KR20180084139A - 11형 인유두종 바이러스 엘1 단백질의 돌연변이체 - Google Patents

11형 인유두종 바이러스 엘1 단백질의 돌연변이체 Download PDF

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Abstract

돌연변이된 HPV11 L1 단백질(또는 그의 변체), 그의 암호화 서열 및 제조 방법, 및 상기를 포함하는 바이러스유사 입자를 개시하며, 여기에서 상기 단백질(또는 그의 변체) 및 상기 바이러스유사 입자는 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV11 및 HPV6)에 대한 중화 항체를 유도할 수 있고 따라서 이들을 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마의 예방에 사용할 수 있다. 또한 약학 조성물 또는 백신의 제조를 위한 상기-언급된 단백질 및 바이러스유사 입자의 용도를 개시한다. 상기 약학 조성물 또는 백신을 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하는데 사용할 수 있다.

Description

11형 인유두종 바이러스 엘1 단백질의 돌연변이체
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 돌연변이된 HPV11 L1 단백질(또는 그의 변체), 상기를 암호화하는 서열, 그의 제조 방법, 및 상기를 포함하는 바이러스유사 입자에 관한 것이며, 여기에서 상기 단백질(또는 그의 변체) 및 상기 바이러스유사 입자는 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV11 및 HPV6)에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고 따라서 이들을 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마의 예방에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하기 위한 약학 조성물 또는 백신의 제조에서 상기 단백질 및 상기 바이러스유사 입자의 용도에 관한 것이다.
인유두종 바이러스(HPV)는 주로 피부 및 점막에 사마귀를 유발시킨다. HPV 유형은 종양형성과의 관련성에 따라 고위험 유형 및 저위험 유형으로 분류된다. 이 중에서, 고위험 HPV 유형에 의한 감염은 여성에서 자궁경부암을 포함한 음부암의 선두 원인인 것으로 입증되었으며; 저위험 HPV 유형은 주로 첨형 콘딜로마를 유발시킨다. HPV 감염의 예방 및 억제에 가장 유효한 방법은 HPV 백신, 특히 자궁경부암을 일으키는 고위험 HPV 유형에 대한 백신을 접종하는 것이다.
HPV의 주요 캡시드 단백질 L1은 중공 바이러스유사 입자(VLP)로 자가-조립하는 특성을 갖는다. HPV VLP는 주요 캡시드 단백질 L1의 72개 오량체로 구성된 대칭적인 20면체 구조를 갖는다(Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9). HPV VLP는 구조에 대해서 천연 HPV와 고도로 유사하고, 천연 바이러스의 중화 에피토프의 대부분을 유지하며, 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있다(Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4).
그러나, 기존의 연구들은 HPV VLP가 주로 동일한 HPV 유형에 대한 중화 항체의 생성을 유도하고, 동일한 HPV 유형에 대한 보호 면역성을 생성시키며, 소수의 고도로 상동성인 HPV 유형들간에 단지 낮은 교차-보호 효과를 가짐을 보인다(Sara L. Bissett, Giada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555). 따라서, 기존의 HPV 백신들은 매우 제한된 보호 범위를 갖는다. 일반적으로, 하나의 HPV 유형의 VLP는 단지 동일한 HPV 유형에 의한 감염의 예방에만 사용될 수 있다. 이 경우에, HPV 백신의 보호 범위를 확장시킬 필요가 있는 경우, 유일한 방법은 백신 중에 보다 많은 HPV 유형의 VLP를 부가하는 것이다. 현재, 상업적으로 입수할 수 있는 HPV 백신, 예를 들어 가르다실(Gardasil)(등록상표)(머크(Merck))(HPV16, 18, 6 및 11에 대한 4가 백신이다), 세르바릭스(Cervarix)(등록상표)(GSK)(HPV16 및 18에 대한 2가 백신이다), 및 가르다실(등록상표)9(머크)(9-가 백신이다)이 다수의 HPV 유형의 VLP들을 병용하여 제조된다. 그러나, 상기와 같은 해법은 HPV 백신의 생산비용을 크게 증가시킬 것이며, 면역화 용량의 증가로 인해 안전성 문제를 일으킬 수도 있다.
따라서, 당해 분야에서는 다수의 HPV 유형에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하기 위해, 다수의 HPV 유형에 대한 보호 중화 항체의 생성을 유도할 수 있는 HPV 바이러스유사 입자의 보다 경제적이고 유효한 개발이 시급하다.
발명의 내용
본 발명은 적어도 부분적으로 발명자의 놀라운 발견, 즉 11형 인유두종 바이러스(HPV)의 L1 단백질의 특정 조각을 제2 HPV 유형(예를 들어 HPV6)의 L1 단백질의 상응하는 조각으로 치환 후, 상기와 같이 수득된 돌연변이된 HPV11 L1 단백질이 유기체에서 HPV11 및 제2 HPV 유형(예를 들어 HPV6)에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 보호 효과가 HPV11 VLP와 제2 HPV 유형의 VLP의 혼합물의 효과에 필적하고, HPV11에 대한 그의 보호 효과가 상기 HPV11 VLP 단독의 경우에 필적하며, 제2 HPV 유형(예를 들어 HPV6)에 대한 그의 보호 효과가 상기 제2 HPV 유형 단독의 경우에 필적한다는 발견을 기본으로 한다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 제공하며, 여기에서 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질은 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여 하기의 돌연변이:
(1) 3 내지 6개 아미노산, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6개 아미노산의 N-말단 절두; 및
(2) (a) 상기 야생형 HPV11 L1 단백질의 170-179번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
(b) 상기 야생형 HPV11 L1 단백질의 346-351번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
(c) 상기 야생형 HPV11 L1 단백질의 119-140번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환
을 갖고;
상기 변체는 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질과 오직 하나 또는 다수(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환(바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실에 의해서만 상이하고, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질의 기능, 즉 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV11 및 HPV6)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 유지한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질은 상기 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여, N-말단에 절두된 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질은 상기 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여, N-말단에 절두된 4개의 아미노산을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 제2 유형의 야생형 HPV는 HPV6이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 (2)(a)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV6 L1 단백질의 169-178번 위치의 아미노산 잔기이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 제2 유형의 야생형 HPV는 HPV6이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 (2)(b)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV6 L1 단백질의 345-350번 위치의 아미노산 잔기이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 제2 유형의 야생형 HPV는 HPV6이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 (2)(c)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV6 L1 단백질의 119-139번 위치의 아미노산 잔기이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV11 L1 단백질은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV6 L1 단백질은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV6 L1 단백질의 169 내지 178번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV6 L1 단백질의 345 내지 350번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV6 L1 단백질의 119 내지 139번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질은 서열번호 6, 7 및 9로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산은 서열번호 13, 14 및 16으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
관심 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 유용한 벡터, 예를 들어 비제한적으로 클로닝 벡터 및 발현 벡터는 당해 분야에 주지되어 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 상기 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이 세포, 및 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 마우스 세포, 인간 세포 등)를 포함한다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 또한 세포주, 예를 들어 293T 세포일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 HPV 바이러스유사 입자에 관한 것이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여 3 내지 6개 아미노산, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6개 아미노산의 N-말단 절두, 및 야생형 HPV11 L1 단백질의 170-179번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 169-178번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여 3 내지 6개 아미노산, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6개 아미노산의 N-말단 절두, 및 야생형 HPV11 L1 단백질의 346-351번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 345-350번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여 3 내지 6개 아미노산, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6개 아미노산의 N-말단 절두, 및 야생형 HPV11 L1 단백질의 119-140번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 119-139번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질을 포함한다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 서열번호 6, 7 또는 9에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체, 상기 단리된 핵산, 상기 벡터, 상기 숙주 세포 또는 상기 HPV 바이러스유사 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신을 HPV 감염, 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마의 예방에 사용할 수 있다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 바이러스유사 입자는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 유효한 양으로 존재한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV11 감염 및/또는 HPV6 감염)이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 감염은 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신을 당해 분야에 주지된 방법에 의해, 예를 들어 비제한적으로 경구로 또는 주사에 의해 투여할 수 있다. 본 발명에서, 특히 바람직한 투여 경로는 주사이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신을 단위 투여형으로 투여한다. 예를 들어, 본 발명에 비제한적으로, 각각의 단위 투여량은 5 ㎍ 내지 80 ㎍, 바람직하게는 20 ㎍ 내지 40 ㎍의 HPV 바이러스유사 입자를 함유한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 숙주 세포에서 발현시키고, 이어서 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 상기 숙주 세포의 배양물로부터 회수함을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 이 콜라이(E. coli)이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 이 콜라이에서 발현시키고, 이어서 상기 이 콜라이의 용해물 상등액을 정제시킴으로써 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 크로마토그래피(예를 들어 양이온-교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 상기 이 콜라이의 용해물 상등액으로부터 회수한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제와 병용함을 포함하는 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방 방법에 관한 것으로, 피실험자에게 예방학적 유효량의 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자 또는 약학 조성물 또는 백신을 투여함을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV11 감염 및/또는 HPV6 감염)이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질병은 비제한적으로 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 피실험자는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방을 위한 약학 조성물 또는 백신의 제조에서 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체 또는 HPV 바이러스유사 입자의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV11 감염 및/또는 HPV6 감염)이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질병은 비제한적으로 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 포함한다.
