CN111362860A - 一种从发酵液中提取色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其包括如下步骤：(1)发酵液初结晶；(2)分离得一次晶体；(3)发酵液二次结晶；(4)获得色氨酸成品。本发明先从色氨酸发酵液中分离出一次晶体，后去除发酵液中的菌体和蛋白，获得的清液脱色后蒸发浓缩，结晶分离得到二次晶体，完全无离交工序，排污少，对环境友好；无有机膜的工艺，设备投资少，成本低。在降低成本、减少水资源和热能消耗的情况下，产品纯度和收率均较现有工艺有大幅度提高；本发明工艺适合大规模工业化生产。
Description
技术领域：
本发明涉及一种色氨酸的生产方法，特别是涉及一种从发酵液中提取色氨酸的方法。
背景技术：
色氨酸作为人和动物生命活动的必需氨基酸，广泛应用于食品、饲料、医药以及农林等行业。在食品中添加色氨酸可促进蛋白质被人体吸收。作为饲料添加剂，在低蛋白日粮饲料中添加色氨酸对提高畜禽增重率、改善饲料效率十分有效，色氨酸是继赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸后的第四大饲料添加氨基酸。色氨酸的代谢产物5-羟基色氨酸在动物体有抗高密度、断奶等应激作用，有促进R-球蛋白的产生、增强机体抗病力的作用。此外，色氨酸还对畜禽行为产生影响，可减少攻击行为，减轻应激反应。近年来，随着色氨酸在医药、食品和饲料等方面应用的开拓，市场需求量不断增加，色氨酸的年产量超过4万吨，已成为一种国际市场上发展前景良好，国内市场需求较大的产品。
传统的色氨酸生产工艺主要是化学合成和蛋白质水解。由于生产原料有限、污染问题严重以及成本偏高等原因，上述方法已逐渐被生物发酵法取代。在过去的20年中，随着生物技术的不断发展以及生物发酵法所特有的成本低、环境友好、以及较高生产率的优势，生物发酵生产色氨酸的策略已得到广泛应用。
目前，色氨酸主要采用生物发酵法生产，从发酵液中提取色氨酸。色氨酸的提取工艺根据是否采用离交工序，可分为离交工艺和无离交工艺。离交工艺因为需要用到离子交换树脂，在树脂循环使用过程中必须用到大量的酸碱对树脂进行清洗和再生，离交工艺面临的最大问题是污水排放量大。如专利号200910224005.1公开的一种提取L-色氨酸的方法采用单柱离交工艺；又如专利号201510083900.1公开的一种L-色氨酸的提取工艺采用三柱串联离交工艺，虽然多柱串联能够大幅度减少污水排放量，但只要使用离子交换树脂，其固有的工艺性质就改变不了，必须使用酸碱再生离子交换树脂，产生大量的污水。
随着国家新环保法的出台，生产企业的环保压力急剧增大，成为制约色氨酸产品发展的重要因素。无离交的色氨酸提取工艺也得到快速发展，如专利号201410486855.X公开的一种L-色氨酸的提取方法及装置采用纳滤+两次结晶工艺；专利号200910019458.0公开的一种从发酵液中提取色氨酸的工艺采用有机膜+一次结晶+离交回收工艺，都绕开离交工序，但均使用到了昂贵的有机膜，有机膜的使用对温度要求较为苛刻，而且容易污染，不利于大规模工业化放大，同时收率上与质量上都低于离交工艺，因此山东恩贝的专利200910019458.0最后还是用上了离交回收工序，虽然比单纯的离交工艺有优势，但不可避免的又用到了离子交换树脂，污水带来的环保问题依然存在。
同时，发酵结束后，发酵液中的色氨酸含量一般在40g/L以上，由于色氨酸的溶解度低，色氨酸在水中的溶解度为11.4g/L(25℃)，在发酵液中的溶解度在20g/L左右，发酵液中会有大量的色氨酸晶体颗粒。现有工艺中，包括离交工艺和有机膜分离工艺，一般操作为先加水稀释并加热溶解发酵液中的晶体，之后再对晶体完全溶解的发酵液进行后续提取操作。根据发酵液中色氨酸的含量不同，需要加入大量的水来溶解晶体，这样就增加了用水量，同时会增加后道工序处理的物料体积，增大了后续工艺的负担，延长处理时间，增加热能消耗，增加了生产成本。
发明内容：
为克服以上技术问题，本发明提供一种完全无离交、无有机膜、高效、高质量、低成本的从发酵液中提取色氨酸的方法。
本发明的目的由如下技术方案实施：一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其包括如下步骤：(1)发酵液初结晶；(2)分离得一次晶体；(3)发酵液二次结晶；(4)获得色氨酸成品；其中，
(1)发酵液初结晶：进行发酵液结晶控制，通过改变发酵液的理化性质，使发酵液中的色氨酸更多的以晶体颗粒形态沉淀析出；
(2)分离得一次晶体：将步骤(1)结晶出的色氨酸晶体从发酵液中分离出来，得到一次晶体；
(3)发酵液二次结晶：经步骤(2)分离出一次结晶后的发酵液进行二次结晶，得到二次晶体；
