JP2019532102A

JP2019532102A - ルブソシドの調製方法

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Publication number: JP2019532102A
Application number: JP2019538302A
Authority: JP
Inventors: ジャオ，ジュン; ソン，ユンフェイ; ヤン，ウェングオ; チャン，リンフェン; ヤン，メイイン; リ，ユーユー
Original assignee: Guilin Layn Natural Ingredients Corp
Current assignee: Guilin Layn Natural Ingredients Corp
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2019-11-07
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN108276462A; EP3505525A4; US10968470B2; US20200340027A1; AU2017416080B2; CN108276462B; WO2018233092A1; JP6768970B2; EP3505525A1; AU2017416080A1

Abstract

本発明は、原料の粉砕、フラッシュ抽出、二重遠心、マクロポーラス樹脂による精製及び脱着、酵素分解、有機膜による分級脱色、濃縮、結晶化、及び乾燥によりルブソシドを得るステップを含むことを特徴とするルブソシドの調製方法に関する。本発明によれば、抽出、分離、精製及び脱色などの肝要な工程の品質制御を最適化することで、純度９９％以上のルブソシド製品が得られ、製品が純白で、苦味がなく、残留溶媒が少なく、残留農薬がなく、製品の品質が安定である。

Description

本発明は、植物抽出の技術分野に属し、特に、ルブソシドの調製方法に関する。

甜茶（ＲｕｂｕｓＳｕａｔｒｓｓｉｍｕｓＳ．Ｌｅｅ）は、広西省の四大名物の１つであり、広東省、湖南省、江西省などにおいても栽培されている。甜茶は、大量のバイオフラボノイドを含み、一般的な緑茶の効果を持つ他に、心血管疾患の治療や予防、脳卒中の予防、癌の予防、歯周病の予防などの薬効を持ち、薬用価値が極めて高い。

ルブソシドは、甜茶において甘味に寄与し、保健作用を発揮する主成分である。初期に、ルブソシドを抽出する方法として、熱湯浸出による簡単なプロセスは簡単であったものの、抽出率が一般的に低く、資源の無駄な消費が極めて多かった。抽出率及び製品の品質を向上するために、近年、ルブソシドの抽出プロセスの改良に関する研究が行なわれている。

例えば、ＣＮ１０６２４３１６５Ａには、１）甜茶葉を粉砕し、エタノールで抽出し、抽出液を濾過し、濾液からエタノールを減圧回収し、粗抽出物を得るステップと、２）粗抽出物を水に溶解し、濾過し、濾液を取って準備するステップと、３）ステップ２）の濾液を分画分子量１０００の高分子濾過膜により分離し、流出液を収集するステップと、４）流出液にＥｕＡｌＯ_３を液固比１０００ｍｌ：０．２〜１ｍｇの割合で加え、３０〜５０ｓ沈殿させ、濾過して沈殿物を除去し、濾液を乾燥してルブソシドを得るステップと、を含む甜茶葉からのルブソシドの抽出方法が開示されている。

ＣＮ１０４９２６８９２Ａには、（１）乾燥した甜茶葉を粉砕するステップと、（２）超音波により解砕して予備処理を行うステップと、（３）定温で浸出するステップと、（４）吸引濾過し、濾液を収集するステップと、（５）凝集剤をＦｅＳＯ_４として、得られた濾液をｐＨ１０、温度６０℃で凝集させるステップと、（６）溶離液を蒸留水としてマクロポーラス樹脂により溶離し、流出液を収集するステップと、（７）流出液を濃縮するステップと、（８）ステップ（７）で得られた濃縮液にメタノールを加え、低温で結晶化させ、さらに遠心分離し、メタノールを回収するステップと、（９）遠心分離後の固体物質を４５℃〜５０℃で恒量に達するまで真空乾燥して、前記ルブソシドを得るステップと、を含む甜茶からのルブソシドの抽出方法が開示されている。

上述した従来技術を含めて、中国国内の甜茶抽出産業は、実際的な生産において、プロセスが複雑で、肝要な生産工程の制御が困難であり、有害な化学的成分が取り込まれるという問題が普遍的に存在することにより、生産された製品は、いずれも、ある程度の苦味を持ち、色が十分に白くならず、製品の品質が不安定であるという欠点を持つ。

従来技術に存在する問題を解決して、高品質で高含有量のルブソシドを調製するために、本発明者は、抽出、分離、精製、及び脱色などの肝要な工程の品質制御を最適化した、ルブソシドの調製方法を提供する。

