CN110551182A - 一种人乳头瘤病毒18型l1蛋白的突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种突变的HPV18L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV18和HPV45，或者HPV18、HPV45和HPV59)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。

Description

一种人乳头瘤病毒18型L1蛋白的突变体
本申请是以CN申请号为201810566208.8，申请日为2018年6月4日的申请为基础，并主张其优先权，该CN申请的公开内容在此作为整体引入本申请中。
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种突变的HPV18 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV18和HPV45，或者HPV18、HPV45和HPV59)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤和粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的生殖器癌症的主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是施用HPV疫苗，特别是针对能引起宫颈癌的高危型HPV的疫苗。
HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体构成的20面体立体对称结构(Doorbar,J.and P.H.Gallimore.1987.J Virol,61(9):2793-9)。HPV VLP的结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A 89(24):12180-4)。
然而，现有的研究显示，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在低的交叉保护作用(SaraL.Bissett,Giada Mattiuzzo,et al.2014 Vaccine.32:6548-6555)。因此，现有的HPV疫苗的保护范围非常有限。通常，一个型别的HPV VLP只能用于预防该型别的HPV感染。在这种情况下，如果要扩大HPV疫苗的保护范围，那就只能在疫苗中增加更多型别的HPV VLP。目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的(其为针对HPV16，18，6和11的四价疫苗)，GSK公司的(其为针对HPV16，18的二价疫苗)和Merck公司的9(其为针对HPV6，11，16，18，31，33，45，52，58的九价疫苗)，均是通过混合多个型别的HPVVLP而制成。然而，这种方案将导致HPV疫苗的生产成本大大提高，并且可能因为免疫剂量的增加而导致潜在的安全性问题。
因此，本领域需要开发能够诱导针对多个型别的HPV的保护性中和抗体的HPV病毒样颗粒，以更经济、有效地预防多个型别的HPV感染和由此导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
发明内容
本发明至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：将人乳头瘤病毒(HPV)18型L1蛋白中的一个特定区段置换为第二型别的HPV(例如HPV45)L1蛋白的相应区段后，所获得的突变的HPV18 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV18和第二型别的HPV(例如HPV45)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV18 VLP和第二型别的HPV VLP相当，并且其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18 VLP相当，且针对第二型别的HPV(例如HPV45)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当。
此外，在上述置换的基础上，还可以将HPV18 L1蛋白中的另一个特定区段进一步置换为第三型别的HPV(例如HPV59)L1蛋白的相应区段，由此所获得的含有双置换的突变的HPV18 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV18、第二型别的HPV(例如HPV45)和第三型别的HPV(例如HPV59)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV18 VLP、第二型别的HPV VLP和第三型别的HPV VLP相当；并且，其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18 VLP相当，针对第二型别的HPV(例如HPV45)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当，且针对第三型别的HPV(例如HPV59)的保护效果与单独的第三型别的HPV VLP相当。
因此，在一个方面，本发明提供了一种突变的HPV18 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV18 L1蛋白与野生型HPV18 L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸；和
(2)(a)位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(b)位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(c)位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(d)位于野生型HPV18 L1蛋白第176-202位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
并且，所述变体与所述突变的HPV18 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV18 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV18和HPV45，或者HPV18、HPV45和HPV59)的中和抗体。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有(2)(a)或(2)(b)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(3)位于野生型HPV18 L1蛋白第112-123位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有(2)(c)或(2)(d)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(4)位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有(2)(c)和(2)(a)所定义的突变，并且任选地，还具有(4)所定义的突变。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有下述突变：位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基，并且第112-123位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有下述突变：位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基，并且第112-123位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有下述突变：位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基，并且第410-421位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有下述突变：位于野生型HPV18 L1蛋白第176-202位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基，并且第410-421位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有下述突变：位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基，并且第235-243位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基，并且第410-421位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPVL1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了65个氨基酸。
在某些优选的实施方案中，所述第二型别的野生型HPV为HPV45。在某些优选的实施方案中，(2)(a)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(2)(b)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(2)(c)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(2)(d)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第142-168位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述第三型别的野生型HPV为HPV59。在某些优选的实施方案中，(3)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV59 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(4)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV18 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1或113所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV45 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2或115所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV59 L1蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:39所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV45 L1蛋白第142-168位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:40所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:41所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:42所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV59 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:43所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:44所示。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、5、6、7、9、13、17、18或19。
在某些更优选的实施方案中，所述突变的HPV18 L1蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、7、9、13、17、18或19。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的突变的HPV18L1蛋白或其变体。在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含所述分离的核酸。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:23、24、25、26、28、32、36、37或38。在某些更优选的实施方案中，本发明的分离的核酸具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:25、26、28、32、36、37或38。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种HPV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的突变的HPV18 L1蛋白或其变体，或者由本发明的突变的HPV18 L1蛋白或其变体组成或形成。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第176-202位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第142-168位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第112-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第112-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第176-202位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第142-168位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸，例如45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV18 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:4、5、6、7、9、13、17、18或19所示的序列。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述突变的HPV18 L1蛋白或其变体，或上述分离的核酸或载体或宿主细胞或HPV病毒样颗粒的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的突变的HPV18 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV病毒样颗粒。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
在某些优选的实施方案中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)。在某些优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。
在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HPV病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV18L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体。
在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体。
在另一个方面，本发明涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，还涉及根据本发明的突变的HPV18 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。
在另一个方面，本发明还涉及本发明所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒，其用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明，术语“第二型别的野生型HPV”是指，不同于HPV18的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第二型别的野生型HPV优选为野生型HPV45。根据本发明，术语“第三型别的野生型HPV”是指，不同于HPV18，且不同于第二型别的野生型HPV的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第三型别的野生型HPV优选为野生型HPV59。
根据本发明，表述“相应位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中的等同位置。
根据本发明，术语“野生型HPV18 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒18型(HPV18)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV18 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号ARS43428.1、ARS43407.1、ARS43401.1、AAP20601.1和ABP99727.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV18 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV18L1蛋白的第235-243位氨基酸残基”是指，SEQID NO：1所示的多肽的第235-243位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV18可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV18的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV18 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:1所示的蛋白，而且应包括各种HPV18分离株的L1蛋白(例如ARS43428.1、ARS43407.1、ARS43401.1、AAP20601.1和ABP99727.1所示的HPV18L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV18 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括各种HPV18分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV18 L1蛋白的第235-243位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第235-243位氨基酸残基，以及各种HPV18分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV45 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒45型(HPV45)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV45 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号P36741.1、ALV85689.1、ABP99815.1、AGU90600.1和ALV85649.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV45 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV45L1蛋白的第201-209位氨基酸残基”是指，SEQID NO：2所示的多肽的第201-209位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV45可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV45的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV45 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:2所示的蛋白，而且应包括各种HPV45分离株的L1蛋白(例如P36741.1、ALV85689.1、ABP99815.1、AGU90600.1和ALV85649.1所示的HPV45L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV45 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括各种HPV45分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV45 L1蛋白的第201-209位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：2的第201-209位氨基酸残基，以及各种HPV45分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV59 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒59型(HPV59)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV59 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号CAA54856.1、AGU90656.1、AEP23088.1、AEP23087.1和AGU90672.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV59 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：3所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV59 L1蛋白的第51-62位氨基酸残基”是指，SEQID NO：3所示的多肽的第51-62位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV59可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV59的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV59 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:3所示的蛋白，而且应包括各种HPV59分离株的L1蛋白(例如CAA54856.1、AGU90656.1、AEP23088.1、AEP23087.1和AGU90672.1所示的HPV59L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV59 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：3的序列片段，还包括各种HPV59分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV59 L1蛋白的第51-62位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：3的第51-62位氨基酸残基，以及各种HPV59分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸”是指，用起始密码子(用于起始蛋白质翻译)编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1－X位氨基酸残基。例如，N端截短了65个氨基酸的HPV18 L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV18 L1蛋白N末端的第1-65位氨基酸残基所获得的蛋白质。