본 발명에서 용어의 정의
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 과학기술 용어들은 당해 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 정의되는 의미를 갖는다. 더욱이, 본 명세서에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험 작업들은 상응하는 분야에 널리 사용되는 통상적인 작업들이다. 한편으로, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해서, 관련 용어의 정의 및 설명을 하기와 같이 제공한다.
본 발명에 따라, "제2 유형의 야생형 HPV"란 용어는 HPV11 이외의 야생형 HPV 유형을 지칭한다. 본 발명에서, 제2 유형의 야생형 HPV는 바람직하게는 야생형 HPV6이다.
본 발명에 따라, "상응하는 위치"란 표현은 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 최고의 일치성 백분율이 획득되도록 정렬시킬 때 비교되는 상기 서열들의 균등한 위치를 지칭한다.
본 발명에 따라, "야생형 HPV11 L1 단백질"이란 용어는 11형 인유두종 바이러스(HPV11)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV11 L1 단백질의 서열은 당해 분야에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스에서 찾을 수 있다(예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 M14119.1, AF335603.1, AF335602.1 등에 의해 암호화되는 HPV11 L1 단백질).
본 발명에서, 야생형 HPV11 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 기재한다. 예를 들어, "야생형 HPV11 L1 단백질의 170-179번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 170-179번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 야생형 HPV11이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 더욱또한, 당해 분야의 숙련가는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV11 단리물들간에 매우 높은 일치성(일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, "야생형 HPV11 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV11 단리물의 L1 단백질(예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 M14119.1, AF335603.1, AF335602.1 등에 의해 암호화되는 HPV11 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV11 L1 단백질의 서열 단편을 기재하는 경우, 상기는 서열번호 1의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV11 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "야생형 HPV11 L1 단백질의 170-179번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 1의 170-179번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV11 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따라, "야생형 HPV6 L1 단백질"이란 용어는 인유두종 바이러스 6(HPV6)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV6 L1 단백질의 서열은 당해 분야에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스에서 찾을 수 있다(예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 AF067042.1, AF092932.1, L41216.1, XOO203.1 등에 의해 암호화되는 HPV6 L1 단백질).
본 발명에서, 야생형 HPV6 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 기재한다. 예를 들어, "야생형 HPV6 L1 단백질의 169-178번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 169-178번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 야생형 HPV6이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 더욱또한, 당해 분야의 숙련가는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV6 단리물들간에 매우 높은 일치성(일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, "야생형 HPV6 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV6 단리물의 L1 단백질(예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 AF067042.1, AF092932.1, L41216.1, XOO203.1 등에 의해 암호화되는 HPV6 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV6 L1 단백질의 서열 단편을 기재하는 경우, 상기는 서열번호 2의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV6 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "야생형 HPV6 L1 단백질의 169-178번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 2의 169-178번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV6 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따라, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이란 표현은 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 최고의 일치성 백분율이 획득되도록 정렬시킬 때 비교되는 상기 서열들의 균등한 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.
본 발명에 따라, "X 아미노산의 N-말단 절두" 또는 "N-말단에 절두된 X 아미노산을 가짐"이란 표현은 단백질의 N-말단의 1 내지 X번 위치의 아미노산 잔기의, 개시 코돈(단백질 번역을 개시하기 위한)에 의해 암호화된 메티오닌 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 예를 들어 N-말단에 절두된 4개 아미노산을 갖는 HPV11 L1 단백질은 야생형 HPV11 L1 단백질의 N-말단의 1 내지 4번 위치의 아미노산 잔기의, 개시 코돈에 의해 암호화된 메티오닌 잔기에 의한 치환으로부터 생성되는 단백질을 지칭한다.
본 발명에 따라, "변체"란 용어는 단백질의 아미노산 서열이 하나 또는 다수(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환(바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실을 갖거나, 또는 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질(예를 들어 서열번호 6, 7 또는 9에 제시된 바와 같은 단백질)과 비교하여 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 일치성을 가지며, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질의 기능을 유지하는 상기 단백질을 지칭한다. 본 발명에서, "돌연변이된 HPV11 L1 단백질의 기능"이란 용어는 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV11 및 HPV6)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 지칭한다. "일치성"이란 용어는 뉴클레오타이드 서열들 또는 아미노산 서열들간의 유사성의 척도를 지칭한다. 일반적으로, 서열들은 최대의 합치가 획득되도록 정렬되었다. "일치성"은 당해 분야에서 주지된 의미를 가지며 공개된 알고리즘(예를 들어 BLAST)에 의해 계산될 수 있다.
본 발명에 따라, "일치성"이란 용어는 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 핵산간의 합치 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2개의 서열이 특정한 위치에서 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브유닛을 갖는 경우(예를 들어 2개의 DNA 분자가 각각 특정한 위치에서 아데닌을 갖거나, 또는 2개의 폴리펩타이드가 각각 특정한 위치에서 리신을 갖는 경우), 상기 2개의 분자는 상기 부위에서 일치한다. 2개 서열간의 일치성 퍼센트는 비교를 위한 부위의 총수에 걸쳐 상기 2개 서열에 의해 공유된 일치하는 부위수 x 100의 함수이다. 예를 들어 2개 서열의 10개 부위 중 6개가 합치하는 경우, 이들 2개 서열은 60%의 일치성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 일치성을 공유한다(6개 부위 중 3개가 합치된다). 일반적으로 2개 서열의 비교를 최대 일치성을 생성시키는 방식으로 수행한다. 상기와 같은 정렬을 예를 들어 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 얼라인(Align) 프로그램(DNAstar 인코포레이티드)(니들맨(Needleman) 등의 방법(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)에 기반한다)을 사용하여 수행할 수 있다. 2개 아미노산 서열간의 일치성 퍼센트를 또한, PAM120 중량 잔기 표를 사용하고 12의 끊김 길이 벌점 및 4의 끊김 벌점을 갖는 이 마이어스(E. Meyers) 및 더블유 밀러(W. Miller)(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘(상기 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되었다)을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열간의 일치성 백분율을, 블로슘(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하고 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 끊김 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하는, 니들맨 및 분취(Wunsch)의 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)(GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 입수할 수 있다)에 통합되었다)에 의해 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "보존적 치환"이란 용어는 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 필수적인 성질에 불리한 영향을 미치거나 또는 상기 성질을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지향된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 상응하는 아미노산 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한(예를 들어 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성시키는 능력을 포함한 화학적 성질 등을 갖는) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 과가 당해 분야에 정의되었다. 이들 과는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 아스파트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 일반적으로 보존적인 치환은 상응하는 아미노산 잔기의, 동일한 측쇄 과로부터의 또 다른 아미노산 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 아미노산 보존적 치환의 식별 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)]; [Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)]; 및 [Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)]을 참조하시오).
본 발명에 따라, "이 콜라이 발현 시스템"이란 용어는 이 콜라이(균주) 및 벡터로 이루어지는 발현 시스템을 지칭하며, 여기에서 상기 이 콜라이(균주)는 비제한적으로 ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), 및 BLR (DE3)을 포함한 상업적으로 입수할 수 있는 균주로부터 유래된다.
본 발명에 따라, "벡터"란 용어는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 담체 도구를 지칭한다. 상기 벡터가 상기 중에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라 칭한다. 상기 벡터는 숙주 세포내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 상기 숙주 세포에서 발현된 운반된 유전물질 요소를 가질 수 있다. 벡터, 예를 들어 비제한적으로 플라스미드, 파지, 코스미드 등은 당해 분야의 숙련가에 의해 주지되어 있다.
본 발명에 따라, "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"란 용어는 피실험자 및 활성 성분에 약물학적으로 및/또는 생리학적으로 상용성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하며, 이들은 당해 분야에 주지되어 있고(예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995]을 참조하시오), 비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 및 이온 강도 증대제를 포함한다. 예를 들어, pH 조절제는 비제한적으로 포스페이트 완충제를 포함하고; 계면활성제는 비제한적으로 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈-80을 포함하고; 항원보강제는 비제한적으로 알루미늄 항원보강제(예를 들어 수산화 알루미늄), 및 프로인트 항원보강제(예를 들어 프로인트 완전 항원보강제)를 포함하고; 이온 강도 증대제는 비제한적으로 NaCl을 포함한다.