(4)获得色氨酸成品：将所述一次晶体与所述二次晶体混合，干燥，粉碎后，得到符合国家标准的色氨酸成品。
进一步，所述步骤(1)发酵液初结晶，具体操作为：
发酵结束后，控制搅拌转速50～300转/min，进行等电结晶，具体为：将发酵液的pH调节至5.85～5.95，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为37-40℃(色氨酸的等电点pI＝5.89)；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低2-5℃，直至温度为5-15℃，温度达到后维持30分钟。该过程使色氨酸细小的晶核育晶长大，色氨酸晶体的比重较菌体细胞比重更大，晶体与菌体比重有显著的差异，有助于后续色氨酸晶体的分离。
进一步，所述步骤(1)中，调节发酵液pH前，向发酵液中加入结晶助剂来改善发酵液的表面张力，所述结晶助剂的添加量为100～1000ppm。
进一步，所述结晶助剂为脂肪酸甘油酯、脂肪醇酯、蔗糖酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯20或聚山梨酯80中的任意一种或一种以上的混合物。
进一步，所述步骤(2)中使用分级过滤与离心沉降的方式，将色氨酸晶体从发酵液中分离出来，分离过程中加乙醇冲洗去除晶体表面的杂质。由于结晶的排他性，该部分晶体纯度高，纯度达到99％以上，达到色氨酸饲料级国家标准要求。
进一步，所述步骤(3)发酵液二次结晶的具体操作步骤为：
I、经步骤(2)分离出一次结晶后的发酵液，调节pH至3.5～5.5，使可溶性蛋白沉降析出；进一步提高发酵液的质量。
II、调节pH后的发酵液使用菌体分离设备将菌体细胞和沉降析出的蛋白一起分离去除，得到色氨酸的过滤清液；
III、过滤清液使用大孔吸附介质进行脱色，去除色素等大分子杂质，及不溶性颗粒物，得到脱色清液；
IV、脱色清液进行蒸发浓缩，浓缩至色氨酸含量为140～180g/L，得到蒸发浓缩液；
V、蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：调节pH至5.85～5.95，等电结晶温度为55-65℃，得到初步结晶液；蒸发浓缩液用氢氧化钠或氢氧化钾调节pH值，优选用氢氧化钠调pH值。
VI、初步结晶液进行梯度降温，降温梯度为每小时降低2-5℃，直至温度为5-15℃，温度达到后维持30分钟，得到色氨酸结晶的晶浆液；
VII、对晶浆液进行离心分离，分离过程中加乙醇冲洗去除晶体表面的杂质，得到二次晶体，甩出的母液为一次母液。所述二次晶体的含量可以达到98.5％以上，二次晶体的纯度略低于上述第二步的一次晶体。
进一步，所述步骤II中使用的菌体分离设备为陶瓷膜或板框压滤机；所述步骤III使用的大孔吸附介质为活性炭，每100mL过滤清液中添加0.3～0.8g的所述活性炭，脱色温度为55～65℃，脱色时间30-60分钟；所述步骤IV中，蒸发温度控制在45-60℃，压力为-0.090～-0.099Mpa；所述步骤VI中梯度降温过程中，每小时温度降低2-5℃。
进一步，将所述步骤VII中得到的一次母液蒸发浓缩后与饲料载体按比例混匀，烘干、粉碎，制得低含量的色氨酸产品。
进一步，所述饲料载体为载体粉和钙盐，蒸发浓缩后一次母液、所述载体粉与所述钙盐的混合质量比例为：10∶1.2～1.8∶0.1～0.3。
进一步，所述载体粉为玉米芯粉、玉米皮粉、玉米浆干粉、玉米碎粒或大豆皮粉中的任意一种或一种以上的组合；所述钙盐为碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、硫酸钙或氯化钙中的任意一种或一种以上的组合；所述载体粉优选为玉米芯粉，所述钙盐优选为碳酸钙。
本发明的优点：本发明先从色氨酸发酵液中分离出一次晶体，后去除发酵液中的菌体和蛋白，获得的清液脱色后蒸发浓缩，结晶分离得到二次晶体，完全无离交工序，排污少，对环境友好；无有机膜的工艺，设备投资少，成本低。在降低成本、减少水资源和热能消耗、保证产品纯度的情况下，产品收率较现有工艺有大幅度提高；本发明工艺适合大规模工业化生产；具体表现在以下几点：
(1)先对发酵液进行预处理形成较大的晶体颗粒，分离出该部分晶体，得到大部分高质量的一次晶体，同时较现有工艺先加水溶解发酵液中的晶体，过滤去除蛋白后又蒸发浓缩获得晶体的矛盾操作，本发明节约了大量的水和热能，减少了后道工序的处理量，节约了大量的水和热能，缩短了生产时间，降低了生产成本；
(2)采用调低pH值沉降蛋白、用活性炭吸附除杂的方式提高了后续产品纯度，并提高了产品收率；
