JPH03200765A - Ｌ―トリプトフアンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｌ−１−リプトファンの精製方法に関するも
のである。更に詳しく説明すると、発酵法または酵素法
により得られたＬ−トリプトファン含有反応液から、精
製された高品質のＬ−ト！Ｊブト７アンを分離する方法
に関するものである。

従来の技術 Ｌ−トリプトファンは必須アミノ酸の一種であり、医薬
品、ｍ康食品、飼料添加剤などに使用される有用な化合
物である。

従来Ｌ−１−リプトファンは、セリンとインドールより
トリプト７アンシンテターゼを用いて合戊する方法、ピ
ルビン酸とアンモニアとインドールよりトリプトファナ
ーゼを用いて合皮する方法、アンスラニル酸から中間体
発酵法などの発酵法または酵素法によって製造されるこ
とが知られている。いずれの方法による場合も、精製さ
れた良好な品質のＬ−１リプトフアンを反応液から分離
するためには、菌体や酵素及び不純物を除去することか
必要である。

このような発酵法または酵素法によって得られたＬ−ト
リプトファンを反応液から純度よく分離し回収する方法
は、下記に示すいくつかの方法が提案されている。

（１）非イオン交換性の多孔質性樹脂による接触処理及
び限外濾過膜による濾過処理を行なう方法（特開昭５８
−８９５号公報参照）。この方法によれば、得られた結
晶は微かに着色しており白色結晶を得るためには水／メ
タノール再結晶が必要でありそのため工程が増加しコス
トアップになる。

（２）トリプトファンまたはフェニルアラニンのアルカ
リ溶液に低級アルコールまたはケトン類を添加し、これ
らアミノ酸を晶析する方法（特開昭５９−３９８５７号
公報参照）。この方法は結晶形態を変えて晶出させる方
法であるが、この方法によって得られたトリプトファン
は成る程度の色相は改善されるが、その純度は充分満足
すべきものとは言えない。

（３）　Ｌ　−トリプトファン含有反応液を濃縮し、こ
れに脂肪族低級アルコールを添加して、Ｌ−トリプトフ
ァンを晶出させる方法（特開昭６０−３０６９４号公報
参照）及びＬ−１−リグドアアン含有反応液をｐＨ２〜
５で活性炭で処理し、得られる炉液を非極性多孔質性樹
脂と接触処理し、処理液を濃縮後、脂肪族アルコールを
添加してＬ−）リプドアアンを晶出させる方法（特開昭
６１−１２６０７０号公報参照）。これらの方法によれ
ば、得られたＬ−トリプトファンの色相はほぼ満足すべ
きものではあるが、多量のアルコールを必要とすること
、さらにＬ−）リプドアアンの回収率が低いことなどの
ためにコストアップになるという問題がある。

（４）不純物を含有するトリプトファン溶液を非極性多
孔質性吸着剤と接触させ、次いで水、酸、アルカリ、脂
肪族アルコール或いはこれらの混合液でＬ−トリプトフ
ァンを溶離する方法（特開昭６１−２４９９６１号公報
参照）及び不純物を含有するトリプトファン水溶液を非
極性ハイポーラスポリマー樹脂に通液してトリプトファ
ンを吸着し、次いでアンモニア水を用いてトリプトファ
ンを溶出させ、得られた溶出液を逆浸透膜を用いて濃縮
し、濃縮液からアンモニアを除去してトリプトファンを
晶出させる方法（特開昭６３−１３０５８０号公報参照
）。これらの方法は、可成り高品質のトリプトファンが
得られるので優れているが、これらの方法のみでは、後
述する透過率が９５％以上の極めて高品質のものは得ら
れない。

（５）発酵法または酵素法により得られたＬ−アミノ酸
液またはその濃縮液を、限外濾過膜処理し、次いでイオ
ン交換樹脂または吸着樹脂処理する方法（特開平１−１
１２９９１号公報参照）。この方法によれは、純度は可
成り高いものが得られるが、Ｌ−トリプトファンに関す
る限り、透過率は９５％以上のものは得られない。

