CN115340583A - 一种阿卡波糖的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种阿卡波糖的提取纯化方法，涉及药物纯化技术领域。本发明先絮凝后过滤实现固液分离，结合陶瓷膜过滤和超滤膜去除悬浮物及大分子，一级纳滤膜脱盐，脱盐后的一级纳滤浓缩液经过一步阳离子交换树脂层析除杂，使阿卡波糖的纯度达到97％以上，最后经喷雾干燥得到阿卡波糖成品。本发明采用不同截留分子量的纳滤膜脱盐，脱盐过程不使用酸碱，减少了脱盐树脂的使用以及酸碱的使用量，减少了废水的排放量，是一种绿色的脱盐方法。本发明采用一步层析实现阿卡波糖与杂质的有效分离，大孔聚苯乙烯系阳离子交换树脂为层析介质，收率高且质量稳定，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物纯化技术领域，尤其涉及一种阿卡波糖的提取纯化方法。
背景技术
阿卡波糖(Acarbose)为一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，是复杂的低聚糖，主要用于Ⅱ型糖尿病的治疗。阿卡波糖的化学结构比较复杂，结构式如式1所示，目前工业上主要是利用微生物发酵来获得，代谢产生的杂质较多，然后通过发酵液的提取纯化得到高纯度的阿卡波糖，后提取过程难度大，工艺复杂。
申请号为CN200310117484的中国专利公开了一种阿卡波糖的纯化方法，使用了三步膜分离、预层析树脂、层析树脂和精制树脂等步骤，步骤长且树脂使用步骤多，会产生大量废水。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阿卡波糖的提取纯化方法，本发明的方法简单，能够降低废水排放量，且阿卡波糖的纯度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种阿卡波糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
将阿卡波糖发酵液进行絮凝，然后过滤，得到滤液；
将所述滤液用陶瓷膜过滤，得到复滤液；所述陶瓷膜的孔径为10～100nm；
将所述复滤液过超滤膜除蛋白，得到阿卡波糖超滤液；所述超滤膜的截留分子量为3000～20000Da；
将所述阿卡波糖超滤液过一级纳滤膜脱盐，浓缩至电导率降低至1000us/cm以下，得到一级纳滤浓缩液；所述一级纳滤膜的截留分子量为200～1000Da；
将所述一级纳滤浓缩液经阳离子交换层析柱吸附，待吸附完成后用去离子水洗涤至层析柱流出液澄清无色，然后用盐酸溶液进行洗脱，分段收集洗脱液；所述盐酸溶液的浓度为0.005～0.05mol/L；
将分段收集的纯度97％以上的阿卡波糖洗脱液经阴离子交换树脂脱色和中和，然后调节流出液的pH值为6～7，得到中和液；
将所述中和液用二级纳滤膜浓缩至阿卡波糖浓度为120000mg/L以上，然后向所得二级纳滤浓缩液中加入活性炭脱色，喷雾干燥，得到阿卡波糖成品；所述二级纳滤膜的截留分子量为200～600Da。
优选的，所述絮凝采用的絮凝剂为阳离子型聚丙烯酰胺或阴离子型聚丙烯酰胺。
优选的，所述过滤为板框过滤。
优选的，所述阳离子交换层析柱层的填料为大孔聚苯乙烯系阳离子交换树脂，粒径为80～160目。
优选的，所述阳离子交换层析柱层的径高比为1:8～15。
优选的，所述一级纳滤浓缩液经阳离子交换层析柱吸附的上样速度为0.1～1.0BV/h，每升树脂上样量含阿卡波糖不超过30g。
优选的，所述一级纳滤膜脱盐采用稀释过滤法。
优选的，所述洗脱的流速为0.1～1.0BV/h。
优选的，所述活性炭的加入量为二级纳滤浓缩液体积的1.0～3.0％。
优选的，所述阿卡波糖洗脱液经阴离子交换树脂的上样速度为1～5BV/h。