(3)由于不用离交工序，节约酸碱的用量，减少了大量污水排放，工艺环保，无环保压力，同时不用有机膜，降低了生产设备投入成本；
(4)本发明方法操作方便、生产过程容易控制，不存在物料排口，整体收率可达到90％以上。
附图说明：
图1为本发明一种从发酵液中提取色氨酸的方法工艺流程图。
具体实施方式：
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数也视为在本专利的范围内。
实施例1-6及对比实施例1-2以L-色氨酸为例对本发明做进一步说明。
色氨酸属于芳香族氨基酸，含氮13.72％，α-氨基氮6.86％。色氨酸有三种光学异构体，L-色氨酸呈绢丝光泽、六角片状白色晶体，无臭，有甜味。水中溶解度为11.4g/L(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚，等电点5.89，熔点289-290℃(分解，快速加热到210℃发黄)。L-色氨酸(又名β-吲哚-α-氨基丙酸)，英文名L—Tryptophan，分子量：204.21。
其化学结构式为：
实施例1：一种从发酵液中提取色氨酸的方法，本实施例不添加结晶助剂，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为51.6g/L，控制搅拌转速为100转/min，调节发酵液的pH值进行等电结晶，具体为：向发酵液中流加硫酸，使发酵液的pH以每5分钟下降0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为40℃；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低3℃，温度降至10℃后维持30分钟。采用自动排渣过滤器进行过滤分离晶体，过滤结束前加入6L质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体986g，即为一次晶体，湿晶体的水分含量为33.6％，一次晶体收率42.9％。
去除L-色氨酸一次晶体后的发酵液为28.9L，L-色氨酸含量为27.5g/L，用硫酸缓慢调节pH至5.00±0.02，然后进行陶瓷膜过滤，浓缩5倍后加40％体积的透析水11.5L，最终得到过滤清液41.2L，L-色氨酸含量为17.8g/L，计算陶瓷膜过滤收率为92.3％。
将过滤清液加热到60℃，然后加入活性炭进行脱色，每100mL过滤清液中添加0.4g的所述活性炭，维持60分钟后真空抽滤，得到脱色清液，透光度为40％。将脱色清液进行旋转蒸发浓缩，蒸发温度控制50℃，压力控制-0.096±0.002Mpa，浓缩至L-色氨酸含量为160±5g/L，得到蒸发浓缩液。
蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：向蒸发浓缩液中流加氢氧化钠溶液，使蒸发浓缩液的pH以每10分钟上调0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟；等电结晶温度为55-65℃。等电结晶后进行梯度降温，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为10℃，维持30分钟后进行离心分离，分离结束前加入600mL质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体834g/L，即为二次晶体，湿晶体的水分含量为33.8％。同时得到母液2.23L，即为一次母液，母液的L-色氨酸含量为26.5g/L，计算浓缩结晶分离的收率83.3％。
将一次晶体与二次晶体混合，65℃烘8小时，粉碎，得到L-色氨酸成品1216g，液相检测L-色氨酸含量为95.8％，L-色氨酸成品对发酵液的收率为75.3％。
将一次母液进行旋转蒸发浓缩3倍后，得到浓缩液1004g，与150g玉米芯粉和10g碳酸钙混合，65℃烘12小时，粉碎，得到L-色氨酸低含量成品229g，液相检测L-色氨酸含量为25.8％，低含量L-色氨酸成品对发酵液的收率为3.8％。
合计提取总收率为：75.3％+3.8％＝79.1％。
实施例2：一种从发酵液中提取色氨酸的方法，本实施例添加结晶助剂100ppm，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为50.4g/L，控制搅拌转速为100转/min，加入100ppm脂肪酸甘油酯，调节发酵液的pH值进行等电结晶，具体为：向发酵液中流加硫酸，使发酵液的pH以每5分钟下降0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为40℃；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低3℃，温度降至10℃后维持30分钟。采用自动排渣过滤器进行过滤分离晶体，过滤结束前加入6L质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体1116g，即为一次晶体，湿晶体的水分含量为30.5％，一次晶体收率51.3％。
