 3

Eine 50 g/l L-Threonin (L-Thr) enthaltende Fermentations flüssigkeit wurde mit 35%iger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und durch eine Ultra filtrationsmembran mit einer nominellen Ausschlußgrenze des Molekulargewichts von 6000 gegeben, um mikrobielle Zellen und polymere Substanzen zu entfernen.

Die so erhaltene klare Lösung wurde durch eine mit "Agent D" gepackte Säule gegeben, um Pigmente und fluoreszieren de Stoffe zu entfernen. Die insgesamt aufgegebene L-Thr- Menge lag bei 1000 g/l Harz.

Die entfärbte Säulenauslauf-Flüssigkeit wurde mit 27%iger Natronlauge-Lösung auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt und danach bei 50°C unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer bis zu einer L-Thr-Konzen tration von 120 g/l konzentriert. Impfkristalle wurden in einer Menge von 10% zugesetzt und die Konzentration wur de weiter bis auf einen Wert von 350 g/l durch Einengen erhöht. Die konzentrierte Aufschlämmung wurde in ein mit einem Rührwerk versehenes Kristallisationsgefäß über führt, worin die Kristallisation unter programmiert kon trollierter Kühlung von 50 auf 20°C durchgeführt wurde. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel- Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mut terlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit Leitungs wasser (150 ml auf 300 g L-Thr) in dem Abscheider gewa schen und zentrifugiert. Die Reinheit der so erhaltenen L-Thr-Kristalle lag bei 97% und höher (Homoserin-Gehalt: 2%), und die Gesamtausbeute der Kristalle war 83%, bezo gen auf die anfänglich in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene L-Thr-Menge.

Beispiel 4

Eine 65 g/l L-Valin (L-Val) enthaltende Fermentations flüssigkeit wurde mit 35%iger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und durch eine Ultra filtrationsmembran mit einer nominellen Ausschlußgrenze des Molekulargewichts von 6000 gegeben, um mikrobielle Zellen und polymere Substanzen zu entfernen.

Die so erhaltene klare Lösung wurde durch eine mit "Agent D" gepackte Säule gegeben, um Pigmente und fluoreszieren de Stoffe zu entfernen. Die insgesamt aufgegebene L-Val- Menge lag bei 1200 g/l Harz.

Die entfärbte Säulenauslauf-Flüssigkeit wurde bei 50°C unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer bis zu einer L-Val-Konzentration von 200 g/l konzentriert. Die konzentrierte Aufschlämmung wurde mit 27%iger kau stischer Sodalösung auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt und in ein mit einem Rührwerk versehenes Kristallisa tionsgefäß überführt, worin die Kristallisation unter programmiert kontrollierter Kühlung von 50 auf 10°C durchgeführt wurde. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit Leitungswasser (50 ml auf 240 g L-Val) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert. Die Rein heit der so erhaltenen L-Thr-Kristalle lag bei 96% und höher.

Die wie oben beschrieben abgetrennte Mutterlauge, die noch 50 g/l L-Val enthielt, wurde bei 50°C unter vermin dertem Druck bis auf eine L-Val-Konzentration von 106 g/l konzentriert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde in einem Siebmantel-Zentrifugenabscheider in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Danach wurde der Kuchen der Kri stalle der zweiten Charge darin mit Leitungswasser gewa schen (10 ml Wasser auf 30 g L-Val) und zentrifugiert.

Die Gesamtausbeute (Gesamtmenge der bei der ersten und zweiten Kristallisation erhaltenen Kristalle) betrug 91,3%, bezogen auf die in der anfänglich in der Fermen tationsflüssigkeit enthaltene Menge an L-Val.

Beispiel 5

Eine 23 g/l L-Histidin (L-His) enthaltende Fermentations flüssigkeit wurde mit 35%iger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und durch eine Ultra filtrationsmembran mit einer nominellen Ausschlußgrenze des Molekulargewichts von 6000 gegeben, um mikrobielle Zellen und polymere Substanzen zu entfernen.