前述した従来公知の方法は、操作が繁雑であったり、ま
た無色の高品質のＬ−）リプドアアンを得ることが困難
であるという欠点を有していた。

すなわち、発酵法または酵素法によって得られたＬ−）
リプトファン反応液或いはそれから分離されたＬ−トリ
プトファンの溶液中には、菌体由来の不純物が含まれて
おり、それが発泡成分または着色成分の原因となる。従
ってこれら不純物は出来る限り除去する必要がある。こ
れら不純物は、特にＵＶ波長が４３０ｎｍ近辺に特性吸
収を有している。

問題を解決するための手段 そこで本発明者らは比較的簡単な方法で且つ工業的な方
法で、しかも日本薬局方規格に満足する高品質の、すな
わち４３０ｎｍのＵＶ波長で測定した透過率が９５％以
上の無色で高純度のＬ　−１−ＩＪブトファンを高い回
収率で得ることが可能な方法について研究を進めた。

その結果、発酵法または酵素法によって得られたＬ　−
トＩＪブト７アン反応液を限外濾過膜処理し、次いで非
極性多孔質性樹脂で処理し、さらに活性炭処理を行なう
ことにより、着色不純物を容易に除去することができ、
目的とする透過率を有するＬ−１リプドアアンが得られ
ることが見出された。

本発明は、かかる知見に基いて到達されたものであって
、発酵法または酵素法により得られたＬトリプトファン
反応液を、 （１）限外濾過膜による濾過処理を行ない（第１工程）
、 （２）前記第１工程で得られたろ液を、非極性多孔質性
樹脂と接触せしめて、Ｌ−トリプトファンを該樹脂に吸
着させ、次いで該樹脂に吸着したトリプトファンをアン
モニア水で溶出させ（第２工程） （３）前記第２工程で得られたＬ−トリプトファン含有
アンモニア水を活性炭と接触させ（第３工程） さらに、 （４）前記第３工程より得られたＬ−トリプトファン含
有アンモニア水からＬ−４リプドアアンを晶出せしめて
回収する（第４工程）、ことを特徴とするＬ−１リプト
フアンの精製方法である。

以下本発明の精製方法について更に詳しく説明する。

発酵法や酵素法により得られたＬ−トリプトファン反応
液中には、菌体成分や培地成分及びそれら由来のタンパ
ク質、多糖類などの高分子物質や有機物、脂質類などの
低分子物質が含まれている。

これらの種々の不純物を含む反応液より高品質のＬ−ト
リプトファンを得るには順次不純物の物性に適応した方
法を効率的に組み合わせねばならない。

一方工業的実施を考えるとＬ−トリプトファンの回収率
が高く、簡便かつ低コストである必要がある。上記の点
を考慮して本発明は完成されたものである。

本発明においては、先ず第１工程において菌体由来の高
分子物質を限外濾過膜を使用して除去する。発酵法また
は酵素法によって得られた反応液中には、一般にＬ−ト
リプトファンが約５〜２５９／Ｑ含有されている。この
反応液を限外濾過膜処理し、高分子物質を除去する。使
用される限外濾過膜は分画分子量が約５００−１００．
０００の範囲の種々のものであればよく、好ましくは約
６゜０００〜５０，０００の分画分子量のものである。

限外濾過膜を形成するポリマーは、例えばポリスルホン
、ポリアクリルニトリル、フッ化ポリビニリデン及びセ
ルロースなどが好ましい例として挙げられる。また限外
濾過膜の形式は、何等制限されないか、平膜型、中空系
型、チューブラ−型またはスパイラル型が一般的である
。

限外濾過膜処理を実施する条件は、その膜の性状によっ
て左右されるが、通常温度は５〜８５°Ｃの範囲、ｐＨ
は２〜８の範囲、また圧力は入口圧が０．５〜５．０ｋ
ｇ／ｃｍ２の範囲であり、さらに反応液の流速は、１０
〜ｌ　５０　Ｑ／ｍ２／ｈｒの範囲が有利である。

前記した第１工程による限外濾過膜処理を行って得られ
た酒液中には、Ｌ−トリプトファンの他に、培地成分や
低分子量物質を含有している。かくして本発明において
は前記第１工程で得られたろ液を非極性多孔質性樹脂と
接触させて、培地成分及び低分子量物質の除去を行なう
（第２工程）。