본 발명에 따라, "유효량"이란 용어는 의도하는 목적을 유효하게 성취할 수 있는 양을 지칭한다. 예를 들어, 질병(예를 들어 HPV 감염) 예방 유효량은 질병(예를 들어 HPV 감염)의 발생을 예방하거나, 억제하거나 또는 지연시키기에 유효한 양을 지칭한다. 상기와 같은 유효량의 측정은 당해 분야의 숙련가의 능력내에 있다.
본 발명에 따라, "크로마토그래피"란 용어는 비제한적으로 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 흡수성 크로마토그래피(예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 젤 여과 크로마토그래피(젤 배제 크로마토그래피), 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명에 따라, "용해물 상등액"이란 용어는 하기의 단계에 의해 생성된 용액을 지칭한다: 숙주 세포(예를 들어 이 콜라이)를 용해 완충제에서 붕괴시키고, 이어서 불용성 물질을 상기 붕괴된 숙주 세포를 함유하는 용해된 용액으로부터 제거한다. 다양한 용해 완충제, 예를 들어 비제한적으로 트리스 완충제, 포스페이트 완충제, HEPES 완충제, MOPS 완충제 등이 당해 분야에 주지되어 있다. 또한, 숙주 세포의 붕괴를 당해 분야의 숙련가에 의해 주지된 방법, 예를 들어 비제한적으로 균질화기 붕괴, 초음파 처리, 분쇄, 고압 추출, 리소자임 처리 등에 의해 수행할 수 있다. 불용성 물질의 제거 방법, 예를 들어 비제한적으로 여과 및 원심분리가 또한 당해 분야의 숙련가에 의해 주지되어 있다.
연구들은 HPV11 및 다른 HPV 유형(들)(예를 들어 HVP6)간에 어느 정도의 교차-보호가 존재하지만, 상기와 같은 교차-보호는 매우 낮음, 일반적으로 동일한 HPV 유형의 보호 수준의 1 퍼센트 미만, 심지어 1/1000임을 보인다. 따라서, HPV11 백신을 접종받은 피실험자는 여전히 다른 HPV 유형(들)(예를 들어 HPV6)에 의해 감염될 위험이 높다.
본 발명은 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 및 이에 의해 형성된 HPV 바이러스유사 입자를 제공한다. 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 HPV11 및 다른 HPV 유형(들)(예를 들어 HPV6)에 대해 현저한 교차-보호를 제공할 수 있다. 특히, 동일한 면역화 용량에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 유기체에서 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV11 및 HPV6)에 대해 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 효과는 다수 HPV 유형의 VLP의 혼합물(예를 들어 HPV11 VLP 및 HPV6 VLP의 혼합물)의 경우에 필적한다. 따라서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 사용하여 동시에 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV11 및 HPV6)에 의한 감염뿐만 아니라 상기 감염과 관련된 질병을 예방할 수 있으며, 상기 입자는 현저하게 이로운 기술적 효과를 갖는다. 이는 특히 HPV 백신의 보호 범위의 연장 및 HPV 백신의 생산 비용의 감소에 대해 상당한 장점을 갖는다.
본 발명의 실시태양을 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 추가로 기재한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 하기 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정한다기 보다는 단지 본 발명의 예시를 위한 것임을 이해할 것이다. 하기 도면 및 바람직한 실시태양의 상세한 설명에 따라, 본 발명의 다양한 목적 및 장점들이 당해 분야의 숙련가에게 자명하다.
도 1은 실시예 1의 정제된 돌연변이된 단백질의 SDS-PAGE 결과를 도시한다. 레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: HPV11N4 (N-말단에 절두된 4개 아미노산을 갖는 HPV11 L1 단백질); 레인 2: H11N4-6T1; 레인 3: H11N4-6T2; 레인 4: H11N4-6T3; 레인 5: H11N4-6T4; 레인 6: H11N4-6T5. 상기 결과는 크로마토그래피 정제 후, 단백질 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5가 95% 초과의 순도에 도달함을 보였다.
도 2A-2F는 각각 단백질 HPV11N4, H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5를 포함하는 샘플들의 분자체 크로마토그래피 분석의 결과를 도시한다. 도 2A: HPV11N4; 도 2B: H11N4-6T1; 도 2C: H11N4-6T2; 도 2D: H11N4-6T3; 도 2E: H11N4-6T4; 도 2F: H11N4-6T5. 상기 결과는 각각 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5를 포함하는 샘플들의 첫 번째 단백질 피크가 약 12분째에 나타났으며, 이는 HPV11N4 VLP의 경우에 필적함을 보였다. 이는 이들 돌연변이된 단백질이 모두 VLP로 조립될 수 있음을 보였다.
도 3A-3F는 HPV11N4 VLP, H11N4-6T1 VLP, H11N4-6T2 VLP, H11N4-6T3 VLP, H11N4-6T4 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 침강 속도 분석의 결과를 도시한다. 도 3A, HPV11N4 VLP; 도 3B, H11N4-6T1 VLP; 도 3C, H11N4-6T2 VLP; 도 3D, H11N4-6T3 VLP; 도 3E, H11N4-6T4 VLP; 도 3F, H11N4-6T5 VLP. 상기 결과는 H11N4-6T1 VLP, H11N4-6T2 VLP, H11N4-6T3 VLP, H11N4-6T4 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 침강 계수가 각각 140S, 138S, 111S, 139S 및 139S임을 보였다. 이는 상기에서 제조된 바와 같은 5개의 돌연변이된 HPV11 L1 단백질이 크기 및 형태에 관하여 야생형 VLP (HPV11N4 VLP, 136.3S)와 유사한 바이러스유사 입자로 조립될 수 있음을 암시하였다.
도. 4A-4F는 다양한 VLP 샘플의 투과형 전자 현미경검사(TEM) 사진(100,000 x 배율로 촬영됨, 바 = 0.1 ㎛)을 도시한다. 도 4A, HPV11N4 VLP; 도 4B, H11N4-6T1 VLP; 도 4C, H11N4-6T2 VLP; 도 4D, H11N4-6T3 VLP; 도 4E, H11N4-6T4 VLP; 도 4F, H11N4-6T5 VLP. 상기 결과는 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5가 HPV11N4와 유사하고, 약 25 ㎚의 반경을 갖는 VLP로 조립될 수 있음을 보였다.
도 5A-5F는 각각 HPV11N4, H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5에 의해 형성된 VLP의 열안정성 평가의 결과를 도시한다. 도 5A, HPV11N4 VLP; 도 5B, H11N4-6T1 VLP; 도 5C, H11N4-6T2 VLP; 도 5D, H11N4-6T3 VLP; 도 5E, H11N4-6T4 VLP; 도 5F, H11N4-6T5 VLP. 상기 결과는 이들 단백질에 의해 형성된 VLP가 모두 매우 높은 열안정성을 가짐을 보였다.
도 6A-6D는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 저온-전자 현미경검사(저온EM) 사진 및 분석된 구조를 도시하며; 여기에서 도 6A 및 도 6C는 각각 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 저온-전자 현미경검사(저온EM) 사진을 도시하고; 도 6B 및 도 6D는 각각 17.38 Å 및 20.48 Å의 분해능에서 저온-전자 현미경검사(저온EM)를 사용하여 분석된 바와 같은 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 3차원 구조를 도시한다.
도 7은 마우스에서 실험 그룹 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5, 및 대조용 그룹 HPV11N4 VLP, HPV6N5 VLP 및 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 면역보호의 평가 결과를 도시한다. 상기 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV11 및 HPV6에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; HPV11에 대한 그들의 보호 효과가 HPV11N4 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며, HPV6N5 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높고; HPV6에 대한 그들의 보호 효과가 HPV6N5 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며, HPV11N4 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높음을 보였다. H11N4-6T2 VLP는 또한 마우스에서 HPV11 및 HPV6에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었으나, HPV6에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 그의 능력은 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 경우보다 약하였다. 이들 결과는 H11N4-6T2 VLP, H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 HPV11 감염 및 HPV6 감염의 에방에 유효한 백신으로서 사용될 수 있고, HPV11 VLP 및 HPV6 VLP를 포함하는 혼합 백신 대신에 사용될 수 있음을 보였다.
