JPH0564627B2

JPH0564627B2 -

Info

Publication number: JPH0564627B2
Application number: JP7448685A
Authority: JP
Inventors: Shoichiro Myahara; Toshio Matsumoto; Tooru Myahara; Kazunari Nitsuta
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1985-04-10
Filing date: 1985-04-10
Publication date: 1993-09-16
Also published as: JPS61234789A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、インドールを原料に用いて、酵素法
により得られるＬ−トリプトフアンからインドー
ルを分離、回収する方法に関する。

トリプトフアン、特にＬ−トリプトフアンは必
須アミノ酸の一つであり医薬品、健康食品、飼料
などに使用される有用な化合物である。

Ｌ−トリプトフアンの製造方法としては、グル
コース等を原料とする発酵法、アンスラニル酸等
を原料とする半発酵法の外に、インドールを原料
としてＬ−セリンと酵素的縮合反応させてＬ−ト
リプトフアンを得る方法、あるいはインドールと
ピルビン酸及びアンモニアに酵素を作用させてＬ
−トリプトフアンを得る方法などが知られてい
る。

従来の技術及び発明が解決しようとする問題点インドールを原料としてＬ−トリプトフアンを
得る方法において問題となるのは、インドールは
微量でも特有の悪臭を発するため、最終製品中の
含量を少なくとも10ppm程度以内にする必要があ
る。

しかしながらＬ−トリプトフアンはインドール
骨格を有し、その化学構造がインドールに似てい
るため、インドールはトリプトフアンへの付着力
が強く、このためＬ−トリプトフアンの結晶洗浄
などの手段では許容できる量までインドールは除
去できない。

また、インドールは単価の高い原料であり、こ
れを回収できないとコストアツプにつながる。

従つてインドールを用いたトリプトフアン製造
においては反応終了後、未反応インドールとトリ
プトフアンとの分離は勿論のこと、精製工程での
製品液よりのトリプトフアンを回収する際のイ
ンドールとトリプトフアンとの分離は、他の夾雑
物の完全な除去と同時に、インドールとトリプト
フアンを効率良く分離回収できる方法でなくては
ならない。

通常酵素法によるトリプトフアン製造法は、中
性付近の水性媒体中で、トリプトフアンシンター
ゼ（E.C.4.2.1.20）の作用を有する酵素や菌体の
存在下で、例えばインドールとＬ−セリンとを反
応させて得られる。該反応液中に含有されている
菌体や酵素を除去せねばならず、これらの菌体や
酵素の除去には通常のアミノ酸単離方法に準じて
活性炭、吸着シリカゲルなどの固体物質に吸着分
離させる方法や、遠心分離器などにより沈降分離
する方法、さらにはイオン交換樹脂や、非極性多
孔性樹脂を用いた分離精製する方法が採用されて
いる。

しかしながら、これらの方法ではインドールと
トリプトフアンの分離は不可能である。

インドールは水は難溶性であり、酵素反応条件
のPHでは生成したＬ−トリプトフアンの溶解度が
低い。このため、反応終了後はトリプトフアンは
結晶状で存在し、スラリー液であり、精製工程の
途中で多量の水希釈してトリプトフアンを水溶液
となし、活性炭処理により未反応インドールを吸
着除去させようとすればインドールとともに多量
のトリプトフアンも吸着され、かつその回収は不
可能である。またその際トリプトフアンのみイオ
ン交換樹脂に吸着させ、ベンゼン、トルエンなど
の水と混和しない有機溶媒にインドールを接触さ
せて有機溶媒側へ抽出して分離する方法も考えら
れるが、その場合は多量の溶媒が必要であり、溶
媒回収操作など煩雑となる。

問題点を解決するための手段本発明者らは上記のような問題を解決すべく鋭
意検討の結果、本発明方法に到達したものであ
る。

即ち、本発明方法はインドールを原料に用いて
酵素作用により得られたＬ−トリプトフアンよ
り、未反応インドールを分離、回収する方法にお
いて、インドールを含むトリプトフアン反応液
を、ポーラス型陽イオン交換樹脂層へ通液して、
樹脂イオン交換基におけるトリプトフアンのイオ
ン吸着、溶離、再生の繰返し処理を行つた後、樹
脂ポーラス部に吸着されたインドールを、水と混
合する含水有機溶媒を用いて溶離させ、溶離液か
ら常法にしたがいインドールを単離することを特
徴とする、Ｌ−トリプトフアンよりインドールの
分離回収方法である。