Die so erhaltene klare Lösung wurde durch eine mit "Agent D" gepackte Säule gegeben, um Pigmente und fluoreszieren de Stoffe zu entfernen. Die insgesamt aufgegebene L-His- Menge lag bei 900 g/l Harz.

Die entfärbte Säulenauslauf-Flüssigkeit wurde bei 50°C unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer bis zu einer L-His-Konzentration von 250 g/l konzentriert. Die konzentrierte Aufschlämmung wurde in ein mit einem Rührwerk versehenes Kristallisationsgefäß überführt, wo rin die Kristallisation unter programmiert kontrollierter Kühlung von 50 auf 10°C durchgeführt wurde. Die so er haltene Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifu genabscheider gefüllt und in Kristalle von L-His×HCl×H₂O und Mutterlauge getrennt. Der Kristall kuchen wurde mit Leitungswasser (80 ml auf 400 g L-His× HCl×H₂O) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert. Die Reinheit der so erhaltenen Kristalle lag bei 99% und höher, und die Ausbeute lag bei 82%, bezogen auf die anfänglich in der Fermentationsflüssigkeit enthaltene Menge L-His.

Beispiel 6

Eine 20 g/l L-Tryptophan (L-Trp) enthaltende Fermenta tionsflüssigkeit wurde mit 60%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und durch eine Ultra filtrationsmembran mit einer nominellen Ausschlußgrenze des Molekulargewichts von 6000 gegeben, um mikrobielle Zellen und polymere Substanzen zu entfernen.

Die so erhaltene klare Lösung wurde durch eine mit "Agent D" gepackte Säule gegeben, um Pigmente und fluoreszieren de Stoffe zu entfernen. "Agent D" ist ein amphoteres Ionenaustauscher-Harz, hergestellt durch Kondensation von m-Phenylendiamin und Resorcin. In diesem Verfahrens schritt wurde ein Teil des L-Trp an "Agent D" adsorbiert. Dieser Teil wurde anschließend dadurch gewonnen, daß man entionisiertes Wasser durch die Säule laufen ließ. Die insgesamt aufgegebene L-Trp-Menge lag bei 500 g/l Harz.

Die zur Gewinnung des adsorbierten L-Trp verwendete wäß rige Lösung wurde mit der Hauptmenge der Säulenauslauf- Flüssigkeit vereinigt, und die vereinigte Lösung wurde mit 5%iger kaustischer Soda-Lösung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wurde bei 45°C unter vermindertem Druck bis zu einer L-Trp-Konzentration von 150 g/l in einem mit einem Rührwerk versehenen Calan dria-Verdampfer konzentriert. Die konzentrierte Auf schlämmung wurde in ein mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehenes Kristallisationsgefäß überführt, worin die Kristallisation durch Abkühlen von 45 auf 5°C zum Ende geführt wurde.

Die so erhaltene gekühlte Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit Leitungswasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert. Die Kristallmasse wurde in einem mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehenen Kristallisationsgefäß in entionisiertem Wasser aufge schlämmt (400 l auf 100 kg Kristalle). Die Aufschlämmung wurde darin bei 20°C eine Stunde lang gerührt und dann in einem Siebmantel-Zentrifugenabscheider in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde noch mals mit Leitungswasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert und anschließend in einem Scheibentrockner bei 40°C unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute betrug 72%, und die Rein heit der Kristalle lag bei 99,9% (Gehalt an anderen Aminosäuren: weniger als 0,01%). Der Lichtdurchlaßgrad einer Lösung von 1 g der Kristalle in 100 ml entionisier ten Wassers betrug 93%.

Vergleichsbeispiel 5

Eine 20 g/l L-Tryptophan (L-Trp) enthaltende Fermenta tionsflüssigkeit wurde mit 60%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und durch eine Ultra filtrationsmembran aus Polysulfon mit einer nominellen Ausschlußgrenze des Molekulargewichts von 6000 gegeben, um mikrobielle Zellen und polymere Substanzen zu entfer nen.

