JP6920694B2 - ヒトパピローマウイルスタイプ11のl1タンパク質の突然変異 - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも部分的には、本発明者らの驚くべき発見に基づいている:ヒトパピローマウイルス(HPV)タイプ11のL1タンパク質の特定のセグメントを第2のHPVタイプ(HPV6など)のL1タンパク質の対応するセグメントで置換した後、このようにして得られた突然変異型HPV11 L1タンパク質は、生物におけるHPV11及び第2のHPV型(例えばHPV6)に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、HPV11 VLP及び第2のHPVタイプのVLPの混合物のものに匹敵し、HPV11に対するその保護効果は、HPV11 VLP単独のものに匹敵し、第2のHPVタイプ(HPV6など)に対するその保護効果は、第2のHPVタイプ単独のVLPのものに匹敵する。
(1)3〜6アミノ酸、例えば3、4、5又は6アミノ酸のN末端切断;及び
(2)(a)第2のタイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV11 L1タンパク質の170〜179位のアミノ酸残基の置換;又は
(b)第2のタイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型のHPV11 L1タンパク質の346〜351位のアミノ酸残基の置換;又は
(c)第2のタイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV11 L1タンパク質の119〜140位のアミノ酸残基の置換;
ならびに、改変体は、1つ又は複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8又は9個)のアミノ酸の置換(好ましくは保存的置換)、付加又は欠失のみによる突然変異型HPV11 L1タンパク質とは異なるが、突然変異型HPV11 L1タンパク質の機能、すなわち少なくとも2つのHPVタイプ(例えば、HPV11及びHPV6)に対する中和抗体の生成を誘導する能力を保持する。
本発明において、他に特定しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されているルーチン操作である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義及び説明は以下のように提供される。
研究は、HPV11と他のHPVタイプ(HPV6など)との間に一定の交差防御があるが、そのような交差防御は非常に低く、一般的に、同HPVタイプのVLPの保護レベルの1%より低く、さらには1000分の1、さらには1000分の1であることを示す。したがって、HPV11ワクチンでワクチン接種された対象は、他のHPVタイプ(HPV6など)に感染するリスクがなおも高い。
本発明に関与する配列のいくつかを以下の表1に提供する。
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KQCTNTPVQA
TTSSTY
FLNKYDDVENSGSGGNPGQDN
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明されるが、これらの実施例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明する目的でのみ使用される。
発現ベクターの構築
HPV6 L1タンパク質由来の特定のセグメントを含む突然変異型HPV11 L1タンパク質(H11N4−6T1)をコードする発現ベクターは、マルチサイト突然変異誘発のためのPCRによって構築した。使用した初期鋳型は、プラスミドpTO−T7−HPV11N4C(N末端で切断された4アミノ酸を有するHPV11 L1タンパク質をコードする;表2に11L1N4と略記する)であった。各PCRの鋳型及びプライマーを表2に示し、PCRの増幅条件を以下のようにした:94℃で10分間の変性;25サイクル(94℃で50秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、72℃で7.5分間の伸長);最後に72℃で10分間伸長する。使用したPCRプライマーの配列を表3に列挙した。
組換えプラスミドpTO−T7−H11N4−6T1、pTO−T7−H11N4−6T2、pTO−T7−H11N4−6T3、pTO−T7−H11N4−6T4、及びpTO−T7−H11N4−6T5をそれぞれ含む大腸菌を−70℃の冷蔵庫から取り出し、カナマイシンを含有する100mLのLB液体培地に播種し、200rpm及び37℃で約8時間インキュベートした。次に、培養物をカナマイシンを含む500mLのLB培地に移し(1mlの細菌溶液を移した)、さらにインキュベートした。細菌の濃度が約0.6のOD600に達したとき、培養温度を25℃に下げ、各培養ボトルに500μLのIPTGを添加した。インキュベーションをさらに8時間行った。インキュベーションが終了した後、細菌を遠心分離によって回収した。H11N4−6T1、H11N4−6T2、H11N4−6T3、H11N4−6T4及びH11N4−6T5タンパク質を発現する細菌をそれぞれ得た。
得られた細菌は、1gの細菌1g/10mLの溶解緩衝液(20mM Tris緩衝液、pH7.2、300mM NaCl)の比で再懸濁された。細菌は、超音波装置を用いて30分間破砕された。破砕された細菌を含む溶解溶液を13500rpm(30000g)で15分間遠心分離し、上清(すなわち、破砕された細菌の上清)を得た。
装置:GE Healthcare(すなわち、元のAmershan Pharmacia Co.)によって製造されたAKTA Explorer 100分取液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー媒体:SP Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare Co.)、CHT−II(Bio−RADから購入)及びButyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare Co.)