根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的突变的HPV18L1蛋白(如SEQ ID NO:6、7、9、13、17、18或19所示的蛋白)的氨基酸序列相比，具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，或者具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述突变的HPV18 L1蛋白的功能。在本发明中，术语“突变的HPV18 L1蛋白的功能”是指：能够诱导机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV18和HPV45，或者HPV18、HPV45和HPV59)的中和抗体。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法(例如BLAST)来计算。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。
根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，术语“裂解上清”是指通过下述步骤所产生的溶液：将宿主细胞(例如大肠杆菌)在裂解液中破碎，然后将含有经破碎的宿主细胞的裂解液中的不溶物去除。各种裂解液是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。此外，可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现宿主细胞的破碎，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。去除裂解液中的不溶物的方法也是本领域技术人员公知的，包括但不限于过滤和离心。
发明的有益效果
研究表明，虽然HPV18和其他型别的HPV(例如HPV45和HPV59)之间存在一定的交叉保护，但是这种交叉保护的能力很低，通常低于自身型别的VLP的保护水平的百分之一，甚至低于千分之一。因此，对于接种了HPV18疫苗的受试者来说，其感染其他型别的HPV(例如HPV45和HPV59)的风险依然很高。
本发明提供了一种突变的HPV18 L1蛋白以及由其形成的HPV病毒样颗粒。本发明的HPV病毒样颗粒能够在HPV18和其他型别的HPV(例如HPV45和HPV59)之间提供显著的交叉保护能力。特别地，在同等免疫剂量下，本发明的HPV病毒样颗粒能够诱发机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV18和HPV45，或者HPV18、HPV45和HPV59)的高滴度中和抗体，并且其效果与多个型别的HPV VLP的混合物(例如，HPV18 VLP和HPV45 VLP的混合物，或者HPV18 VLP、HPV45 VLP和HPV59 VLP的混合物)相当。因此，本发明的HPV病毒样颗粒能够用于同时预防至少两个型别的HPV(例如，HPV18和HPV45，或者HPV18、HPV45和HPV59)的感染以及与此相关的疾病，具有显著的有利技术效果。这在扩大HPV疫苗的保护范围和降低HPV疫苗的生产成本等方面具有特别显著的优势。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例1中经纯化的突变蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1:HPV18N65(N端截短了65个氨基酸的HPV18 L1蛋白)；泳道2:H18N65-45T1；泳道3:H18N65-45T2；泳道4:H18N65-45T3；泳道5:H18N65-45T4；泳道6:H18N65-45T5；泳道7:HPV18N65；泳道8:H18N65-45T3-59S1；泳道9:H18N65-45T3-59S2；泳道10:H18N65-45T3-59S4；泳道11:H18N65-45T3-59S5；泳道12:H18N65-45T4-59S1；泳道13:H18N65-45T4-59S2；泳道14:H18N65-45T4-59S3；泳道15:HPV18N65；泳道16:H18N65-45T4-59S5；泳道17:HPV18N65；泳道18:H18N65-45T1-59S5；泳道19:H18N65-45T2-59S5；泳道20:H18N65-45T1T3-59S5。结果显示，经过色谱纯化后，H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5蛋白的纯度均达到85％以上。
图2显示了用广谱抗体4B3检测实施例1中制备的H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5的蛋白质免疫印迹检测的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1:HPV18N65；泳道2:H18N65-45T1；泳道3:H18N65-45T2；泳道4:H18N65-45T3；泳道5:H18N65-45T4；泳道6:H18N65-45T5；泳道7:HPV18N65；泳道8:H18N65-45T3-59S1；泳道9:H18N65-45T3-59S2；泳道10:H18N65-45T3-59S4；泳道11:H18N65-45T3-59S5；泳道12:H18N65-45T4-59S1；泳道13:H18N65-45T4-59S2；泳道14:H18N65-45T4-59S3；泳道15:HPV18N65；泳道16:H18N65-45T4-59S5；泳道17:HPV18N65；泳道18:H18N65-45T1-59S5；泳道19:H18N65-45T2-59S5；泳道20:H18N65-45T1T3-59S5。结果显示，突变蛋白H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5都能够被广谱抗体4B3特异性识别。
图3A-图3S显示了包含蛋白HPV18N65(图3A)、HPV45N27(图3B)、HPV59 L1(图3C)、H18N65-45T1(图3D)、H18N65-45T2(图3E)、H18N65-45T3(图3F)、H18N65-45T4(图3G)、H18N65-45T5(图3H)、H18N65-45T3-59S1(图3I)、H18N65-45T3-59S2(图3J)、H18N65-45T3-59S4(图3K)、H18N65-45T3-59S5(图3L)、H18N65-45T4-59S1(图3M)、H18N65-45T4-59S2(图3N)、H18N65-45T4-59S3(图3O)、H18N65-45T4-59S5(图3P)、H18N65-45T1-59S5(图3Q)、H18N65-45T2-59S5(图3R)、H18N65-45T1T3-59S5(图3S)的样品的分子筛层析分析的结果。结果显示，包含蛋白H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5的样品最先出现的蛋白峰均在13min左右，与由HPV18N65 L1蛋白组装的VLP(HPV18N65VLP)、由HPV45N27蛋白组装的VLP(HPV45N27VLP)以及由HPV59L1蛋白组装的VLP(HPV59 VLP)相当。这表明，这些蛋白均可组装成VLP。
图4A-图4S显示了各种VLP样品的透射电镜观察结果(放大倍数为100,000倍，Bar＝0.1μm)。其中：图4A，由HPV18N65组装的VLP；图4B，由HPV45N27组装的VLP；图4C，由HPV59L1组装的VLP；图4D，由H18N65-45T1组装的VLP；图4E，由H18N65-45T2组装的VLP；图4F，由H18N65-45T3组装的VLP；图4G，由H18N65-45T4组装的VLP；图4H，由H18N65-45T5组装的VLP；图4I，由H18N65-45T3-59S1组装的VLP；图4J，由H18N65-45T3-59S2组装的VLP；图4K，由H18N65-45T3-59S4组装的VLP；图4L，由H18N65-45T3-59S5组装的VLP；图4M，由H18N65-45T4-59S1组装的VLP；图4N，由H18N65-45T4-59S2组装的VLP；图4O，由H18N65-45T4-59S3组装的VLP；图4P，由H18N65-45T4-59S5组装的VLP；图4Q，由H18N65-45T1-59S5组装的VLP；图4R，由H18N65-45T2-59S5组装的VLP；图4S，由H18N65-45T1T3-59S5组装的VLP。结果显示，H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5与HPV18N65、HPV45N27和HPV59 L1类似，都能够组装成半径为30nm左右的VLP。
图5A-图5H显示了HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP、HPV59 VLP、H18N65-45T3 VLP、H18N65-45T4 VLP、H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1T3-59S5VLP的沉降速率分析的结果。图5A，HPV18N65 VLP；图5B，HPV45N27 VLP；图5C，HPV59 VLP；图5D，H18N65-45T3 VLP；图5E，H18N65-45T4 VLP；图5F，H18N65-45T3-59S1 VLP；图5G，H18N65-45T4-59S1 VLP；图5H，H18N65-45T1T3-59S5 VLP。结果显示，H18N65-45T3 VLP、H18N65-45T4 VLP、H18N65-45T1T3-59S5 VLP的沉降系数分别为143.7S、173.3S、167.1S，与HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP和HPV59 VLP的沉降系数(HPV18N65 VLP，142.2S；HPV45N27VLP，146.5S和HPV59VLP，139.3S)相近。这表明，H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T1T3-59S5能够组装成大小、形态与野生型VLP相似的病毒样颗粒。
图6A-6H显示了HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP、HPV59 VLP、H18N65-45T3 VLP、H18N65-45T4 VLP、H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1T3-59S5VLP热稳定性的检测结果。图6A，HPV18N65 VLP；图6B，HPV45N27 VLP；图6C，HPV59VLP；图6D，H18N65-45T3 VLP；图6E，H18N65-45T4 VLP；图6F，H18N65-45T3-59S1 VLP；图6G，H18N65-45T4-59S1 VLP；图6H，H18N65-45T1T3-59S5 VLP。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。
图7A显示了实验组H18N65-45T1 VLP、H18N65-45T2 VLP、H18N65-45T3 VLP、H18N65-45T4 VLP、H18N65-45T5 VLP和对照组HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP、混合的HPV18/45 VLP在小鼠体内的免疫保护性的评价结果。结果显示，H18N65-45T1 VLP、H18N65-45T2、VLPH18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP各自均保留了在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV18的中和抗体的活性，并且其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18N65 VLP、混合的HPV18/HPV45 VLP相当，并且它们在小鼠体内诱导针对HPV45的中和抗体的活性也高于单独的HPV18N65 VLP。特别地，H18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV45和HPV18的中和抗体；并且其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18N65VLP、混合的HPV18/HPV45VLP相当，且显著高于单独的HPV45N27 VLP；并且其针对HPV45的保护效果与单独的HPV45N27 VLP、混合的HPV18/HPV45 VLP相当，且显著高于单独的HPV18N65VLP。这表明，经突变后，H18N65-45T1 VLP、H18N65-45T2、VLPH18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP不仅保留了针对HPV18的免疫原性，而且针对HPV45的免疫原性相对于HPV18N65VLP也有所提高，特别是H18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP对HPV18和HPV45具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性，可用作预防HPV18感染和/或HPV45感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV18 VLP和HPV45 VLP的混合疫苗。
图7B显示了实验组H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T3-59S2VLP、H18N65-45T3-59S4 VLP、H18N65-45T3-59S5 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S2 VLP、H18N65-45T4-59S3 VLP、H18N65-45T4-59S5 VLP以及对照组HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP、HPV59 VLP和混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP在小鼠体内的免疫保护性的评价结果。结果显示，H18N65-45T3-59S1 VLP和H18N65-45T4-59S1 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV18、HPV45和HPV59的中和抗体；并且其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18N65VLP、混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著高于单独的HPV45N27 VLP和单独的HPV59 VLP；并且其针对HPV45的保护效果与单独的HPV45N27 VLP、混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著高于单独的HPV18N65 VLP和单独的HPV59 VLP；并且其针对HPV59的保护效果与单独的HPV59 VLP、混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著高于单独的HPV45N27 VLP和单独的HPV18N65 VLP。这表明，H18N65-45T3-59S1 VLP和H18N65-45T4-59S1 VLP对HPV18、HPV45和HPV59具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性，可用作预防HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV18 VLP、HPV45 VLP和HPV59VLP的混合疫苗。
图8A-图8B显示了用H18N65-45T4 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图8A：10μg剂量组(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)；图8B：1μg剂量组(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。结果显示，H18N65-45T4 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV18的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV18N65 VLP、混合的HPV18/45 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV45N27 VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV45的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV45N27 VLP、混合的HPV18/45 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV18N65 VLP。这表明，H18N65-45T4 VLP对HPV18和HPV45具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
图8C-图8D显示了用H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP、H18N65-45T1T3-59S5 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图8C：10μg剂量组(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)；图8D：1μg剂量组(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。结果显示，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV18的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV18N65VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV45N27 VLP或单独的HPV59 VLP；并且H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV45的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV45N27 VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV18N65 VLP或单独的HPV59 VLP；并且H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV59的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV59 VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV18N65 VLP或单独的HPV45N27 VLP。这表明，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP对HPV18、HPV45和HPV59具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
序列1(SEQ ID NO:1)：
MCLYTRVLILHYHLLPLYGPLYHPQPLPLHSILVYMVHIIICGHYIILFLRNVNVFPIFLQMALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
序列2(SEQ ID NO:2)：
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序列3(SEQ ID NO:3)：
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序列4(SEQ ID NO:4)：
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序列6(SEQ ID NO:6)：
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序列7(SEQ ID NO:7)：