Die so erhaltene klare Lösung wurde bei 45°C unter vermindertem Druck bis zu einer L-Trp-Konzentration von 100 g/l in einem mit einem Rührwerk versehenen Calan dria-Verdampfer konzentriert. Die konzentrierte Auf schlämmung wurde in ein mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehenes Kristallisationsgefäß überführt, worin die Kristallisation durch Abkuhlen von 45 auf 5°C zum Ende geführt wurde.

Die so erhaltene Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel- Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mut terlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit Leitungs wasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewa schen und zentrifugiert. Die Kristallmasse wurde in einem mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehenen Kri stallisationsgefäß in entionisiertem Wasser aufgeschlämmt (400 l auf 100 kg Kristalle). Die Aufschlämmung wurde darin bei 20°C eine Stunde lang gerührt und dann in einem Siebmantel-Zentrifugenabscheider in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde noch mals mit Leitungswasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert und anschließend in einem Scheibentrockner bei 40°C unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute betrug 66%, und die Rein heit der Kristalle lag bei 98,2% (Gehalt an anderen Aminosäuren: weniger als 0,1%). Der Lichtdurchlaßgrad einer Lösung von 1 g der Kristalle in 100 ml entionisier ten Wassers betrug 9,2%.

Der Reinigungsprozeß wurde wie folgt fortgesetzt: Die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Kri stalle wurden nochmals in entionisiertem Wasser aufge schlämmt (1000 l auf 100 kg L-Trp). Die Aufschlämmung wurde auf 35°C erwärmt, und die Kristalle wurden in Lö sung gebracht, indem der pH-Wert mit 60%iger Schwefel säure auf 2,0 eingestellt wurde. Der Lösung wurde Aktiv kohle (20 kg auf 100 kg L-Trp) zugesetzt, und die Mi schung wurde 1 Stunde lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde bei 35°C gehalten und durch langsame Zugabe von 10%iger kaustischer Sodalösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, um eine Kristallisation zu bewirken. Danach wurde die Lösung langsam auf 5°C abgekühlt.

Die so erhaltene gekühlte Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit Leitungswasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert. Die Kristallmasse wurde in einem mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehenen Kristallisationsgefäß in entionisiertem Wasser aufge schlämmt (400 l auf 100 kg Kristalle). Die Aufschlämmung wurde darin bei 20°C eine Stunde lang gerührt und dann in einem Siebmantel-Zentrifugenabscheider in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde noch mals mit Leitungswasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert und anschließend in einem Scheibentrockner bei 40°C unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute betrug 76%, und die Rein heit der Kristalle lag bei 99,1% (Gehalt an anderen Aminosäuren: weniger als 0,05%). Der Lichtdurchlaßgrad einer Lösung von 1 g der Kristalle in 100 ml entionisier ten Wassers betrug 20,5%.

Vergleichsbeispiel 6

Eine 20 g/l L-Tryptophan (L-Trp) enthaltende Fermenta tionsflüssigkeit wurde mit 60%iger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und in einem Zentrifu genabscheider behandelt, um mikrobielle Zellen zu entfer nen.

Der Überstand wurde durch eine mit einem Kationenaustau scher-Harz (Vernetzungsgrad: 4%; Na-Salz-Form) gepackte Säule gegeben, um L-Trp zu adsorbieren. Die gesamte auf gegebene Menge an L-Trp betrug 150 g/l Harz. Das adsor bierte L-Trp wurde durch Eingeben eines Eluens, das mit 27%iger kaustischer Sodalösung bei einem pH-Wert von 12,5 bis 13,0 gehalten wurde, am unteren Ende der Säule eluiert, während das Harz wie üblich unter Flüssigkeit gehalten wurde, und die Auslaufflüssigkeit vom oberen Ende der Säule in den Eluat-Tank zurückgeführt wurde. Dieser Verfahrensschritt wurde zwei Stunden lang fortge führt, und die Säule wurde anschließend mit 0,5%iger kaustischer Sodalösung behandelt. Das nach dem beschrie benen Verfahren erhaltene, L-Trp in hoher Konzentration enthaltende Eluat wurde in ein mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehenes Kristallisationsgefäß über führt, worin es auf 45°C erwärmt und mit 60%iger Schwefelsäure zur Kristallbildung neutralisiert wurde. Danach wurde es abgekühlt, um die Kristallisation voll ständig zu machen.