去除L-色氨酸一次晶体后的发酵液为28.7L，L-色氨酸含量为22.8g/L，用硫酸缓慢调节pH至5.00±0.02，然后进行陶瓷膜过滤，浓缩5倍后加40％体积的透析水11.5L，最终得到过滤清液39.5L，L-色氨酸含量为15.4g/L，计算陶瓷膜过滤收率为93.0％。
将过滤清液加热到60℃，然后加入活性炭进行脱色，每100mL过滤清液中添加0.4g的所述活性炭，维持60分钟后真空抽滤，得到脱色清液，透光度为45％。将脱色清液进行旋转蒸发浓缩，蒸发温度控制50℃，压力控制-0.096±0.002Mpa，浓缩至L-色氨酸含量为160±5g/L，得到蒸发浓缩液。
蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：向蒸发浓缩液中流加氢氧化钠溶液，使蒸发浓缩液的pH以每10分钟上调0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟；等电结晶温度为55-65℃。等电结晶后进行梯度降温，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为10℃，维持30分钟后进行离心分离，分离结束前加入600mL质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体681g/L，即为二次晶体，湿晶体的水分含量为31.5％。同时得到母液2.4L，即为一次母液，母液的L-色氨酸含量为25.2g/L，计算浓缩结晶分离的收率86.6％。
将一次晶体与二次晶体混合，65℃烘8小时，粉碎，得到L-色氨酸成品1242g，液相检测L-色氨酸含量为96.9％，L-色氨酸成品对发酵液的收率为79.6％。
将一次母液进行旋转蒸发浓缩3倍后，得到浓缩液1035g，与150g玉米芯粉和10g碳酸钙混合，65℃烘12小时，粉碎，得到L-色氨酸低含量成品233g，液相检测L-色氨酸含量为25.3％，低含量L-色氨酸成品对发酵液的收率为3.9％。
合计提取总收率为：79.6％+3.9％＝83.5％。
实施例3：一种从发酵液中提取色氨酸的方法，本实施例添加结晶助剂250ppm，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为52.6g/L，控制搅拌转速为200转/min，加入250ppm脂肪酸甘油酯，调节发酵液的pH值进行等电结晶，具体为：向发酵液中流加硫酸，使发酵液的pH以每5分钟下降0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为38℃；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为15℃，维持30分钟。采用自动排渣过滤器进行过滤分离晶体，过滤结束前加入6L质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体1258g，即为一次晶体，湿晶体的水分含量为29.5％，一次晶体收率56.2％。
去除L-色氨酸一次晶体后的发酵液为28.5L，L-色氨酸含量为21.7g/L，用硫酸缓慢调节pH至5.00±0.02，然后进行陶瓷膜过滤，浓缩5倍后加40％体积的透析水11.4L，最终得到过滤清液40.8L，L-色氨酸含量为14.3g/L，计算陶瓷膜过滤收率为94.3％。
将过滤清液加热到60℃，然后加入活性炭进行脱色，每100mL过滤清液中添加0.6g的所述活性炭，维持45分钟后真空抽滤，得到脱色清液，透光度为65％。将脱色清液进行旋转蒸发浓缩，蒸发温度控制45℃，压力控制-0.096±0.002Mpa，浓缩至L-色氨酸含量为160±5g/L，得到蒸发浓缩液。
蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：向蒸发浓缩液中流加氢氧化钠溶液，使蒸发浓缩液的pH以每10分钟上调0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟；等电结晶温度为55-65℃。等电结晶后进行梯度降温，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为15℃，维持30分钟后进行离心分离，分离结束前加入600mL质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体644g/L，即为二次晶体，湿晶体的水分含量为29.7％。同时得到母液2.5L，即为一次母液，母液的L-色氨酸含量为23.8g/L，计算浓缩结晶分离的收率87.8％。
将一次晶体与二次晶体混合，65℃烘8小时，粉碎，得到L-色氨酸成品1339g，液相检测L-色氨酸含量为97.8％，L-色氨酸成品对发酵液的收率为83.0％。
将一次母液进行旋转蒸发浓缩3倍后，得到浓缩液1085g，与150g玉米芯粉和15g碳酸钙混合，65℃烘12小时，粉碎，得到L-色氨酸低含量成品239g，液相检测L-色氨酸含量为24.7％，低含量L-色氨酸成品对发酵液的收率为3.7％。
合计提取总收率为：83.0％+3.7％＝86.8％。
实施例4：一种从发酵液中提取色氨酸的方法，本实施例添加结晶助剂500ppm，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为52.6g/L，控制搅拌转速为300转/min，加入500ppm脂肪酸甘油酯，调节发酵液的pH值进行等电结晶，具体为：向发酵液中流加硫酸，使发酵液的pH以每5分钟下降0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为38℃；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为5℃，维持30分钟。采用自动排渣过滤器进行过滤分离晶体，过滤结束前加入6L质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体1306g，即为一次晶体，湿晶体的水分含量为29.0％，一次晶体收率58.8％。
去除L-色氨酸一次晶体后的发酵液为28.2L，L-色氨酸含量为21.6g/L，用硫酸缓慢调节pH至5.00±0.02，然后进行陶瓷膜过滤，浓缩5倍后加40％体积的透析水11.3L，最终得到过滤清液41.5L，L-色氨酸含量为13.9g/L，计算陶瓷膜过滤收率为94.7％。
将过滤清液加热到60℃，然后加入活性炭进行脱色，每100mL过滤清液中添加0.8g的所述活性炭，维持45分钟后真空抽滤，得到脱色清液，透光度为82％。将脱色清液进行旋转蒸发浓缩，蒸发温度控制55℃，压力控制-0.096±0.002Mpa，浓缩至L-色氨酸含量为160±5g/L，得到蒸发浓缩液。
蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：向蒸发浓缩液中流加氢氧化钠溶液，使蒸发浓缩液的pH以每10分钟上调0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟；等电结晶温度为55-65℃。等电结晶后进行梯度降温，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为5℃，维持30分钟后进行离心分离，分离结束前加入600mL质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体655g/L，即为二次晶体，湿晶体的水分含量为29.5％。同时得到母液2.6L，即为一次母液，母液的L-色氨酸含量为22.6g/L，计算浓缩结晶分离的收率90.2％。
将一次晶体与二次晶体混合，65℃烘8小时，粉碎，得到L-色氨酸成品1389g，液相检测L-色氨酸含量为98.6％，L-色氨酸成品对发酵液的收率为86.8％。
将一次母液进行旋转蒸发浓缩3倍后，得到浓缩液1117g，与150g玉米芯粉和20g碳酸钙混合，65℃烘12小时，粉碎，得到L-色氨酸低含量成品246g，液相检测L-色氨酸含量为23.6％，低含量L-色氨酸成品对发酵液的收率为3.7％。
合计提取总收率为：86.8％+3.7％＝90.5％。
实施例5：一种从发酵液中提取色氨酸的方法，本实施例添加结晶助剂750ppm，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为52.3g/L，控制搅拌转速为300转/min，加入750ppm脂肪酸甘油酯，调节发酵液的pH值进行等电结晶，具体为：向发酵液中流加硫酸，使发酵液的pH以每5分钟下降0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为38℃；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为5℃，维持30分钟。采用自动排渣过滤器进行过滤分离晶体，过滤结束前加入6L质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体1336g，即为一次晶体，湿晶体的水分含量为29.0％，一次晶体收率60.5％。