この第２工程では、非極性多孔質性樹脂を充填した塔（
またはカラム）に、前記限外濾過膜通過液を、例えば液
空間速度（ＳＶ）が１−１０の範囲で通液し、Ｌ−１−
リプトファンを非極性多孔質性樹脂に吸着させる。該樹
脂へのＬ−１−リプトファンの吸着操作は充填塔の排出
液中にＬ−トリプトファンが実質的に検出される間は続
けられる。かくして実質的な量のＬ−トリプトファンが
該樹脂に吸着された後、通液を停止し、次いで水を通液
することによって、該樹脂に吸着した培地成分や低分子
量物質を除去する。

本発明の第２工程において使用される非極性多孔質性樹
脂はイオン極性を有しない中性の多孔質性樹脂であり、
例えばスチレン、ジビニルベンゼンナトのビニルモノマ
ーを主たる七ツマ−として得られた重合体または共重合
体から形成され、しかも１００−１０００人の細孔半径
の微細孔を有する樹脂である。

この様な非極性多孔質性樹脂は、多種類市販されており
、そのまま使用することができる。その例としては、た
とえば゛ダイヤイオンＨＰ−１０’″゛同ＨＰ−２０”
“同ＨＰ−２１”　　“同ＨＰ−３０″　゛同ＨＰ　−
４０”　　“同ＨＰ　−５０”　　“セパピーズ５Ｐ−
２０６”　　”同５Ｐ−２０７”同５ｐ８００”’″同
ＳＰ　−９００”　（以上商品名、三菱化成社製）、゛
アンバーライトＸ　Ａ　Ｄ　−２”“同Ｘ　Ａ　Ｄ　−
４”　（以上商品名、ローム・アンド・ハース社製）、
レバチット０Ｃ１０６２（以上商品名、バイエル社製）
などが挙げられる。

前述の如く非極性多孔質性樹脂を充填した塔（またはカ
ラム）に第１工程の炉液を通液し、Ｌトリプトファンを
該樹脂に吸着させ、しかる後、水を通液して培地成分や
低分子物質を除去する。

次いで該樹脂に吸着したＬ−トリプトファンの溶出操作
を行う。この溶出操作はアンモニア水を前記塔に通液す
ることにより行なわれる。この溶出操作に使用されるア
ンモニア水は０．５〜１４Ｎ。

好ましくは１〜５Ｎの範囲の濃度のものが有利に使用さ
れる。かかるアンモニア水を溶出液として使用すること
によって、Ｌ−トリプトファンが純度よく溶出される。

かくして得られたＬ−トリプトファン含有アンモニア水
は活性炭と接触せしめる（第３工程）。

その際、Ｌ−トリプトファンを濃縮して活性炭と接触せ
しめると、活性炭の接触処理が効率的に行なわれる。こ
の濃縮は逆浸透膜を用いて行なうのが好適である。その
際使用される逆浸透膜としては耐アルカリ性の膜であれ
ばよく、膜材質及び形式は通常市販のものを使用するこ
とができる。

本発明の第３工程において使用される活性炭は、一般的
に水相吸着に使用されるものが望ましく、例えばヤシガ
ラ由来の活性炭、石炭由来の活性炭などいずれであって
もよい。

この第３工程において、Ｌ−トリプトファン含有アンモ
ニア水と活性炭との接触形式としては、前記アンモニア
水中に活性炭粉末を加えて懸濁撹拌する方式及び活性炭
を充填した塔（またはカラム）に前記アンモニア水を通
液する方式のいずれでも差支えないが、後者の方式は、
操作及び効率の点から優れている。接触の操作条件は、
特に制限を受けない。例えば温度は通常５〜６０℃の範
囲で充分であり、またｐＨはＬ−トリプトファンをアン
モニア水により溶出した時と同じで差支えない。活性炭
量に対する前記アンモニア水の処理液量比は、通常で５
〜２００、好ましくは５０〜１００の範囲が好適である
。また前記した活性炭充填塔に前記アンモニア水を通液
する場合の通液速度は液空間速度（ＳＶ）として０．１
〜５、好ましくは０．５〜２の範囲が望ましい。

この第３工程において、Ｌ−トリプトファン含有アンモ
ニア水を活性炭と接触することにより、Ｌ−トリプトフ
ァンのロスを軽減させることができ、着色不純物を高度
に除去することが可能となった。