Die so erhaltene gekühlte Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit Leitungswasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert. Die Kristallmasse wurde in einem mit einem Rührwerk und einem Kühlmantel versehenen Kristallisationsgefäß in entionisiertem Wasser aufge schlämmt (400 l auf 100 kg Kristalle). Die Aufschlämmung wurde darin bei 20°C eine Stunde lang gerührt und dann in einem Siebmantel-Zentrifugenabscheider in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde noch mals mit Leitungswasser (90 l auf 100 kg L-Trp) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert und anschließend in einem Scheibentrockner bei 40°C unter vermindertem Druck getrocknet. Die Ausbeute betrug 62%, und die Rein heit der Kristalle lag bei 99,0% (Gehalt an anderen Aminosäuren: weniger als 0,05%). Der Lichtdurchlaßgrad einer Lösung von 1 g der Kristalle in 100 ml entionisier ten Wassers betrug 15%. Eine weitere wesentliche Erhö hung des Lichtdurchlaßgrades nach weiterer Reinigung des Produktes mit üblichen Methoden wurde nicht erzielt.

Tabelle 1 gibt die Werte für den Lichtdurchlaßgrad und andere Eigenschaften der in Beispiel 6 und den Ver gleichsbeispielen 5 und 6 erhaltenen Kristalle wieder. Aus dieser Tabelle ergibt sich besonders deutlich die Auswirkung der Kombination der erfindungsgemäßen Verfah rensschritte Ultrafiltration (UF) und Behandlung mit "Agent D".

Tabelle 1

Beispiel 7

Eine 55 g/l L-Valin (L-Val) enthaltende Fermentations flüssigkeit wurde unter Druck durch eine Ultrafiltra tionsmembran aus regenerierter Cellulose mit einer nomi nellen Ausschlußgrenze des Molekulargewichts von 10 000 gegeben, um mikrobielle Zellen und polymere Substanzen zu entfernen. Die Gesamtmenge der Flüssigkeit betrug 3,84 l, und sie enthielt eine Gesamtmenge von 211 g L-Val.

Die so erhaltene klare Lösung, die einen pH-Wert von 7,5 hatte, wurde durch eine mit dem schwach basischen Ionen austauscher-Harz Ionac® A-365 gepackte Säule gegeben, um anionische Verunreinigungen zu entfernen. Das gepackte Säulenvolumen betrug 1,0 l, und das Harz lag in Form seiner freien Base vor. Die gesamte aufgegebene Menge an L-Valin betrug 205 g/l Harz. Die aus der Säule auslaufen de Flüssigkeit hatte einen pH-Wert von 8,2.

Die Säulenauslauf-Flüssigkeit wurde bei 50°C unter ver mindertem Druck in einem Rotationsverdampfer konzen triert, um Ammoniak zu entfernen. Am Ende betrug die L-Val-Konzentration 75 g/l.

Der pH-Wert der konzentrierten Lösung wurde mit 35%iger Chlorwasserstoffsäure auf 1,0 eingestellt. Die Flüssig keit wurde bei pH 1,0, einer Temperatur von 70°C und unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer bis zu einer L-Val-Konzentration von 300 g/l konzentriert. Danach hatte die Lösung ein Volumen von 680 ml und ent hielt 204 g L-Val.

Die konzentrierte Lösung wurde in ein mit einem Rührwerk versehenes Kristallisationsgefäß überführt. Danach wurden 204 ml 35%ige Chlorwasserstoffsäure langsam zugesetzt, und es kristallisierte L-Val×HCl×H₂O aus. Nach Ab schluß der HCl-Zugabe wurde durch Abkühlen von 70 auf 10°C in kontrollierter Weise der Kristallisationsvorgang fortgesetzt.