具体的には、本発明は以下を要旨とする。
（１）乾燥した甜茶葉を取り、粉砕し、４０〜６０メッシュの篩を通し、篩通し後の甜茶葉の粉末をフラッシュ抽出器に入れ、甜茶葉の粉末の重量の１８〜２０倍量の水を加え、毎回１分間ずつで３回抽出し、３回の抽出液を併合して総抽出液を得るステップと、
（２）総抽出液を原料としての甜茶葉の重量の５倍量の濃縮液になるまで濃縮し、濃縮液をディスク型遠心分離機で遠心分離した後、管型遠心分離機で遠心分離して遠心液を得、酸液でｐＨを５．０〜６．０に調整するステップと、
（３）ｐＨ調整された遠心液をマクロポーラス樹脂カラムに送液し、流出液を濃度０．２％の水酸化ナトリウム溶液でｐＨ＝７に調整し、ルブソシド含有量＞１％であることを検出した時点を終点として送液し、送液終了後、まず、カラムを流出液が無色透明になるまで純水で洗浄した後、カラムを流出液のｐＨ＝１１．０〜１２．０になるまでアルカリ液で洗浄し、その後、カラムを流出液のｐＨ＝７．０〜７．５になるまで純水で洗浄し、その後、カラムを流出液のｐＨ＝２．０〜２．５になるまで酸液で洗浄し、最後に、カラムを流出液のｐＨ＝７．０になるまで純水で洗浄するステップと、
（４）濃度４５％〜５０％のエタノール溶液で脱着し、流出液の収集はルブソシド含有量＞１％であることを検出した時点からルブソシド含有量＜１％であることを検出した時点まで行い、流出液を減圧濃縮してボーメ度５の濃縮液を作成するステップと、
（５）ステップ（４）で得られた濃縮液に生体酵素を加え、４５〜６０℃の温度で１〜３時間酵素分解し、酵素分解液を得るステップと、
（６）酵素分解液を、まず、０．４５〜０．５ＭＰａの膜入口圧で分画分子量８０００の有機膜に透過させ、次に、１．８〜２．０ＭＰａの膜入口圧で分画分子量８００の有機膜に透過させ、脱色された膜透過液を得るステップと、
（７）膜透過液を減圧濃縮してボーメ度１５のペーストを作成し、溶媒としてペーストの３倍量のメタノール又はエタノールを加え、５〜１１℃で８〜１４時間結晶化させ、得られた結晶を乾燥し、ルブソシドを得るステップと、
を含むルブソシドの調製方法。

ここで、
ステップ（２）に記載のディスク型遠心分離機を用いる遠心時間が３０〜５０分間であり、前記管型遠心分離機を用いる遠心時間が４０〜６０分間である。
ステップ（３）に記載のアルカリ液として、濃度０．２％の水酸化ナトリウム水溶液又は濃度０．２％の水酸化カリウム水溶液を採用する。前記酸液として、濃度０．４％の塩酸水溶液又は濃度０．４５％の硫酸水溶液を採用する。
ステップ（３）に記載のマクロポーラス樹脂カラムとして、Ｔ−２８樹脂又はＨ−３０樹脂のいずれか一つを採用する。
ステップ（５）に記載の生体酵素はブロメライン、ペクチナーゼ、及び中性プロテアーゼから選択される１種又は２種以上の組み合わせである。

好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素の添加量が甜茶葉の総重量の０．５‰〜１．０‰である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素の添加量が甜茶葉の総重量の０．６‰〜０．８‰である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素がペクチナーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせであり、それらの混合比がペクチナーゼ：中性プロテアーゼ＝５：１である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素がペクチナーゼとブロメラインとの組み合わせであり、それらの混合比がペクチナーゼ：ブロメライン＝１：１である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素が中性プロテアーゼとブロメラインとの組み合わせであり、それらの混合比が中性プロテアーゼ：ブロメライン＝４：１である。

従来技術と比較すると、本発明は以下の特徴及び技術的効果を有する。
１、フラッシュ抽出器により甜茶葉の総抽出液を抽出することは、従来の抽出タンクによる抽出と比較して、生産性が大幅に向上し、常温での抽出が実現でき、操作が簡便となる。
２、フラッシュ抽出により得られた抽出液に対して、ディスク型遠心分離機と管型遠心分離機を併用する２段の遠心分離プロセスを採用することで、微細な不純物を最大限に分離することを確保することができる。
３、マクロポーラス樹脂カラムによる精製工程において、順次にカラムを「水-アルカリ液-水-酸液-水」で５回洗浄し、且つマクロポーラス樹脂による精製の各工程パラメータを最適化する。
４、従来の樹脂の代わりに、酵素分解と有機膜との組み合わせを使用して脱色を行うことで、脱色したサンプルにおけるルブソシド含有量が樹脂による脱色後のものよりも５％高く、結晶化によって得られた製品が純白となり、苦味がなくなり、残留溶媒が少なくなり、残留農薬がなくなる。

