CN110156853A - 一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物药物分离纯化技术领域，具体涉及一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法。本方法将预处理过的阿卡波糖发酵液经过微滤去除菌体和发酵培养基中大颗粒不溶杂质，然后经过超滤去除可溶性大分子蛋白、糖类和部分色素，再经过反渗透去除盐和色素，并得到浓缩的阿卡波糖初纯液。在完成膜过滤后将阿卡波糖溶液上样中压制备液相色谱系统，检测波长为210 nm，流动相为有机溶剂和水混合相，流速控制在10‑50 ml/min。将获得的高纯度阿卡波糖收集液进行减压浓缩，最后进行喷雾干燥获得成品。本方法采用膜过滤和中压制备色谱制备的阿卡波糖纯度高、生产效率高。

Description

一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法

技术领域

本发明属于生物药物分离纯化技术领域，具体涉及一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法。

背景技术

阿卡波糖（Acarbose）是一种由微生物游动放线菌合成的次级代谢产物，可以竞争性抑制α-葡萄糖苷酶活性，减少或延缓小肠壁细胞对寡糖、多糖的酶解，从而降低糖的吸收，达到降糖的作用。在我国，阿卡波糖是治疗糖尿病的一线用药之一。

由于阿卡波糖是由微生物生产获得，所以在生产过程中容易产生多种与阿卡波糖结构高度相似的类似物，互为同分异构体，给分离纯化带来了极大的困难，导致生产成本也很高。目前国内生产阿卡波糖原料药的厂商并不多，主要原因则是分离纯化难度大，也包括上游发酵调控也存在技术壁垒。

中国专利CN108753866A公开了一种制备低杂质阿卡波糖的方法。该专利主要通过改变发酵工艺参数来达到降低主要杂质C含量的目的。中国专利CN108148104A公开了一种阿卡波糖分离纯化方法，主要是采用离子交换层析的方法获得高纯度阿卡波糖，但是该方法并不是从发酵液开始处理，而是对阿卡波糖粗品（HPLC纯度45.25%）进行纯化。中国专利CN1521176A公开了一种制备高纯度阿卡波糖的方法，该方法先通过强酸性阳离子交换树脂层析，再用阴离子交换树脂层析，最后用膜过滤进行浓缩，获得纯度大于98%的阿卡波糖。中国专利CN1170836C公开了一种制备高纯度阿卡波糖的方法，该方法先用膜过滤除去菌丝体，依次用阳离子交换层析和阴离子交换层析，再采用膜过滤浓缩，最后经过强酸性大孔树脂和阴离子树脂，以及膜过滤浓缩获得98%的阿卡波糖。中国专利CN102603822B公开了一种提高阿卡波糖纯度的方法，通过氧化铝层析柱去除阿卡波糖中的A杂质。中国专利CN106423305A公开了一种卤代强酸型阳离子交换树脂的合成方法及用于高纯度阿卡波糖的制备，该方法主要涉及一种新的强酸型阳离子交换树脂的制备。中国专利CN106397506A公开了一种高品质阿卡波糖的纯化方法。主要是通过阳离子交换树脂层析和酸顶洗工艺获得高品质阿卡波糖。中国专利CN1321126C公开了一种高纯度阿卡波糖的制备方法，该方法主要通过膜过滤去除菌丝体和可溶性杂质，然后再利用膜过滤进行脱盐和浓缩，最后再经过两步树脂层析、纳滤浓缩和喷雾干燥获得98%的阿卡波糖。中国专利CN104693250A公开了一种从阿卡波糖溶液中提纯阿卡波糖的方法，主要是降低杂质A的含量。先后通过弱酸性离子交换、弱碱性树脂中和、强酸性树脂层析、纳滤浓缩和喷雾干燥获得阿卡波糖。以上发明涉及的方法都需要进行阴阳离子交换层析，不可避免会产生酸性或碱性废水，而且树脂再生麻烦。因此，需要发明一种更加高效的阿卡波糖分离纯化方法，减少人工操作环节，降低污染物排放。

发明内容

本发明的主要目的是建立一种高效快捷的生产高纯度阿卡波糖的方法，解决阿卡波糖杂质多的问题，降低生产成本。

为了达到上述目的，本发明提供了一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，该方法设计构思如下：

根据发酵工艺参数终止微生物发酵，并确保阿卡波糖发酵液性状优良，特别是菌体不能出现自溶，用12N盐酸调节发酵液pH值至4.5-6.5，优选5.5-6.0。将预处理过的阿卡波糖发酵液经过微滤去除菌体和发酵培养基中大颗粒杂质，微滤操作可以是陶瓷膜、高分子膜或金属膜，优选陶瓷膜；然后经过超滤去除可溶性大分子蛋白、糖类和部分色素，超滤膜优选高分子聚砜膜；再经过纳滤和反渗透去除盐和色素，并得到浓缩的阿卡波糖初纯液，纳滤和反渗透膜优选复合膜。在完成膜过滤后将阿卡波糖溶液上样中压制备液相色谱系统，检测波长为210nm，流动相为有机溶剂和水混合相，流速控制在10-50ml/min。将获得的高纯度阿卡波糖收集液进行减压浓缩，最后进行喷雾干燥获得成品。