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序列8(SEQ ID NO:8)：
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序列26(SEQ ID NO:26)：
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序列35(SEQ ID NO:35)：
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序列36(SEQ ID NO:36)：
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具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.突变的HPV18 L1蛋白的表达与纯化
表达载体的构建
采用Gibson装配(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat Methods.2009；6:343-5.doi:10.1038/nmeth.1318)来构建含有来源于HPV45 L1蛋白的特定区段和/或来源于HPV59 L1的特定区段的突变的HPV18 L1蛋白的表达载体。简言之，首先采用PCR反应来获得一个包含突变的短片段和一个不包含突变的长片段，然后再采用Gibson装配体系将这两个片段连接成环。
所使用的初始模板包括pTO-T7-HPV18N65L1质粒(其编码N端截短了65个氨基酸的HPV18 L1蛋白，该蛋白命名为HPV18N65；在表2中简写为18L1N65)、pTO-T7-HPV45L1N27C质粒(其编码N端截短了27个氨基酸的HPV45 L1蛋白，该蛋白命名为HPV45N27；在表2中简写为45L1N27)、pTO-T7-H18N65-45T1质粒(其编码突变蛋白H18N65-45T1；在表2中简写为H18N65-45T1)、pTO-T7-H18N65-45T2质粒(其编码突变蛋白H18N65-45T2；在表2中简写为H18N65-45T2)、pTO-T7-H18N65-45T3质粒(其编码突变蛋白H18N65-45T3；在表2中简写为H18N65-45T3)、pTO-T7-H18N65-45T4质粒(其编码突变蛋白H18N65-45T4；在表2中简写为H18N65-45T4)、pTO-T7-H18N65-45T3-59S5质粒(其编码突变蛋白H18N65-45T3-59S5；在表2中简写为H18N65-45T3-59S5)和pTO-T7-HPV59L1质粒(其编码HPV59 L1蛋白；在表2中简写为59L1)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，用于扩增短片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸1分钟)；最后72℃延伸10分钟。用于扩增长片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。退火温度和时间列于表2。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。
将扩增产物进行电泳，随后使用DNA回收试剂盒(BEYOTIME(碧云天)，货号：D0033)回收目的片段并测定其浓度。按2:1的摩尔比将扩增得到的短片段和长片段混合(总体积3μL)，随后添加3μL 2X Gibson装配预混试剂(2X Gibson Assembly Master Mix，购自NEB，包含T5exonuclease，Phusion DNA polymerase，Taq DNA ligase)，并在50℃反应1小时。
用装配后的产物(6μL)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(终浓度25μg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQID NO：23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38，其编码的氨基酸序列为SEQID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19(所对应的蛋白分别命名为H18N65-45T1、H18N65-45T2，H18N65-45T3，H18N65-45T4，H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1，H18N65-45T3-59S2，H18N65-45T3-59S4，H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1，H18N65-45T4-59S2，H18N65-45T4-59S3，H18N65-45T4-59S5，H18N65-45T1-59S5，H18N65-45T2-59S5和H18N65-45T1T3-59S5)。
突变蛋白H18N65-45T1与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T2与HPV18 L1的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第176-202位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第142-168位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T3与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T4与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T5与HPV18 L1的区别在于：位于野生型HPV18L1蛋白第411-419位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第379-387位的氨基酸残基。
突变蛋白H18N65-45T3-59S1与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45L1蛋白第201-209位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第112-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第51-62位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T3-59S2与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第183-204位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第122-143位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T3-59S4与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第325-351位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第264-290位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T3-59S5与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第349-360位的氨基酸残基。
突变蛋白H18N65-45T4-59S1与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45L1蛋白第293-314位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第112-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第51-62位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T4-59S2与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第183-204位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第122-143位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T4-59S3与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第231-242位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第170-181位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T4-59S5与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白的第349-360位的氨基酸残基。
突变蛋白H18N65-45T1-59S5与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45L1蛋白第79-89位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T2-59S5与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18L1蛋白第176-202位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第142-168位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基。突变蛋白H18N65-45T1T3-59S5与HPV18N65的区别在于：位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基，并且第235-243位的氨基酸残基被替换为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基。
表2.用于构建表达载体的PCR反应的模板和引物
表3：所使用的引物的具体序列(SEQ ID NO:45-108)
突变蛋白的大量表达
从-70℃冰箱中取出携带重组质粒pTO-T7-H18N65-45T1、pTO-T7-H18N65-45T2、pTO-T7-H18N65-45T3、pTO-T7-H18N65-45T4、pTO-T7-H18N65-45T5、pTO-T7-H18N65-45T3-59S1、pTO-T7-H18N65-45T3-59S2、pTO-T7-H18N65-45T3-59S4、pTO-T7-H18N65-45T3-59S5、pTO-T7-H18N65-45T4-59S1、pTO-T7-H18N65-45T4-59S2、pTO-T7-H18N65-45T4-59S3、pTO-T7-H18N65-45T4-59S5、pTO-T7-H18N65-45T1-59S5、pTO-T7-H18N65-45T2-59S5、pTO-T7-H18N65-45T1T3-59S5的大肠杆菌菌液，分别接种入100ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下培养大约8小时；然后分别转接入500ml含卡那霉素的LB培养基中(接入1ml菌液)，并继续进行培养。当细菌浓度达到OD600为0.6左右时，将培养温度降至25℃，并向各培养瓶中加入500μL IPTG，继续培养8小时。培养结束后，离心收集菌体。获得表达了H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5蛋白的菌体。
表达突变蛋白的菌体破碎
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬上述得到的菌体。用超声波仪破碎菌体30min。以13500rpm(30000g)离心含有经破碎的菌体的裂解液15min，留取上清(即，菌体破碎上清)。
突变蛋白的色谱纯化
仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质：SP Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)、CHT-Ⅱ(购自Bio－RAD)和Butyl Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)。
缓冲液：缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT)；以及，缓冲液B(20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT，2M NaCl)。下面的洗脱程序中用到的含有不同浓度NaCl的缓冲液是由缓冲液A和B按比例混合配置而成。
样品：如上获得的含有H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5的菌体破碎上清。
洗脱程序为：
(1)用SP Sepharose 4Fast Flow对菌体破碎上清进行阳离子交换纯化：将样品上柱，然后用含有400mM NaCl的缓冲液(80％缓冲液A+20％缓冲液B)洗脱杂蛋白，然后用含有800mM NaCl的缓冲液(60％缓冲液A+40％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有800mMNaCl的缓冲液洗脱的级分；
(2)用CHTⅡ(羟基磷灰石色谱)对前一步获得的洗脱级分进行色谱纯化：对前一步骤获得的洗脱级分进行稀释，以使得NaCl的浓度降至0.5M；将样品上柱，然后用含有500mMNaCl的缓冲液(75％缓冲液A+25％缓冲液B)洗脱杂蛋白，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液(50％缓冲液A+50％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；
(3)用HIC(疏水相互作用色谱)对前一步骤获得的洗脱级分进行色谱纯化：将样品上柱，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有200mM NaCl的缓冲液(90％缓冲液A+10％缓冲液B)洗脱目的蛋白，并收集由含有200mM NaCl的缓冲液洗脱的级分。
取步骤(3)获得的洗脱级分150μL，加入30μL 6X Loading Buffer(1L中含有1M TB6.8 300ml、100％甘油600ml、SDS120g、溴酚蓝6g、β-巯基乙醇50ml)中，混匀，并于80℃水浴中温育10min。然后取10μl样品于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果示于图1中。结果显示，经过上述纯化步骤后，H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5蛋白的纯度均大于85％。
通过类似的方法，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV18N65L1质粒制备和纯化了HPV18N65蛋白(SEQ ID NO:113)；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV45L1N27C质粒制备和纯化了HPV45N27蛋白(SEQ ID NO:115)；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV59L1质粒制备和纯化了HPV59L1蛋白(SEQ ID NO:3)。
突变蛋白的免疫印迹实验
按上述方法对经纯化的H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5蛋白进行电泳。电泳结束后，使用抗HPV L1蛋白的广谱抗体4B3进行Wes tern Blot检测，结果示于图2中。结果显示，H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5都能够被广谱抗体4B3特异性识别。
实施例2：HPV病毒样颗粒的组装与颗粒形态学检测
HPV病毒样颗粒的组装
取一定体积(约2ml)的蛋白H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5，分别依次透析至(1)2L储存缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，0.5M NaCl)；(2)2L复性缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0，2mM CaCl2，2mM MgCl2，0.5M NaCl)；和(3)20mM磷酸钠缓冲液pH 7.0，0.5M NaCl中。在三种缓冲液中各自进行透析12h。
通过类似的方法，将HPV18N65、HPV45N27和HPV59 L1蛋白分别组装为HPV18N65VLP、HPV45N27 VLP和HPV59 VLP。
分子筛层析分析
用美国安捷伦公司的1120Compact LC高效液相色谱系统对经透析的样品进行分子筛层析分析，其中，所使用的分析柱为TSK Gel PW5000xl 7.8x300mm。分析结果如图3A-图3S所示。结果显示，包含蛋白H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5的样品最先出现的蛋白峰均在13min左右，与HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP以及HPV59 VLP相当。这表明，这些蛋白均可组装成VLP。
病毒样颗粒的形态学检测
取100μL含有VLP的样品进行透射电镜观察。所使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。简言之，取13.5μL样品，用2％磷钨酸pH7.0进行负染，并固定于喷炭的铜网上，然后进行透射电镜观察。观察结果如图4A-4S所示。结果显示，H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5均可组装成病毒样颗粒。此外，结果还显示，这些突变蛋白所组装形成的颗粒的半径均在30nm左右，大小均一。野生型的HPV18N65、HPV45N27和HPV59 L1所组装形成的病毒样颗粒的半径也在30nm左右，大小均一。这表明，这些突变蛋白与HPV18、HPV45和HPV59的L1蛋白类似，能够形成大小均一的VLP。
沉降速率分析
沉降速率分析所使用的仪器为Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法分析HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP、HPV59VLP、H18N65-45T3 VLP、H18N65-45T4 VLP、H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1VLP、H18N65-45T1T3-59S5 VLP的沉降系数。结果如图5A-5H所示。结果显示，H18N65-45T3VLP、H18N65-45T4 VLP、H18N65-45T1T3-59S5 VLP的沉降系数分别为143.7S、173.3S、167.1S，与HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP和HPV59 VLP的沉降系数(HPV18N65 VLP，142.2S；HPV45N27 VLP，146.5S和HPV59 VLP，139.3S)相近。这表明，H18N65-45T3 VLP、H18N65-45T4VLP、H18N65-45T1T3-59S5 VLP能够组装成大小、形态与野生型VLP相似的病毒样颗粒。
实施例3：病毒样颗粒的热稳定性的评价
使用购自美国GE公司(原MicroCal公司)的差温量热仪VP Capillary DSC来评价蛋白HPV18N65、HPV45N27、HPV59、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T1T3-59S5所形成的VLP的热稳定性，其中，使用所述蛋白的储存缓冲液作为对照，并且以1.5℃/min的升温速率在10℃-90℃区间对各蛋白进行扫描。检测结果如图6A-6H所示。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。
实施例4：用病毒样颗粒免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价1
使用小鼠来评价由H18N65-45T1、H18N65-45T2、H18N65-45T3、H18N65-45T4、H18N65-45T5、H18N65-45T3-59S1、H18N65-45T3-59S2、H18N65-45T3-59S4、H18N65-45T3-59S5、H18N65-45T4-59S1、H18N65-45T4-59S2、H18N65-45T4-59S3、H18N65-45T4-59S5、H18N65-45T1-59S5、H18N65-45T2-59S5、H18N65-45T1T3-59S5形成的VLP的免疫保护性。用于免疫接种的动物为，5-6周龄BalB/c普通级小鼠(购自上海斯莱康实验动物有限公司)。