本発明においては、反応後の水媒体中の未反応
インドールは、トリプトフアンがポーラス型の陽
イオン交換樹脂層に通液され、トリプトフアンの
イオン交換基による吸着、溶離、再生のトリプト
フアン分離操作の繰返し処理を行われている間、
樹脂中のポーラス部分に吸着され蓄積されるの
で、樹脂への吸着量が平衡吸着量以下の一定値に
なつた時点でインドール溶離剤を通液して溶離さ
せれば高濃度のインドール溶液が得られ、これよ
り濃縮、晶析などの常法にしたがい分離すれば分
離工程では低コストで容易に高純度のインドール
が単離できる。しかもポーラス型陽イオン交換樹
脂で処理したＬ−トリプトフアン溶離液中には、
インドールは殆んど含まれていないことがわかつ
た。

本発明において使用されるＬ−トリプトフアン
反応液とは、例えばインドールとＬ−セリンとを
水媒体中トリプトフアンシンターゼの存在下酵素
的に縮合させて得られる反応液、あるいはインド
ールとピルビン酸及びアンモニアとをトリプトフ
アナーゼ（E.C.4.1.99.1）存在下に作用させた反
応液などであり、菌体タンパクの除去など前処理
を施した後のものでも差しつかえない。また、有
効成分であるＬ−トリプトフアン及び、インドー
ルを回収する目的であれば反応液でなくても精製
工程中で排出される液、例えば洗液などに適用
しても差しつかえない。

これらの反応液や洗液などの有効成分を含む
液は、実際に使用する前に樹脂塔閉塞の原因とな
る固型物類は好ましくは除去しておくのが良い。

本発明方法において、用いるイオン交換樹脂と
しては、ポーラス型の陽イオン交換樹脂であれば
いずれでも良いが、例えばレバチツト（Lewatit
SP−112）、アンバライト（Amberlite 200C）、
ダイアイオン（Diaion PK−220）など強酸性カ
チオン交換樹脂のマクロポーラス型が好ましく、
強酸性カチオン交換樹脂でもゲル型は本発明方法
には使用できない。

樹脂の使用量は、被処理液中の総カチオン量、
すなわちＬ−トリプトフアンの他に通常の反応液
中に含まれている夾雑物アミノ酸、アンモニウム
イオン、ナトリウムイオンなどの陽イオン総モル
当量が樹脂の総交換容量以内となる様にする。

樹脂は、カラムに充填して使用するのが好まし
い。

通液時の被処理液はPHは中性〜酸性が好まし
く、温度は90℃以下で通液はSV＝１〜10^h-1で行
う。

通液終了後は水を通液し、樹脂を十分洗浄後、
常法にしたがいトリプトフアンの溶離を行う。溶
離液としてはアンモニア水が好ましく、アンモニ
ア水で溶離する場合は、５〜30wt％のアンモニ
ア水をカラム上部よりSV＝１〜10^h-1で溶離させ
る方法もしくはカラム内の水を循環させそこへガ
ス状アンモニアを吹き込む方法など、いずれでも
良く、少なくともカラム内のPHを10以上とする
のがよい。また該操作によりＬ−トリプトフアン
はほぼ完全に溶離されるが、カラム内の残留分を
回収するために、さらに水で押し出しを実施する
と良い。

このようにして通常被処理液中に含有のＬ−ト
リプトフアンの95％が処理液へ回収される。また
被処理液含有のインドールの５％以下が処理液中
へリークされるが、Ｌ−トリプトフアンを含む処
理液は、公知の単離方法すなわち、濃縮、晶出、
固液分離、乾燥などの単位操作により許容以下の
インドールを含有する悪臭で高品質のＬ−トリプ
トフアンを単離することができる。

トリプトフアン溶離後の樹脂は充分水洗し、樹
脂は常法により塩酸、硫酸などにより再生し、反
復使用される。

以上のようにトリプトフアンの吸着、溶離、樹
脂再生操作は繰返えされるが、本発明においては
被処理液中に含まれるトリプトフアンとインドー
ルの濃度比率に大きな差があり、また吸着機構が
異るため、吸着されたインドールの溶離は、トリ
プトフアンの分離処理を繰返した後のインドール
の吸着容量にほぼ達した時点で実施する必要があ
る。さもなければその後の溶離液からのインドー
ル単離に困難をきたす。したがつて通常は、イン
ドールの含有比率にもよるが、トリプトフアンの
吸着、溶離、再生を少くとも５回以上繰返した後
インドールの溶離を行う。

インドール溶離液としては、含水有機溶媒を用
いる。有機溶媒だけでは親和性に乏しく完全な溶
離ができない。好ましい有機溶媒としては低級脂
肪族アルコールであり、メタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどが
挙げられ、特にイソプロパノールが好ましい。こ
れらを10％以上、望ましくは70％以上含むアルコ
ール水溶液に調整し、カラム上部よりSV＝１〜
10^h-1の速度で樹脂量の１倍以上、好ましくは２
倍程度用いて通液溶離する。

得られたインドール溶離液は、常法に従い、濃
縮、溶媒回収後、トルエン、ヘキサンなどの非水
系有機溶媒で逆抽出、分液後有機溶媒を冷却し、
インドールを晶出させるなどの常套手段により固
体となし過分離される。

