CN116769653A - 一种非特异免疫激活剂的制备方法 - Google Patents
一种非特异免疫激活剂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于非特异免疫激活剂的制备技术领域，公开了一种非特异免疫激活剂的制备方法，本发明采用将双歧杆菌菌株接种在培养基上，取发酵完成的菌液，并进行裂解；将裂解液加热浸出有效成份；冷却至室温后用无菌离心管以每分钟3000转以上的速度离心60分钟；吸出上清，分装于无菌容器中；加热灭菌；即获得非特异免疫激活剂。本发明通过培养基制备方法制备的培养基大大提高双歧杆菌存活时间，大大提高双歧杆菌发酵生物量，从而提高非特异免疫激活剂量；同时，通过低聚果糖制备方法可以制备高纯度低聚果糖，有利于双歧杆菌培养，从而产生高质量非特异免疫激活剂。
Description
技术领域
本发明属于非特异免疫激活剂的制备技术领域，尤其涉及一种非特异免疫激活剂的制备方法。
背景技术
免疫系统是排除外来病毒和微生物等的侵入和癌细胞等异物，维持机体平衡的重要的机体防御功能之一。因衰老、应激、疲劳和环境因素等因素而免疫功能降低时，容易引起各种疾病和感染等。因此，加强作为机体防御机能的免疫力在维持机体平衡上是重要的，激活免疫系统的免疫激活剂作为食品和药品具有广泛的用途；然而，现有非特异免疫激活剂的制备方法采用的培养基培养的双歧杆菌存活时间短，发酵生物量偏低，难以满足需求；同时，采用的低聚果糖纯度低，影响双歧杆菌培养，导致产生非特异免疫激活剂质量差。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有非特异免疫激活剂的制备方法采用的培养基培养的双歧杆菌存活时间短，发酵生物量偏低，难以满足需求。
(2)采用的低聚果糖纯度低，影响双歧杆菌培养，导致产生非特异免疫激活剂质量差。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种非特异免疫激活剂的制备方法。
本发明是这样实现的，一种非特异免疫激活剂的制备方法包括：
步骤一，将双歧杆菌菌株接种在培养基上，并在培养基中加入低聚果糖；于37℃温度下发酵培养15小时；取发酵完成的菌液，经每分钟4000转、5℃的离心处理35分钟，弃去上清液，保留收集的该菌体沉淀，再用0.7％生理盐水洗涤至该菌体为白色；
所述0.7％生理盐水配制方法：
准备要配制氯化钠溶液所需的溶剂和原料，备好烧杯、称量器；
通过称量器称取0.7克氯化钠；将氯化钠粉末放入烧杯之中，用蒸馏水稀释到100毫升，获得0.7％生理盐水；
步骤二，按1:5(g/ml)的比例，将白色的该菌体与细胞裂解剂混合，并置入95C水浴中，恒温处理且连续搅拌1小时，再立即冷却至室温，并用双蒸水彻底洗涤；所述细胞裂解剂为3％SDS；
步骤三，将裂解液加热浸出有效成份；冷却至室温后用无菌离心管以每分钟3000转以上的速度离心60分钟；吸出上清，分装于无菌容器中；加热灭菌；即获得非特异免疫激活剂。
进一步，所述培养基制备方法如下：
(1)按重量份数称取L-半胱氨酸2份、无机盐5份、螺旋藻粉6份、水苏糖3份、植物胨10份、蒸馏水15份进行混合，制得用于双歧杆菌发酵的培养基。
进一步，所述无机盐以重量份数计包括氯化钠2份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钾1份、硫酸亚铁0.007份、硫酸锰0.003份、硫酸镁1份和氯化钙0.6份。
进一步，所述螺旋藻粉的制备过程为：选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径130μm，称重后，用60目筛过筛除杂，所选螺旋藻粉用气流粉碎方法进一步粉碎，直至得到平均粒径为90μm的可溶性螺旋藻微粉体，烘干。
进一步，所述水苏糖为可溶性水苏糖结晶。
进一步，所述气流粉碎方法是指将过筛选取的螺旋藻粉，低温冻结至裂碎临界点后，使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨或靶式气流磨的气流粉碎方法进行能量破碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体。
进一步，所述低聚果糖制备方法如下：
1)对蔗糖进出除杂处理；蔗糖经法夫酵母JMU-MVP14发酵制得含有低聚果糖和虾青素的发酵液，发酵液经过离心机离心分离，提取出下层虾青素；
2)将上层清液经沸水浴加热灭酶活后再经微滤膜提纯，得到的滤液流经填充吸附介质的层析柱吸附；用乙醇溶液洗脱吸附介质，将洗脱液蒸发浓缩后得到低聚果糖。
进一步，所述吸附介质为活性炭或活性炭与硅藻土的混合物，所述层析柱采用36度的柱温。
进一步，所述微滤膜提纯是将上层清液在真空抽滤条件下依次通过0.7μm、0.35μm和0.22μm的微滤膜过滤；所述活性炭与硅藻土的混合物中活性炭与硅藻土的重量比为等于1:1；所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为2ml/min。