本发明提供了一种阿卡波糖的提取纯化方法，包括以下步骤：将阿卡波糖发酵液进行絮凝，然后过滤，得到滤液；将所述滤液用陶瓷膜过滤，得到复滤液；所述陶瓷膜的孔径为10～100nm；将所述复滤液过超滤膜除蛋白，得到阿卡波糖超滤液；所述超滤膜的截留分子量为3000～20000Da；将所述阿卡波糖超滤液过一级纳滤膜脱盐，浓缩至电导率降低至1000us/cm以下，得到一级纳滤浓缩液；所述一级纳滤膜的截留分子量为200～1000Da；将所述一级纳滤浓缩液经阳离子交换层析柱吸附，待吸附完成后用去离子水洗涤至层析柱流出液澄清无色，然后用盐酸溶液进行洗脱，分段收集洗脱液；所述盐酸溶液的浓度为0.005～0.05mol/L；将分段收集的纯度97％以上的阿卡波糖洗脱液经阴离子交换树脂脱色和中和，然后调节流出液的pH值为6～7，得到中和液；将所述中和液用二级纳滤膜浓缩至阿卡波糖浓度为120000mg/L以上，然后向所得二级纳滤浓缩液中加入活性炭脱色，喷雾干燥，得到阿卡波糖成品；所述二级纳滤膜的截留分子量为200～600Da。
本发明先絮凝后过滤实现固液分离，结合陶瓷膜过滤和超滤膜去除悬浮物及大分子，一级纳滤膜脱盐，脱盐后的一级纳滤浓缩液经过一步阳离子交换树脂层析除杂，使阿卡波糖的纯度达到97％以上，最后经喷雾干燥得到阿卡波糖成品。本发明采用不同截留分子量的纳滤膜脱盐，脱盐过程不使用酸碱，减少了脱盐树脂的使用以及酸碱的使用量，减少了废水的排放量，是一种绿色的脱盐方法。
进一步的，本发明采用一步层析实现阿卡波糖与杂质的有效分离，大孔聚苯乙烯系阳离子交换树脂为层析介质，收率高且质量稳定，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1制备的阿卡波糖成品的液相图谱；
图2为实施例2制备的阿卡波糖成品的液相图谱；
图3为实施例3制备的阿卡波糖成品的液相图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种阿卡波糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
将阿卡波糖发酵液进行絮凝，然后过滤，得到滤液；
将所述滤液用陶瓷膜过滤，得到复滤液；所述陶瓷膜的孔径为10～100nm；
将所述复滤液过超滤膜除蛋白，得到阿卡波糖超滤液；所述超滤膜的截留分子量为3000～20000Da；
将所述阿卡波糖超滤液过一级纳滤膜脱盐，浓缩至电导率降低至1000us/cm以下，得到一级纳滤浓缩液；所述一级纳滤膜的截留分子量为200～1000Da；
将所述一级纳滤浓缩液经阳离子交换层析柱吸附，待吸附完成后用去离子水洗涤至层析柱流出液澄清无色，然后用盐酸溶液进行洗脱，分段收集洗脱液；所述盐酸溶液的浓度为0.005～0.05mol/L；
将分段收集的纯度97％以上的阿卡波糖洗脱液经阴离子交换树脂脱色和中和，然后调节流出液的pH值为6～7，得到中和液；
将所述中和液用二级纳滤膜浓缩至阿卡波糖浓度为120000mg/L以上，然后向所得二级纳滤浓缩液中加入活性炭脱色，喷雾干燥，得到阿卡波糖成品；所述二级纳滤膜的截留分子量为200～600Da。
本发明将阿卡波糖发酵液进行絮凝，然后过滤，得到滤液。
在本发明中，所述阿卡波糖发酵液采用本领域公知的方法发酵得到即可。在本发明中，所述阿卡波糖发酵液由菌丝体、剩余培养基、残糖、阿卡波糖、副产物等组成。在本发明中，所述絮凝采用的絮凝剂优选为阳离子型聚丙烯酰胺或阴离子型聚丙烯酰胺。本发明对所述絮凝剂的用量没有特殊要求，添加絮凝剂时，发酵液中的菌体会聚集成团，当出现明显的絮状物时，絮凝剂即可停止加入。本发明优选在缓慢搅拌条件下进行絮凝。本发明对所述缓慢搅拌的速率没有特殊要求，不破坏絮状物结构即可。在本发明中，所述过滤优选为板框过滤。本发明采用板框过滤有利于实现工业化生产。本发明利用絮凝和过滤初步实现固液分离。
得到滤液后，本发明将所述滤液用陶瓷膜过滤，得到复滤液。
在本发明中，所述陶瓷膜的孔径为10～100nm，优选为20～90nm，进一步优选为30～80nm。本发明利用陶瓷膜过滤除去滤液中的悬浮物和大分子物质。
得到复滤液后，本发明将所述复滤液过超滤膜除蛋白，得到阿卡波糖超滤液。