将如上制备的H18N65-45T1 VLP、H18N65-45T2 VLP、H18N65-45T3 VLP、H18N65-45T4 VLP、H18N65-45T5 VLP、HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP以及混合的HPV18/HPV45 VLP(即，混合的HPV18N65VLP和HPV45N27 VLP)分别吸附于铝佐剂上。按不同的免疫原将小鼠分为8组，每组包含5只小鼠。免疫程序为：在0周时进行初次免疫；在第2和4周时各进行加强免疫一次。免疫方式为腹腔注射，所使用的免疫原与剂量如表4所示。在初次免疫后的第8周，抽取眼球静脉血，并分离血清，随后检测血清中的中和抗体的滴度。检测结果如图7A所示。结果显示，H18N65-45T1 VLP、H18N65-45T2、VLPH18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP各自均保留了在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV18的中和抗体的活性，并且其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18N65 VLP、混合的HPV18/HPV45 VLP相当，并且它们在小鼠体内诱导针对HPV45的中和抗体的活性也高于单独的HPV18N65 VLP。特别地，H18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV45和HPV18的中和抗体；并且其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18N65 VLP、混合的HPV18/HPV45 VLP相当，且显著高于单独的HPV45N27 VLP；并且其针对HPV45的保护效果与单独的HPV45N27 VLP、混合的HPV18/HPV45 VLP相当，且显著高于单独的HPV18N65 VLP。这表明，经突变后，H18N65-45T1 VLP、H18N65-45T2、VLPH18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP不仅保留了针对HPV18的免疫原性，而且针对HPV45的免疫原性相对于HPV18N65 VLP也有所提高，特别是H18N65-45T3 VLP和H18N65-45T4 VLP对HPV18和HPV45具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性，可用作预防HPV18感染和/或HPV45感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV18 VLP和HPV45VLP的混合疫苗。
表4.免疫方案
免疫抗原 佐剂 免疫剂量 数量 免疫程序(周)
H18N65-45T1 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H18N65-45T2 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H18N65-45T3 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H18N65-45T4 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H18N65-45T5 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
HPV18N65 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
HPV45N27 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
HPV18/HPV45 VLP 铝佐剂 每种VLP各5μg 5 0、2、4
另外，将如上制备的H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T3-59S2VLP、H18N65-45T3-59S4 VLP、H18N65-45T3-59S5 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S2 VLP、H18N65-45T4-59S3 VLP、H18N65-45T4-59S5 VLP、HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP、HPV59 VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP(即，HPV18N65 VLP、HPV45N27VLP和HPV59 VLP的混合物)分别吸附于铝佐剂上。按不同的免疫原将小鼠分为12组，每组包含5只小鼠。免疫程序为：在0周时进行初次免疫；在第2和4周时各进行加强免疫一次。免疫方式为腹腔注射，所使用的免疫原与剂量如表5所示。在初次免疫后的第8周，抽取眼球静脉血，并分离血清，随后检测血清中的中和抗体的滴度。检测结果如图7B所示。结果显示，H18N65-45T3-59S1 VLP和H18N65-45T4-59S1 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV18、HPV45和HPV59的中和抗体；并且其针对HPV18的保护效果与单独的HPV18N65VLP、混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著高于单独的HPV45N27 VLP和单独的HPV59 VLP；并且其针对HPV45的保护效果与单独的HPV45N27 VLP、混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著高于单独的HPV18N65VLP和单独的HPV59 VLP；并且其针对HPV59的保护效果与单独的HPV59 VLP、混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著高于单独的HPV45N27 VLP和单独的HPV18N65 VLP。这表明，H18N65-45T3-59S1 VLP和H18N65-45T4-59S1 VLP对HPV18、HPV45和HPV59具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性，可用作预防HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV18 VLP、HPV45 VLP和HPV59 VLP的混合疫苗。
表5.免疫方案
免疫抗原 佐剂 免疫剂量 数量 免疫程序(周)
H18N65-45T3-59S1 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
H18N65-45T3-59S2 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
H18N65-45T3-59S4 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
H18N65-45T3-59S5 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
H18N65-45T4-59S1 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
H18N65-45T4-59S2 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
H18N65-45T4-59S3 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
H18N65-45T4-59S5 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
HPV18N65 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
HPV45N27 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
HPV59 VLP 铝佐剂 5ug 5 0、2、4
HPV18/HPV45/HPV59 VLP 铝佐剂 每种VLP各5ug 5 0、2、4
实施例5：病毒样颗粒诱导血清转换的ED50的评价
本实验中，所用病毒样颗粒为H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP。
采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄的BalB/c雌鼠(8只)进行免疫，其中，实验组使用H18N65-45T3-59S1 VLP或H18N65-45T4-59S1 VLP或H18N65-45T1T3-59S5(免疫剂量为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)；对照组使用单独的HPV45N27 VLP、单独的HPV18N65 VLP或单独的HPV59 VLP(免疫剂量分别为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)，或者混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP(即，HPV18N65 VLP、HPV45N27VLP和HPV59VLP的混合物，每种VLP的免疫剂量各为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)；免疫体积为1mL。另外，还将用于稀释疫苗的稀释液用作空白对照。每组免疫8只小鼠，并且在免疫后第五周，抽取眼球静脉血，检测血清中的HPV抗体，并通过Reed-Muench法(Reed LJMH.A s imple method of es t imat ing fifty percent endpoints.Am J Hyg.1938；27:493-7)来计算各个样品诱导血清转换(即，诱导小鼠产生抗体)的ED50。结果如表6-12所示。
表6.HPV18N65 VLP诱导小鼠产生抗HPV45、抗HPV18和抗HPV59抗体(血清转换)的ED50
表7.HPV45N27 VLP诱导小鼠产生抗HPV45、抗HPV18和抗HPV59抗体(血清转换)的ED50
表8.HPV59 VLP诱导小鼠产生抗HPV45、抗HPV18和抗HPV59抗体(血清转换)的ED50
表9.混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP诱导小鼠产生抗HPV45、抗HPV18和抗HPV59抗体(血清转换)的ED50
表10.H18N65-45T3-59S1 VLP诱导小鼠产生抗HPV45、抗HPV18和抗HPV59抗体(血清转换)的ED50
表11.H18N65-45T4-59S1 VLP诱导小鼠产生抗HPV45、抗HPV18和抗HPV59抗体(血清转换)的ED50
表12.H18N65-45T1T3-59S5 VLP诱导小鼠产生抗HPV45、抗HPV18和抗HPV59抗体(血清转换)的ED50
结果显示，在免疫小鼠5周后，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP诱导小鼠产生抗HPV18的ED50与单独的HPV18N65 VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59VLP相当，且显著优于单独的HPV45N27 VLP以及单独的HPV59 VLP；并且，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP诱导小鼠产生抗HPV45的ED50与单独的HPV45N27VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著优于单独的HPV18N65 VLP以及单独的HPV59 VLP；并且，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP诱导小鼠产生抗HPV59的ED50与单独的HPV59VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59VLP相当，且显著优于单独的HPV45N27 VLP以及单独的HPV18N65VLP。这表明，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP对HPV18、HPV45以及HPV59具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
实施例6：用病毒样颗粒免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价2
本实验中，所用的病毒颗粒为H18N65-45T4 VLP。
在本实验中，免疫方案如表13所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为2个组：10μg剂量组(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)，和1μg剂量组(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为5个亚组，对照亚组1和2分别用单独的HPV45N27VLP、单独的HPV18N65VLP进行免疫，对照亚组3用混合的HPV18/HPV45 VLP(即，HPV18N65 VLP和HPV45N27 VLP的混合物，其中每种VLP均以指定的免疫剂量施用)进行免疫，实验亚组用H18N65-45T4 VLP进行免疫。
采用腹腔注射方式免疫6只小鼠/亚组，免疫剂量分别为10μg、1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV18和HPV45抗体的滴度。分析结果如图8A和图8B所示。结果显示，H18N65-45T4 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV18的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV18N65 VLP、混合的HPV18/HPV45 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV45N27VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV45的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV45N27 VLP、混合的HPV18/HPV45 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV18N65 VLP。这表明，H18N65-45T4VLP对HPV18和HPV45具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
表13.免疫方案
实施例7：用病毒样颗粒免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价3
本实验中，所用的病毒颗粒为H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP。
在本实验中，免疫方案如表14所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为2个组：10μg剂量组(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)，和1μg剂量组(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为9个亚组：对照亚组1、2和3分别用单独的HPV18N65 VLP、单独的HPV45N27 VLP和单独的HPV59 VLP进行免疫，对照亚组4用混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP(即，HPV18N65 VLP、HPV45N27 VLP和HPV59 VLP的混合物，其中每种VLP均以指定的免疫剂量施用)进行免疫，实验亚组1、2、3、4和5分别用H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP进行免疫。
采用腹腔注射方式免疫6只小鼠/亚组，免疫剂量为10μg、1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV18、HPV45和HPV59抗体的滴度。分析结果如图8C-图8D所示。结果显示，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP都能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV18的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV18N65 VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV45N27VLP或单独的HPV59 VLP；并且H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV45的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV45N27 VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV18N65VLP或单独的HPV59 VLP；并且H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV59的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV59 VLP以及混合的HPV18/HPV45/HPV59 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV18N65VLP或单独的HPV45N27 VLP。这表明，H18N65-45T3-59S1 VLP、H18N65-45T4-59S1 VLP、H18N65-45T1-59S5 VLP、H18N65-45T2-59S5 VLP和H18N65-45T1T3-59S5 VLP对HPV18、HPV45和HPV59具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
表14.免疫方案
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
厦门万泰沧海生物技术有限公司
<120> 一种人乳头瘤病毒18型L1蛋白的突变体
<130> IDC180139
<150> CN201810566208.8
<151> 2018-06-04
<160> 116
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
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Leu Tyr Gly Pro Leu Tyr His Pro Gln Pro Leu Pro Leu His Ser Ile
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Phe Leu Arg Asn Val Asn Val Phe Pro Ile Phe Leu Gln Met Ala Leu
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Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr
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Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val
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Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu
245 250 255
Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser
260 265 270
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Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly
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Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His
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Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu
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Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr
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Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe
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Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val
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Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser
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Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp
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Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr
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Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Ala Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro
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<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 45
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Met Ala His Asn Ile Ile Tyr Gly His Gly Ile Ile Ile Phe Leu Lys
1 5 10 15
Asn Val Asn Val Phe Pro Ile Phe Leu Gln Met Ala Leu Trp Arg Pro
20 25 30
Ser Asp Ser Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg Val Val