本発明の実施例１で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。本発明の実施例２で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。本発明の実施例３で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。本発明の実施例４で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。本発明の実施例５で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。本発明の実施例６で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。本発明の実施例７で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。本発明の実施例８で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。比較例１で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。比較例２で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。比較例３で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。比較例４で調製されたルブソシド製品のＨＰＬＣパターンを示す図。

実施例１
（１）乾燥した甜茶葉１．５ｋｇを取り、ＨＰＬＣにより検出した結果、ルブソシド含有量が５．３％であった。乾燥した甜茶葉を取り、４０メッシュに粉砕し、材料をフラッシュ抽出器に入れ、純水を抽出溶媒として使用し、材料に１８倍量の水を加え、モータの回転数５０００ｒ／ｍｉｎ、常温で毎回１分間ずつで３回抽出し、合計３分間行った。１回抽出完了した後、２分間停止した。濾液を分離し、３回抽出された濾液を併合して総濾液を得た。

（２）総抽出液を原料としての甜茶葉の重量の５倍量の濃縮液になるまで濃縮し、濃縮液を、２５℃に冷却し、ディスク型遠心分離機で４５分間遠心分離して、さらに、管型遠心分離機で６０分間遠心分離し、遠心後の沈殿物を捨て、遠心液を酸液でｐＨ＝５．２に調整した。

（３）ステップ（２）のｐＨ調整された遠心液をマクロポーラス樹脂カラム（Ｔ−２８樹脂）に送液し、流出液を濃度０．２％の水酸化ナトリウム溶液でｐＨ＝７．０に調整し、ルブソシド含有量＞１％であることを検出した時点を終点として送液し、送液終了後、まず、カラムを流出液が無色透明になるまで純水で洗浄した後、カラムを流出液のｐＨ＝１１．０になるまでアルカリ液で洗浄し、その後、カラムを流出液のｐＨ＝７．１になるまで純水で洗浄し、その後、カラムを流出液のｐＨ＝２．０になるまで酸液で洗浄し、最後に、カラムを流出液のｐＨ＝７．０になるまで純水で洗浄した。

（４）濃度４８％のエタノール溶液で脱着し、流出液の収集はルブソシド含有量＞１％であることを検出した時点からルブソシド含有量＜１％であることを検出した時点まで行い、流出液を減圧濃縮してエタノールを回収し、ボーメ度５の濃縮液を作成した。

（５）ステップ（４）で調製された濃縮液にブロメライン０．９６ｇを加え、４８℃で３時間酵素分解し、酵素分解後の溶液を常温２５℃まで冷却し、酵素分解液を得た。

（６）酵素分解液を、まず、０．４５ＭＰａの膜入口圧で分画分子量８０００の有機膜に透過させ、全体として透過後、１．８ＭＰａの膜入口圧で分画分子量８００の有機膜に透過させ、脱色された膜透過液を得た。

（７）膜透過液を減圧濃縮してボーメ度１５のペーストを作成し、ペーストの３倍量の溶媒を加え、均一に攪拌し、６℃で１２時間結晶化させ、得られた結晶を乾燥し、ルブソシドのサンプル７７．１ｇを得た。ＨＰＬＣにより検出した結果、ルブソシド含有量は９９．３％であった。

実施例２〜８
実施例１に記載の方法のステップを基にし、分解酵素の種類の組み合わせ、酵素分解の温度、酵素分解の時間、第１の有機膜（膜入口圧）、第２の有機膜（膜入口圧）、結晶化温度、結晶化時間などの技術パラメータを調整してその他のパラメータを変更せずに、生産試験を行い、且つＨＰＬＣにより調製されたルブソシド製品の質量及びルブソシド含有量を測定し、その結果を表１に示す。

