JPH03200766A - Ｌ―トリプトフアンの分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＬ−トリプトファン反応液からＬ−トリプトフ
ァンを分離する方法に関するものである。

更に詳しく説明すると、インドールを原料として用いる
酵素反応によって得られたＬ−１−リプトファン含有液
から、Ｌ−トリプトファンを優れた品質で且つ高い回収
率で分離し、一方インドールも高い回収率で回収する方
法に関するものである。

従来の技術 Ｌ−トリプトファンは必須アミノ酸の一種であリ、医薬
品、健康食品、飼料添加剤などに使用される有用な化合
物である。

従来Ｌ−トリプトファンは、インドールとセリンよりト
リプトファンセターゼを用いて合皮する方法、インドー
ルとピルビン酸とアンモニアよりトリプトファナーゼを
用いて合皮する方法などの酵素反応によって製造される
ことが知られている。

これらの方法によって得られたＬ−トリプトファン含有
反応液中には、原料であるインドール、酵素及び不純物
などが含まれている。

前記Ｌ−トリプトファン含有反応液から、菌体や酵素を
除去する方法として、例えば限外濾過膜による口過分離
法、遠心分離器などによる沈降分離法、活性炭やシリカ
ゲルなどの固体吸着剤による吸着分離法が提案され、こ
れらの一部は工業的に採用されている。しかしながら、
これらの分離法によれば菌体や酵素を反応液から分離す
ることは可能であるが、目的とするＬ−トリプトファン
を原料のインドールと分離することはできない。

上記分離法により除菌された反応液と有機溶媒を接触さ
せ、インドールを有機溶媒側に抽出する方法もあるが、
この方法は、多量の溶媒を必要とし且つ溶媒回収のため
の他の繁雑な操作を要するので工業的には好ましくない
。

方特開昭６２−２１５５６４号公報には、未反応インド
ールを含むＬ−トリプトファン反応液を、ポーラス型陽
イオン交換樹脂層へ通液し、樹脂のイオン交換部に吸着
させたトリプトファンをアルカリまたは酸の水溶液を用
いて溶離し、その後樹脂のポーラス部に吸着されたイン
ドールを含水有機溶媒を用いて溶離させる方法が記載さ
れている。しかしこの方法はトリプトファンの溶離の際
微量のインドールが流入し、またイオン交換樹脂の再生
が必要であって、経済的に難点があった。

問題を解決するための手段 そこで本発明者らはインドールを原料として用いる酵素
反応によって得られたＬ−１−リブドアアン反応液から
、簡単で工業的に有利な方法で、インドールを実質・的
に含まない優れた品質のＬ−トリプトファンを高回収率
で分離することができ、また原料のインドールも効率的
に回収することができる方法について研究を進めた。

その結果、前述した酵素反応によって得られたＬ−トリ
プトファン反応液を、非極性多孔質性樹脂を充填した第
１塔及び第２塔に通液し、第１塔においてはインドール
を実質的に吸着させ、一方策２塔においてＬ−トリプト
ファンを実質的に吸着させ、しかる後第２塔からＬ−ト
リプトファンを溶出させ、また第１塔からインドールを
溶出させることによって、インドールを良好な収率で回
収することができると共にインドールを実質的に含まな
い高品質のＬ−１リプドアアンが得られることが見出さ
れた。

本発明は、かかる知見に基いて到達されたものであって
、インドールを原料として用いる酵素反応により得られ
た、インドール及び不純物を含有するＬ−トリプトファ
ン反応液を、 （ｉ）非極性多孔質性樹脂を充填した第１塔へ通液し該
反応液中のインドールを実質的に第１塔中の該樹脂に吸
着させ、 （ｉ）前記第１塔からのインドールを実質的に含まない
排出液を非極性多孔質性樹脂を充填した第２塔へ通液し
、核排出液中のＬ−トリプトファンを実質的に第２塔中
の咳樹脂に吸着させ、 （ｉｉ）Ｌかる後第２塔へアルカリ水溶液を通液してＬ
−トリプトファンを溶出させ、 （１ｖ）得られたＬ−トリプトファン含有アルカリ水溶
液からＬ−トリプトファンを分離し、（ｖ）一方第１塔
へ有機溶媒を通液してインドールを溶出させ、そして （ｖｉ）得られたインドール含有有機溶媒溶液からイン
ドールを回収する、 ことを特徴とするＬ−トリプトファンの分離法である。

かかる本発明によれば、インドールを原料として用いる
酵素反応により得られた、未反応インドール及び不純物
を含有するＬ−１リプドアアン反応液から、簡単な手段
によって、良好な純度のＬトリプトファンを高い回収率
で分離することができ、また未反応原料であるインドー
ルも純度よく高回収率で分離でき、再び酵素反応に利用
しうる。従って本発明は前記反応液から高分子原料及び
目的物をいずれも純度よくしかも高回収率で分離でき、
そのうえ手段及び操作が簡単であって経済的であるので
工業的に優れている。