またインドール溶離後のカラムは充分水洗して
溶媒を除去した後、トリプトフアンの分離に再使
用される。

以下参考例、実施例を示すが％は重量％であ
る。

実施例１大腸菌を培養して生産された酵素トリプトフア
ンシンターゼの存在下、水性媒体中でインドール
とＬ−セリンを縮合させて得たＬ−トリプトフア
ンを含む反応液に、活性炭及び水を添加し、硫酸
にてPH4として95〜100℃で１時間加熱して菌体
をフロツク化後、活性炭に吸着された菌体をその
まま過により除去した。このようにして前処理
して得られたＬ−トリプトフアン3.8％
（0.19M）、インドールを0.1％、Ｌ−セリンを0.2
％（0.02M）、アンモニウムイオンを0.8％
（0.44M）、ナトリウムイオンを0.2％（0.09M）含
む水溶液2580ｇ（アミノ酸及びカチオン総モル当
量が1.9）をレバチツトSP−112（バイエル社品、
交換容量1.9mol）1.0をコンデイシヨニング再
生によりH⁺型とした樹脂を充填したカラムの上
部よりSV＝5^h-1で通液させた。通液終了時の流
出液を、高速液体クロマトグラフイーでＬ−トリ
プトフアンの検出を行なつたが検出されなかつ
た。

さらに水２をSV＝10^h-1で通水して洗浄後、
10％NH₃水600ｇをSV＝2^h-1で通液し、さらに水
1000ｇを通水して押し出しを行い、溶離液16000
ｇを得た。溶離液中には、Ｌ−トリプトフアン
5.9％（94.1ｇ相当、吸着原液中のＬ−トリプト
フアンに対して96.0％の回収率）、インドール
1ppm以下（インドール除去率ほぼ100％）を含有
していた。

該溶離液を減圧下に濃縮して約630ｇとし、イ
ソプロピルアルコール200ｇを添加して５℃で２
時間晶出を行ないヌツチエによる真空過後、さ
らに30％イソプロピルアルコール水100ｇで洗浄
しwet・ケーキ106.6ｇを得てこれを乾燥し、白色
鱗片状の結晶66.7ｇを得た。

通算収率68.0％／吸着原液、製品品質は純度
99.6％、旋光度−31.3°、インドールは不検出であ
り、透過率95.0％（2NHCl ２％水溶液として
430nmの透過率を測定）など日本薬局方を満足で
きるものであつた。

また、Ｌ−トリプトフアン溶離後の樹脂は、さ
らに２の水で水洗後、80％イソプロピルアルコ
ール水溶液2000ｇをカラム上部よりSV＝2^h-1で
通液し、インドール含有溶離液2000ｇを得た。該
溶離液中にはインドールが0.12％（吸着原液中の
インドールに対して92.0％の回収率）含有されて
いた。

実施例２参考例と同様にしてインドールの溶離を行なわ
ないで、Ｌ−トリプトフアンの吸着、溶離、再生
のみを23回繰り返した。その間、通液終了時の留
下液を高速液体クロマトグラフイーでＬ−トリプ
トフアンの検出をチエツクし、Ｌ−トリプトフア
ンの検出を認めた後反応液の通液を止め、80％イ
ソプロピルアルコール水溶液2000ｇをカラム上部
よりSV＝2^h-1で通流し、インドール含有溶離液
2000ｇを得た。該溶離液中には、インドールが
3.2％含有されていた。該溶離液を500ｇまで濃縮
後、60℃にてｎ−ヘキサン200ｇを加えて混合抽
出、分液後ｎ−ヘキサン層を冷却して、５℃／
2Hr晶出を行い、ヌツチエで過して、得られた
wetケーキを乾燥して、インドール39.0ｇを得た。
（回収率61.0％、ガスクロマトグラフイー純度100
％）該回収インドールは、Ｌ−トリプトフアン酵
素反応の原料として再使用したが、反応には全く
影響ないことが確認された。

Claims

【特許請求の範囲】１インドールを原料に用いて酵素作用により得
らたＬ−トリプトフアンより、未反応インドール
を分離、回収する方法において、インドールを含
むＬ−トリプトフアン反応液を、ポーラス型イオ
ン交換樹脂層へ通液して、樹脂のイオン交換基に
おけるＬ−トリプトフアンの吸着、溶離、再生の
繰返し処理を行つた後、樹脂のポーラス部に吸着
されたインドールを、水と混合する含水有機溶媒
を用いて溶離させ、溶離液からインドールを単離
することを特徴とする、Ｌ−トリプトフアンより
インドールの分離回収方法。２水と混合する含水有機溶媒が、低級脂肪族ア
ルコール水溶液である特許請求の範囲第１項記載
の方法。