緩衝液:20mMリン酸緩衝液、pH8.0、20mM DTT;20mMリン酸緩衝液、pH8.0、20mM DTT、2M NaCl
試料:上記で得られたそれぞれH11N4−6T1、H11N4−6T2、H11N4−6T3、H11N4−6T4及びH11N4−6T5を含む破砕された細菌の上清。
(1)SP Sepharose 4 Fast Flowによる破砕した細菌の上清の陽イオン交換精製:試料をカラムに装填し、次に、400mM NaClを含む緩衝液で不要なタンパク質を溶出し、続いて、800mM NaClを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出した。800mM NaClを含む緩衝液で溶出された画分を回収した;
(2)CHT−II(ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー)による、工程(1)で得られた溶出画分のクロマトグラフィーによる精製:工程(1)で得られた溶出画分は、NaCl濃度が0.5Mになるように希釈されるように希釈され;試料をカラムに装填し、500mMのNaClを含む緩衝液で溶出した後、1000mMのNaClを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、1000mMのNaClを含む緩衝液で溶出した画分を回収した;
(3)HIC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)による、工程(2)で得られた溶出画分の精製:試料をカラムに装填し、次に、不要なタンパク質を1000mM NaClを含む緩衝液で溶出した後、200mMのNaClを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、200mMのNaClを含む緩衝液で溶出された画分を回収した。
HPBウイルス様粒子のアセンブリ
所定体積(約2ml)のタンパク質H11N4−6T1、H11N4−6T2、H11N4−6T3、H11N4−6T4又はH11N4−6T5は、(1)2L保存緩衝液(20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、0.5M NaCl);(2)2L再生緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0、2mM CaCl2、2mM MgCl2、0.5M NaCl);及び(3)20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、0.5M NaClに対して連続的に透析した。透析は3つの緩衝液のそれぞれで12時間行った。
透析した試料を、1120コンパクトLC高速液体クロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies)によるモレキュラーシーブクロマトグラフィー分析に供し、分析カラムは、TSK Gel PW5000xl 7.8x300mmであった。分析結果を図2A〜2Fに示した。結果は、タンパク質H11N4−6T1、H11N4−6T2、H11N4−6T3、H11N4−6T4及びH11N4−6T5をそれぞれ含む試料の最初のタンパク質ピークは約12分で現れたことを、これはHPV11N4 VLPのそれに匹敵することを示した。これは、上記で調製したタンパク質がVLPにアセンブルすることができたことを示した。
沈降速度分析のための装置は、光学検査システム及びAn−50Ti及びAn−60Tiローターを備えたBeckman XL−A Analytical Ultracentrifugeであった。HPV11N4 VLP、H11N4−6T1 VLP、H11N4−6T2 VLP、H11N4−6T3 VLP、H11N4−6T4 VLP及びH11N4−6T5 VLPの沈降係数を沈降速度法により分析した。結果を図3A〜3Fに示した。結果は、H11N4−6T1 VLP、H11N4−6T2 VLP、H11N4−6T3 VLP、H11N4−6T4 VLP及びH11N4−6T5 VLPの沈降係数はそれぞれ140S、138S、111S、139S及び139Sであることを示した。これは、5つの突然変異型HPV11 L1タンパク質が、サイズ及び形態に関して野生型VLP(HPV11N4 VLP、136.3S)に類似したウイルス様粒子にアセンブルすることができることを示した。
VLPを含む試料100μLを透過型電子顕微鏡(TEM)で観察した。使用した装置は、JEOL Ltd.によって供給された100kV透過電子顕微鏡(倍率100,000倍)であった。要するに、13.5μLの試料を2%リンタングステン酸(pH7.0)で陰性に染色し、炭素被覆した銅グリッドに固定し、次いでTEMで観察した。結果を図4A〜4Fに示した。結果は、H11N4−6T1、H11N4−6T2、H11N4−6T3、H11N4−6T4及びH11N4−6T5がウイルス様粒子にアセンブルし得ることを示した。さらに、これらの結果はまた、これらの突然変異型タンパク質によってアセンブルした粒子が約25nmの半径を有し、サイズが均一であることを示した。これは、これらの突然変異型タンパク質がHPV11 L1タンパク質(HPV11N4 VLP)に類似しており、均一なサイズのVLPにアセンブルすることができたことを示した。