以下本発明方法について更に詳しく説明する。

本発明において、対象とするＬ−トリプトファン反応液
は、インドールを出発原料の一種として使用し酵素反応
によって得られた反応液から菌体などの不溶物を分離し
た溶液であって、インドール、Ｌ−トリプトファン及び
不純物を含有する反応液であればよい。

本発明方法の操作を効率よ〈実施し且つ分離するＬ−ト
リプトファン及びインドールの純度を良好ならしめるた
めに、前記した酵素反応液から限外濾過などの手段によ
り菌体その他不純物を除去した反応液に対して本発明方
法を実施するのが望ましい。

本発明方法は、前述しＩ；ようにＬ−トリプトファン反
応液を、非極性多孔質性樹脂が充填された２つの連続し
た塔に順次通液し、第１塔ではインドールを、第２塔で
はＬ−トリプトファンを樹脂に吸着させる。

この場合第１塔及び第２塔は共に１つの塔である必要は
なく、どちらも２またはそれ以上並列して、液の流れを
切換えて吸着−溶出操作を行うことができる。殊に本発
明方法を連続的に実施する場合には、第１塔及び第２塔
を複数塔並列して設置し、反応液の流れを切換えながら
操作することが望ましい。

第１塔及び第２塔における容量、すなわち充填すべき樹
脂の量を如何程にすべきかは、反応液中に含まれるイン
ドール及びＬ−トリプトファンの含有量に大略依存して
決められる。即ち、一般的に言って、反応液中における
インドールはＬ−トリプトファンに比べて可成り少ない
量であるので、第１塔の容量は第２塔に比べて小さくて
よい。

第１塔及び第２塔の容量（樹脂量）は、反応液中におけ
るインドール含量、Ｌ−トリプトファン含量、及び操作
方法、殊に回分式まｔ；は連続式かなどによって適宜決
定される。樹脂に対するインドール及びＬ−１−リプト
ファンの飽和吸着量は、簡単な実験により容易に測定す
ることができ、飽和吸着量の値に基いて樹脂量及び並列
した塔の数を決定すればよい。

本発明方法において第１塔及び第２塔に充填されるべき
非極性多孔質性樹脂は、イオン極性を有しない中性の多
孔質性樹脂であり、例えばスチレン、ジヒニルベンゼン
などのビニルモノマーを主たる七ツマ−として得られた
重合体または共重合体から形成され、しかも１００〜１
００ＯＡの細孔半径の微細孔を有する樹脂である。

この様な非極性多孔質性樹脂は、多種類市販されており
、そのまま使用することができる。その例としては、た
とえば“ダイヤイオンＨＰ−１０”“同ＨＰ　−２０”
　　“同ＨＰ−２Ｆ“同ＨＰ−３０“同ＨＰ−４０”同
ＨＰ　−５０”　　“セパピーズ５Ｐ−２０６”　　“
同Ｓ　Ｐ　−２０７”　　“同ＳＰ８００　”　　“同
Ｓ　Ｐ　−９００”　（以上商品名、三菱化成社製）、
′アンバーライトＸＡＤ−２’″“同Ｘ　Ａ　Ｄ　−４
”　（以上商品名、ローム・アンド・ハース社製）、レ
バチット０Ｃ１０６２（以上商品名、バイエル社製）な
どが挙げられる。

これらの樹脂は、第１塔及び第２塔共に同じものを充填
してもよくまた異なっていてもよい。

本発明方法における吸着操作は、先ず反応液を第１塔へ
通液し第１塔から排出液を第２塔へ供給することによっ
て行なわれる。第１塔におけるインドールの吸着量が飽
和吸着量に達する前に、通液を止めるか、或いは第１塔
の他の並列塔へ反応液の流れを切り換える。かくするこ
とにより第２塔へは、インドールが実質的に含まれない
反応液が供給されることになる。実際の操作に当っては
、第１塔と第２塔の間に示差屈折検出器を設置し、イン
ドールの流出をモニターしながら反応液の流れを制御す
ることができる。第２塔においてはＬトリプトファンの
吸着が実質的に行なわれ、第１塔から第２塔への通液は
通常第２塔におけるＬ−トリプトファンの飽和吸着量に
達する前まで継統される。飽和吸着量に達する前までに
第２塔への供給を止めるか第２塔の他の並列塔へ切り換
えて吸着操作を行なう。