Die so erhaltene gekühlte Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit 51 ml einer wäßrigen Lösung von 20%iger Chlorwasser stoffsäure (31,5 ml auf 100 g L-Val) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert.

Die Ausbeute an L-Val×HCl×H₂O-Kristallen betrug 288,8 g (Naßgewicht) (entsprechend 179,3 g L-Val als freie Base). Die Gesamtausbeute betrug 85%, bezogen auf die anfänglich in der Flüssigkeit gelöste Menge L-Val.

Beispiel 8

Eine 24 g/l L-Isoleucin (L-Ile) enthaltende Fermenta tionsflüssigkeit wurde unter Druck durch eine Ultrafil trationsmembran aus regenerierter Cellulose mit einer nominellen Ausschlußgrenze des Molekulargewichts von 10 000 gegeben, um mikrobielle Zellen und polymere Sub stanzen zu entfernen. Die Gesamtmenge der Flüssigkeit betrug 3,55 l, und sie enthielt eine Gesamtmenge von 85 g L-Ile.

Die so erhaltene klare Lösung, die einen pH-Wert von 7,4 hatte, wurde durch eine mit dem schwach basischen Ionen austauscher-Harz Ionac® A-365 gepackte Säule gegeben, um anionische Verunreinigungen zu entfernen. Das gepackte Säulenvolumen betrug 1,0 l, und das Harz lag in Form sei ner freien Base vor. Die gesamte aufgegebene Menge an L-Ile betrug 139 g/l Harz. Die aus der Säule auslaufende Flüssigkeit hatte einen pH-Wert von 8,2.

Die Säulenauslauf-Flüssigkeit wurde bei 50°C unter ver mindertem Druck in einem Rotationsverdampfer konzen triert, um Ammoniak zu entfernen. Am Ende betrug die L-Ile-Konzentration 40 g/l.

Der pH-Wert der konzentrierten Lösung wurde mit 35%iger Chlorwasserstoffsäure auf 1,0 eingestellt. Die Flüssig keit wurde bei pH 1,0, einer Temperatur von 70°C und unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer bis zu einer L-Ile-Konzentration von 240 g/l konzentriert. Danach hatte die Lösung ein Volumen von 340 ml und ent hielt 82 g L-Ile.

Die konzentrierte Lösung wurde in ein mit einem Rührwerk versehenes Kristallisationsgefäß überführt. Danach wurden 120 ml 35%ige Chlorwasserstoffsäure langsam zugesetzt, und es kristallisierte L-Ile×HCl×H₂O aus. Nach Ab schluß der HCl-Zugabe wurde durch Abkühlen von 70 auf 10°C in kontrollierter Weise der Kristallisationsvorgang fortgesetzt.

Die so erhaltene gekühlte Aufschlämmung wurde in einen Siebmantel-Zentrifugenabscheider gefüllt und in Kristalle und Mutterlauge getrennt. Der Kristallkuchen wurde mit 30 ml einer wäßrigen Lösung aus 20%iger Chlorwasser stoffsäure (42 ml auf 100 g L-Ile) in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert.

Die Ausbeute an L-Ile×HCl×H₂O-Kristallen betrug 134 7 g (Naßgewicht) (entsprechend 71,4 g L-Ile als freie Base). Die Gesamtausbeute betrug 84%, bezogen auf die anfänglich in der Flüssigkeit gelöste Menge L-Ile.

Beispiel 9

Der pH-Wert einer 42 g/l L-Glutamin (L-Gln) enthaltenden Fermentationsflüssigkeit wurde mit 35%iger Chlorwasser stoffsäure auf einen Wert von 5,6 eingestellt. Die Flüs sigkeit wurde durch einen flachen Ultrafiltrationsfilm mit einer nominellen Ausschlußgrenze des Molekularge wichts von 6000 ultrafiltriert, um mikrobielle Zellen und polymere Stoffe zu entfernen. Das dabei erhaltene klare Permeat wurde dann durch eine mit einem schwach basischen Anionenaustauscher-Harz (Amberlite® IRA-68) gepackte Säule gegeben, um Pigmente, L-Glutaminsäure, Pyrrolidoncarbonsäure und andere in der Fermentations flüssigkeit enthaltene Anionen zu adsorbieren und aus der Lösung zu entfernen. Die insgesamt aufgegebene Menge betrug 500 g L-Gln pro Liter Harz.