本発明が顕著な技術的効果を有することを実証するために、本発明者は、以下のように、４つの比較実験を行った。

比較例１
本発明の実施例１に記載の方法のステップを基にし、ステップ（１）の抽出装置を抽出タンクに変更してルブソシドを抽出した。その他のステップ及び技術パラメータは変更しなかった。
抽出タンクによりルブソシドを抽出する方法は、具体的には以下の通りである。乾燥した甜茶葉１．５ｋｇを取り、ＨＰＬＣにより検出した結果、ルブソシド含有量が５．４％であった。乾燥した甜茶葉を取り、４０メッシュに粉砕し、材料を抽出タンクに入れ、８倍量の蒸留水を加え、９５℃で毎回１時間ずつで３回抽出した。濾液を分離し、３回抽出された濾液を併合して総抽出液を得た。

比較例２
本発明の実施例１に記載の方法のステップを基にし、ステップ（２）では卓上型高速遠心機により１回で遠心分離した。その他のステップ及び技術パラメータは変更しなかった。
卓上型高速遠心機による抽出の方法として、具体的には、総濾液を原料としての甜茶葉の重量の５倍量の濃縮液になるまで濃縮し、濃縮液を２５℃に冷却し、卓上型高速遠心機により６０分間遠心分離し、遠心後の沈殿物を捨て、遠心液を酸液でｐＨ＝５．２に調整した。

比較例３
本発明の実施例１に記載の方法のステップを基にし、ステップ（３）、（４）ではマクロポーラス樹脂カラムによる精製及び脱着プロセスとして中国国内で一般的に用いられるプロセスを採用した。その他のステップ及び技術パラメータは変更しなかった。
マクロポーラス樹脂カラムによる精製及び脱着プロセスとして、具体的には、ｐＨ調整された遠心液をマクロポーラス樹脂カラムに送液し、流出液の甘味がなくなる時点を終点として送液し、カラムを流出液が無色透明になるまで蒸留水で洗浄した後、濃度６０％のエタノールで脱着し、甘味が発現する時点から収集し始め、甘味がなくなると中止して、ボーメ度５の濃縮液とした。

比較例４
本発明の実施例１に記載の方法のステップを基にし、ステップ（５）の酵素分解工程及びステップ（６）の有機膜による脱色工程を省略し、濃縮液をそのまま結晶化工程に付した。

本発明の実施例１と比較例１〜４で調製されたルブソシドの質量、回収率、含有量及び色を比較した結果を表２に示す。

表１、表２に示す実施例１〜８及び比較例１〜４のデータを分析したところ、以下の結論を得た。

１、本発明の技術案によれば、各工程パラメータを実行可能な範囲内で調整することで、ルブソシド含有量はいずれも９９％以上となり、且つ変動値が小さい。これにより、本発明の方法が確実であり、製品の品質をより良く制御することができることが示された。

２、抽出方法、分離方法、マクロポーラス樹脂カラムによる精製及び脱着プロセス、結晶化温度及び結晶化時間は、ルブソシドの産出量に大きく影響する。本発明に係るフラッシュ抽出プロセス、２段の抽出プロセス及び最適化されたマクロポーラス樹脂による精製工程は、ルブソシドの回収率に大きく寄与することができる。

３、酵素の種類又は組み合わせ、酵素分解パラメータ、有機膜による工程のパラメータは、ルブソシドの色に大きく影響する。本発明に係る「酵素分解＋有機膜」による脱色プロセスは製品の白色度の改善に大きく寄与することができる。

本発明はルブソシドの調製方法を提供する。本発明は、原料の粉砕、フラッシュ抽出、二重遠心、マクロポーラス樹脂による精製及び脱着、酵素分解、有機膜による分級脱色、濃縮、結晶化、及び乾燥によりルブソシドを得る。本発明によれば、抽出、分離、精製及び脱色などの肝要な工程の品質制御を最適化することができ、これにより純度９９％以上のルブソシド製品が得られ、且つ、製品が純白で、苦味がなく、残留溶媒が少なく、残留農薬がなく、品質が安定であり、比較的良好な経済的価値及び応用展望を備える。

好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素の添加量が甜茶葉の総重量の０．５‰〜１．２‰である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素の添加量が甜茶葉の総重量の０．６‰〜０．８‰である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素がペクチナーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせであり、それらの混合比がペクチナーゼ：中性プロテアーゼ＝５：１である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素がペクチナーゼとブロメラインとの組み合わせであり、それらの混合比がペクチナーゼ：ブロメライン＝１：１である。
好ましくは、ステップ（５）に記載の生体酵素が中性プロテアーゼとブロメラインとの組み合わせであり、それらの混合比が中性プロテアーゼ：ブロメライン＝４：１である。