去除L-色氨酸一次晶体后的发酵液为28.1L，L-色氨酸含量为21.3g/L，用硫酸缓慢调节pH至5.00±0.02，然后进行陶瓷膜过滤，浓缩5倍后加40％体积的透析水11.2L，最终得到过滤清液41.2L，L-色氨酸含量为13.9g/L，计算陶瓷膜过滤收率为95.7％。
将过滤清液加热到60℃，然后加入活性炭进行脱色，每100mL过滤清液中添加0.8g的所述活性炭，维持45分钟后真空抽滤，得到脱色清液，透光度为83％。将脱色清液进行旋转蒸发浓缩，蒸发温度控制55℃，压力控制-0.096±0.002Mpa，浓缩至L-色氨酸含量为160±5g/L，得到蒸发浓缩液。
蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：向蒸发浓缩液中流加氢氧化钠溶液，使蒸发浓缩液的pH以每10分钟上调0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟；等电结晶温度为55-65℃。等电结晶后进行梯度降温，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为5℃，维持30分钟后进行离心分离，分离结束前加入600mL质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体648g/L，即为二次晶体，湿晶体的水分含量为29.5％。同时得到母液2.5L，即为一次母液，母液的L-色氨酸含量为22.5g/L，计算浓缩结晶分离的收率89.6％。
将一次晶体与二次晶体混合，65℃烘8小时，粉碎，得到L-色氨酸成品1405g，液相检测L-色氨酸含量为99.1％，L-色氨酸成品对发酵液的收率为88.8％。
将一次母液进行旋转蒸发浓缩3倍后，得到浓缩液1125g，与150g玉米芯粉和20g碳酸钙混合，65℃烘12小时，粉碎，得到L-色氨酸低含量成品237g，液相检测L-色氨酸含量为23.6％，低含量L-色氨酸成品对发酵液的收率为3.6％。
合计提取总收率为：88.8％+3.6％＝92.3％。
实施例6：一种从发酵液中提取色氨酸的方法，本实施例添加结晶助剂1000ppm，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为52.3g/L，控制搅拌转速为300转/min，加入1000ppm脂肪酸甘油酯，调节发酵液的pH值进行等电结晶，具体为：向发酵液中流加硫酸，使发酵液的pH以每5分钟下降0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为38℃；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为5℃，维持30分钟。采用自动排渣过滤器进行过滤分离晶体，过滤结束前加入6L质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体1329g，即为一次晶体，湿晶体的水分含量为29.0％，一次晶体收率60.1％。
去除L-色氨酸一次晶体后的发酵液为28.1L，L-色氨酸含量为21.5g/L，用硫酸缓慢调节pH至5.00±0.02，然后进行陶瓷膜过滤，浓缩5倍后加40％体积的透析水11.2L，最终得到过滤清液41.2L，L-色氨酸含量为13.9g/L，计算陶瓷膜过滤收率为94.8％。
将过滤清液加热到60℃，然后加入活性炭进行脱色，每100mL过滤清液中添加0.8g的所述活性炭，维持45分钟后真空抽滤，得到脱色清液，透光度为82％。将脱色清液进行旋转蒸发浓缩，蒸发温度控制55℃，压力控制-0.096±0.002Mpa，浓缩至L-色氨酸含量为160±5g/L，得到蒸发浓缩液。
蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：向蒸发浓缩液中流加氢氧化钠溶液，使蒸发浓缩液的pH以每10分钟上调0.1的速度调节至5.90±0.02，pH达到后维持15分钟；等电结晶温度为55-65℃。等电结晶后进行梯度降温，降温梯度为每小时降低3℃，直至温度为5℃，维持30分钟后进行离心分离，分离结束前加入600mL质量体积比为10％的乙醇冲洗，得到湿晶体645g/L，即为二次晶体，湿晶体的水分含量为29.5％。同时得到母液2.5L，即为一次母液，母液的L-色氨酸含量为22.5g/L，计算浓缩结晶分离的收率89.2％。