HPV11N4、H11N4−6T1、H11N4−6T2、H11N4−6T3、H11N4−6T4及びH11N4−6T5により形成されたVLPは、GE Company(すなわち、もともとはMicroCal Co.)から購入した示差走査熱量計VPキャピラリーDSCを用いてそれらの熱安定性について評価した。タンパク質の保存緩衝液を対照として使用し、タンパク質を10℃〜90℃の温度範囲内で1.5℃/分の加熱速度で走査した。検出結果を図5A〜5Fに示した。結果は、タンパク質によって形成されたこれらのVLPのすべてが非常に高い熱安定性を有することを示した。
以前に報告された方法(Wolf M, Garcea RL, Grigorieff N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2010), 107(14): 6298-303)に従って、H11N4−6T3 VLP及びH11N4−6T5 VLPの3次元構造は、低温電子顕微鏡法(cryoEM)を用いて再構築された。簡単に述べると、低温電子顕微鏡(cryoEM)を用いて、H11N4−6T3 VLP及びH11N4−6T5 VLPを観察し、次に、H11N4−6T3 VLP及びH11N4−6T5 VLPの低温電子顕微鏡(cryoEM)写真(図6A及び6C)では、コンピュータの重なり及び構造の再構成のために、均一なサイズ及び50nmより大きい直径を有する、それぞれ300個の粒子及び360個の粒子を選択し、H11N4−6T3 VLP及びH11N4−6T5 VLPの三次元構造を得た。得られた三次元構造を図6B及び6D(それぞれ17.38Å及び20.48Åの解像度にて)に示した。結果は、H11N4−6T3 VLP及びH11N4−6T5 VLPの両方が、72個のキャプソマー(形態学的サブユニット、ペンタマー)からなるT=7の二十面体構造(h=1、k=2)を有することを示した。準同値原理に一致する従来の二十面体ウイルスキャプシドとは異なり、H11N4−6T3 VLP及びH11N4−6T5 VLPの構造における構成的サブユニットはすべて、六量体を含まず、五量体であった。さらに、前記VLPは、約60nmの外径を有していた。これらは、以前報告された天然のHPVウイルス粒子及び真核生物発現系によって調製されたHPV VLP(例えば、ポックスウイルス発現系)の三次元構造と同様であった(Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7)。
H11N4−6T1、H11N4−6T2、H11N4−6T3、H11N4−6T4及びH11N4−6T5によって形成されたVLPの免疫防御をマウスで評価した。ワクチン接種のための動物は、5〜6週齢のBALB/cマウス(正常な等級)(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.LTDから購入)であった。
この実験において、ワクチン接種スケジュールを表5に示した。全てのマウス(6週齢のBalB/c雌性マウス)を3群に分けた:アルミニウムアジュバントグループ1(10μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する)、アルミニウムアジュバントグループ2(1μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する)、アルミニウムアジュバントグループ3(0.1μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する)。各グループをさらに5つのサブグループに分けた。対照サブグループ1〜3は、それぞれHPV11N4 VLP単独、HPV6N5 VLP単独、及び混合したHPV11/HPV6 VLPでワクチン接種され、実験サブグループ1〜2は、H11N4−6T3 VLP及びH11N4−6T5 VLPでそれぞれワクチン接種された。
6週齢のBalB/c雌性マウス(8匹のマウス)に単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントを接種した。実験群にH11N4−6T3 VLP又はH11N4−6T5 VLP(0.300μg、0.100μg、0.033μg又は0.011μgの免疫化用量で)を用いた。対照群にHPV6N5 VLP単独又はHPV11N4 VLP単独(0.300μg、0.100μg、0.033μg又は0.011μgの免疫化用量で)、又は混合したHPV11/HPV6 VLP(すなわち、HPV6N5 VLPとHPV11N4 VLPの混合物)、各VLPについて免疫化用量は0.300μg、0.100μg、0.033μg又は0.011μgであった)を用いた。免疫容量は1mLであった。さらに、ワクチンを希釈するための希釈剤をブランク対照として使用した。8匹のマススを各グループにおいてワクチン接種し、ワクチン接種から5週後に血清を回収した。その後、血清の中和抗体力価を中和化試験によって、及びReed−Muench法(Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7)によって決定し、セロコンバージョンを誘導する(すなわち、マウスにおける抗体の生成を誘導する)ためのED50を各試料について計算した。結果を表6.1〜6.5に示す。