在本发明中，所述超滤膜的截留分子量为3000～20000Da，优选为5000～18000Da，更优选为10000～15000Da。在本发明中，所述超滤膜的材质优选为聚砜。本发明利用超滤膜过滤除去复滤液中的蛋白大分子。在本发明中，经过超滤膜过滤后，得到的阿卡波糖超滤液中阿卡波糖含量3000～6000mg/L，电导率优选为5000～7000us/cm。
得到阿卡波糖超滤液后，本发明将所述阿卡波糖超滤液过一级纳滤膜脱盐，浓缩至电导率降低至1000us/cm以下，得到一级纳滤浓缩液。
在本发明中，所述一级纳滤膜的截留分子量为200～1000Da，优选为300～900Da，更优选为400～800Da。在本发明中，所述一级纳滤膜脱盐优选采用稀释过滤法。本发明采用稀释过滤法保证无机盐小分子通过纳滤膜，阿卡波糖截留下来。本发明对所述稀释过滤法的稀释倍数和稀释次数没有要求，直至浓缩至电导率降低至1000us/cm以下即可。在本发明的某一实施例中，具体是在一级纳滤开始前，向阿卡波糖超滤液中加去离子水至体积20L，进行一级纳滤膜脱盐，浓缩至剩余10L料时，再加水至体积20L，重复3次，最后浓缩至体积8L，电导率为812us/cm。本发明经过一级纳滤膜脱盐后再进行层析柱分离，可以提高生产效率和层析分离除杂效果。在本发明中，所述一级纳滤浓缩液中阿卡波糖的含量优选为3000～10000mg/L。
在本发明中，陶瓷膜过滤、超滤膜除蛋白和一级纳滤膜脱盐可连续操作，过程中控制温度优选不超过25℃。膜运行过程中，由于泵的高速旋转，料液温度会升高，温度过高杂质会升高。
得到一级纳滤浓缩液后，本发明将所述一级纳滤浓缩液经阳离子交换层析柱吸附，待吸附完成后用去离子水洗涤至层析柱流出液澄清无色，然后用盐酸溶液进行洗脱，分段收集洗脱液。
在本发明中，所述阳离子交换层析柱层的填料优选为大孔聚苯乙烯系阳离子交换树脂，粒径优选为80～160目，更优选为100～140目；所述阳离子交换层析柱层的径高比优选为1:8～15，更优选为1:10～13。在本发明中，所述一级纳滤浓缩液的上样速度优选为0.1～1.0BV/h，更优选为0.3～0.8BV/h，进一步优选为0.5～0.6BV/h。在本发明中，每升树脂上样量含阿卡波糖优选不超过30g，更优选含20～30g阿卡波糖。
在本发明中，所述盐酸溶液的浓度为0.005～0.05mol/L，优选为0.01～0.04mol/L，更优选为0.02～0.03mol/L。在本发明中，所述洗脱的流速优选为0.1～1.0BV/h，更优选为0.2～0.8BV/h，进一步优选为0.2～0.4BV/h。本发明采用一步层析实现阿卡波糖与杂质的有效分离，大孔聚苯乙烯系阳离子交换树脂为层析介质，收率高且质量稳定，适合工业化生产。
分段收集洗脱液后，本发明将分段收集的纯度97％以上的阿卡波糖洗脱液经阴离子交换树脂脱色和中和，然后调节流出液的pH值为6～7，得到中和液。
本发明优选将纯度97％以上的洗脱液合并后然后过阴离子交换树脂。在本发明中，所述阴离子交换树脂优选为弱碱性凝胶阴离子交换树脂。在本发明中，所述阿卡波糖洗脱液的上样速度优选为1～5BV/h，更优选为2～4BV/h。本发明利用阴离子交换树脂柱起到脱色和中和的作用，经过阴离子交换树脂柱的流出液呈弱碱性，本发明优选采用盐酸调节其pH值为6～7，从而满足成品的pH质量要求。
得到中和液后，本发明将所述中和液用二级纳滤膜浓缩至阿卡波糖浓度为120000mg/L以上，然后向所得二级纳滤浓缩液中加入活性炭脱色，喷雾干燥，得到阿卡波糖成品。
在本发明中，所述二级纳滤膜的截留分子量为200～600Da，优选为300～500Da。本发明利用二级纳滤膜进一步浓缩。
在本发明中，所述活性炭的加入量优选为二级纳滤浓缩液体积的1.0～3.0％，更优选为1.5～2.5％。在本发明中，所述活性炭脱色优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的时间优选为1～2h。完成所述活性炭脱色后，本发明优选除去二级纳滤浓缩中的活性炭，然后对所得脱色液进行喷雾干燥。本发明对除去活性炭的方式没有特殊要求，本领域熟知的能够去除活性炭的方式均可，具体的如：真空抽滤、板框过滤。
本发明对所述喷雾干燥没有特殊要求，采用本领域熟知的喷雾干燥操作，控制成品水分不超过4％即可。本发明经过提取纯化得到的阿卡波糖成品纯度在97％以上，总收率在60％以上。
下面结合实施例对本发明提供的阿卡波糖的提取纯化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
阿卡波糖发酵液10L，阿卡波糖含量5050mg/L，阴离子型聚丙烯酰胺进行絮凝，然后用板框过滤，滤液电导率为5600us/cm；滤液用孔径100nm的陶瓷膜过滤，提高滤液质量，得到的复滤液澄清，然后复滤液用截留分子量20000Da的超滤膜除蛋白，得到的阿卡波糖超滤液用一级纳滤膜脱盐，一级纳滤膜截留分子量为600Da，采用稀释过滤法，纳滤开始前，阿卡波糖超滤液加去离子水至体积20L，进行纳滤膜脱盐，浓缩至剩余10L料时，再加水至体积20L，重复3次，最后浓缩至体积8L，电导率为812us/cm，阿卡波糖含量为5200mg/L，得到一级纳滤浓缩液。将所述一级纳滤浓缩液阳离子交换层析柱吸附，层析柱径高比为1：10，层析柱按照每升树脂处理25g阿卡波糖上样，吸附流速0.5BV/h，吸附结束后水洗8h至层析柱出口澄清，用0.03mol/L盐酸溶液洗脱，洗脱流速0.2BV/h，分段收集洗脱液，高效液相色谱检测洗脱液纯度，将纯度97％以上的洗脱液合并后上阴离子交换树脂脱色，流速1.5BV/h，然后调节流出液pH值为6.52，得到中和液；中和液用二级纳滤膜浓缩至阿卡波糖含量140000mg/L，二级纳滤膜截留分子量为200Da，浓缩液加1.5％(以浓缩液体积计)活性炭脱色，搅拌1h后真空抽滤除去活性炭，得到脱色液。将所述脱色液喷雾干燥得到阿卡波糖成品。提取总收率为66％，面积归一法检测纯度为99.056％，液相图谱见图1。
实施例2
阿卡波糖发酵液10L，阿卡波糖含量5500mg/L，阳离子型聚丙烯酰胺进行絮凝，然后用板框过滤，滤液电导率约5800us/cm；滤液用孔径50nm的陶瓷膜过滤，提高滤液质量，复滤液澄清，然后复滤液用截留分子量10000Da的超滤膜除蛋白，得到阿卡波糖超滤液。将所述阿卡波糖超滤液用一级纳滤脱盐，一级纳滤膜截留分子量为600Da，采用稀释过滤法，纳滤开始前，阿卡波糖超滤液加去离子水至体积20L，进行纳滤膜脱盐，浓缩至剩余10L料时，再加水至体积20L，重复4次，最后浓缩至体积9升，电导率为752us/cm，阿卡波糖含量为4500mg/L，将所述一级纳滤浓缩液阳离子交换层析柱吸附，层析柱径高比为1:15，层析柱按照每升树脂处理30g阿卡波糖上样，吸附流速0.8BV/h，吸附结束后水洗10h至层析柱出口澄清；用0.05mol/L盐酸洗脱，洗脱流速0.3BV/h，分段收集洗脱液，高效液相色谱检测洗脱液纯度，将纯度97％以上的洗脱液合并后上阴离子交换树脂脱色，流速2.0BV/h，调节流出液的pH值为6.52，得到中和液。所述中和液用二级纳滤膜浓缩至阿卡波糖含量130000mg/L，二级纳滤膜截留分子量为200Da，浓缩液加活性炭2％(以浓缩液体积计)，搅拌1.5h后真空抽滤除去活性炭，喷雾干燥得到阿卡波糖成品。提取总收率为65％，面积归一法检测色谱纯度为99.651％，液相图谱见图2。
实施例3
阿卡波糖发酵液10L，阿卡波糖含量6000mg/L，阴离子型聚丙烯酰胺进行絮凝，然后用板框过滤，滤液电导率约5700us/cm；滤液用孔径30nm的陶瓷膜过滤，提高滤液质量，复滤液澄清，然后复滤液用截留分子量5000Da的超滤膜除蛋白，得到阿卡波糖超滤液。将所述阿卡波糖超滤液用一级纳滤膜脱盐，一级纳滤膜截留分子量为400Da，采用稀释过滤法，纳滤开始前，阿卡波糖超滤液加去离子水至体积20L，进行纳滤膜脱盐，浓缩至剩余10L料时，再加水至体积20L，重复3次，最后浓缩至体积8L，电导率为640us/cm，阿卡波糖含量为4000mg/L，将得到的一级纳滤浓缩液上阳离子交换层析柱吸附，层析柱径高比为1：8，层析柱按照每升树脂处理20g阿卡波糖上样，吸附流速0.5BV/h，吸附结束后水洗8h至层析柱出口澄清，用0.02mol/L盐酸洗脱，洗脱流速0.4BV/h，分段收集洗脱液，高效液相色谱检测洗脱液纯度，将纯度97％以上的洗脱液合并后上阴离子交换树脂脱色，流速2.0BV/h，调节流出液的pH值为6.3，得到中和液。将所述中和液用二级纳滤膜浓缩至含量130000mg/L，纳滤膜截留分子量300Da，浓缩液加1.0％(以浓缩液体积计)活性炭，搅拌1h后真空抽滤除去活性炭，喷雾干燥得到阿卡波糖成品，提取总收率为67％，面积归一法检测色谱纯度为99.590％，液相图谱见图3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种阿卡波糖的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将阿卡波糖发酵液进行絮凝，然后过滤，得到滤液；
将所述滤液用陶瓷膜过滤，得到复滤液；所述陶瓷膜的孔径为10～100nm；
将所述复滤液过超滤膜除蛋白，得到阿卡波糖超滤液；所述超滤膜的截留分子量为3000～20000Da；
将所述阿卡波糖超滤液过一级纳滤膜脱盐，浓缩至电导率降低至1000us/cm以下，得到一级纳滤浓缩液；所述一级纳滤膜的截留分子量为200～1000Da；
将所述一级纳滤浓缩液经阳离子交换层析柱吸附，待吸附完成后用去离子水洗涤至层析柱流出液澄清无色，然后用盐酸溶液进行洗脱，分段收集洗脱液；所述盐酸溶液的浓度为0.005～0.05mol/L；
将分段收集的纯度97％以上的阿卡波糖洗脱液经阴离子交换树脂脱色和中和，然后调节流出液的pH值为6～7，得到中和液；
将所述中和液用二级纳滤膜浓缩至阿卡波糖浓度为120000mg/L以上，然后向所得二级纳滤浓缩液中加入活性炭脱色，喷雾干燥，得到阿卡波糖成品；所述二级纳滤膜的截留分子量为200～600Da。
2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述絮凝采用的絮凝剂为阳离子型聚丙烯酰胺或阴离子型聚丙烯酰胺。
3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述过滤为板框过滤。
4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱层的填料为大孔聚苯乙烯系阳离子交换树脂，粒径为80～160目。
5.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱层的径高比为1:8～15。
6.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述一级纳滤浓缩液经阳离子交换层析柱吸附的上样速度为0.1～1.0BV/h，每升树脂上样量含阿卡波糖不超过30g。
7.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述一级纳滤膜脱盐采用稀释过滤法。
8.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述洗脱的流速为0.1～1.0BV/h。
9.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述活性炭的加入量为二级纳滤浓缩液体积的1.0～3.0％。
10.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述阿卡波糖洗脱液经阴离子交换树脂的上样速度为1～5BV/h。
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