前述の如くして第１塔にはインドールが、第２塔Ｉこは
Ｌ−トリプトファンが実質的に吸着される。

次に吸着した夫々の成分の溶出を行う。

第２塔に吸着したＬ−１リプトフアンは、アルカリ水溶
液を通液することにより溶出する。アルカリ水溶液を通
液する前及び後に水を通液することは、不純物を予め除
去しまた次の吸着操作のために好ましいことである。ア
ルカリ水溶液としては、種々のアルカリ水溶液か使用し
うるが、溶出した後の溶出液からのし一トリプトファン
の分離の容易性などを考慮すると、アンモニア水を使用
するのが有利である。アンモニア水としては１〜１４Ｎ
１好ましくは１〜５Ｎの範囲の濃度のものが好ましい。

かかるアンモニア水を使用することによって第２塔から
Ｌ−）リブトファンが純度よく溶出し、また溶出液から
容易且つ有利にＬ−トリプトファンを分離することが可
能である。

溶出したアルカリ水溶液中のＬ−トリプトファンの分離
はそれ自体公知の方法によって行うことができる。例え
ばアンモニア水による溶出を行った場合ｊこは、アンモ
ニア水から減圧下３０〜６０°Ｃの温度でＬ−トリプト
ファンを晶析し、固液分離することによって回収率よく
純度の良好なＬ−トリプトファン結晶を得ることができ
る。

一方第１塔に吸着されたインドールは、有機溶媒を通液
することにより溶出することができる。

このインドールの溶出を行う前または後に水を通液して
不純物やその他の化合物を除去することは、度々良い結
果がもたらされるので好ましいことである。インドール
を溶出するための有機溶媒としては、脂肪族アルコール
、ケトンまたはこれらの水溶液が挙げられるが、とりわ
け炭素数１〜４の低級脂肪族アルコールまたはその水溶
液が好ましい。かかるアルコールの例としては、メタノ
ール、エタノール、ｎ−プロパツール、ｉ−プロパツー
ルまたはｎ−ブタノールが挙げられる。これらのアルコ
ールまたはその水溶液としてはアルコール濃度が２０〜
１００％のものが一般的である。溶出したインドールは
有ｍ溶媒から溶媒を除去することにより分離し、再び酵
素反応の原料として使用することができる。

前記した第１塔及び第２塔における吸着操作及び溶出操
作は、それぞれ独立して、回分式、半連続式または連続
して実施することができる。

以上説明した本発明方法によれば、Ｌ−トリプトファン
反応液からＬ−トリプトファン及び未反応インドールの
それぞれを良好な純度でしかも高い回収率で分離するこ
とが可能であるが、本発明方法は、前記したように限外
濾過膜処理を行った反応液について実施することもでき
、また本発明方法によるＬ−トリプトファン溶出液を活
性炭処理することによって極めて純度の高いＬ−トリプ
トファンを得ることができる。以下この限外濾過膜処理
及び活性炭処理について説明する。

酵素反応によって得られたＬ−１リプトフアン反応液中
には、菌体およびそれ由来の高分子物質を含んでおり、
これらは限外濾過膜処理することにより有利に除去する
ことができる。使用される限外濾過膜は分画分子量が約
５００〜１００．０００の範囲の種々のものであればよ
く、好ましくは約６．０００〜５０．０００の分画分子
量のものである。限外濾過膜を形成するポリマーは例え
ばポリスルホン、ポリアクリルニトリル、７ツ化ポリビ
ニリデン及びセルロースなどが好ましい例として挙げら
れる。また限外濾過膜の形式は、何等制限されないが、
平膜型、中空系型、チューブラ−！またはスパイラル型
が一般的である。

限外濾過膜処理を実施する条件は、その膜の性状によっ
て左右されるが、通常温度は５〜８５°Ｃの範囲、ｐＨ
は２〜８の範囲、また圧力は入口圧が０．５〜５．０バ
ールの範囲であり、さらに反応液の流速は、ｌ　Ｏ−１
５０Ｑ／ｍ”／ｈｒの範囲が有利である。

前記限外濾過膜処理を行って得られた反応液について本
発明の吸着処理を実施することができる。

一方前記した本発明方法ＪこおいてＭ２塔ＪこＢいてＬ
−トリプトファンのアルカリ水溶液、殊にアンモニア水
による溶出を行って得られたＬ−トリプトファン含有ア
ンモニア水は活性炭と接触処理することができる。その
際Ｌ−１−リプトファンを濃縮して活性炭と接触せしめ
ると、活性炭の接触処理が効率的に行なわれる。この濃
縮は逆浸透膜を用いて行なうのが好適である。その際使
用される逆浸透膜としては耐アルカリ性の膜であればよ
く、膜材質及び形式は通常市販のものを使用することが
できる。