도 8A-8C는 각각 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP에 의한 마우스의 백신화 후 마우스 혈청 중 중화 항체 역가의 평가 결과를 도시한다. 도 8A: 알루미늄 항원보강제 그룹 1(10 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 도 8B: 알루미늄 항원보강제 그룹 2(1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 도 8C: 알루미늄 항원보강제 그룹 3(0.1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용). 상기 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV11에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV11N4 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하고, 동일한 용량에서 HPV6N5 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하며; 마우스에서 HPV6에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV6N5 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하고, 동일한 용량에서 HPV11N4 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수함을 보였다. 이는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 HPV11 및 HPV6에 대한 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 보였다.
도 9는 H11N4-6T3 VLP 또는 H11N4-6T5 VLP에 의한 키노몰구스 원숭이의 백신화 후 키노몰구스 원숭이 혈청 중 중화 항체의 평가 결과를 도시한다. 상기 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP 중 어느 하나가 키노몰구스 원숭이에서 HPV11 및 HPV6에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 보호 효과가 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적함을 보였다. 이는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 HPV11 및 HPV6에 대한 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 보였다.
서열 정보
본 발명에 관련된 서열들 중 일부를 하기 표 1에 제공한다.
서열의 설명
서열 번호 설명
1 야생형 HPV11 L1 단백질
2 야생형 HPV6 L1 단백질
3 N-말단에 절두된 4개 아미노산을 갖는 HPV11 L1 단백질, HPV11N4
4 N-말단에 절두된 5개 아미노산을 갖는 HPV6 L1 단백질, HPV6N5
5 HPV6 L1 단백질의 조각 1을 포함하는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질, H11N4-6T1
6 HPV6 L1 단백질의 조각 2를 포함하는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질, H11N4-6T2
7 HPV6 L1 단백질의 조각 3을 포함하는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질, H11N4-6T3
8 HPV6 L1 단백질의 조각 4를 포함하는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질, H11N4-6T4
9 HPV6 L1 단백질의 조각 5를 포함하는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질, H11N4-6T5
10 서열번호 3을 암호화하는 DNA 서열
11 서열번호 4를 암호화하는 DNA 서열
12 서열번호 5를 암호화하는 DNA 서열
13 서열번호 6을 암호화하는 DNA 서열
14 서열번호 7을 암호화하는 DNA 서열
15 서열번호 8을 암호화하는 DNA 서열
16 서열번호 9를 암호화하는 DNA 서열
35 야생형 HPV6 L1 단백질의 169 내지 178번 위치의 아미노산 잔기의 서열
36 야생형 HPV6 L1 단백질의 345 내지 350번 위치의 아미노산 잔기의 서열
37 야생형 HPV6 L1 단백질의 119 내지 139번 위치의 아미노산 잔기의 서열
서열 1(서열번호 1):
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서열 2(서열번호 2):
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서열 3(서열번호 3):
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서열 4(서열번호 4):
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서열 5(서열번호 5):
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서열 6(서열번호 6):
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서열 7(서열번호 7):
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서열 8(서열번호 8):
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서열 9(서열번호 9):
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서열 10(서열번호 10):
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서열 11(서열번호 11):
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서열 12(서열번호 12):
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서열 13(서열번호 13):
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서열 14(서열번호 14):
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
서열 15(서열번호 15):
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
서열 16(서열번호 16):
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
서열 35(서열번호 35):
KQCTNTPVQA
서열 36(서열번호 36):
TTSSTY
서열 37(서열번호 37):
FLNKYDDVENSGSGGNPGQDN
본 발명을 하기와 같은 실시예를 참조하여 추가로 기재하며, 여기에서 이들 실시예는 본 발명을 제한한다기 보다는 단지 본 발명을 예시하기 위해 사용된다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자 생물학적 실험 방법 및 면역학적 분석들은 실질적으로 문헌[Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 및 문헌[F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 수행되며; 제한 효소는 제조사에 의해 권장되는 조건하에서 사용된다. 당해 분야의 숙련가들은 이들 실시예가 본 발명을 예시하기 위해 사용되지만, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해한다.
실시예 1. 돌연변이된 HPV11 L1 단백질의 발현 및 정제
발현 벡터의 구성
HPV6 L1 단백질로부터의 특정한 조각을 포함하는 돌연변이된 HPV11 L1 단백질(H11N4-6T1)을 암호화하는 발현 벡터를 다중-부위 돌연변이유발을 위해 PCR에 의해 구성하였으며, 여기에서 사용된 초기 주형은 플라스미드 pTO-T7-HPV11N4C(N-말단에 절두된 4개 아미노산을 갖는 HPV11 L1 단백질을 암호화한다; 표 2에서 11L1N4로서 약기됨)였다. 각각의 PCR에 대한 주형 및 프라이머를 표 2에 나타내었으며, PCR에 대한 증폭 조건은 하기와 같았다: 94 ℃에서 10분간 변성; 25 주기(94 ℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72 ℃에서 7.5분간 연장); 및 최종적으로 72 ℃에서 10분간 연장. 상기 사용된 PCR 프라이머의 서열을 표 3에 나열하였다.
증폭 산물(50 ㎕)에 대해서, 2 ㎕의 제한 엔도뉴클레아제 DpnI를 가하고 생성 혼합물을 37 ℃에서 60분간 배양하였다. 10 ㎕의 절단 산물을 사용하여, 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 40 ㎕ 수용성 이 콜라이 ER2566(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 구입)을 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 이 콜라이를 카나마이신(25 ㎎/㎖의 최종 농도로, 본 명세서에서 이후에도 동일함)을 함유하는 고형 LB 배지(상기 LB 배지의 성분들: 10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 분말, 10 g/L NaCl, 본 명세서에서 이후에도 동일함)상에 평판도말하고, 단일 콜로니가 명백히 관찰될 수 있을 때까지 37 ℃에서 10 내지 12시간 동안 정적으로 배양시켰다. 단일 콜로니를 채집하고 4 ㎖ 액체 LB 배지(카나마이신 함유)를 함유하는 튜브에 접종하고 37 ℃에서 10시간 동안 220 rpm으로 진탕시키면서 배양하고, 이어서 1 ㎖ 세균 용액을 취하여 -70 ℃에서 보관하였다. 플라스미드를 이 콜라이로부터 추출하고, T7 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열분석하였다. 상기 서열분석 결과는 상기 구성된 플라스미드(발현 벡터)에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 12이고, 그의 암호화된 아미노산 서열이 서열번호 5(상응하는 단백질을 H11N4-6T1으로 표시하였다)임을 보였다. 상기 돌연변이된 단백질 H11N4-6T1은, 야생형 HPV11 L1 단백질의 49 내지 63번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 49 내지 63번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV11N4와 상이하다.
깁슨(Gibson) 조립(Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318)를 사용하여 다른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 구성하였으며, 여기에서 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질은 HPV6 L1으로부터의 특정한 조각을 포함하였다. 간단히, 돌연변이를 포함하는 짧은 단편 및 돌연변이를 포함하지 않는 긴 단편을 PCR에 의해 수득하고, 이어서 깁슨 조립 시스템을 사용하여 상기 2개의 단편을 결찰시켜 고리를 형성시켰다. 사용된 초기 주형은 플라스미드 pTO-T7-HPV11N4C 및 플라스미드 pTO-T7-HPV6N5C(N-말단에 절두된 5개 아미노산을 갖는 HPV6 L1 단백질을 암호화한다; 표 2에 6L1N5로서 약기됨)를 포함하였다. 각각의 PCR에 대한 주형 및 프라이머를 표 2에 나타내었으며, 상기 짧은 단편을 증폭시키기 위한 PCR에 대한 증폭 조건은 하기와 같았다: 94 ℃에서 10분간 변성; 25 주기(94 ℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72 ℃에서 1분간 연장); 및 최종적으로 72 ℃에서 10분간 연장. 상기 긴 단편을 증폭시키기 위한 PCR에 대한 증폭 조건은 하기와 같았다: 94 ℃에서 10분간 변성; 25 주기(94 ℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72 ℃에서 7.5분간 연장); 및 최종적으로 72 ℃에서 10분간 연장. 상기 사용된 PCR 프라이머의 서열을 표 3에 나열하였다. 상기 증폭 산물에 전기영동을 가하고, 이어서 관심 단편을 DNA 추출 키트를 사용하여 회수하고, 그의 농도를 측정하였다. 증폭에 의해 획득된 짧은 단편 및 긴 단편을 2:1의 몰비(총 부피 3 ㎕)로 혼합하고, 이어서 3 ㎕의 2X 깁슨 조립 마스터 믹스(NEB로부터 구입, T5 엑소뉴클레아제, 퓨전(Phusion) DNA 폴리머라제, Taq DNA 리가제를 함유한다)를 가하고, 50 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 조립된 생성물(6 ㎕)을 사용하여, 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 수용성 이 콜라이 ER2566(뉴잉글랜드 바이오랩스로부터 구입) 40 ㎕를 형절전환시켰다. 상기 형질전환된 이 콜라이를 카나마이신을 함유하는 고체 LB 배지상에 평판도말하고, 단일 콜로니가 명백히 관찰될 수 있을 때까지 37 ℃에서 10 내지 12시간 동안 정적으로 배양시켰다. 단일 콜로니를 채집하고 4 ㎖ 액체 LB 배지(카나마이신 함유)를 함유하는 튜브에 접종하고 37 ℃에서 10시간 동안 220 rpm으로 진탕시키면서 배양하고, 이어서 1 ㎖ 세균 용액을 취하여 -70 ℃에서 보관하였다. 플라스미드를 이 콜라이로부터 추출하고, T7 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열분석하였다. 상기 서열분석 결과는 상기 구성된 플라스미드(발현 벡터)에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열들이 각각 서열번호 13, 14, 15 및 16이고, 이들의 암호화된 아미노산 서열이 각각 서열번호 6, 7, 8 및 9(상응하는 단백질을 각각 H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4, 및 H11N4-6T5로서 표시하였다)임을 보였다.