技术方案如下：

本发明所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法包括以下步骤：

（1）将符合发酵工艺参数的阿卡波糖发酵液终止发酵后，用稀盐酸调节pH值至酸性，然后采用微滤膜进行微滤除菌丝体和不溶性大颗粒，得到微滤滤液；经微滤获得的滤液用超滤膜去除可溶性蛋白、糖类和部分色素，得到超滤滤液；经超滤获得的滤液用纳滤膜进行部分脱盐、脱色素和浓缩，得到纳滤截留液；最后将纳滤截留液经反渗透膜进行脱盐和进一步浓缩得到阿卡波糖膜过滤初纯液；

（2）将（1）中获得的阿卡波糖膜过滤初纯液上样中压制备液相色谱，检测波长为210nm，流动相为有机溶剂和水混合液，流速控制在10-50 ml/min，收集纯度大于99%的流出液；

（3）收集（2）中流出液，先经过减压浓缩，再经喷雾干燥获得成品。

上述符合发酵工艺参数的阿卡波糖发酵液是，当发酵进行到168—180小时，对菌丝体和发酵液性状指标进行评价，菌丝体没有自溶且染色均匀无空泡、发酵液粘度在350-430 mps的阿卡波糖发酵液；所述用稀盐酸调节pH是指用稀盐酸调节阿卡波糖发酵液的pH值至5.5-6.0。

上述的微滤膜是孔径范围为100-200nm的陶瓷膜或者有机膜或者金属膜。

上述超滤膜的材质为金属膜或者陶瓷膜或者天然高分子膜或者合成高分子膜，超滤膜的截留分子量选用10-150KD。

上述纳滤膜的材质为聚苯乙烯或者聚偏氟乙烯或者聚四氟乙烯，纳滤膜的截留分子量是300-500。

上述反渗透膜材质为聚苯乙烯或者聚偏氟乙烯或者聚四氟乙烯，反渗透膜的截留分子量是100-300。

采用上述技术方案以后，使阿卡波糖产品中的杂质显著降低，阿卡波糖的HPLC纯度达到99%以上，而且与工业上已采用的常压树脂层析方法相比，大大提高了纯化效率

附图说明

图1是本发明第一个实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC色谱图。

图2是本发明第二个实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC色谱图。

图3是本发明第二个实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

（1）当阿卡波糖发酵液进行到180小时，对菌丝体和发酵液性状指标进行评价，确保菌丝体没有自溶，染色均匀无空泡，发酵液粘度控制在350 mps，将符合上述发酵工艺参数的阿卡波糖发酵液42 L用12N盐酸溶液调节pH值至5.5，随后采用孔径为100nm的陶瓷微滤膜过滤，去除菌丝体和不溶性大颗粒，得到微滤滤液。微滤过滤时的平均膜通量为23LMH，压力控制在0.01-0.05Mpa，加水量为0.5-1倍。微滤操作的收率为99%。将微滤滤液收集后采用超滤膜进行超滤去杂，得到超滤滤液，超滤膜材质为聚砜，截留分子量为50KD，超滤步骤的平均膜通量为16LMH，压力控制在0.1-0.2Mpa，加水量为1-2倍，超滤操作的收率为99%。将超滤滤液收集后采用纳滤膜脱盐、脱色素和浓缩，得到纳滤截留液。纳滤膜选用聚酰胺聚砜复合膜，其截留分子量为400，纳滤步骤的平均膜通量为6.4LMH，压力控制在0.2-0.4 Mpa，加水量为1-1.5倍，电导率可控制在700 µs/cm以下，纳滤操作的收率为98%。最后将纳滤截留液收集后采用反渗透脱盐和浓缩得到阿卡波糖膜过滤初纯液，反渗透膜选用醋酸纤维素或聚酰胺膜，截留分子量为100。反渗透步骤的平均膜通量为3.5LMH，压力控制在0.6-0.8Mpa，加水量为0.25-0.5倍，电导率可控制在50 µs/cm以下，反渗透操作的收率为98%。