同体重のカニクイザル18匹を無作為に3グループ(各グループあたり6匹のサル)に分け、グループ1のサルに5μgのH11N4−6T3 VLPをワクチン接種した。グループ2のサルに、5μgのH11N4−6T5 VLPをワクチン接種した;グループ3のサルに10μgの混合したHPV11/HPV6 VLP(5μgのHPV6N5 VLP+5μgのHPV11N4 VLP)をワクチン接種した。使用したアジュバントはアルミニウムアジュバントであり、注入量は1mlであり、サルは筋肉内注射によってワクチン接種された。ワクチン接種スケジュールを表7に示した。
Claims (17)
- 突然変異型HPV11 L1タンパク質であって、野生型HPV11 L1タンパク質と比較すると、突然変異型HPV11 L1タンパク質は、以下の突然変異を有する:
(1)3、4、5又は6アミノ酸のN末端切断;そして
(2)(a)野生型HPV6のL1タンパク質の対応する位置の全てのアミノ酸残基による、野生型HPV11 L1タンパク質の346〜351位のアミノ酸残基の置換;又は
(b)野生型HPV6のL1タンパク質の対応する位置の全てのアミノ酸残基による、野生型HPV11 L1タンパク質の119〜140位のアミノ酸残基の置換;
を有する、上記突然変異型HPV11 L1タンパク質。 - (2)(a)に記載の対応する位置のアミノ酸残基が、野生型HPV6 L1タンパク質の345〜350位のアミノ酸残基であり;及び/又は、(2)(a)に記載の対応する位置のアミノ酸残基が、野生型HPV6 L1タンパク質の119〜139位のアミノ酸残基である、請求項1に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質。
- 野生型HPV11 L1タンパク質が、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し;及び/又は、野生型HPV6 L1タンパク質が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質。
- 突然変異型HPV11 L1タンパク質が、配列番号6及び9からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質をコードする単離された核酸。
- 請求項5に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 請求項5に記載の単離された核酸及び/又は請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質を含む又はそれからなるHPVウイルス様粒子。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質、又は請求項5に記載の単離された核酸、又は請求項6に記載のベクター、又は請求項7に記載の宿主細胞、又は請求項8に記載のHPVウイルス様粒子を含む組成物。
- 請求項8に記載のHPVウイルス様粒子、及び場合により医薬として許容される担体及び/又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチン。
- HPVウイルス様粒子が、HPV感染又はHPV感染によって引き起こされる疾患の予防に有効な量で存在する、請求項10に記載の医薬組成物又はワクチン。
- HPV感染が、HPV11感染及び/又はHPV6感染であり;及び/又は、HPV感染によって引き起こされる疾患が、子宮頸癌及び尖圭コンジロームからなる群から選択される、請求項10又は11に記載の医薬組成物又はワクチン。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質を調製する方法であって、該方法は、突然変異型HPV11 L1タンパク質を宿主細胞で発現させ、次に、突然変異型HPV11 L1タンパク質を宿主細胞の培養物から回収することを含む、上記方法。
- 宿主細胞が大腸菌である、請求項13に記載の方法。
- 請求項8に記載のHPVウイルス様粒子を医薬として許容される担体及び/又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製する方法。
- HPV感染又はHPV感染によって引き起こされる疾患に使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質、又は請求項8に記載のHPVウイルス様粒子。
- HPV感染が、HPV11感染及び/又はHPV6感染であり;及び/又は、HPV感染によって引き起こされる疾患が、子宮頸癌及び尖圭コンジロームからなる群から選択される、請求項16に記載の突然変異型HPV11 L1タンパク質。
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