Claims

（１）乾燥した甜茶葉を取り、粉砕し、４０〜６０メッシュの篩を通し、篩通し後の甜茶葉の粉末をフラッシュ抽出器に入れ、甜茶葉の粉末の重量の１８〜２０倍量の水を加え、毎回１分間ずつで３回抽出し、３回の抽出液を併合して総抽出液を得るステップと、
（２）総抽出液を原料としての甜茶葉の重量の５倍量の濃縮液になるまで濃縮し、濃縮液をディスク型遠心分離機で遠心分離した後、管型遠心分離機で遠心分離して遠心液を得、酸液でｐＨを５．０〜６．０に調整するステップと、
（３）ｐＨ調整された遠心液をマクロポーラス樹脂カラムに送液し、流出液を濃度０．２％の水酸化ナトリウム溶液でｐＨ＝７．０に調整し、ルブソシド含有量＞１％であることを検出した時点を終点として送液し、送液終了後、まず、カラムを流出液が無色透明になるまで純水で洗浄した後、カラムを流出液のｐＨ＝１１．０〜１２．０になるまでアルカリ液で洗浄し、その後、カラムを流出液のｐＨ＝７．０〜７．５になるまで純水で洗浄し、その後、カラムを流出液のｐＨ＝２．０〜２．５になるまで酸液で洗浄し、最後に、カラムを流出液のｐＨ＝７．０になるまで純水で洗浄するステップと、
（４）濃度４５％〜５０％のエタノール溶液で脱着し、流出液の収集はルブソシド含有量＞１％であることを検出した時点からルブソシド含有量＜１％であることを検出した時点まで行い、流出液を減圧濃縮してボーメ度５の精製した濃縮液を作成するステップと、
（５）ステップ（４）で得られた濃縮液に生体酵素を加え、４５〜６０℃の温度で１〜３時間酵素分解し、酵素分解液を得るステップと、
（６）酵素分解液を、まず、０．４５〜０．５ＭＰａの膜入口圧で分画分子量８０００の有機膜に透過させ、次に、１．８〜２．０ＭＰａの膜入口圧で分画分子量８００の有機膜に透過させ、脱色された膜透過液を得るステップと、
（７）膜透過液を減圧濃縮してボーメ度１５のペーストを作成し、溶媒としてペーストの３倍量のメタノール又はエタノールを加え、５〜１１℃で８〜１４時間結晶化させ、得られた結晶を乾燥し、ルブソシドを得るステップと、
を含むことを特徴とするルブソシドの調製方法。
ステップ（２）に記載のディスク型遠心分離機を用いる遠心時間が３０〜５０分間であり、前記管型遠心分離機を用いる遠心時間が４０〜６０分間であることを特徴とする請求項１に記載のルブソシドの調製方法。
ステップ（３）に記載のアルカリ液として、濃度０．２％の水酸化ナトリウム水溶液又は濃度０．２％の水酸化カリウム水溶液を採用し、
前記酸液として、濃度０．４％の塩酸水溶液又は濃度０．４５％の硫酸水溶液を採用することを特徴とする請求項１に記載のルブソシドの調製方法。
ステップ（３）に記載のマクロポーラス樹脂カラムとして、Ｔ−２８樹脂又はＨ−３０樹脂のいずれか一つを採用することを特徴とする請求項１に記載のルブソシドの調製方法。
ステップ（５）に記載の生体酵素がブロメライン、ペクチナーゼ、及び中性プロテアーゼから選択される１種又は２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載のルブソシドの調製方法。
生体酵素の添加量が甜茶葉の総重量の０．５‰〜１．２‰であることを特徴とする請求項５に記載のルブソシドの調製方法。
生体酵素の添加量が甜茶葉の総重量の０．６‰〜０．８‰であることを特徴とする請求項５に記載のルブソシドの調製方法。
前記生体酵素がペクチナーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせであり、それらの混合比がペクチナーゼ：中性プロテアーゼ＝５：１であることを特徴とする請求項５に記載のルブソシドの調製方法。
前記生体酵素がペクチナーゼとブロメラインとの組み合わせであり、それらの混合比がペクチナーゼ：ブロメライン＝１：１であることを特徴とする請求項５に記載のルブソシドの調製方法。
前記生体酵素が中性プロテアーゼとブロメラインとの組み合わせであり、それらの混合比が中性プロテアーゼ：ブロメライン＝４：１である請求項５に記載のルブソシドの調製方法。