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Cys Val Gly Met Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Ile Gly Leu
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Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu
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Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Arg Pro Thr Ile Gly Pro
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Arg Lys Arg Pro Ala Ala Ser Thr Ser Thr Ala Ser Thr Ala Ser Arg
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Pro Ala Lys Arg Val Arg Ile Arg Ser Lys Lys
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<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 59
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Ser Val Ala Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Ser
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210 215 220
Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp
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Ala Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Val Phe
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Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ser Gly Thr Met Gly Asp Gln Leu Pro
260 265 270
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Thr Ala Pro Pro Val Lys Gln Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp
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Pro Val Asp Leu Lys Glu Arg Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro
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<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 20
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caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa tatagagtat ttagggtgca gttacctgac 420
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cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa 1707
<210> 21
<211> 1707
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 21
atgtgcctgt atacacgggt cctgatatta cattaccatc tactacctct gtatggccca 60
ttgtatcacc cacagcccct gcctctacac agtatattgg tatacatggt acacattatt 120
atttgtggcc attatattat tttattccta agaaacgtaa acgtgttccc tatttttttg 180
cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatatc ttccacctcc ttctgtggca 240
agagttgtaa ataccgatga ttacgtgact cgcacaagca tattttatca tgctggcagc 300
tctagattat taactgttgg taatccatat tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag 360
caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa tatagagtat ttagggtgca gttacctgac 420
ccaaataaat ttggtttacc tgatactagt atttataatc ctgaaacaca acgtttagtg 480
tgggcctgtg ctggagtgga aattggccgt ggtcagcctt taggtgttgg ccttagtggg 540
catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgccac gtctaatgtt 600
tctgaggacg ttagggacaa tgtgtctgta gattataagc agacacagtt atgtattttg 660
ggctgtgccc ctgctattgg ggaacactgg gctaaaggca ctgcttgtaa atcgcgtcct 720
ttatcacagg gcgattgccc ccctttagaa cttaaaaaca cagttttgga agatggtgat 780
atggtagata ctggatatgg tgccatggac tttagtacat tgcaagatac taaatgtgag 840
gtaccattgg atatttgtca gtctatttgt aaatatcctg attatttaca aatgtctgca 900
gatccttatg gggattccat gtttttttgc ttacggcgtg agcagctttt tgctaggcat 960
ttttggaata gagcaggtac tatgggtgac actgtgcctc aatccttata tattaaaggc 1020
acaggtatgc gtgcttcacc tggcagctgt gtgtattctc cctctccaag tggctctatt 1080
gttacctctg actcccagtt gtttaataaa ccatattggt tacataaggc acagggtcat 1140
aacaatggtg tttgctggca taatcaatta tttgttactg tggtagatac cactcgcagt 1200
accaatttaa caatatgtgc ttctacacag tctcctgtac ctgggcaata tgatgctacc 1260
aaatttaagc agtatagcag acatgttgag gaatatgatt tgcagtttat ttttcagttg 1320
tgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380
ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc ccgccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440
cgttttgtac aatctgttgc tattgcctgt caaaaggatg ctgcaccggc tgaaaataag 1500
gatccctatg ataagttaaa gttttggaat gtggatttaa aggaaaagtt ttctttagac 1560
ttagatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620
accataggcc ctcgcaaacg ttctgctcca tctgccacta cggcttctaa acctgccaag 1680
cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa 1707
<210> 22
<211> 1527
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 59
<400> 22
atggccctgt ggaggagcag cgacaacaag gtgtacctgc ccccccccag cgtggccaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accagcatct tctaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctga ccgtgggcca cccctacttc aaggtgccca agggcggcaa cggcaggcag 180
gacgtgccca aggtgagcgc ctaccagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcctgcccga caacaccgtg tacgacccca acagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcgtgg gcgtggagat cggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcct gagcggccac 360
cccctgtaca acaagctgga cgacaccgag aacagccacg tggccagcgc cgtggacacc 420
aaggacacca gggacaacgt gagcgtggac tacaagcaga cccagctgtg catcatcggc 480
tgcgtgcccg ccatcggcga gcactggacc aagggcaccg cctgcaagcc caccaccgtg 540
gtgcagggcg actgcccccc cctggagctg atcaacaccc ccatcgagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gctacggcgc catggacttc aagctgctgc aggacaacaa gagcgaggtg 660
cccctggaca tctgccagag catctgcaag taccccgact acctgcagat gagcgccgac 720
gcctacggcg acagcatgtt cttctgcctg aggagggagc aggtgttcgc caggcacttc 780
tggaacagga gcggcaccat gggcgaccag ctgcccgaga gcctgtacat caagggcacc 840
gacatcaggg ccaaccccgg cagctacctg tacagcccca gccccagcgg cagcgtggtg 900
accagcgaca gccagctgtt caacaagccc tactggctgc acaaggccca gggcctgaac 960
aacggcatct gctggcacaa ccagctgttc ctgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020
aacctgagcg tgtgcgccag caccaccagc agcatcccca acgtgtacac ccccaccagc 1080
ttcaaggagt acgccaggca cgtggaggag ttcgacctgc agttcatctt ccagctgtgc 1140
aagatcaccc tgaccaccga ggtgatgagc tacatccaca acatgaacac caccatcctg 1200
gaggactgga acttcggcgt gacccccccc cccaccgcca gcctggtgga cacctacagg 1260
ttcgtgcaga gcgccgccgt gacctgccag aaggacaccg ccccccccgt gaagcaggac 1320
ccctacgaca agctgaagtt ctggcccgtg gacctgaagg agaggttcag cgccgacctg 1380
gaccagttcc ccctgggcag gaagttcctg ctgcagctgg gcgccaggcc caagcccacc 1440
atcggcccca ggaagagggc cgcccccgcc cccaccagca cccccagccc caagagggtg 1500
aagaggagga agagcagcag gaagtga 1527
<210> 23
<211> 1518
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T1的DNA序列
<400> 23
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactag gaccagcatc ttctaccacg ccggcagcag caggctgctg 120
accgtgggca acccctactt cagggtggtg cccaacggcg ccggcaacaa gcaggccgtg 180
cccaaggtga gcgcctacca gtacagggtg ttcagggtgc agttacctga cccaaataaa 240
tttggtttac ctgatactag tatttataat cctgaaacac aacgtttagt gtgggcctgt 300
gctggagtgg aaattggccg tggtcagcct ttaggtgttg gccttagtgg gcatccattt 360
tataataaat tagatgacac tgaaagttcc catgccgcca cgtctaatgt ttctgaggac 420
gttagggaca atgtgtctgt agattataag cagacacagt tatgtatttt gggctgtgcc 480
cctgctattg gggaacactg ggctaaaggc actgcttgta aatcgcgtcc tttatcacag 540
ggcgattgcc cccctttaga acttaaaaac acagttttgg aagatggtga tatggtagat 600
actggatatg gtgccatgga ctttagtaca ttgcaagata ctaaatgtga ggtaccattg 660
gatatttgtc agtctatttg taaatatcct gattatttac aaatgtctgc agatccttat 720
ggggattcca tgtttttttg cttacggcgt gagcagcttt ttgctaggca tttttggaat 780
agagcaggta ctatgggtga cactgtgcct caatccttat atattaaagg cacaggtatg 840
cgtgcttcac ctggcagctg tgtgtattct ccctctccaa gtggctctat tgttacctct 900
gactcccagt tgtttaataa accatattgg ttacataagg cacagggtca taacaatggt 960
gtttgctggc ataatcaatt atttgttact gtggtagata ccactcgcag taccaattta 1020
acaatatgtg cttctacaca gtctcctgta cctgggcaat atgatgctac caaatttaag 1080
cagtatagca gacatgttga ggaatatgat ttgcagttta tttttcagtt gtgtactatt 1140
actttaactg cagatgttat gtcctatatt catagtatga atagcagtat tttagaggat 1200
tggaactttg gtgttccccc cccgccaact actagtttgg tggatacata tcgttttgta 1260
caatctgttg ctattgcctg tcaaaaggat gctgcaccgg ctgaaaataa ggatccctat 1320
gataagttaa agttttggaa tgtggattta aaggaaaagt tttctttaga cttagatcaa 1380
tatccccttg gacgtaaatt tttggttcag gctggattgc gtcgcaagcc caccataggc 1440
cctcgcaaac gttctgctcc atctgccact acggcttcta aacctgccaa gcgtgtgcgt 1500
gtacgtgcca ggaagtaa 1518
<210> 24
<211> 1515
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T2的DNA序列
<400> 24
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120
actgttggta atccatattt tagggttcct gcaggtggtg gcaataagca ggatattcct 180
aaggtttctg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240
ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300
ggagtggaga tcggcagggg ccagcccctg ggcatcggcc tgagcggcca ccccttctac 360
aacaagctgg acgacaccga gagcgcccac gccgccaccg ccgtgatcac ccaggacgtg 420
agggacaacg tgagcgtgga ctacaagcag acccagctgt gcatcctggg ctgcgcccct 480
gctattgggg aacactgggc taaaggcact gcttgtaaat cgcgtccttt atcacagggc 540
gattgccccc ctttagaact taaaaacaca gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600
ggatatggtg ccatggactt tagtacattg caagatacta aatgtgaggt accattggat 660
atttgtcagt ctatttgtaa atatcctgat tatttacaaa tgtctgcaga tccttatggg 720
gattccatgt ttttttgctt acggcgtgag cagctttttg ctaggcattt ttggaataga 780
gcaggtacta tgggtgacac tgtgcctcaa tccttatata ttaaaggcac aggtatgcgt 840
gcttcacctg gcagctgtgt gtattctccc tctccaagtg gctctattgt tacctctgac 900
tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac agggtcataa caatggtgtt 960
tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca ctcgcagtac caatttaaca 1020
atatgtgctt ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa atttaagcag 1080
tatagcagac atgttgagga atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact 1140
ttaactgcag atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200
aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260
tctgttgcta ttgcctgtca aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 1320
aagttaaagt tttggaatgt ggatttaaag gaaaagtttt ctttagactt agatcaatat 1380
ccccttggac gtaaattttt ggttcaggct ggattgcgtc gcaagcccac cataggccct 1440
cgcaaacgtt ctgctccatc tgccactacg gcttctaaac ctgccaagcg tgtgcgtgta 1500
cgtgccagga agtaa 1515
<210> 25
<211> 1515
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T3的DNA序列
<400> 25
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120
actgttggta atccatattt tagggttcct gcaggtggtg gcaataagca ggatattcct 180
aaggtttctg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240
ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300
ggagtggaaa ttggccgtgg tcagccttta ggtgttggcc ttagtgggca tccattttat 360
aataaattag atgacactga aagttcccat gccgccacgt ctaatgtttc tgaggacgtt 420