상기 돌연변이된 단백질 H11N4-6T2는, 야생형 HPV11 L1 단백질의 119 내지 140번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 119 내지 139번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV11N4와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H11N4-6T3은, 야생형 HPV11 L1 단백질의 170 내지 179번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 169 내지 178번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV11N4와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H11N4-6T4는, 야생형 HPV11 L1 단백질의 257 내지 288번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 256 내지 287번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV11N4와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H11N4-6T5는, 야생형 HPV11 L1 단백질의 346 내지 351번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV6 L1 단백질의 345 내지 350번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV11N4와 상이하다.
발현 벡터를 구성하기 위한 PCR 주형 및 프라이머
주형 상류 프라이머 하류 프라이머 생성물
11L1N4 H11N4-6T1-F H11N4-6T1-R H11N4-6T1
6L1N5 G-H11N4-6T2-F G-H11N4-6T2-R H11N4-6T2-짧은 단편
11L1N4 G-V-H11N4-6T2-F G-V-H11N4-6T2-R H11N4-6T2-긴 단편
6L1N5 G-H11N4-6T3-F G-H11N4-6T3-R H11N4-6T3-짧은 단편
11L1N4 G-V-H11N4-6T3-F G-V-H11N4-6T3-R H11N4-6T3-긴 단편
6L1N5 G-H11N4-6T4-F G-H11N4-6T4-R H11N4-6T4-짧은 단편
11L1N4 G-V-H11N4-6T4-F G-V-H11N4-6T4-R H11N4-6T4-긴 단편
6L1N5 G-H11N4-6T5-F G-H11N4-6T5-R H11N4-6T5-짧은 단편
11L1N4 G-V-H11N4-6T5-F G-V-H11N4-6T5-R H11N4-6T5-긴 단편
사용된 프라이머들의 서열(서열번호 17-34)
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3')
17 H11N4-6T1-F GTGGGACATCCATATTTTTCTATCAAACGGGCTAACAAAACAGTTGTAC
18 H11N4-6T1-R GTACAACTGTTTTGTTAGCCCGTTTGATAGAAAAATATGGATGTCCCAC
19 G-H11N4-6T2-F TCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGC
20 G-H11N4-6T2-R CCCACCATACATAGCTGGGTTTGTTTATAATCCATACCAACAT
21 G-V-H11N4-6T2-F AAACAAACCCAGCTATGTATGGTGG
22 G-V-H11N4-6T2-R CACTACCTTAAACACTCTATATTGAT
23 G-H11N4-6T3-F CTGTACAGAATGGTGACTGCCCGCCCTTAG
24 G-H11N4-6T3-R AACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGC
25 G-V-H11N4-6T3-F TAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGCCCTTAG
26 G-V-H11N4-6T3-R GATGTATTAGAACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCG
27 G-H11N4-6T4-F GGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGG
28 G-H11N4-6T4-R ACCAAGGATCCACTAGGTGTATGAACATATATACTACTCCCTACAG
29 G-V-H11N4-6T4-F CATACACCTAGTGGATCCTTGG
30 G-V-H11N4-6T4-R AAAGTGTCTAGCAAACATTTGTTCCT
31 G-H11N4-6T5-F TGGTATTTGCTGGGGAAACCACCTGTTTGTTACTGTGGTAGATAC
32 G-H11N4-6T5-R GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTC
33 G-V-H11N4-6T5-F TTTGATTTACAGTTTATTTTTC
34 G-V-H11N4-6T5-R GTGGTTTCCCCAGCAAATACCATTG
돌연변이된 단백질의 대규모 발현각각 재조합 플라스미드 pTO-T7-H11N4-6T1, pTO-T7-H11N4-6T2, pTO-T7-H11N4-6T3, pTO-T7-H11N4-6T4, 및 pTO-T7-H11N4-6T5를 포함하는 이 콜라이 용액을 -70 ℃ 냉장고로부터 꺼내어, 카나마이신을 함유하는 100 ㎖ LB 액체 배지에 시딩하고, 각각 200 rpm 및 37 ℃에서 약 8시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 배양물을 카나마이신을 함유하는 500 ㎖ LB 배지로 옮기고(1 ㎖ 세균 용액을 옮기고), 추가로 배양하였다. 상기 세균 농도가 약 0.6의 OD600에 도달했을 때, 배양 온도를 25 ℃로 낮추고 500 ㎕의 IPTG를 각 배양 보틀에 가하였다. 상기 배양을 8시간 동안 추가로 수행하였다. 배양을 끝낸 후에, 세균을 원심분리에 의해 수집하였다. 각각 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5 단백질을 발현하는 세균을 수득하였다.
돌연변이된 단백질을 발현하는 세균의 붕괴
상기 수득된 세균을 1 g 세균 대 10 ㎖ 용해 완충제(20 mM 트리스 완충제, pH 7.2, 300 mM NaCl)의 비로 재-현탁시켰다. 상기 세균을 30분 동안 초음파 기구를 사용하여 붕괴시켰다. 상기 붕괴된 세균을 함유하는 용해 용액을 13500 rpm(30000 g)에서 15분 동안 원심분리시키고, 상등액(즉 붕괴된 세균의 상등액)을 수득하였다.
돌연변이된 단백질의 크로마토그래피 정제
장비: GE 헬쓰케어(즉 오리지널 애머샨 파마시아 캄파니(Amershan Pharmacia Co.))에 의해 제조된 AKTA 익스플로러(Explorer) 100 예비 액체 크로마토그래피 시스템
크로마토그래피 매질: SP 세파로스 4 패스트 플로우(Sepharose 4 Fast Flow)(GE 헬쓰케어 캄파니), CHT-II(바이오 래드(Bio-RAD)로부터 구입) 및 부틸 세파로스 4 패스트 플로우(GE 헬쓰케어 캄파니)
완충제: 20 mM 포스페이트 완충제, pH 8.0, 20 mM DTT; 및 20 mM 포스페이트 완충제, pH 8.0, 20 mM DTT, 2 M NaCl.
샘플: 상기에서 수득된 바와 같은, 각각 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5를 함유하는 붕괴된 세균의 상등액.
용출 프로토콜:
(1) SP 세파로스 4 패스트 플로우에 의한 붕괴된 세균의 상등액의 양이온 교환 정제: 상기 샘플을 상기 컬럼상에 로딩하고, 이어서 불필요한 단백질을 400 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시킨 다음 관심 단백질을 800 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시키고, 상기 800 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출된 분획을 수집하였다;
(2) CHT-II(하이드록시아파타이트 크로마토그래피)에 의한 상기 단계 (1)에서 수득된 용출 분획의 크로마토그래피 정제: 상기 단계 (1)에서 수득된 용출 분획을, NaCl 농도가 0.5 M로 감소되도록 희석시키고; 상기 샘플을 상기 컬럼상에 로딩하고, 이어서 불필요한 단백질을 500 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시킨 다음 관심 단백질을 1000 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시키고, 상기 1000 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출된 분획을 수집하였다;
(3) HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의한 상기 단계 (2)에서 수득된 용출 분획의 크로마토그래피 정제: 상기 샘플을 상기 컬럼상에 로딩하고, 이어서 불필요한 단백질을 1000 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시킨 다음 관심 단백질을 200 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시키고, 상기 200 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출된 분획을 수집하였다.