（2）收集阿卡波糖膜过滤初纯液，用流动相（不含甲酸铵）调节阿卡波糖浓度为0.04-0.1g/ml。安装制备液相色谱柱和分部收集装置，设定程序按照峰收集。色谱柱选用氨基柱。色谱柱长度为250 mm。检测波长为210nm，制备液相色谱所用流动相A为超纯水（含0.5%甲酸铵），流动相B为纯甲醇。流动相为甲醇水混合液，比例为60:40。流速控制在10-50ml/min，收集阿卡波糖组份色谱纯度大于99%的部分。

（3）收集（2）中制备液相色谱流出的高纯度（HPLC纯度>99%）阿卡波糖洗脱液，经减压浓缩后喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为135-140℃，出风温度为88-92℃，即可获得高纯度阿卡波糖成品，经检测HPLC纯度为99.6%，总收率约为85%。

如图1所示，本实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC色谱图。

本实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC纯度测定结果如下

序号	保留时间（min）	峰面积百分比（%）	理论塔板数	分离度
					1	2.617	0.37	34139	47.979
2	6.867	99.63	37615	21.698
					总计		100.00

实施例2

（1）当阿卡波糖发酵液进行到168小时，对菌丝体和发酵液性状指标进行评价，确保菌丝体没有自溶，染色均匀无空泡，发酵液粘度控制在430 mps，将符合上述发酵工艺参数的阿卡波糖发酵液45 L用12N盐酸溶液调节pH值至6.0。随后采用孔径为200 nm的陶瓷微滤膜过滤，去除菌丝体和不溶性大颗粒，得到微滤滤液。微滤过滤时的平均膜通量为26LMH，压力控制在0.02-0.07Mpa，加水量为0.5-1.2倍。微滤操作的收率为99%。将微滤滤液收集后采用超滤膜进行超滤去杂，得到超滤滤液，超滤膜材质为聚砜，截留分子量为35 KD，超滤步骤的平均膜通量为12 LMH，压力控制在0.15-0.3 Mpa，加水量为1.5-3倍，超滤操作的收率为99%。将超滤滤液收集后采用纳滤膜脱盐和浓缩，得到纳滤截留液。纳滤膜选用聚酰胺聚砜复合膜，截留分子量为500，平均膜通量为9 LMH，压力控制在0.2-0.4 Mpa，加水量为1.2-2倍，电导率可控制在800 µs/cm以下，纳滤操作的收率为98.5%。最后将纳滤截留液收集后采用反渗透脱盐和浓缩，得到阿卡波糖膜过滤初纯液。反渗透膜选用醋酸纤维素或聚酰胺膜，截留分子量为200，反渗透步骤的平均膜通量为2.5LMH，压力控制在0.8-1.0 Mpa，加水量为0.5-0.8倍，电导率可控制在40 µs/cm以下，反渗透操作的收率为98%。

（2）收集阿卡波糖膜过滤初纯液，用流动相（不含甲酸铵）调节阿卡波糖浓度调节浓度为0.04-0.1g/ml。安装制备液相色谱柱和分部收集装置，设定程序按照峰收集。色谱柱选用氨基柱。色谱柱长度为300 mm。制备液相色谱所用流动相A为超纯水（含0.5%甲酸铵），流动相B为纯甲醇。流动相为甲醇水混合液，比例为60:40。流速控制在10-50 ml/min，收集阿卡波糖组份色谱纯度大于99%的部分。

（3）收集（2）中制备液相色谱流出的高纯度（HPLC纯度>99%）阿卡波糖洗脱液，经减压浓缩后喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为135-140℃，出风温度为88-92℃，即可获得高纯度阿卡波糖成品，经检测HPLC纯度为99.2%，总收率约为85%。

如图2所示，本实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC色谱图。

本实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC纯度测定结果如下

序号	保留时间（min）	峰面积百分比（%）	理论塔板数	分离度
					1	2.583	0.84	21296	34.993
2	6.850	99.16	37433	20.015
					总计		100.00

实施例3

（1）当阿卡波糖发酵液进行到170小时，对菌丝体和发酵液性状指标进行评价，确保菌丝体没有自溶，染色均匀无空泡，发酵液粘度控制在380 mps，将符合上述发酵工艺参数的阿卡波糖发酵液40 L用12N盐酸溶液调节pH值至5.8。随后采用孔径为150 nm的陶瓷微滤膜过滤，去除菌丝体和不溶性大颗粒，得到微滤滤液。该过滤步骤的微滤膜也可以采用有机膜或者金属膜。微滤过滤时的平均膜通量为20 LMH，压力控制在0.01-0.03 Mpa，加水量为0.5倍。微滤操作的收率为99%。将微滤滤液收集后采用超滤膜进行超滤去杂，超滤膜材质为聚砜，截留分子量为50 KD，平均膜通量为18 LMH，压力控制在0.2-0.3Mpa，加水量为2倍，超滤操作的收率为99%。