进一步，所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为0.6ml/min。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明通过培养基制备方法制备的培养基大大提高双歧杆菌存活时间，大大提高双歧杆菌发酵生物量，从而提高非特异免疫激活剂量；同时，通过低聚果糖制备方法可以制备高纯度低聚果糖，有利于双歧杆菌培养，从而产生高质量非特异免疫激活剂。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明通过培养基制备方法制备的培养基大大提高双歧杆菌存活时间，大大提高双歧杆菌发酵生物量，从而提高非特异免疫激活剂量；同时，通过低聚果糖制备方法可以制备高纯度低聚果糖，有利于双歧杆菌培养，从而产生高质量非特异免疫激活剂。
附图说明
图1是本发明实施例提供的非特异免疫激活剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的培养基制备方法流程图。
图3是本发明实施例提供的低聚果糖制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图1所示，本发明提供一种非特异免疫激活剂的制备方法包括以下步骤：
S101，将双歧杆菌菌株接种在培养基上，并在培养基中加入低聚果糖；于37℃温度下发酵培养15小时；取发酵完成的菌液，经每分钟4000转、5℃的离心处理35分钟，弃去上清液，保留收集的该菌体沉淀，再用0.7％生理盐水洗涤至该菌体为白色；
所述0.7％生理盐水配制方法：
准备要配制氯化钠溶液所需的溶剂和原料，备好烧杯、称量器；
通过称量器称取0.7克氯化钠；将氯化钠粉末放入烧杯之中，用蒸馏水稀释到100毫升，获得0.7％生理盐水；
S102，按1:5(g/ml)的比例，将白色的该菌体与细胞裂解剂混合，并置入95C水浴中，恒温处理且连续搅拌1小时，再立即冷却至室温，并用双蒸水彻底洗涤；所述细胞裂解剂为3％SDS；
S103，将裂解液加热浸出有效成份；冷却至室温后用无菌离心管以每分钟3000转以上的速度离心60分钟；吸出上清，分装于无菌容器中；加热灭菌；即获得非特异免疫激活剂。
如图2所示，本发明提供的培养基制备方法如下：
S201，按重量份数称取L-半胱氨酸2份、无机盐5份、螺旋藻粉6份、水苏糖3份、植物胨10份、蒸馏水15份进行混合，制得用于双歧杆菌发酵的培养基。
本发明提供的无机盐以重量份数计包括氯化钠2份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钾1份、硫酸亚铁0.007份、硫酸锰0.003份、硫酸镁1份和氯化钙0.6份。
本发明提供的螺旋藻粉的制备过程为：选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径130μm，称重后，用60目筛过筛除杂，所选螺旋藻粉用气流粉碎方法进一步粉碎，直至得到平均粒径为90μm的可溶性螺旋藻微粉体，烘干。
本发明提供的水苏糖为可溶性水苏糖结晶。
本发明提供的气流粉碎方法是指将过筛选取的螺旋藻粉，低温冻结至裂碎临界点后，使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨或靶式气流磨的气流粉碎方法进行能量破碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体。
如图3所示，本发明提供的低聚果糖制备方法如下：
S301，对蔗糖进出除杂处理；蔗糖经法夫酵母JMU-MVP14发酵制得含有低聚果糖和虾青素的发酵液，发酵液经过离心机离心分离，提取出下层虾青素；
S302，将上层清液经沸水浴加热灭酶活后再经微滤膜提纯，得到的滤液流经填充吸附介质的层析柱吸附；用乙醇溶液洗脱吸附介质，将洗脱液蒸发浓缩后得到低聚果糖。
本发明提供的吸附介质为活性炭或活性炭与硅藻土的混合物，所述层析柱采用36度的柱温。
本发明提供的微滤膜提纯是将上层清液在真空抽滤条件下依次通过0.7μm、0.35μm和0.22μm的微滤膜过滤；所述活性炭与硅藻土的混合物中活性炭与硅藻土的重量比为等于1:1；所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为2ml/min。
本发明提供的滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为0.6ml/min。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明通过培养基制备方法制备的培养基大大提高双歧杆菌存活时间，大大提高双歧杆菌发酵生物量，从而提高非特异免疫激活剂量；同时，通过低聚果糖制备方法可以制备高纯度低聚果糖，有利于双歧杆菌培养，从而产生高质量非特异免疫激活剂。