agggacaatg tgtctgtaga ttataagcag acacagttat gtattttggg ctgtgccccc 480
gccatcggcg agcactgggc caagggcacc ctgtgcaagc ccgcccagct gcagcccggc 540
gactgccccc ccctggagct gaagaacacc gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600
ggatatggtg ccatggactt tagtacattg caagatacta aatgtgaggt accattggat 660
atttgtcagt ctatttgtaa atatcctgat tatttacaaa tgtctgcaga tccttatggg 720
gattccatgt ttttttgctt acggcgtgag cagctttttg ctaggcattt ttggaataga 780
gcaggtacta tgggtgacac tgtgcctcaa tccttatata ttaaaggcac aggtatgcgt 840
gcttcacctg gcagctgtgt gtattctccc tctccaagtg gctctattgt tacctctgac 900
tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac agggtcataa caatggtgtt 960
tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca ctcgcagtac caatttaaca 1020
atatgtgctt ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa atttaagcag 1080
tatagcagac atgttgagga atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact 1140
ttaactgcag atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200
aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260
tctgttgcta ttgcctgtca aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 1320
aagttaaagt tttggaatgt ggatttaaag gaaaagtttt ctttagactt agatcaatat 1380
ccccttggac gtaaattttt ggttcaggct ggattgcgtc gcaagcccac cataggccct 1440
cgcaaacgtt ctgctccatc tgccactacg gcttctaaac ctgccaagcg tgtgcgtgta 1500
cgtgccagga agtaa 1515
<210> 26
<211> 1521
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T4的DNA序列
<400> 26
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120
actgttggta atccatattt tagggttcct gcaggtggtg gcaataagca ggatattcct 180
aaggtttctg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240
ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300
ggagtggaaa ttggccgtgg tcagccttta ggtgttggcc ttagtgggca tccattttat 360
aataaattag atgacactga aagttcccat gccgccacgt ctaatgtttc tgaggacgtt 420
agggacaatg tgtctgtaga ttataagcag acacagttat gtattttggg ctgtgcccct 480
gctattgggg aacactgggc taaaggcact gcttgtaaat cgcgtccttt atcacagggc 540
gattgccccc ctttagaact taaaaacaca gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600
ggatacggcg ccatggactt cagcaccctg caggacacca agtgcgaggt gcccctggac 660
atctgccaga gcatctgcaa gtaccccgac tacctgcaga tgagcgccga cccctacggc 720
gacagcatgt tcttctgcct gaggagggag cagctgttcg ccaggcactt ctggaacagg 780
gccggcgtga tgggcgacac cgtgcccacc gacctgtaca tcaagggcac cagcgccaac 840
atgagggaga cccccggcag ctgcgtgtac agccccagcc ccagcggcag catcgttacc 900
tctgactccc agttgtttaa taaaccatat tggttacata aggcacaggg tcataacaat 960
ggtgtttgct ggcataatca attatttgtt actgtggtag ataccactcg cagtaccaat 1020
ttaacaatat gtgcttctac acagtctcct gtacctgggc aatatgatgc taccaaattt 1080
aagcagtata gcagacatgt tgaggaatat gatttgcagt ttatttttca gttgtgtact 1140
attactttaa ctgcagatgt tatgtcctat attcatagta tgaatagcag tattttagag 1200
gattggaact ttggtgttcc ccccccgcca actactagtt tggtggatac atatcgtttt 1260
gtacaatctg ttgctattgc ctgtcaaaag gatgctgcac cggctgaaaa taaggatccc 1320
tatgataagt taaagttttg gaatgtggat ttaaaggaaa agttttcttt agacttagat 1380
caatatcccc ttggacgtaa atttttggtt caggctggat tgcgtcgcaa gcccaccata 1440
ggccctcgca aacgttctgc tccatctgcc actacggctt ctaaacctgc caagcgtgtg 1500
cgtgtacgtg ccaggaagta a 1521
<210> 27
<211> 1515
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T5的DNA序列
<400> 27
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120
actgttggta atccatattt tagggttcct gcaggtggtg gcaataagca ggatattcct 180
aaggtttctg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240
ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300
ggagtggaaa ttggccgtgg tcagccttta ggtgttggcc ttagtgggca tccattttat 360
aataaattag atgacactga aagttcccat gccgccacgt ctaatgtttc tgaggacgtt 420
agggacaatg tgtctgtaga ttataagcag acacagttat gtattttggg ctgtgcccct 480
gctattgggg aacactgggc taaaggcact gcttgtaaat cgcgtccttt atcacagggc 540
gattgccccc ctttagaact taaaaacaca gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600
ggatatggtg ccatggactt tagtacattg caagatacta aatgtgaggt accattggat 660
atttgtcagt ctatttgtaa atatcctgat tatttacaaa tgtctgcaga tccttatggg 720
gattccatgt ttttttgctt acggcgtgag cagctttttg ctaggcattt ttggaataga 780
gcaggtacta tgggtgacac tgtgcctcaa tccttatata ttaaaggcac aggtatgcgt 840
gcttcacctg gcagctgtgt gtattctccc tctccaagtg gctctattgt tacctctgac 900
tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac agggtcataa caatggtgtt 960
tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca ctcgcagtac caatttaaca 1020
atatgcgcca gcacccagaa ccccgtgccc agcacctacg accccaccaa gttcaagcag 1080
tacagcaggc acgtggagga gtacgacctg cagttcatct tccagctgtg caccatcacc 1140
ctgaccgccg atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200
aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260
tctgttgcta ttgcctgtca aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 1320
aagttaaagt tttggaatgt ggatttaaag gaaaagtttt ctttagactt agatcaatat 1380
ccccttggac gtaaattttt ggttcaggct ggattgcgtc gcaagcccac cataggccct 1440
cgcaaacgtt ctgctccatc tgccactacg gcttctaaac ctgccaagcg tgtgcgtgta 1500
cgtgccagga agtaa 1515
<210> 28
<211> 1515
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T3-59S1的DNA序列
<400> 28
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120
actgttggta atccatattt caaggtgccc aagggcggca acggcaggca ggacgtgccc 180
aaggtgagcg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240
ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300
ggagtggaaa ttggccgtgg tcagccttta ggtgttggcc ttagtgggca tccattttat 360
aataaattag atgacactga aagttcccat gccgccacgt ctaatgtttc tgaggacgtt 420
agggacaatg tgtctgtaga ttataagcag acacagttat gtattttggg ctgtgccccc 480
gccatcggcg agcactgggc caagggcacc ctgtgcaagc ccgcccagct gcagcccggc 540
gactgccccc ccctggagct gaagaacacc gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600
ggatatggtg ccatggactt tagtacattg caagatacta aatgtgaggt accattggat 660
atttgtcagt ctatttgtaa atatcctgat tatttacaaa tgtctgcaga tccttatggg 720
gattccatgt ttttttgctt acggcgtgag cagctttttg ctaggcattt ttggaataga 780
gcaggtacta tgggtgacac tgtgcctcaa tccttatata ttaaaggcac aggtatgcgt 840
gcttcacctg gcagctgtgt gtattctccc tctccaagtg gctctattgt tacctctgac 900
tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac agggtcataa caatggtgtt 960
tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca ctcgcagtac caatttaaca 1020
atatgtgctt ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa atttaagcag 1080
tatagcagac atgttgagga atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact 1140
ttaactgcag atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200
aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260
tctgttgcta ttgcctgtca aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 1320
aagttaaagt tttggaatgt ggatttaaag gaaaagtttt ctttagactt agatcaatat 1380
ccccttggac gtaaattttt ggttcaggct ggattgcgtc gcaagcccac cataggccct 1440
cgcaaacgtt ctgctccatc tgccactacg gcttctaaac ctgccaagcg tgtgcgtgta 1500
cgtgccagga agtaa 1515
<210> 29
<211> 1515
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T3-59S2的DNA序列
<400> 29
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120
actgttggta atccatattt tagggttcct gcaggtggtg gcaataagca ggatattcct 180
aaggtttctg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240
ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300
ggcgtggaga tcggcagggg ccagcccctg ggcgtgggcc tgagcggcca ccccctgtac 360
aacaagctgg acgacaccga gaacagccac gtggccagcg ccgtggacac caaggacacc 420
agggacaacg tgagcgtgga ctacaagcag acccagctgt gcatcttggg ctgtgccccc 480
gccatcggcg agcactgggc caagggcacc ctgtgcaagc ccgcccagct gcagcccggc 540
gactgccccc ccctggagct gaagaacacc gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600
ggatatggtg ccatggactt tagtacattg caagatacta aatgtgaggt accattggat 660
atttgtcagt ctatttgtaa atatcctgat tatttacaaa tgtctgcaga tccttatggg 720
gattccatgt ttttttgctt acggcgtgag cagctttttg ctaggcattt ttggaataga 780
gcaggtacta tgggtgacac tgtgcctcaa tccttatata ttaaaggcac aggtatgcgt 840
gcttcacctg gcagctgtgt gtattctccc tctccaagtg gctctattgt tacctctgac 900
tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac agggtcataa caatggtgtt 960
tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca ctcgcagtac caatttaaca 1020
atatgtgctt ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa atttaagcag 1080
tatagcagac atgttgagga atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact 1140
ttaactgcag atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200
aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 编码H18N65-45T3-59S5的DNA序列
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<400> 37
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ttaactgcag atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200
aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260
tctgttgcta ttgcctgtca aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 1320
aagttaaagt tttggaatgt ggatttaaag gaaaagtttt ctttagactt agatcaatat 1380
ccccttggac gtaaattttt ggttcaggct ggattgcgtc gcaagcccac cataggccct 1440
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码H18N65-45T1T3-59S5的DNA序列
<400> 38
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ggggattcca tgtttttttg cttacggcgt gagcagcttt ttgctaggca tttttggaat 780
agagcaggta ctatgggtga cactgtgcct caatccttat atattaaagg cacaggtatg 840
cgtgcttcac ctggcagctg tgtgtattct ccctctccaa gtggctctat tgttacctct 900
gactcccagt tgtttaataa accatattgg ttacataagg cacagggtca taacaatggt 960
gtttgctggc ataatcaatt atttgttact gtggtagata ccactcgcag taccaattta 1020
acaatatgcg ccagcaccac cagcagcatc cccaacgtgt acacccccac cagcttcaag 1080
cagtatagca gacatgttga ggaatatgat ttgcagttta tttttcagtt gtgtactatt 1140
actttaactg cagatgttat gtcctatatt catagtatga atagcagtat tttagaggat 1200
tggaactttg gtgttccccc cccgccaact actagtttgg tggatacata tcgttttgta 1260
caatctgttg ctattgcctg tcaaaaggat gctgcaccgg ctgaaaataa ggatccctat 1320
gataagttaa agttttggaa tgtggattta aaggaaaagt tttctttaga cttagatcaa 1380
tatccccttg gacgtaaatt tttggttcag gctggattgc gtcgcaagcc caccataggc 1440
cctcgcaaac gttctgctcc atctgccact acggcttcta aacctgccaa gcgtgtgcgt 1500
gtacgtgcca ggaagtaa 1518
<210> 39
<211> 11
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 39
Val Pro Asn Gly Ala Gly Asn Lys Gln Ala Val
1 5 10
<210> 40
<211> 27
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 40
Ile Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu
1 5 10 15