상기 단계 (3)에서 수득된 150 ㎕ 용출 분획을 30 ㎕의 6X 로딩 완충제에 가하였다. 상기 생성된 용액을 균일하게 혼합하고 80 ℃ 수욕에서 10분 동안 배양하였다. 이어서 10 ㎕의 상기 생성된 샘플에 120 V에서 120분 동안 10% SDS-PAGE를 가하고; 쿠마씨 브릴리언트 블루에 의해 전기영동 밴드를 염색하였다. 상기 전기영동 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 결과는 상기 정제 단계 후에, H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5 단백질이 95% 초과의 순도를 가짐을 보였다.
유사한 방법에 의해, HPV11N4 단백질을 제조하고 이 콜라이 및 플라스미드 pTO-T7-HPV11N4C를 사용하여 정제시키고; HPV6N5 단백질을 제조하고 이 콜라이 및 플라스미드 pTO-T7-HPV6N5C를 사용하여 정제시켰다.
실시예 2: HPV 바이러스유사 입자의 조립 및 입자의 형태학적 시험
HPV 바이러스유사 입자의 조립
제공된 부피(약 2 ㎖)의 단백질 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 또는 H11N4-6T5를 (1) 2L 저장 완충제(20 mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH 6.5, 0.5 M NaCl); (2) 2L 재생 완충제(50 mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH 6.0, 2 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 0.5 M NaCl); 및 (3) 20 mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH 7.0, 0.5 M NaCl에 연속적으로 투석시켰다. 상기 투석을 상기 각각의 3개의 완충제에서 12시간 동안 수행하였다.
유사한 방법에 의해, HPV11N4 및 HPV6N5 단백질을 각각 HPV11N4 VLP 및 HPV6N5 VLP로 조립하였다.
분자체 크로마토그래피 분석
상기 투석된 샘플에 1120 콤팩트 LC 고성능 액체 크로마토그래피 시스템(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))에 의해 분자체 크로마토그래피 분석을 수행하였으며, 여기에서 상기 사용된 분석 컬럼은 TSK Gel PW5000xl 7.8x300 ㎜이었다. 상기 분석 결과를 도 2A-2F에 도시하였다. 상기 결과는 각각 단백질 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5를 포함하는 샘플의 첫 번째 단백질 피크가 약 12분째에 존재하고, 이는 HPV11N4 VLP의 경우에 필적함을 보였다. 이는 상기 제조된 단백질들이 VLP로 조립될 수 있음을 보였다.
침강 속도 분석
침강 속도 분석용 기구는 벡크만(Beckman) XL-A 분석학적 초원심분리기로, 광학 검사 시스템 및 An-50Ti 및 An-60Ti 로터가 구비되어 있다. HPV11N4 VLP, H11N4-6T1 VLP, H11N4-6T2 VLP, H11N4-6T3 VLP, H11N4-6T4 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 침강 계수를 침강 속도 방법에 의해 분석하였다. 상기 결과를 도 3A-3F에 도시하였다. 상기 결과는 H11N4-6T1 VLP, H11N4-6T2 VLP, H11N4-6T3 VLP, H11N4-6T4 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 침강 계수가 각각 140S, 138S, 111S, 139S 및 139S임을 보였다. 이는 상기 5개의 돌연변이된 HPV11 L1 단백질들이 크기 및 형태에 관하여 야생형 VLP(HPV11N4 VLP, 136.3S)와 유사한 바이러스유사 입자로 조립될 수 있음을 보였다.
바이러스유사 입자의 형태학적 시험
VLP를 포함하는 100 ㎕ 샘플을 투과형 전자 현미경(TEM)에 의해 관찰하였다. 사용된 장비는 JEOL Ltd에 의해 공급된 100kV 투과형 전자 현미경이었다(100,000x 배율). 간단히, 13.5 ㎕ 샘플을 2% 포스포텅스텐산(pH 7.0)으로 음으로 염색하고, 탄소-코팅된 구리 격자상에 고정시키고, 이어서 TEM에 의해 관찰하였다. 상기 결과를 도 4A-4F에 도시하였다. 상기 결과는 H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5가 바이러스유사 입자로 조립될 수 있음을 보였다. 또한, 상기 결과는 또한 이들 돌연변이된 단백질에 의해 조립된 입자가 약 25 ㎚의 반경을 가지며, 크기가 균일함을 보였다. 이는 이들 돌연변이된 단백질이 야생형 HPV11 L1 단백질(HPV11N4 VLP)과 유사하며 균일한 크기를 갖는 VLP로 조립될 수 있음을 암시하였다.
실시예 3: 바이러스유사 입자의 열안정성의 평가
HPV11N4, H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5에 의해 형성된 VLP를 GE 캄파니(즉 오리지널 마이크로칼 캄파니(MicroCal Co.))로부터 구입한 차동 주사 열량계 VP 캐필러리(Capillary) DSC를 사용하여 그들의 열안정성에 대해 평가하였으며, 여기에서 상기 단백질용 보관 완충제가 대조용으로서 사용되었고, 상기 단백질들을 10 ℃ 내지 90 ℃의 온도 범위내에서 1.5 ℃/분의 가열속도로 주사하였다. 검출 결과를 도 5A-5F에 도시하였다. 상기 결과는 상기 단백질들에 의해 형성된 이들 VLP가 모두 매우 높은 열안정성을 가짐을 보였다.
실시예 4: H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 3차원 구조의 재구성
앞서 보고된 방법(Wolf M, Garcea RL, Grigorieff N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2010), 107(14): 6298-303)에 따라, H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 3차원 구조를 저온-전자 현미경검사(저온EM)에 의해 재구성하였다. 간단히, 저온-전자 현미경검사(저온EM)를 사용하여 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP를 관찰하고, 이어서 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 저온-전자 현미경검사(저온EM) 사진(도 6A 및 6C) 중에서, 균일한 크기 및 50 ㎚ 초과의 직경을 갖는 300개 입자 및 360개 입자를 각각 컴퓨터 오버랩핑 및 구조 재구성을 위해 선택하였고, 이에 의해 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 3차원 구조를 획득하였다. 상기 획득된 3차원 구조를 도 6B 및 6D(각각 17.38 Å 및 20.48 Å의 분해능에서)에 도시하였다. 상기 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 모두 72개의 캡소머(형태학적 서브유닛, 오량체)로 이루어지는 T=7 20면체 구조(h=1, k=2)를 가짐을 보였다. 준-등가(quasi-equivalence) 원리와 일치하는 통상적인 20면체 바이러스 캡시드와 달리, H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 구조 중 모든 구성 서브유닛들은 육량체 없이 오량체였다. 더욱이, 상기 VLP들은 약 60 ㎚의 외부 직경을 가졌다. 이들은 앞서 보고된 천연 HPV 바이러스 입자 및 진핵생물 발현 시스템(예를 들어 폭스바이러스 발현 시스템)에 의해 제조된 HPV VLP의 3차원 구조와 유사하였다(Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7).
실시예 5: 동물에서 바이러스유사 입자의 면역 보호의 평가
H11N4-6T1, H11N4-6T2, H11N4-6T3, H11N4-6T4 및 H11N4-6T5에 의해 형성된 VLP의 면역 보호를 마우스에서 평가하였다. 백신화를 위한 동물은 5 내지 6주 된 BALB/c 마우스(통상적인 등급)였다(샹하이 SLAC 레보라토리 애니멀 캄파니 리미티드(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. LTD.)로부터 구입).
상기에서 제조된 바와 같은 HPV11N4 VLP, HPV6N5 VLP, H11N4-6T1 VLP, H11N4-6T2 VLP, H11N4-6T3 VLP, H11N4-6T4 VLP, H11N4-6T5 VLP 및 혼합된 HPV11/HPV6 VLP(즉 HPV11N4 VLP 및 HPV6N5 VLP의 혼합물)를 각각 알루미늄 항원보강제상에 흡수시켰다. 마우스들을 면역원에 따라 8개의 그룹으로 분류하고, 각 그룹에 4마리의 마우스를 포함시켰다. 백신화 과정은 하기와 같았다: 0주째에 1차 백신화, 및 각각 2주 및 4주째에 추가 백신화. 마우스를 피하 주사를 통해 백신화하였다. 사용된 면역원 및 그의 용량을 표 4에 나타내었다. 상기 1차 백신화 후 8주째에, 정맥혈을 안구로부터 채혈하고, 혈청을 분리시켰다. 상기 혈청 중 중화 항체의 역가를 측정하였다. 상기 검출 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV11 및 HPV6에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; HPV11에 대한 이들의 보호 효과가 HPV11N4 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며 HPV6N5 VLP 단독보다 현저하게 더 높고; HPV6에 대한 이들의 보호 효과가 HPV6N5 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며 HPV11N4 VLP 단독보다 현저하게 더 높음을 보였다. H11N4-6T2 VLP는 마우스에서 HPV11 및 HPV6에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었지만, HPV6에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 그의 능력은 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 경우보다 더 약하였다. 이러한 결과는 H11N4-6T2 VLP, H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 HPV11 감염 및 HPV6 감염의 예방에 유효한 백신으로서 사용될 수 있고 HPV11 VLP 및 HPV6 VLP를 포함하는 혼합 백신 대신에 사용될 수 있음을 보였다.