将一次晶体与二次晶体混合，65℃烘8小时，粉碎，得到L-色氨酸成品1399g，液相检测L-色氨酸含量为99.3％，L-色氨酸成品对发酵液的收率为88.5％。
将一次母液进行旋转蒸发浓缩3倍后，得到浓缩液1127g，与150g玉米芯粉和20g碳酸钙混合，65℃烘12小时，粉碎，得到L-色氨酸低含量成品241g，液相检测L-色氨酸含量为23.3％，低含量L-色氨酸成品对发酵液的收率为3.6％。
合计提取总收率为：88.5％+3.6％＝92.1％。
对比实施例1：利用现有离交工艺提取色氨酸的方法，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为50.5g/L，加30.6L水稀释至25g/L，调pH值至3.0过膜去除菌体，浓缩5倍，加入40％透析水24.2L，得到清液74.7L，L-色氨酸含量19.3g/L；然后离交吸附洗脱，得到高流分63L，L-色氨酸含量21.0g/L；再脱氨脱色蒸发结晶，冷却分离后母液套用至离交回用，加上回用的母液，烘干得到1218g成品，总收率79.6％，产品纯度99.1％。
对比实施例2：利用现有有机膜工艺提取色氨酸的方法，具体步骤为：
发酵结束后，立即取30L发酵液，发酵液中的L-色氨酸含量为52.3g/L，加32.8L水稀释至25g/L，调pH值至3.5，过管式膜去除菌体，浓缩5倍，加入40％透析水25.1L，得到清液77.5L，L-色氨酸含量19.2g/L；然后蒸发浓缩，得到浓缩液，浓缩液冷却后分离得到一次晶体与一次结晶母液。湿晶体溶解后过有机膜，然后蒸发浓缩得到二次浓缩液，冷却分离后得到二次晶体与二次结晶母液。二次晶体烘干后得到L-色氨酸成品1062g，含量98.9％，收率为66.9％。
一次结晶母液与二次结晶母液还有有机膜浓缩液使用玉米纤维载体制作低含量饲料，总L-色氨酸含量为355g，收率为22.6％。
合计提取总收率为66.9％+22.6％＝89.5％。
效果例：
表1为对比实施例1-2与本发明实施例1-6的结晶效果、提取收率、成品含量对照表
本发明实施例1-6及对比实施例是根据GB/T 18246-2000附录A，采用高效液相色谱(HPLC)检测L-色氨酸含量。
本发明实施例1-6及对比实施例均采用安捷伦公司的高效液相色谱仪(AgilentTechnologies 1200)进行L-色氨酸含量检测，具体方法如下：
1、色谱柱：XDB-C18(5μm，4.6×250mm)
2、流动相：乙酸钠缓冲液，{c(Na+)＝0.0085mol/L的乙酸钠溶液用乙酸调节pH至4.0，用0.45μm的滤膜过滤}+甲醇＝95+5。
3、流速：1.5ml/min。
4、检测：紫外检测器(λ＝280nm)。
5、进样量：15μL。
由表1可知，与对比实施例1和对比实施例2相比，本发明实施例提取总收率有显著提高，实施例5和实施例6的提取总收率分别为92.3％和92.1％，较对比实施例1提高12.7％，较对比实施例2提高2.8％，液相含量达到99.1％以上。对比实施例2虽然总收率达到89.5％的较高水平，但其高纯L-色氨酸产品收率低，仅为66.9％，低附加值产品收率过高达到22.6％，而本发明实施例5和实施例6的高纯L-色氨酸产品收率可以达到88.5％以上。
节能减排方面，对比实施例1的用水量是本发明实施例5的27倍，排污就更多，实施例5的污水排放为0。对比实施例1在发酵液晶体溶解时稀释多用水30.6L，透析水24.2L，离交尾液排污74.7L，使用洗脱氨水60L，酸再生与洗柱子用水250L，测算每吨产品排放污水达到300吨。对比实施例2由于过膜加水稀释，增加一倍多后续蒸发用量，并且是两次结晶工艺，又增加近一倍蒸发水量，蒸汽成本为本发明的三倍。同时对比实施例2使用到有机膜设备，有机膜容易受细菌污染，影响物料质量与模芯寿命。模芯寿命最长为一年，再加上设备投入和洗膜再生费用，平均每吨产品增加膜成本1000元，蒸汽成本增加3000元以上，多排水65m3。而本发明实施例5仅有800左右的活性炭费用，活性炭可以作为能源燃烧利用。
本发明对结晶助剂的添加量和添加效果进行验证，得出实施例5的效果最佳，添加结晶助剂为750ppm时，一次晶体收率最高，达到60.5％，总收率也最高，达到92.3％，继续增大结晶助剂添加量到1000ppm时，效果与添加750ppm相当，说明结晶助剂最优添加量为750ppm。本发明通过添加结晶助剂，提高一次晶体的收率取得意想不到显著效果，成品收率和纯度显著提升。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)发酵液初结晶；(2)分离得一次晶体；(3)发酵液二次结晶；(4)获得色氨酸成品；其中，