活性炭との接触処理をしたＬ−トリプトファン含有アン
モニア水はそれ自体知られた方法に従って、Ｌ−トリプ
トファンの晶析処理を行なう（第４工程）。この晶析処
理は、前記アンモニア水を減圧下３０〜６０℃の温度条
件下で行なうのが適当である。この第４工程によって晶
析したＬ−トリプトファンは通常の固液分離操作例えば
遠心分離によりスラリーから分離し、しかる後乾燥する
ことによって目的とする着色成分を殆んど含有しない。

高い透過率を有するＬ−トリプトファンを得ることがで
きる。

一方本発明の第２工程における非極性多孔質性樹脂及び
第３工程における活性炭は、それぞれの接触処理を行な
った後容易に再生することができる。すなわち、希酸、
希アルカリ及びアセトン、メタノール、エタノール、イ
ソプピルアルコール、ブタノールなどの有機溶媒または
それらの水溶液と接触することにより容易に再生され、
しかも反復使用することができる。従って本発明の精製
方法は経済的に有利であり、工業的に充分価値を有する
ものである。

以下実施例を掲げ本発明を詳述する。

なお実施例中透過率は、Ｌ−トリブトファン結晶を２Ｎ
　　Ｈ（ｌに溶解して２％溶液とし４３０ｎｍの波長で
測定された透過率（Ｔ％）の値である。

実施例 酵素トリプトファンシンターゼの存在下、インドールと
セリンを縮合させて得たＬ−１リプドアアンを１０．？
＃の濃度で含む反応液をポリアクリルニトリル限外濾過
膜（公称分画分子量１３．０００）を用いて濾過をした
。これにより得られた清澄液２０Ｑを非極性多孔質性樹
脂（ダイヤイオンＨＰ−２０）を１０１２充填したカラ
ムに５Ｖ＝３で通液したところ、Ｌ−トリプトファンが
選択的に吸着した。そのカラムに５Ｑの水を通液した後
；２Ｎ−アンモニア水２０ＱでＬ−ｈリプドアアンを溶
離した。吸着したＬ−トリプトファンは、はとんど完全
に溶離した。さらに、逆浸透膜を用いて溶液を濃縮し、
Ｌ−トリプトファン濃度を１００Ｉ／Ｑとした。この時
のＬ−トリプトファンの回収率はほぼ１００％であった
。濃縮したＬ−トリプトファン溶液２Ｑを石炭系活性炭
ダイヤホープＳ８０：三菱化成社製）２０＋ｎｊ！を充
填したカラムにｓｖ＝　１で通液し、処理液２Ｑ　　（
Ｌ−１−リプトラアン１９５２含有）を得た。

次ニ、この処理液を減圧下５０’Ｏでアンモニアを蒸発
させ、Ｌ−トリプトファンのスラリーを得た。冷却後ヌ
ッチェを用いて濾過し、窒素気流下７０℃で減圧乾燥し
た。このようにしてＬ−トリプトファンの結晶１６５２
を得た。得られたＬトリプトファンの透過率は９８％で
あり、純度など他の分析値はすべて日本薬局方第１０改
正基準を満すものであった。

比較例 実施例１で活性炭処理工程を省略したほかは実施例１と
同様にしてＬ−トリプトファンの結晶を得た。この結晶
は若干黄味を帯びており透過率７５％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発酵法または酵素法により得られたＬ−トリプトフ
   ァン反応液を、 （１）限外濾過膜による濾過処理を行ない（第１工程）
   、 （２）前記第１工程で得られたろ液を、非極性多孔質性
   樹脂と接触せしめて、Ｌ−トリプトファンを該樹脂に吸
   着させ、次いで該樹脂に吸着したトリプトファンをアン
   モニア水で溶出させ（第２工程） （３）前記第２工程で得られたＬ−トリプトファン含有
   アンモニア水を活性炭と接触させ（第３工程） さらに、 （４）前記第３工程より得られたＬ−トリプトファン含
   有アンモニア水からＬ−トリプトファンを晶出せしめて
   回収する（第４工程）、ことを特徴とするＬ−トリプト
   ファンの精製方法。 ２、前記第２工程で得られたＬ−トリプトファン含有ア
   ンモニア水を、逆浸透膜を使用して濃縮し、得られた濃
   縮液を第３工程へ供給する特許請求の範囲第１項記載の
   精製方法。３、前記第３工程における接触はｐＨ１０以
   上で行なう特許請求の範囲第１項記載の精製方法。