Ser Ala His Ala Ala Thr Ala Val Ile Thr Gln
20 25
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 41
Leu Cys Lys Pro Ala Gln Leu Gln Pro
1 5
<210> 42
<211> 22
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 42
Val Met Gly Asp Thr Val Pro Thr Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Ser
1 5 10 15
Ala Asn Met Arg Glu Thr
20
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 59
<400> 43
Lys Val Pro Lys Gly Gly Asn Gly Arg Gln Asp Val
1 5 10
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 59
<400> 44
Thr Ser Ser Ile Pro Asn Val Tyr Thr Pro Thr Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 45
cagttacctg acccaaataa att 23
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 46
agtcacgtaa tcatcggtat 20
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 47
taaataccga tgattacgtg actaggacca gcatcttcta ccac 44
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 48
aatttatttg ggtcaggtaa ctgcaccctg aacaccctgt actgg 45
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 49
gcccctgcta ttggggaaca ctgggct 27
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 50
cactccagca caggcccaca ctaaac 26
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 51
gtgtgggcct gtgctggagt ggagatcggc aggggccag 39
<210> 52
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 52
cagtgttccc caatagcagg ggcgcagccc aggatgcaca gct 43
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 53
gttttggaag atggtgatat ggt 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 54
ggcacagccc aaaatacata act 23
<210> 55
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 55
agttatgtat tttgggctgt gcccccgcca tcggcgagca ctggg 45
<210> 56
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 56
accatatcac catcttccaa aacggtgttc ttcagctcca gggg 44
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 57
gttacctctg actcccagtt gtt 23
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 58
tccagtatct accatatcac catctt 26
<210> 59
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 59
gatggtgata tggtagatac tggatacggc gccatggact tcagcac 47
<210> 60
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 60
aacaactggg agtcagaggt aacgatgctg ccgctggggc tggggct 47
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 61
gatgttatgt cctatattca t 21
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 62
tattgttaaa ttggtactgc gag 23
<210> 63
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 63
ctcgcagtac caatttaaca atatgcgcca gcacccagaa ccccg 45
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 64
ctatgaatat aggacataac atcggcggtc agggtgatgg tgcac 45
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 65
gcataccaat atagagtatt tag 23
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 66
atatggatta ccaacagtta ataat 25
<210> 67
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 67
tattaactgt tggtaatcca tatttcaagg tgcccaaggg cggc 44
<210> 68
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 68
cctaaatact ctatattggt atgcgctcac cttgggcacg tcctgc 46
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 69
ttgggctgtg cccccgccat cgg 23
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 70
agcacaggcc cacactaaac gttgt 25
<210> 71
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 71
caacgtttag tgtgggcctg tgctggcgtg gagatcggca ggggc 45
<210> 72
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 72
gccgatggcg ggggcacagc ccaagatgca cagctgggtc tgcttgt 47
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 73
ggctctattg ttacctctga ctc 23
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 74
aagctgctca cgccgtaagc aaaaa 25
<210> 75
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 75
tgcttacggc gtgagcagct tttcgccagg cacttctgga acag 44
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 76
ggagtcagag gtaacaatag agccgctggg gctggggctg tacaggt 47
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 77
cagtatagca gacatgttga gg 22
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 78
tattgttaaa ttggtactgc gag 23
<210> 79
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 79
actcgcagta ccaatttaac aatatgcgcc agcaccacca gcagcat 47
<210> 80
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 80
ttcctcaaca tgtctgctat actgcttgaa gctggtgggg gtgt 44
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 81
gcataccaat atagagtatt tag 23
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 82
attaccaaca gttaataatc tagagc 26
<210> 83
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 83
gattattaac tgttggtaat ccctacttca aggtgcccaa gggcgg 46
<210> 84
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 84
atttgggtca ggtaactgca ccctgaacac cctgtactgg taggcgc 47
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 85
ttatgtattt tgggctgtgc ccctg 25
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 86
agcacaggcc cacactaaac gtt 23
<210> 87
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 87
gtttagtgtg ggcctgtgct ggcgtggaga tcggcagggg ccagccc 47
<210> 88
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 88
gcaggggcac agcccaaaat acataactgg gtctgcttgt agtccac 47
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 89
aaaaacacag ttttggaaga tggtg 25
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 90
ggcacagccc aaaatacata act 23
<210> 91
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 91
ttatgtattt tgggctgtgc ccccgccatc ggcgagcact ggac 44
<210> 92
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 92
accatcttcc aaaactgtgt ttttcagctc cagggggggg cagtcgc 47
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 93
cagtatagca gacatgttga gg 22
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 94
tattgttaaa ttggtactgc ggtggt 26
<210> 95
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 95
cagtaccaat ttaacaatat gcgccagcac caccagcagc atcccc 46
<210> 96
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 96
atattcctca acatgtctgc tatactgctt gaagctggtg ggggtgt 47
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 97
cagtatagca gacatgttga gg 22
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 98
tattgttaaa ttggtactgc gag 23
<210> 99
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 99
actcgcagta ccaatttaac aatatgcgcc agcaccacca gcagcat 47
<210> 100
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 100
ttcctcaaca tgtctgctat actgcttgaa gctggtgggg gtgt 44
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 101
cagtatagca gacatgttga gg 22
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 102
tattgttaaa ttggtactgc gag 23
<210> 103
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 103
actcgcagta ccaatttaac aatatgcgcc agcaccacca gcagcat 47
<210> 104
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 104
ttcctcaaca tgtctgctat actgcttgaa gctggtgggg gtgt 44
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 105
cagttacctg acccaaataa att 23
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 106
agtcacgtaa tcatcggtat 20
<210> 107
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 107
taaataccga tgattacgtg actaggacca gcatcttcta ccac 44
<210> 108
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 108
aatttatttg ggtcaggtaa ctgcaccctg aacaccctgt actgg 45
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 109
Asn Pro Val Pro Ser Thr Tyr Asp Pro
1 5
<210> 110
<211> 22
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 59
<400> 110
Leu Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ser His Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Val Asp Thr Lys Asp Thr
20
<210> 111
<211> 27
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 59
<400> 111
Ser Gly Thr Met Gly Asp Gln Leu Pro Glu Ser Leu Tyr Ile Lys Gly
1 5 10 15
Thr Asp Ile Arg Ala Asn Pro Gly Ser Tyr Leu
20 25
<210> 112
<211> 12
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 59
<400> 112
Thr Lys Gly Thr Ala Cys Lys Pro Thr Thr Val Val
1 5 10
<210> 113
<211> 504
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 113
Met Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr
20 25 30
His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg
35 40 45
Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala
50 55 60
Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe
65 70 75 80
Gly Leu Pro Asp Thr Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val
85 90 95
Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val
100 105 110
Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser
115 120 125
Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val
130 135 140
Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro
145 150 155 160
Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro
165 170 175
Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu
180 185 190
Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser
195 200 205
Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser
210 215 220
Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His
245 250 255
Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu
260 265 270
Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr
275 280 285
Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe
290 295 300
Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Val
305 310 315 320
Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser
325 330 335
Thr Asn Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln
340 345 350
Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr
355 360 365
Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp
370 375 380
Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp
385 390 395 400
Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val Asp Thr Tyr
405 410 415
Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Ala Cys Gln Lys Asp Ala Ala Pro
420 425 430
Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp
435 440 445
Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg
450 455 460
Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro
465 470 475 480
Arg Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Ser Lys Pro Ala Lys
485 490 495
Arg Val Arg Val Arg Ala Arg Lys
500
<210> 114
<211> 1515
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 18
<400> 114
atgcggccta gtgacaatac cgtatatctt ccacctcctt ctgtggcaag agttgtaaat 60
accgatgatt acgtgactcg cacaagcata ttttatcatg ctggcagctc tagattatta 120