백신화 스케줄
백신화용 항원 항원보강제 면역화 용량 수 백신화 과정(주)
HPV6N5 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 4 0, 2, 4
HPV11N4 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 4 0, 2, 4
혼합된 HPV11/HPV6 VLP 알루미늄 항원보강제 10 ㎍
(각각의 VLP에 대해
5 ㎍)		 4 0, 2, 4
H11N4-6T1 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 4 0, 2, 4
H11N4-6T2 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 4 0, 2, 4
H11N4-6T3 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 4 0, 2, 4
H11N4-6T4 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 4 0, 2, 4
H11N4-6T5 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 4 0, 2, 4
실시예 6: VLP로 백신화된 마우스의 혈청 중 중화 항체 역가의 평가본 실험에서, 백신화 스케줄을 표 5에 나타내었다. 모든 마우스(6주된 BalB/c 암컷 마우스)를 3개의 그룹: 알루미늄 항원보강제 그룹 1(10 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 알루미늄 항원보강제 그룹 2(1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 및 알루미늄 항원보강제 그룹 3(0.1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용)으로 분류하였다. 각 그룹을 5개의 하위그룹으로 추가로 분류하였다. 대조용 하위그룹 1 내지 3을 각각 HPV11N4 VLP 단독, HPV6N5 VLP 단독 및 혼합된 HPV11/HPV6 VLP(즉 HPV11N4 VLP 및 HPV6N5 VLP의 혼합물, 여기에서 각 VLP를 주어진 면역화 용량으로 제공하였다)로 백신화하였으며, 실험 하위그룹 1 내지 2를 각각 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP로 백신화하였다.
6마리의 마우스/하위그룹을 복강내 주사에 의해 각각 10 ㎍, 1 ㎍, 0.1 ㎍의 면역화 용량, 및 1 ㎖의 주사 부피로 백신화하였다. 상기 마우스 모두에게 0주째에 1차 백신화를 가하고, 이어서 각각 2주 및 4주째에 추가 백신화를 가하였다. 8주째에, 혈액 샘플을 안와 출혈을 통해 채혈하고, 혈청 중 HPV11 및 HPV6에 대한 항체의 역가를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 8A-8C에 나타내었다. 상기 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV11에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV11N4 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV6N5 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하고; 마우스에서 HPV6에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV6N5 VLP 단독 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV11N4 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수함을 보였다. 이는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 HPV11 및 HPV6에 대해 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 보였다.
백신화 스케줄
그룹 백신화용 항원 항원 보강제 면역화 용량 수 백신화 과정(주)
알루미늄 항원보강제 그룹 1 HPV11N4 VLP 알루미늄 항원보강제 10 ㎍ 6 0, 2, 4
HPV6N5 VLP 알루미늄 항원보강제 10 ㎍ 6 0, 2, 4
혼합된 HPV11/HPV6 VLP 알루미늄 항원보강제 각각에 대해 10 ㎍ 6 0, 2, 4
H11N4-6T3 VLP 알루미늄 항원보강제 10 ㎍ 6 0, 2, 4
H11N4-6T5 VLP 알루미늄 항원보강제 10 ㎍ 6 0, 2, 4
알루미늄 항원보강제 그룹 2 HPV11N4 VLP 알루미늄 항원보강제 1 ㎍ 6 0, 2, 4
HPV6N5 VLP 알루미늄 항원보강제 1 ㎍ 6 0, 2, 4
혼합된 HPV11/HPV6 VLP 알루미늄 항원보강제 각각에 대해 1 ㎍ 6 0, 2, 4
H11N4-6T3 VLP 알루미늄 항원보강제 1 ㎍ 6 0, 2, 4
H11N4-6T5 VLP 알루미늄 항원보강제 1 ㎍ 6 0, 2, 4
알루미늄 항원보강제 그룹 3 HPV11N4 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 ㎍ 6 0, 2, 4
HPV6N5 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 ㎍ 6 0, 2, 4
혼합된 HPV11/HPV6 VLP 알루미늄 항원보강제 각각에 대해 0.1 ㎍ 6 0, 2, 4
H11N4-6T3 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 ㎍ 6 0, 2, 4
H11N4-6T5 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 ㎍ 6 0, 2, 4
실시예 7: 혈청전환 유도에 대한 VLP의 ED50의 평가6주된 BalB/c 암컷 마우스(8마리 마우스)를 단일 복강내 주사에 의해 알루미늄 항원보강제로 백신화하였으며, 여기에서 H11N4-6T3 VLP 또는 H11N4-6T5 VLP(0.300 ㎍, 0.100 ㎍, 0.033 ㎍ 또는 0.011 ㎍의 면역화 용량에서)를 실험 그룹에 사용하였고; HPV6N5 VLP 단독 또는 H11N4 VLP 단독(0.300 ㎍, 0.100 ㎍, 0.033 ㎍ 또는 0.011 ㎍의 면역화 용량에서), 또는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP(즉 HPV6N5 VLP 및 HPV11N4 VLP의 혼합물, 여기에서 각각의 VLP에 대한 면역화 용량은 0.300 ㎍, 0.100 ㎍, 0.033 ㎍, 0.011 ㎍ 또는 0.004 ㎍이었다)를 대조용 그룹에 사용하였으며; 면역화 부피는 1 ㎖이었다. 또한, 백신 희석용 희석제를 블랭크 대조용으로서 사용하였다. 8마리의 마우스를 각 그룹에서 백신화하고, 백신화 후 5주째에 혈청을 수집하였다. 이후에, 혈청의 중화 항체 역가를 중화 시험 및 리드 뮤엔치(Reed-Muench) 방법(Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7)에 의해 측정하고, 혈청전환 유도(즉 마우스에서 항체의 생성을 유도하는)에 대한 ED50을 각 샘플에 대해 계산하였다. 결과를 표 6-10에 나타내었다.
마우스에서 HPV6 및 HPV11에 대한 항체의 유도(혈청전환)에 대한 HPV6N5 VLP의 ED50
항체 면역화 용량
(㎍)		 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50 (㎍)
HPV6에 대한 항체 0.300 8 7 92.31% 0.090
0.100 8 5 55.56%
0.033 8 0 0.00%
0.011 8 0 0.00%
HPV11에 대한 항체 0.300 8 1 22.22% >0.3
0.100 8 0 6.25%
0.033 8 1 4.35%
0.011 8 0 0.00%
마우스에서 HPV6 및 HPV11에 대한 항체의 유도(혈청전환)에 대한 H11N4-6T3 VLP의 ED50
항체 면역화 용량
(㎍)		 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50 (㎍)
HPV6에 대한 항체 0.300 8 8 100.00% 0.025
0.100 8 7 92.86%
0.033 8 6 66.67%
0.011 8 0 0.00%
HPV11에 대한 항체 0.300 8 8 100.00% 0.073
0.100 8 5 66.67%
0.033 8 1 9.09%
0.011 8 0 0.00%
마우스에서 HPV6 및 HPV11에 대한 항체의 유도(혈청전환)에 대한 H11N4-6T5 VLP의 ED50
항체 면역화 용량
(㎍)		 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50 (㎍)
HPV6에 대한 항체 0.300 8 4 66.67% 0.180
0.100 8 3 30.70%
0.033 8 1 5.88%
0.011 8 0 0.00%
HPV11에 대한 항체 0.300 8 6 81.82% 0.189
0.100 8 2 27.27%
0.033 8 0 5.88%
0.011 8 1 4.17%
마우스에서 HPV6 및 HPV11에 대한 항체의 유도(혈청전환)에 대한 HPV11N4 VLP의 ED50
항체 면역화 용량
(㎍)		 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50 (㎍)
HPV6에 대한 항체 0.300 8 3 44.44% >0.3
0.100 8 1 7.69%
0.033 8 0 0.00%
0.011 8 0 0.00%
HPV11에 대한 항체 0.300 8 8 100.00% 0.044
0.100 8 7 91.67%
0.033 8 2 36.36%
0.011 8 2 13.33%
마우스에서 HPV6 및 HPV11에 대한 항체의 유도(혈청전환)에 대한 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 ED50
항체 면역화 용량
(㎍)		 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50 (㎍)
HPV6에 대한 항체 각각의 VLP에 대해 0.300 8 7 95.24% 0.033
각각의 VLP에 대해 0.100 8 8 92.86%
각각의 VLP에 대해 0.033 8 4 50.00%
각각의 VLP에 대해 0.011 8 1 7.69%
HPV11에 대한 항체 각각의 VLP에 대해 0.300 8 7 95.65% 0.023
각각의 VLP에 대해 0.100 8 8 93.75%
각각의 VLP에 대해 0.033 8 6 70.00%
각각의 VLP에 대해 0.011 8 1 9.09%
상기 결과는 마우스에서 HPV6에 대한 항체의 생성의 유도에 대한 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 ED50이 HPV6N5 VLP 단독의 경우 및 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며, HPV11N4 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하고; 마우스에서 HPV11에 대한 항체의 생성의 유도에 대한 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 ED50이 HPV11N4 VLP 단독의 경우 및 혼합된 HPV11/HPV6 VLP의 경우에 필적하며, HPV6N5 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수함을 보였다. 이는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 HPV6 및 HPV11에 대해 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 추가로 보였다.실시예 8: 키노몰구스 원숭이에서 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP의 면역 보호의 평가
유사한 체중을 갖는 18마리의 키노몰구스 원숭이를 3개의 그룹(각 그룹에 대해 6마리의 원숭이)으로 무작위 분할하였으며, 여기에서 그룹 1의 원숭이는 5 ㎍ H11N4-6T3 VLP로 백신화하고; 그룹 2의 원숭이는 5 ㎍ H11N4-6T5 VLP로 백신화하고; 그룹 3의 원숭이는 10 ㎍ 혼합된 HPV11/HPV6 VLP(5 ㎍ HPV6N5 VLP + 5 ㎍ HPV11N4 VLP)로 백신화하였다. 사용된 항원보강제는 알루미늄 항원보강제이며, 주사 부피는 1 ㎖이었고, 상기 원숭이들을 근육내 주사에 의해 백신화하였다. 백신화 스케줄을 표 11에 나타내었다.