将超滤滤液收集后采用纳滤膜脱盐和浓缩，得到纳滤截留液。纳滤膜选用聚酰胺聚砜复合膜，也可以采用其他金属膜或者陶瓷膜或者天然高分子膜或者合成高分子膜。纳滤膜的截留分子量为300。纳滤步骤的平均膜通量为4.6 LMH，压力控制在0.4-0.6 Mpa，加水量为1.5倍，电导率可控制在500 µs/cm以下，纳滤操作的收率为99%。最后将纳滤截留液收集后采用反渗透脱盐和浓缩，得到阿卡波糖膜过滤初纯液。反渗透膜选用醋酸纤维素或聚酰胺膜，也可以采用聚苯乙烯或者聚偏氟乙烯或者聚四氟乙烯。其截留分子量为300，反渗透步骤的平均膜通量为4.2 LMH，压力控制在0.6-0.8Mpa，加水量为0.25-0.5倍，电导率可控制在50 µs/cm以下，反渗透操作的收率为98%。

（2）收集阿卡波糖膜过滤初纯液，用流动相（不含甲酸铵）调节阿卡波糖浓度调节浓度为0.04-0.1g/ml。安装制备液相色谱柱和分部收集装置，设定程序按照峰收集。色谱柱选用氨基柱。色谱柱长度为300 mm。制备液相色谱所用流动相A为超纯水（含0.5%甲酸铵），流动相B为纯甲醇。流动相为甲醇水混合液，比例为60:40。收集阿卡波糖组份色谱纯度大于99%的部分。

（3）收集（2）中制备液相色谱流出的高纯度（HPLC纯度>99%）阿卡波糖洗脱液，经减压浓缩后喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为135-140℃，出风温度为88-92℃，即可获得高纯度阿卡波糖成品，经检测HPLC纯度为99.7%，总收率约为82%。

如图3所示，本实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC色谱图如下。

本实施例中阿卡波糖纯化产品HPLC纯度测定结果如下

序号	保留时间（min）	峰面积百分比（%）	理论塔板数	分离度
					1	2.583	0.26	33275	53.901
2	7.033	99.74	39463	23.855
					总计		100.00

Claims (8)

1.一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

将符合发酵工艺参数的阿卡波糖发酵液终止发酵后，用稀盐酸调节pH值至酸性，然后采用微滤膜进行微滤除菌丝体和不溶性大颗粒，得到微滤滤液；经微滤获得的滤液用超滤膜去除可溶性蛋白、糖类和部分色素，得到超滤滤液；经超滤获得的滤液用纳滤膜进行部分脱盐、脱色素和浓缩，得到纳滤截留液；最后将纳滤截留液经反渗透膜进行脱盐和进一步浓缩得到阿卡波糖膜过滤初纯液；

将（1）中获得的阿卡波糖膜过滤初纯液上样中压制备液相色谱，检测波长为210nm，流动相为有机溶剂和水混合液，流速控制在10-50 ml/min，收集纯度大于99%的流出液；

收集（2）中流出液，先经过减压浓缩，再经喷雾干燥获得成品。

2.如权利要求1所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于：所述符合发酵工艺参数的阿卡波糖发酵液是，当发酵进行到168—180小时，对菌丝体和发酵液性状指标进行评价，菌丝体没有自溶且染色均匀无空泡、发酵液粘度在350-430mps的阿卡波糖发酵液；所述用稀盐酸调节pH值是指用稀盐酸调节阿卡波糖发酵液的pH值至5.5-6.0。

3.如权利要求1或2所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于：所述的微滤膜是孔径范围为100-200nm的陶瓷膜或者有机膜或者金属膜。

4.如权利要求1或2所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于：所述超滤膜的材质为金属膜或者陶瓷膜或者天然高分子膜或者合成高分子膜，超滤膜的截留分子量选用10-150KD。

5.如权利要求1或2所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于：所述纳滤膜的材质为聚苯乙烯或者聚偏氟乙烯或者聚四氟乙烯，纳滤膜的截留分子量是300-500。

6.如权利要求1或2所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于：所述反渗透膜材质为聚苯乙烯或者聚偏氟乙烯或者聚四氟乙烯，反渗透膜的截留分子量是100-300。

7.如权利要求1或2所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于：在步骤（1），发酵液经反渗透膜进行脱盐后的电导率控制在50 µs/cm以下；当电导率高于50 µs/cm，重复反渗透脱盐工艺。

8.如权利要求1或2所述一种中压制备液相色谱结合获取高纯度阿卡波糖的方法，其特征在于：所述中压制备液相色谱所用色谱柱是氨基柱或酰胺柱，色谱柱内径20-30 mm，柱长150-250 mm；所述制备液相色谱所用的流动相为乙醇或者甲醇的水溶液，乙醇或者甲醇与水的比例为60:40-80:20。