(1)发酵液初结晶：进行发酵液结晶控制，通过改变发酵液的理化性质，使发酵液中的色氨酸更多的以晶体颗粒形态沉淀析出；
(2)分离得一次晶体：将步骤(1)结晶出的色氨酸晶体从发酵液中分离出来，得到一次晶体；
(3)发酵液二次结晶：经步骤(2)分离出一次结晶后的发酵液进行二次结晶，得到二次晶体；
(4)获得色氨酸成品：将所述一次晶体与所述二次晶体混合，干燥，粉碎后，得到符合国家标准的色氨酸成品。
2.根据权利要求1所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)发酵液初结晶，具体操作为：
发酵结束后，控制搅拌转速50～300转/min，进行等电结晶，具体为：将发酵液的pH调节至5.85～5.95，pH达到后维持15分钟，等电结晶温度为37-40℃；等电结晶后开始降温结晶，降温梯度为每小时降低2-5℃，直至温度为5-15℃，温度达到后维持30分钟。
3.根据权利要求2所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，调节发酵液pH前，向发酵液中加入结晶助剂来改善发酵液的表面张力，所述结晶助剂的添加量为100～1000ppm。
4.根据权利要求3所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述结晶助剂为脂肪酸甘油酯、脂肪醇酯、蔗糖酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯20或聚山梨酯80中的任意一种或一种以上的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中使用分级过滤与离心沉降的方式，将色氨酸晶体从发酵液中分离出来，分离过程中加乙醇冲洗去除晶体表面的杂质。
6.根据权利要求1所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)发酵液二次结晶的具体操作步骤为：
I、经步骤(2)分离出一次结晶后的发酵液，调节pH至3.5～5.5，使可溶性蛋白沉降析出；
II、调节pH后的发酵液使用菌体分离设备将菌体细胞和沉降析出的蛋白一起分离去除，得到色氨酸的过滤清液；
III、过滤清液使用大孔吸附介质进行脱色，得到脱色清液；
IV、脱色清液进行蒸发浓缩，浓缩至色氨酸含量为140～180g/L，得到蒸发浓缩液；
V、蒸发浓缩液进行等电结晶，具体为：调节pH至5.85～5.95，等电结晶温度为55-65℃，得到初步结晶液；
VI、初步结晶液进行梯度降温，降温梯度为每小时降低2-5℃，直至温度为5-15℃，温度达到后维持30分钟，得到色氨酸结晶的晶浆液；
VII、对晶浆液进行离心分离，分离过程中加乙醇冲洗去除晶体表面的杂质，得到二次晶体，甩出的母液为一次母液。
7.根据权利要求6所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述步骤II中使用的菌体分离设备为陶瓷膜或板框压滤机；所述步骤III使用的大孔吸附介质为活性炭，每100mL过滤清液中添加0.3～0.8g的所述活性炭，脱色温度为55～65℃，脱色时间30-60分钟；所述步骤IV中，蒸发温度控制在45-60℃，压力为-0.090～-0.099Mpa；所述步骤VI中梯度降温过程中，每小时温度降低2-5℃。
8.根据权利要求6或7所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，将所述步骤VII中得到的一次母液蒸发浓缩后与饲料载体按比例混匀，烘干、粉碎，制得低含量的色氨酸产品。
9.根据权利要求8所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述饲料载体为载体粉和钙盐，蒸发浓缩后一次母液、所述载体粉与所述钙盐的混合质量比例为：10∶1.2～1.8∶0.1～0.3。
10.根据权利要求9所述的一种从发酵液中提取色氨酸的方法，其特征在于，所述载体粉为玉米芯粉、玉米皮粉、玉米浆干粉、玉米碎粒或大豆皮粉中的任意一种或一种以上的组合；所述钙盐为碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、硫酸钙或氯化钙中的任意一种或一种以上的组合；所述载体粉优选为玉米芯粉，所述钙盐优选为碳酸钙。
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