前記Ｌ−トリプトファン含有アンモニア水またはその濃
縮液の活性炭処理に使用される活性炭は、一般的に水相
吸着に使用されるものが望ましく、例えばヤシガラ由来
の活性炭、石炭由来の活性炭などいずれであってもよい
。

Ｌ−１−リプトファン含有アンモニア水（その濃縮液も
含む）と活性炭との接触形式としては、前記アンモニア
水中に活性炭粉末を加えて懸濁撹拌する方式及び活性炭
を充填した塔（またはカラム）に前記アンモニア水を通
液する方式のいずれでも差支えないが、後者の方式は、
操作及び効率の点から優れている。接触の操作条件は、
特に制限を受けない。例えば温度は通常５〜６０°Ｃの
範囲で充分であり、またｐＨはＬ−１リプドアアンをア
ンモニア水により溶出した時と同じで差支えない。

活性炭量に対する前記アンモニア水の処理液量比は、通
常で５〜２００、好ましくは５０〜１００の範囲が好適
である。また前記した活性炭充填塔に前記アンモニア水
を通液する場合の通液速度は液空間速度（Ｓ　Ｖ）とし
て０．１〜５、好ましくは０．５〜２の範囲が望ましい
。

このように、Ｌ−トリプトファン含有アンモニア水を活
性炭と接触することにより、Ｌ−）リプドアアンのロス
を軽減させることができ着色不純物を高度に除去するこ
とが可能となる。

活性炭との接触処理をしたＬ−トリプトファン含有アン
モニア水はそれ自体知られた方法に従って、Ｌ−トリプ
トファンの晶析処理を行なうことができる。この晶析処
理は、前記アンモニア水を減圧下３０〜６０°Ｃの温度
条件下で行なうのが適当である。

晶析したＬ−１リプトフアンは通常の固液分離操作例え
ば遠心分離によりスラリーから分離し、しかる後乾燥す
ることによって目的とする着色成分を殆んど含有しない
。高い透過率を有するＬトリプトファンを得ることがで
きる。

以下実施例を挙げて本発明方法を詳述する。

実施例　ｌ 酵素トリプトファンンンターゼの存在下、インドールと
ＤＬ−セリンを縮合させて得たトリプトファンを含む反
応液をポリアクリロニトリル限外濾過膜（分画分子量１
３０００）を用いて濾過をした。これにより得られた、
Ｌ−１−リフトファン１０１？／Ｑ、インドール０．１
：ｌ／Ｑ、セリン１０．？／Ｑを含む清澄水２０Ｑをダ
イヤイオンＨＰ−２０（三菱化成品）を充填した第１塔
（５００ＩＩｌｊ２充填）及び第２塔（１０１２充填）
に５Ｖ＝３で通液した。その後、水５Ｑを通液させ留出
液中のインドール及びトリプトファンの分析をＨＰＬＣ
で行ったが、いずれも検出されなかった。

次に、第２塔へ２Ｎのアンモニア水＋５Ｑを通液させ、
その後＋０１２の水を通液し、溶出液２５Ｑを得た。こ
のアンモニア水溶出液中には、Ｌ−トリプトファンが１
９５２含まれており、インドール及びセリンは検出され
なかった。この溶離は濃縮、晶析・固液分離・乾燥する
ことにより、黄白色の結晶１６５１を得た。この製品の
品質は、純度９９．６％であり、インドール含量は５　
ｐｐｍ以下であった。これはもちろん飼料添加剤規格（
昭和５１午農林省令第３６号）を充分に満足する品質で
あった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インドールを原料として用いる酵素反応により得ら
   れた、インドール及び不純物を含有するＬ−トリプトフ
   ァン反応液を、 （ｉ）非極性多孔質性樹脂を充填した第１塔へ通液し該
   反応液中のインドールを実質的に第１塔中の該樹脂に吸
   着させ、 （ｉｉ）前記第１塔からのインドールを実質的に含まな
   い排出液を非極性多孔質性樹脂を充填した第２塔へ通液
   し、該排出液中のＬ−トリプトファンを実質的に第２塔
   中の該樹脂に吸着させ、 （ｉｉｉ）しかる後第２塔へアルカリ水溶液を通液して
   Ｌ−トリプトファンを溶出させ、（ｉｖ）得られたＬ−
   トリプトファン含有アルカリ水溶液からＬ−トリプトフ
   ァンを分離し、 （ｖ）一方第１塔へ有機溶媒を通液してインドールを溶
   出させ、そして （ｖｉ）得られたインドール含有有機溶液からインドー
   ルを回収する、 ことを特徴とするＬ−トリプトファンの分離法。 ２、該アルカリ水溶液がアンモニア水溶液である特許請
   求の範囲第１項記載の分離法。 ３、該有機溶媒が低級脂肪族アルコールまたはその水溶
   液である特許請求の範囲第１項記載の分離法。