actgttggta atccatattt tagggttcct gcaggtggtg gcaataagca ggatattcct 180
aaggtttctg cataccaata tagagtattt agggtgcagt tacctgaccc aaataaattt 240
ggtttacctg atactagtat ttataatcct gaaacacaac gtttagtgtg ggcctgtgct 300
ggagtggaaa ttggccgtgg tcagccttta ggtgttggcc ttagtgggca tccattttat 360
aataaattag atgacactga aagttcccat gccgccacgt ctaatgtttc tgaggacgtt 420
agggacaatg tgtctgtaga ttataagcag acacagttat gtattttggg ctgtgcccct 480
gctattgggg aacactgggc taaaggcact gcttgtaaat cgcgtccttt atcacagggc 540
gattgccccc ctttagaact taaaaacaca gttttggaag atggtgatat ggtagatact 600
ggatatggtg ccatggactt tagtacattg caagatacta aatgtgaggt accattggat 660
atttgtcagt ctatttgtaa atatcctgat tatttacaaa tgtctgcaga tccttatggg 720
gattccatgt ttttttgctt acggcgtgag cagctttttg ctaggcattt ttggaataga 780
gcaggtacta tgggtgacac tgtgcctcaa tccttatata ttaaaggcac aggtatgcgt 840
gcttcacctg gcagctgtgt gtattctccc tctccaagtg gctctattgt tacctctgac 900
tcccagttgt ttaataaacc atattggtta cataaggcac agggtcataa caatggtgtt 960
tgctggcata atcaattatt tgttactgtg gtagatacca ctcgcagtac caatttaaca 1020
atatgtgctt ctacacagtc tcctgtacct gggcaatatg atgctaccaa atttaagcag 1080
tatagcagac atgttgagga atatgatttg cagtttattt ttcagttgtg tactattact 1140
ttaactgcag atgttatgtc ctatattcat agtatgaata gcagtatttt agaggattgg 1200
aactttggtg ttcccccccc gccaactact agtttggtgg atacatatcg ttttgtacaa 1260
tctgttgcta ttgcctgtca aaaggatgct gcaccggctg aaaataagga tccctatgat 1320
aagttaaagt tttggaatgt ggatttaaag gaaaagtttt ctttagactt agatcaatat 1380
ccccttggac gtaaattttt ggttcaggct ggattgcgtc gcaagcccac cataggccct 1440
cgcaaacgtt ctgctccatc tgccactacg gcttctaaac ctgccaagcg tgtgcgtgta 1500
cgtgccagga agtaa 1515
<210> 115
<211> 513
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 115
Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro
1 5 10 15
Ser Val Ala Arg Val Val Ser Thr Asp Asp Tyr Val Ser Arg Thr Ser
20 25 30
Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro
35 40 45
Tyr Phe Arg Val Val Pro Asn Gly Ala Gly Asn Lys Gln Ala Val Pro
50 55 60
Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Ala Leu Pro Asp
65 70 75 80
Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Glu Thr
85 90 95
Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Met Glu Ile Gly Arg Gly Gln
100 105 110
Pro Leu Gly Ile Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp
115 120 125
Asp Thr Glu Ser Ala His Ala Ala Thr Ala Val Ile Thr Gln Asp Val
130 135 140
Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu
145 150 155 160
Gly Cys Val Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Leu Cys
165 170 175
Lys Pro Ala Gln Leu Gln Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys
180 185 190
Asn Thr Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala
195 200 205
Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp
210 215 220
Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala
225 230 235 240
Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu
245 250 255
Phe Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Val Met Gly Asp Thr Val
260 265 270
Pro Thr Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Ser Ala Asn Met Arg Glu Thr
275 280 285
Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Ile Thr
290 295 300
Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln
305 310 315 320
Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val
325 330 335
Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Leu Cys Ala Ser Thr Gln
340 345 350
Asn Pro Val Pro Ser Thr Tyr Asp Pro Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser
355 360 365
Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr
370 375 380
Ile Thr Leu Thr Ala Glu Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser
385 390 395 400
Ser Ile Leu Glu Asn Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr
405 410 415
Ser Leu Val Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Val Thr Cys
420 425 430
Gln Lys Asp Thr Thr Pro Pro Glu Lys Gln Asp Pro Tyr Asp Lys Leu
435 440 445
Lys Phe Trp Thr Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser Asp Leu Asp
450 455 460
Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Pro Thr Ile Gly Pro Arg Lys Arg Pro Ala Ala Ser Thr Ser Thr
485 490 495
Ala Ser Thr Ala Ser Arg Pro Ala Lys Arg Val Arg Ile Arg Ser Lys
500 505 510
Lys
<210> 116
<211> 1542
<212> DNA
<213> Human papillomavirus type 45
<400> 116
atggccctgt ggaggcccag cgacagcacc gtgtacctgc ccccccccag cgtggccagg 60
gtggtgagca ccgacgacta cgtgagcagg accagcatct tctaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctga ccgtgggcaa cccctacttc agggtggtgc ccaacggcgc cggcaacaag 180
caggccgtgc ccaaggtgag cgcctaccag tacagggtgt tcagggtggc cctgcccgac 240
cccaacaagt tcggcctgcc cgacagcacc atctacaacc ccgagaccca gaggctggtg 300
tgggcctgcg tgggcatgga gatcggcagg ggccagcccc tgggcatcgg cctgagcggc 360
caccccttct acaacaagct ggacgacacc gagagcgccc acgccgccac cgccgtgatc 420
acccaggacg tgagggacaa cgtgagcgtg gactacaagc agacccagct gtgcatcctg 480
ggctgcgtgc ccgccatcgg cgagcactgg gccaagggca ccctgtgcaa gcccgcccag 540
ctgcagcccg gcgactgccc ccccctggag ctgaagaaca ccatcatcga ggacggcgac 600
atggtggaca ccggctacgg cgccatggac ttcagcaccc tgcaggacac caagtgcgag 660
gtgcccctgg acatctgcca gagcatctgc aagtaccccg actacctgca gatgagcgcc 720
gacccctacg gcgacagcat gttcttctgc ctgaggaggg agcagctgtt cgccaggcac 780
ttctggaaca gggccggcgt gatgggcgac accgtgccca ccgacctgta catcaagggc 840
accagcgcca acatgaggga gacccccggc agctgcgtgt acagccccag ccccagcggc 900
agcatcatca ccagcgacag ccagctgttc aacaagccct actggctgca caaggcccag 960
ggccacaaca acggcatctg ctggcacaac cagctgttcg tgaccgtggt ggacaccacc 1020
aggagcacca acctgaccct gtgcgccagc acccagaacc ccgtgcccag cacctacgac 1080
cccaccaagt tcaagcagta cagcaggcac gtggaggagt acgacctgca gttcatcttc 1140
cagctgtgca ccatcaccct gaccgccgag gtgatgagct acatccacag catgaacagc 1200
agcatcctgg agaactggaa cttcggcgtg cccccccccc ccaccaccag cctggtggac 1260
acctacaggt tcgtgcagag cgtggccgtg acctgccaga aggacaccac cccccccgag 1320
aagcaggacc cctacgacaa gctgaagttc tggaccgtgg acctgaagga gaagttcagc 1380
agcgacctgg accagtaccc cctgggcagg aagttcctgg tgcaggccgg cctgaggagg 1440
aggcccacca tcggccccag gaagaggccc gccgccagca ccagcaccgc cagcaccgcc 1500
agcaggcccg ccaagagggt gaggatcagg agcaagaagt ga 1542

Claims (12)

1.一种突变的HPV18 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV18 L1蛋白与野生型HPV18L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)N端截短了40-80个氨基酸，例如40-50个、45-70个、50-70个、55-65个、60-70个、65-75个、60-80个或70-80个氨基酸；和
(2)(a)位于野生型HPV18 L1蛋白第235-243位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(b)位于野生型HPV18 L1蛋白第327-346位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(c)位于野生型HPV18 L1蛋白第114-123位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(d)位于野生型HPV18 L1蛋白第176-202位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
并且，所述变体与所述突变的HPV18 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV18 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV18和HPV45，或者HPV18、HPV45和HPV59)的中和抗体；
优选地，所述突变的HPV18 L1蛋白具有(2)(a)或(2)(b)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(3)位于野生型HPV18 L1蛋白第112-123位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
优选地，所述突变的HPV18 L1蛋白具有(2)(c)或(2)(d)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(4)位于野生型HPV18 L1蛋白第410-421位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
优选地，所述突变的HPV18 L1蛋白具有(2)(c)和(2)(a)所定义的突变，并且任选地，还具有(4)所定义的突变；
优选地，所述突变的HPV18 L1蛋白与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了45、50、52、55、58、60、62、65、68、70、72、75或78个氨基酸；
优选地，所述突变的HPV18 L1蛋白与野生型HPV18 L1蛋白相比，N端截短了65个氨基酸；
优选地，所述第二型别的野生型HPV为HPV45；优选地，(2)(a)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第201-209位的氨基酸残基；优选地，(2)(b)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第293-314位的氨基酸残基；优选地，(2)(c)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第79-89位的氨基酸残基；优选地，(2)(d)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV45 L1蛋白第142-168位的氨基酸残基；
优选地，所述第三型别的野生型HPV为HPV59；优选地，(3)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV59 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基；优选地，(4)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV59 L1蛋白第349-360位的氨基酸残基；
优选地，所述野生型HPV18 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1或113所示的氨基酸序列；
优选地，所述野生型HPV45 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2或115所示的氨基酸序列；
优选地，所述野生型HPV59 L1蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述突变的HPV18 L1蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、7、9、13、17、18或19。
2.一种分离的核酸，其编码权利要求1所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体，
优选地，所述分离的核酸具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:25、26、28、32、36、37和38。
3.包含权利要求2所述的分离的核酸的载体。
4.包含权利要求2所述的分离的核酸和/或权利要求3所述的载体的宿主细胞。
5.一种HPV病毒样颗粒，其含有权利要求1所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体，或者由权利要求1所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体组成或形成。
6.一种组合物，其包含权利要求1所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体，或权利要求2的分离的核酸，或权利要求3的载体，或权利要求4的宿主细胞，或权利要求5的HPV病毒样颗粒。
7.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求5的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂，
优选地，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在；
优选地，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)；
优选地，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
8.制备权利要求1所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体；
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌；
优选地，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体；优选地，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV18 L1蛋白或其变体。
9.一种制备疫苗的方法，其包括将权利要求5的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
10.一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的权利要求5的HPV病毒样颗粒或权利要求7的药物组合物或疫苗施用给受试者，
优选地，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)；
优选地，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
11.权利要求1所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体或权利要求5的HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病，
优选地，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)；
优选地，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
12.权利要求1所述的突变的HPV18 L1蛋白或其变体或权利要求5的HPV病毒样颗粒，其用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病，
优选地，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV18感染、HPV45感染和/或HPV59感染)；
优选地，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
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