백신화 후 2개월째에, 정맥혈을 수집하고, 혈청의 중화 항체 역가를 중화 시험에 의해 측정하였다. 실험 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP 중 어느 하나가 키노몰구스 원숭이에서 HPV11 및 HPV6에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; 이들에 의해 유도된 중화 항체의 역가는 혼합된 HPV11/HPV6 VLP에 의해 유도된 중화 항체의 역가에 필적함을 보였다. 이들 결과는 H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP가 모두 양호한 면역원성을 가지며, 키노몰구스 원숭이에서 HPV6 및 HPV11에 대한 교차-보호를 유도할 수 있고, HPV11 및 HPV6에 대한 이들의 보호 효과가 혼합된 HPV11/HPV6 VMLP의 경우에 필적함을 보였다. 따라서, H11N4-6T3 VLP 및 H11N4-6T5 VLP를 HPV6 및 HPV11에 의한 감염의 예방에 사용할 수 있었다.
키노몰구스 원숭이에 대한 백신화 스케줄
면역원 항원보강제 면역화 용량 수 백신화 과정
혼합된 HPV11/HPV6 VLP 알루미늄 항원보강제 10 ㎍ (각각의 VLP에 대해서 5 ㎍) 6 단일 주사
H11N4-6T3 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 6 단일 주사
H11N4-6T5 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ㎍ 6 단일 주사
본 발명의 구체적인 실시태양들을 상세히 기재하였지만, 당해 분야의 숙련가들은 명세서에 개시된 교시에 따라, 이들에 대한 다양한 변형 및 변화를 수행할 수 있고 상기와 같은 변형 및 변화는 본 발명의 범위내에 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구의 범위 및 그의 임의의 균등물에 의해 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> XIAMEN UNIVERSITY; XIAMEN INNOVAX BIOTECH CO. , LTD. <120> MUTANT OF L1 PROTEIN OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 11 <130> IEC150084 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 501 <212> PRT <213> HPV11 <400> 1 Met Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro 1 5 10 15 Val Ser Lys Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile 20 25 30 Phe Tyr His Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr 35 40 45 Tyr Ser Ile Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly 50 55 60 Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe 65 70 75 80 Ala Leu Pro Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val 85 90 95 Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val 100 105 110 Gly Val Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn 115 120 125 Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val 130 135 140 Gly Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro 145 150 155 160 Pro Leu Gly Glu 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acctgtttgt tactgtggta gatac 45 <210> 32 <211> 46 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 32 gaaaaataaa ctgtaaatca aactcttcca catgacgcat gtactc 46 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 33 tttgatttac agtttatttt tc 22 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 34 gtggtttccc cagcaaatac cattg 25 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> HPV6 <400> 35 Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> HPV6 <400> 36 Thr Thr Ser Ser Thr Tyr 1 5 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> HPV6 <400> 37 Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly Gly Asn 1 5 10 15 Pro Gly Gln Asp Asn 20

Claims (11)

  1. 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체로, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질이 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여 하기의 돌연변이:
    (1) 3 내지 6개 아미노산, 예를 들어 3, 4, 5 또는 6개 아미노산의 N-말단 절두; 및
    (2) (a) 상기 야생형 HPV11 L1 단백질의 170-179번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
    (b) 상기 야생형 HPV11 L1 단백질의 346-351번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
    (c) 상기 야생형 HPV11 L1 단백질의 119-140번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환
    을 갖고;
    상기 변체가 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질과 오직 하나 또는 다수(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환(바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실에 의해서만 상이하고, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질의 기능, 즉 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV11 및 HPV6)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 유지하며;
    바람직하게, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질이 상기 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여, N-말단에 절두된 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산을 갖고;
    바람직하게, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질이 상기 야생형 HPV11 L1 단백질과 비교하여, N-말단에 절두된 4개의 아미노산을 갖고;
    바람직하게, 상기 제2 유형의 야생형 HPV가 HPV6이고;
    바람직하게, 상기 (2)(a)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형 HPV6 L1 단백질의 169-178번 위치의 아미노산 잔기 이고;
    바람직하게, 상기 (2)(b)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형 HPV6 L1 단백질의 345-350번 위치의 아미노산 잔기이고;
    바람직하게, 상기 (2)(c)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형 HPV6 L1 단백질의 119-139번 위치의 아미노산 잔기이고;
    바람직하게, 상기 야생형 HPV11 L1 단백질이 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고;
    바람직하게, 상기 야생형 HPV6 L1 단백질이 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고;
    바람직하게, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질이 서열번호 6, 7 및 9로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는
    돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체.
  2. 제 1 항에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 암호화하는 단리된 핵산.
  3. 제 2 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  4. 제 2 항에 따른 단리된 핵산 및/또는 제 3 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 제 1 항에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 HPV 바이러스유사 입자.
  6. 제 1 항에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체, 또는 제 2 항에 따른 단리된 핵산, 또는 제 3 항에 따른 벡터, 또는 제 4 항에 따른 숙주 세포, 또는 제 5 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 포함하는 조성물.
  7. 제 5 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물 또는 백신으로,
    바람직하게, 상기 HPV 바이러스유사 입자가 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 유효한 양으로 존재하고;
    바람직하게, 상기 HPV 감염이 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV11 감염 및/또는 HPV6 감염)이고;
    바람직하게, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 감염이 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는
    약학 조성물 또는 백신.
  8. 제 1 항에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체의 제조 방법으로, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 숙주 세포에서 발현시키고, 이어서 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 상기 숙주 세포의 배양물로부터 회수함을 포함하며;
    바람직하게, 상기 숙주 세포가 이 콜라이(E. coli)이고;
    바람직하게, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 이 콜라이에서 발현시키고, 이어서 상기 이 콜라이의 용해물 상등액을 정제시킴으로써 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 수득하고; 바람직하게, 상기 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체를 크로마토그래피(예를 들어 양이온-교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 상기 이 콜라이의 용해물 상등액으로부터 회수하는 단계들을 포함하는 방법.
  9. 제 5 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제와 병용함을 포함하는 백신의 제조 방법.
  10. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방 방법으로, 피실험자에게 예방학적 유효량의 제 5 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자 또는 제 7 항에 따른 약학 조성물 또는 백신을 투여함을 포함하고,
    바람직하게, 상기 HPV 감염이 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV11 감염 및/또는 HPV6 감염)이고;
    바람직하게, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질병이 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는
    방법.
  11. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방을 위한 약학 조성물 또는 백신의 제조에서 제 1 항에 따른 돌연변이된 HPV11 L1 단백질 또는 그의 변체 또는 제 5 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자의 용도로,
    바람직하게, 상기 HPV 감염이 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV11 감염 및/또는 HPV6 감염)이고;
    바람직하게, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질병이 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는
    용도.
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