应当注意，本发明的实施方式可以通过硬件、软件或者软件和硬件的结合来实现。硬件部分可以利用专用逻辑来实现；软件部分可以存储在存储器中，由适当的指令执行系统，例如微处理器或者专用设计硬件来执行。本领域的普通技术人员可以理解上述的设备和方法可以使用计算机可执行指令和/或包含在处理器控制代码中来实现，例如在诸如磁盘、CD或DVD-ROM的载体介质、诸如只读存储器(固件)的可编程的存储器或者诸如光学或电子信号载体的数据载体上提供了这样的代码。本发明的设备及其模块可以由诸如超大规模集成电路或门阵列、诸如逻辑芯片、晶体管等的半导体、或者诸如现场可编程门阵列、可编程逻辑设备等的可编程硬件设备的硬件电路实现，也可以用由各种类型的处理器执行的软件实现，也可以由上述硬件电路和软件的结合例如固件来实现。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
本发明通过培养基制备方法制备的培养基大大提高双歧杆菌存活时间，大大提高双歧杆菌发酵生物量，从而提高非特异免疫激活剂量；同时，通过低聚果糖制备方法可以制备高纯度低聚果糖，有利于双歧杆菌培养，从而产生高质量非特异免疫激活剂。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述非特异免疫激活剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，将双歧杆菌菌株接种在培养基上，并在培养基中加入低聚果糖；于37℃温度下发酵培养15小时；取发酵完成的菌液，经每分钟4000转、5℃的离心处理35分钟，弃去上清液，保留收集的该菌体沉淀，再用0.7％生理盐水洗涤至该菌体为白色；
所述0.7％生理盐水配制方法：
准备要配制氯化钠溶液所需的溶剂和原料，备好烧杯、称量器；
通过称量器称取0.7克氯化钠；将氯化钠粉末放入烧杯之中，用蒸馏水稀释到100毫升，获得0.7％生理盐水；
步骤二，按1:5(g/ml)的比例，将白色的该菌体与细胞裂解剂混合，并置入95C水浴中，恒温处理且连续搅拌1小时，再立即冷却至室温，并用双蒸水彻底洗涤；所述细胞裂解剂为3％SDS；
步骤三，将裂解液加热浸出有效成份；冷却至室温后用无菌离心管以每分钟3000转以上的速度离心60分钟；吸出上清，分装于无菌容器中；加热灭菌；即获得非特异免疫激活剂。
2.如权利要求1所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述培养基制备方法如下：
(1)按重量份数称取L-半胱氨酸2份、无机盐5份、螺旋藻粉6份、水苏糖3份、植物胨10份、蒸馏水15份进行混合，制得用于双歧杆菌发酵的培养基。
3.如权利要求2所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述无机盐以重量份数计包括氯化钠2份、磷酸氢二钾3份、磷酸二氢钾1份、硫酸亚铁0.007份、硫酸锰0.003份、硫酸镁1份和氯化钙0.6份。
4.如权利要求2所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述螺旋藻粉的制备过程为：选择市售食品级或饲料级螺旋藻粉，平均粒径130μm，称重后，用60目筛过筛除杂，所选螺旋藻粉用气流粉碎方法进一步粉碎，直至得到平均粒径为90μm的可溶性螺旋藻微粉体，烘干。
5.如权利要求2所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述水苏糖为可溶性水苏糖结晶。
6.如权利要求4所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述气流粉碎方法是指将过筛选取的螺旋藻粉，低温冻结至裂碎临界点后，使用圆盘式气流磨、循环管式气流磨、对喷式气流磨、流化床对喷式气流磨或靶式气流磨的气流粉碎方法进行能量破碎，直至得到平均粒径为60-80μm的可溶性螺旋藻微粉体。
7.如权利要求1所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述低聚果糖制备方法如下：
1)对蔗糖进出除杂处理；蔗糖经法夫酵母JMU-MVP14发酵制得含有低聚果糖和虾青素的发酵液，发酵液经过离心机离心分离，提取出下层虾青素；
2)将上层清液经沸水浴加热灭酶活后再经微滤膜提纯，得到的滤液流经填充吸附介质的层析柱吸附；用乙醇溶液洗脱吸附介质，将洗脱液蒸发浓缩后得到低聚果糖。
8.如权利要求7所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述吸附介质为活性炭或活性炭与硅藻土的混合物，所述层析柱采用36度的柱温。
9.如权利要求7所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述微滤膜提纯是将上层清液在真空抽滤条件下依次通过0.7μm、0.35μm和0.22μm的微滤膜过滤；所述活性炭与硅藻土的混合物中活性炭与硅藻土的重量比为等于1:1；所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为2ml/min。
10.如权利要求7所述非特异免疫激活剂的制备方法，其特征在于，所述滤液流经填充吸附介质的层析柱的流速为0.6ml/min。
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