Die durchgelaufene, mit dem Harz behandelte Flüssigkeit wurde einem Kristallisationsschritt unterworfen, indem man die Lösung bei 45°C unter reduziertem Druck in einem Rotationsverdampfer konzentrierte. Die L-Gln-Konzentra tion nach dem Konzentrieren betrug 280 g/l. Die Auf schlämmung wurde in einen mit einem Rührwerk versehenen Kristallisationstank geschüttet und unter Abkühlen von 45 auf 10°C der Kristallisationsschritt eingeleitet. Danach wurden in einem Siebmantel-Zentrifugenabscheider Kristal le und Mutterlauge getrennt. Der resultierende Kristall kuchen wurde mit 50 ml entionisierten Wassers auf 100 g Kristalle in dem Abscheider gewaschen und zentrifugiert.

Die Reinheit dieser Kristalle lag bei 97% L-Gln, und die Ausbeute, bezogen auf den Gehalt in der Fermentations flüssigkeit, betrug 87,5%.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung einer hochreinen L-Aminosäure aus einer Fermentationsflüssigkeit, die im Rahmen der fermentativen Herstellung der Aminosäure oder bei einem enzymatischen Verfahren erhalten wird, wobei das Verfah ren folgende Verfahrensschritte umfaßt:

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ultrafiltrations membran entweder die Form eines ebenen Films oder einer Hohlfasermembran oder eines Hohlrohrs oder einer Spirale hat.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die Ultrafiltrationsmembran hergestellt ist aus einem Materi al gewählt unter Polysulfon, Polyvinylidenfluorid, Poly acrylnitril und Cellulose.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Ultrafiltrations membran aus regenerierter Cellulose oder Polysulfon be steht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Adsorber-Harz gewählt ist unter schwach basischen Anionenaustauscher- Harzen und amphoteren Ionenaustauscher-Harzen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das schwach basische Anionenaustauscher-Harz aus Polystyrol oder Polyacrylni tril besteht, die jeweils beide primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen tragen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Ultrafiltrationsmembran für die fraktionierte Trennung eine nominelle Ausschlußgrenze des Molekulargewichts im Bereich von 6000 bis 50 000 hat.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Ultrafiltrationsschritt ausgeführt wird bei einem pH-Wert von 2,5 bis 8,0, einer Temperatur von 20 bis 70°C, einem Einlaßdruck von 4,0 bis 6,0 bar, einem Auslaßdruck von 1,0 bis 2,0 bar und einer Flußgeschwindigkeit von 70 bis 150 l×m^-2×h^-1.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin für den Schritt der Ultrafiltration die Aminosäure und deren Konzentration wie folgt ausgewählt ist: L-Ile: 20 bis 40 g/l L-Trp: 20 bis 21 g/l L-Ala: 95 bis 130 g/l L-Val: 40 bis 70 g/l L-Thr: 40 bis 90 g/l L-His: 15 bis 40 g/l L-Phe: 20 bis 30 g/l und L-Gln: 30 bis 50 g/l

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Schritt der Behandlung mit einem Ionenaustauscher-Harz oder Adsorber-Harz ausgeführt wird bei einem pH-Wert von 2,5 bis 8,0, einer Temperatur von 20 bis 70°C und einer Zuflußgeschwindigkeit von 3 bis 5 l pro Volumenteil Harz (1) pro Stunde (resin vol(l)/h).

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die zugeführte Volumenmenge der Aminosäure für den Schritt der Behandlung mit einem Ionenaustauscher-Harz oder Adsorber-Harz wie folgt ausgewählt ist: