KR20230126566A - 핵수송 신호 펩타이드가 접합된 핵산 전달용 2세대 폴리아미도아민 덴드리머 고분자 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는 인간유두종 바이러스 11형 E2 단백질, SV40 바이러스, NOSTRINβ의 핵 수송 신호 펩타이드(nuclear localization signal peptide)를 최적화한 RKRAR, KKRK 펩티드를 2세대의 PAMAM 덴드리머 (PAMAM G2)에 적용하여 하이브리드 고분자 형태의 비바이러스성 핵산 전달체를 제조하였다. 한편, 핵산 전달체 제조 시 비바이러스성 벡터의 과량의 아민기에 의해 야기되는 세포독성을 낮추기 위해 세포독성을 낮추는 것으로 알려진 히스티딘을 함께 접합하여 최종적으로 RKRARH, KKRKH 펩티드를 PAMAM G2에 적용함으로써, PAMAM G2 고분자나 기존의 PAMAM G2 고분자-단백질 접합체와 비교하여 현저하게 증가된 유전자 전달 효율을 가지면서도 PAMAM G2 고분자의 세포 안정성을 그대로 유지한 핵산 전달체의 제조가 가능하였다.

Description

핵수송 신호 펩타이드가 접합된 핵산 전달용 2세대 폴리아미도아민 덴드리머 고분자 유도체 {Polyamidoamine generation 2 dendrimers polymer derivative conjugated with nuclear localization signal peptide for nucleic acid delivery}
본 발명은 핵수송 신호 펩타이드가 접합된 핵산 전달용 2세대 폴리아미도아민 덴드리머 고분자 유도체에 관한 것이다. 본 발명에서 상기 핵수송 신호 펩타이드에는 히스티딘이 결합된 채로 2세대 폴리아미도아민 덴드리머에 결합될 수 있다.
DNA 전달체로서 바이러스 백터는 숙주세포에 대한 선택적 감염 및 형질도입 능력이 우수하다. 그러함에도 불구하고 병원성이 제거된 바이러스벡터를 제작하기 위한 제작공정은 복잡하고 수득률이 낮아 높은 생산비용이 발생하며 체내 투여시 강한 면역반응을 유발할 수 있으며, 사용되는 바이러스의 종류에 따라 숙주세포에 삽입 돌연변이를 유발하여 암발생을 유도할 수 있으며, 숙주의 면역시스템에 기억된 바이러스를 사용할 경우 치료효과가 감소하여 반복투여의 어려움이 있다.
이에 바이러스벡터의 단점을 해결할 수 있는 벡터의 개발이 요구되었으며, 비바이러스 벡터는 대량생산 및 품질관리 용이하며 면역원성이 낮고 유전자 돌연변이를 유발하지 않다는 점에서 바이러스벡터가 가지는 경제성 및 안전성 측면의 단점을 극복할 수 있는 대안으로 연구되고 있다.
비바이러스성 벡터는 세포핵으로 특이적으로 핵산을 전달하는 특이성이 없으므로 세포의 원형질막(cellular membrane), 엔도좀(endosome), 핵막(nuclear membrane) 유전물질을 전달을 방해하는 장벽으로 작용하여 낮은 형질감염효율을 나타낸다. 비바이러스성 벡터의 하나인 폴리아미도아민 덴드리머는 0~10 세대가 존재하며 세대(generation)란 화학구조가 반복되는 것을 의미한다. 폴리아미도아민 덴드리머 0세대는 4개의 아민기를 지니며 세대가 증가할 때 아민기의 수가 2배씩 증가한다. 낮은 세대 (0~3세대)의 덴드리머를 사용하면 낮은세포독성을 나타내지만 형질감염효율이 낮고, 높은 세대의 덴드리머를 사용하면 형질감염효율이 높지만 높은 세포독성을 나타낸다.
따라서, 본 발명에서는 바이러스성 벡터가 가지는 문제의 대안으로서 비바이러스 벡터의 하나인 2세대 폴리아미도아민 덴드리머를 사용하는 대신 핵수송 신호 펩타이드로 표면개질하여 유전자 치료를 위한 전달체로 제조하고자 한다.
한국등록특허 제10-1445438호 (핵산 전달용 ＰＡＭＡＭ 유도체) 한국공개특허 제10-2005-0111586호 (드러그 및 유전자 전달 시스템으로서의 다기능의 덴드리머 및 다중결합된 폴리머) 한국공개특허 제10-2012-0088215호 (목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 나노 파이버 유전자 전달체) 한국공개특허 제10-2018-0084139호 (11형 인유두종 바이러스 엘1 단백질의 돌연변이체) 한국등록특허 제10-1413702호 (이중­다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 종양원성 인유두종 바이러스 유형 동정 방법) 한국등록특허 제10-1484441호 (유전자 전달을 위한 GMP 나노입자) 한국등록특허 제10-2156649호 (효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템) 미국등록특허 제11111472호 (Delivery of biomolecules to immune cells)
본 발명의 목적은 핵수송 신호 펩타이드가 접합된 핵산 전달용 2세대 폴리아미도아민 덴드리머 고분자 유도체 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다. 상기 핵수송 신호 펩타이드에는 히스티딘이 결합된 채로 2세대 폴리아미도아민 덴드리머에 결합될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 RKRAR 펩타이드 또는 서열번호 2의 KKRK 펩타이드; 및,
덴드라이트형(dendrite)의 덴드리머(dendrimer)의 2세대(generation) 폴리아미도아민(PAMAM);
으로 이루어진 핵산 전달용 PAMAM 유도체에 관한 것이다.
서열번호 1의 RKRAR 펩타이드 또는 서열번호 2의 KKRK 펩타이드에 아미노산 잔기가 결합될 수 있으며, 상기 아미노산은 히스티딘일 수 있다.
상기 핵산은 DNA, RNA 또는 pDNA인 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 핵산은 특히 pDNA인 것을 특징으로 한다.
이에 본 발명은 상기 PAMAM 유도체와 핵산이 결합되어 형성된 세포 내 핵산 전달용 복합체를 제공할 수 있다.
상기 복합체는 PAMAM 유도체의 질소/pDNA의 인산 비율(N/P 비율)이 1:1 내지 16:1인 것이 바람직하다.
상기 복합체는 300nm 미만의 크기를 가지고, 바람직하게는 100nm 이상, 300nm 미만의 크기인 것일 수 있다. 또한 20~35 mV의 제타 포텐셜 값을 가지는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 상기 PAMAM 유도체를 이용하여 핵산을 세포 내로 전달하는 방법을 제공한다. 상기 핵산이 전달되는 세포 내 장소는 세포질(cytoplasm) 및 핵(nucleus)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 인간유두종 바이러스 11형 E2 단백질, SV40 바이러스, NOSTRINβ의 핵 수송 신호 펩타이드(nuclear localization signal peptide)를 최적화한 RKRAR, KKRK 펩티드를 2세대의 PAMAM 덴드리머 (PAMAM G2)에 적용하여 하이브리드 고분자 형태의 비바이러스성 핵산 전달체를 제조하였다. 한편, 핵산 전달체 제조 시 비바이러스성 벡터의 과량의 아민기에 의해 야기되는 세포독성을 낮추기 위해 세포독성을 낮추는 것으로 알려진 히스티딘을 함께 접합하여 최종적으로 RKRARH, KKRKH 펩티드를 PAMAM G2에 적용함으로써, PAMAM G2 고분자나 기존의 PAMAM G2 고분자-단백질 접합체와 비교하여 현저하게 증가된 유전자 전달 효율을 가지면서도 PAMAM G2 고분자의 세포 안정성을 그대로 유지한 핵산 전달체의 제조가 가능하였다.
도 1은 본 발명의 PAMAM 유도체 중 RKRARH-PAMAM-G2의 제조방법의 일 예를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2d는 합성된 KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 각각의 구조와 1H NMR(nuclear magnetic resonance) 분광계 분석 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 합성된 KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 다양한 세포별 독성 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 합성된 KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 다양한 세포별 공초점 현미경 분석 결과 이미지이다.
도 5a 내지 도 5d는 합성된 KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 다양한 세포별 트랜스펙션 효율을 분석한 결과 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA pDNA(plasmid DNA) 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"덴드리머(dendrimer)"는 분자의 사슬이 일정한 규칙에 따라 중심에서 바깥 방향으로 규칙적으로 3차원으로 퍼진 형태의 분자를 의미한다. 분자의 외관이 배구공이나 럭비공모양이고, 또한 그 분자사슬이 나무(덴드론)와 유사하기 때문에 이러한 명칭이 붙여졌다.
"트랜스펙션(transfection)"은 배양동물 세포에 핵산(DNA, PNA 등)을 직접 도입하여 세포 내에서 유전형질을 발현시키는 방법을 의미한다. 도입한 핵산은 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 것이 일반적인 방법이다. 도입한 유전자가 세포에서 안정화된 경우는 염색체에 끼어들어간 경우가 많았다. 핵산을 도입한 세포를 형질도입체라고 한다. 형질주입 효율이 매우 낮기 때문에 효율을 높이기 위해서 여러 가지 방법을 개발되었다. 그 중에서도 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법. 전기천공법, 재분포법(리포솜이라는 인공막과 DNA복합체를 만들게 하는 세포와 융합시키는 방법) 등이 있다.
본 발명의 PAMAM 유도체는 1차 아민 말단기를 갖는 선형 및 분지형 중합체 또는 덴드리머를 포함한, 폴리(아미도아민)을 뜻한다. 본 발명에 사용할 수 있는 PAMAM은 덴드라이트형(dendrite), 즉, PAMAM 덴드리머(dendrimer)일 수 있다. 또한, 본 발명에서 PAMAM은 2세대(G2)를 사용하는 것이 가장 좋다.
PAMAM 덴드리머의 말단 아미노기는 정전기적 수단에 의해 DNA에 결합하여 양이온적으로 하전된 배위체를 형성하며, 상기 배위체는 식균작용(endocytosis)에 의해 흡수된다. DNA는 표면의 1차 아민과만 반응하고, 내부의 3차 아민을 남겨두어 덴드리머-유전자 배위체의 엔도좀 탈출을 보조하기 때문에, 별 모양의 폴리머는 많은 장점을 가진다.
본 발명의 PAMAM 유도체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드가 결합된 것일 수 있고, 이 때, 서열번호 1과 PAMAM 유도체, 서열번호 2와 PAMAM 유도체의 사이에 히스티딘기가 도입(결합)되는 것이 더 바람직하다.
이에 본 발명은 바람직하게는,
서열번호 3의 RKRARH 펩타이드 또는 서열번호 4의 KKRKH 펩타이드; 및
덴드라이트형(dendrite)의 덴드리머(dendrimer)의 2세대(generation) 폴리아미도아민(PAMAM);
로 이루어진 핵산 전달용 PAMAM 유도체에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 PAMAM 유도체 제조 공정은 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 수행할 수 있는 방법을 이용할 수 있다.
이러한 과정을 통해 제조되어지는 본 발명의 PAMAM 유도체는 세포내로 핵산을 전달시키는 벡터의 용도로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 PAMAM 유도체는 수용액에서 양성 전하를 띠게되어, 수용액에서 음성 전하를 띠는 물질인 핵산들과 정전기적 인력에 의해 결합하여 복합체(폴리플렉스, polyplex)를 형성할 수 있다.
이에 본 발명의 PAMAM 유도체는 세포내 핵산 전달용 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어 유전자 치료를 위해서는 세포내부(세포핵)에서 DNA가 가진 유전자정보를 이용하여 치료용 단백질로 발현시켜야 하지만(세포형질전환, transfection), DNA 단독으로는 세포 내부로 침투되기 어렵기 때문에, DNA 자체로는 세포형질전환이 어렵다. 그 이유는 세포막이 전체적으로 음성전하를 띠기 때문에, 전기적 반발력으로 음성 전하를 띤 DNA가 세포 내부로 들어가기 어렵기 때문이다. 본 발명에 따른 양성 전하를 띠는 PAMAM 유도체는 음전하를 띠는 DNA를 포함한 다양한 핵산들과 복합체(폴리플렉스)를 형성하여 전체적으로 중성 또는 양이온성을 띠게 하여 세포 내부로의 침투를 용이하게 한다.
따라서, 다른 관점에서 본 발명은 상기 PAMAM 유도체와 핵산이 결합되어 있는, 세포 내 핵산 전달을 위한 복합체에 관한 것이다.
상기 핵산으로는 단일사슬 또는 이중사슬의 DNA 또는 RNA 및 플라스미드를 포함한다. DNA 또는 임의의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드, RNA일 수 있으며 RNA는 mRNA, tRNA, rRNA 뿐만 아니라 임의의 세포의 타겟 DNA, RNA 서열과 상보적인 안티센스 RNA 및 리보자임(Rybozyme)을 포함한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자로는 질병의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에는 각종 호르몬, 조직접합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편 등을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 유전자 발현조절인자, 예를 들면 전사프로모터, 인헨서, 사일렌서, 오퍼레이터, 터미네이터, 어테뉴에이터 및 기타 발현조절인자 등을 포함할 수 있다. 특히 본 발명의 일실시예에서는 pDNA(plasmid DNA)의 전달에 사용하였다.
상기 핵산 이외에 본 발명에 따른 PAMAM 유도체를 이용하여 세포내로 전달되어질 수 있는 물질로는, 예를 들어, 저분자화합물, 펩타이드, 단백질의 군에서 선택되는 1종의 물질일 수 있다. 저분자 화합물의 예를 들면, 5-플루오로우라실, 이부프로펜, 파크리탁셀, 커큐민, 클로람페니콜, 악티노마이신, 독소루비신 등이 있다. 펩타이드는 p53 펩타이드, p16 펩타이드, p21 펩타이드, Smac 펩타이드, VHL 종양억제펩타이드, 메를린, MAK19 등이 있다. 단백질의 예를 들면, α-인터페론, β-인터페론, 에리스로포이에틴, 인슐린, 인터루킨-2, 인간성장인자(HGF), 신경성장인(NGF), 혈관내피성장인자(VEGF) 등이 있다.
본 발명에 따른 PAMAM 유도체는 유전자 이외의 상기 저분자, 펩타이드나 단백질 등의 생기능성 혹은 약물 분자를 전달하는 방식은 다음과 같다.
1) 호스트-게스트 방식
상기 방식은 본 발명에 따른 PAMAM 유도체 내부(host)에 생성되는 공간에 저분자 물질(guest)을 끼워 들어가게 해서 세포 내로 전달하는 모든 방식을 포함하는 것으로, 예를 들어 수용액상에 잘 녹지 않는 약물 분자와 수용성인 PAMAM 유도체가 서로 용해되는 유기 용매상에서 혼합된 후 유기용매를 증발시킨 뒤 남은 침전물을 수용액상에 용해시키는 방법으로 복합체를 만드는 방식이 있다. 또다른 방법으로 물에 섞이는 유기용매에 둘을 용해시킨 후 수용액상에 분산시키는 방법으로 복합체를 만들 수도 있을 것이다. 이러한 방법을 통하면 수용액상에서 극도로 용해도가 낮은 약물 분자를 높은 용해도로 수용액상에 용해시킬 수 있어 생화학 또는 의약학적인 응용이 가능해진다. 끼워 들어가는 약물분자의 크기는 PAMAM유도체의 내부공간에 따라 제한되며 그 약물의 특성에 따라 농도, 용매로 쓰이는 유기용매의 종류나 수용액의 pH, 조성 등은 변화될 수 있다.
2) 화학 결합 방식
본 방식은 본 발명에 따른 PAMAM 유도체의 표면에 생기능성 분자 등을 화학적으로 결합하여 일종의 프로드러그(prodrug) 형태로 세포 내로 전달하는 방식이다. 상기 방식은 크게 다음의 두 가지로 나뉠 수 있다.
① 생체 내에서 안정한 결합
상기 결합방식은 본 발명에 따른 PAMAM 유도체와 생체 내에서 안정한 아마이드 결합이나 -C-N- 결합 등을 통하여 생기능성 분자를 생접합하는 모든 방식을 포함한다. 우선 PAMAM 유도체의 표면은 pKa 값이 다른 일차 아민과 구아니딘 작용기가 노출되어 있으므로 일차 아민만을 이용해 결합시키기 위한 완충액 조건이 필요하다. 예를 들어 PAMAM 유도체의 일차 아민의 친핵성 반응을 이용해 결합시키기 위해서는, 전달 물질의 결합 부위 작용기가 -COOH 작용기나, 각종 할로겐 분자 등과 같은 이탈기(leaving group)로 활성화된 작용기로 화학적 처리를 통해 변형되어야 하며 PAMAM 유도체와 전달 물질간의 직접적인 반응이나 커플링제를 이용한 반응을 통해 결합시킨다.
② 생분해성 결합
본 방식은 상기 ①번 방식과 유사하나 결합을 생체내 안정한 결합이 아닌 생분해성 결합으로 대체하는 모든 방식을 포함한다. 이 방식에는 예를 들어 가수분해를 통해 분해되는 에스테르 결합, 엔도좀 환경의 낮은 pH에서 분해되는 오르토-에스테르, 아세탈, 하이드라존 결합, 세포내 환원 전위에서 분해되는 다이설파이드 결합 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 PAMAM 유도체는 native PAMAM G2 및 통상적으로 사용되는 양이온 담체 PEI와 비교하여 훨씬 높은 트랜스펙션 효율을 가진다. 특히, 일 구체예에서 본 발명의 유도체는 기존의 등록특허 제10-1445438호의 각종 PAMAM-G4 유도체들과 비교하여 세포독성이 더 낮고 트랜스펙션 효율도 높은 것으로 확인된다.
또한, 본 발명의 PAMAM 유도체는 세포질 및 핵으로의 핵산 전달능, 세포 흡수능 또는 핵 내부로의 위치화(localization) 능력도 뛰어나며, 세포독성이 낮다. 상기 PAMAM 유도체는 핵산과 결합하여 나노 사이즈 크기의 복합체를 형성하고 높은 제타 포텐셜 값을 갖는다. 이처럼, 본 발명은 높은 트랜스펙션 효율, 낮은 세포독성, 높은 제타 포텐셜을 갖는 PAMAM 유도체 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 따라서, 효과적인 비바이러스성 유전자 전달 시스템으로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 PAMAM 유도체를 통한 생체분자 운반의 결과는 상이한 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 유전자 트랜스펙션과 안티센스 핵산 운반의 경우에, 표적 유전자 발현 수준은 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 루시페라제 유전자, 또는 베타-갈락토시다제 유전자 발현과 같은 리포터 유전자에 의해 검출될 수 있다. GFP의 신호는 현미경하에 직접 관측될 수 있으며, 루시페라제의 활성은 발광기(luminometer)로 검출될 수 있고, β-갈락토시다제에 의해 촉매화된 청색물이 현미경하에 관측되거나 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정될 수 있다. 본 기술분야의 통상의 실시자들은 이들 리포터가 어떻게 기능하며 이들이 유전자 운반 시스템에 도입될 수 있는지 용이하게 확인할 수 있다. 핵산과 그의 생성물, 혹은 여기에 기술된 방법에 따라 운반된 다른 생체분자와 이들 생체분자에 의해 매개된 표적은 면역형광 검출 또는 효소 면역세포화학, 자기방사기록법, 혹은 인사이투(in situ) 하이브리드화와 같은 각종 방법에 의해 측정될 수 있다. 만약 면역형광법이 부호화된 단백질의 발현을 검출하는데 사용될 경우, 표적 단백질과 결합하는 형광라벨 항체가 사용된다(예컨대, 항체의 단백질의 대한 결합을 위한 적절한 조건하에 슬라이드에 첨가). 단백질을 함유한 세포는 이후 형광 신호를 검출함으로써 확인된다. 만약 운반된 세포가 유전자 발현을 매개할 수 있다면, 표적 유전자 발현 수준은 또한 자기방사기록법, 인사이투 하이브리드화 및 인사이투 PCR과 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 그리고 최종 확인 방법은 운반된 생체분자, 그의 발현물, 그에 의해 매개된 표적, 및/또는 생체분자의 운반으로부터 수득된 최종 생성물의 특성에 의존한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 재료준비 및 세포의 배양
본 발명의 조성물의 주요 원료가 되는 PAMAM 2세대(PAMAM G2)는 Sigma-Aldrich (Seoul, South Korea)에서, Fmoc-His(trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Arg-(pbf)-OH는 Anaspec (San Jose, CA, USA)으로부터, 구입하였다. 그 외의 다른 시약은 Sigma-Aldrich나 Gibco, HyClone, Promega, Thermo Fisher Scientific 사의 통상적인 제품을 이용하였다. WST-8 Cell Viability Assay Kit는 BIOMAX 제품, Dual-LuciferaseVR Reporter 1000 Assay System은 Promega 제품을 구매하였다.
루시페라제 발현 플라스미드는 공지의 방법으로 제조하였다(Lee, M. J. et al., Intraperitoneal gene delivery mediated by a novel cationic liposome in a peritoneal disseminated ovarian cancer model.)
실험에 사용한 Hep G2 세포주 (Human hepatocellular carcinoma cell line) 세포주와 NIH3T3 세포주 (Mouse embryonic fibroblast cell line) 및 Neuro-2A 세포주(Mouse neuroblast cell line) 는 10% FBS와 15 antibiotic-antimycotic reagent가 포함된 DMEM을 이용해 37℃, 5% CO2가 유지된 배양기에서 배양하였다.
실시예 2. KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2 합성
본 발명의 합성예의 도식은 도 1에 일 예로서 나타내었다.
먼저, 액체상 펩티드 합성법을 이용해서 PAMAM Generation 2 (PAMAM-G2)와 Fmoc-lys(boc)-OH 또는 Fmoc-Arg(pbf)-OH, HOBt(N-hydroxybenzotrizole), HBTU(2-(1H-benzotriazolel-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium), DIPEA(Diisopropylethylamine)는 1:4:4:4:8의 몰비율로 DMF(N,N-dimethylformamide)에서 18시간 동안 43℃에서 반응하였다. 그 후, 합성된 물질은 차가운 디에틸에테르로 침전하고, 씻어준다. 침전된 합성물을 질소가스로 건조시킨 후 7:3 (v/v)의 DMF/piperidine 혼합물에 용해시켜 암조건 하에서 2시간 동안 Fmoc 보호기 제거를 진행하였다. 이 후에 다음 아미노산 서열들을 동일한 방법으로 펩티드 합성을 진행한다. 아르기닌의 Pbf, 히스티딘의 Trt, 라이신의 Boc 보호기 제거를 위해 TFA/TIS/3차 증류수 (trifluoroaceticacid/triisopropylsilane/tertiary distilled water ; 부피비 95:2.5:2.5) 에 용해시키고 7시간 동안 반응시켰다.
실험에 필요한 대로 각각 KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2가 생성되면, 이후에 디에틸에테르로 침전 후 씻어준 다음에 3차 증류수에 용해시켜 투석막 (MWCO 3500, spectra/por)에 옮긴 후 24 시간 동안 투석을 진행하여 화학반응이 되지 않은 아미노산이나 커플링 시약으로부터 단백질을 정제하였다. 투석 후 동결건조 진행하였다.
합성된 KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 순도는 HPLC를 이용하여 확인하였다. 컬럼은 C18 (5 ㎛, 262.1x100㎜)를 이용하여 검출기 파장은 210 ㎚, 컬럼온도는 25℃, 속도는 0.4 ㎖/min 조건에서 10분간 0.1% 트리플루오로아세트산이 들어있는 물과 아세토니트릴을 95:5에서 75:25의 구배로 분석하였다.
각 조성물의 합성률은 600 MHz 핵자기공명분석법 (NMR)으로 분석하였다.
분석결과를 통해 확인된 합성된 KKRK-G2, KKRKH-G2, RKRAR-PAMAM G2 및 RKRARH-PAMAM G2 각각의 구조와 1H NMR(nuclear magnetic resonance) 분광계 분석 결과는 도 2a 내지 도 2d와 아래에 나타내었다. 이 때 최종 각 HPLC 결과에서 가장 큰 피크가 한 개씩 나타나 각 조성물이 초고순도로 합성되었음을 확인할 수 있었고, 1H NMR 결과를 통해 모두 약 90% 이상의 합성률을 확인할 수 있었다.
RKRAR-PAMAM G2: δ (ppm) 1.42 (알라닌 -H3CCHNHCO-), 1.52 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 1.70 (아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH- 및 라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 1.81 (아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH 및 라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 2.47 (PAMAM -NCH2CH2CO-), 2.69 (PAMAM -CONHCH2CH2N-), 2.87 (PAMAM -NCH2CH2CO-), 3.03 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 3.23 (아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 3.33 (PAMAM -CONHCH2CH2NHCO- 및 PAMAM -CONHCH2CH2NHCO-), 3.41 (PAMAM -CONHCH2CH2NHCO), 3.80 (아르기닌 -HCCH2CH2CH2NH-), 4.26 (알라닌 -H3CCHNHCO-), 4.34 (아르기닌 -HCCH2CH2CH2NH-, 라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-).
RKRARH-PAMAM G2: δ (ppm) 1.33 (알라닌 -H3CCHNHCO-), 1.44 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 1.68 (아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH- 및 라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 1.75 (아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 1.91 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 2.63 (PAMAM -NCH2CH2CO-), 3.08 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH- 및 PAMAM -CONHCH2CH2N-), 3.10 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH- 및 PAMAM -NCH2CH2CO-), 3.19 (PAMAM -NCH2CH2CO-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH- 및 라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 3.38 (PAMAM -CONHCH2CH2NHCO-), 3.33 (PAMAM -CONHCH2CH2NHCO-), 3.48 (PAMAM -CONHCH2CH2NHCO-), 4.05 (아르기닌 -HCCH2CH2CH2NH-), 4.25 (아르기닌 -HCCH2CH2CH2NH- 및 라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 4.33 (알라닌 -H3CCHNHCO-), 4.58 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH-), 7.17 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH-) 및 8.26 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH-).
KKRK-G2: δ(ppm) 1.545 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 1.789 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 1.856 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 2.526 (PAMAM -NCH2CH2CO-), 2.738(PAMAM -CONHCH2CH2N-), 2.926 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 3.089 (PAMAM -NCH2CH2CO-), 3.306 (라이신 -NH2CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 3.382 (PAMAM -NCH2CH2NCO2-), 3.7 (PAMAM -NCH2CH2NCO-), 4.414 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-).
KKRKH-G2: 1.589 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 1.852 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 1.939 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 2.604 (PAMAM -NCH2CH2CO-), 2.858 (PAMAM -CONHCH2CH2N-), 3.035 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 3.154 (PAMAM -NCH2CH2CO-, 히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH-), 3.340 (라이신 -NH2CHCH2CH2CH2CH2NH2-), 3.484 (PAMAM -NCH2CH2NCO-), 4.009 (PAMAM -NCH2CH2NCO-), 4.479 (라이신 -CHCH2CH2CH2CH2NH2-, 아르기닌 -CHCH2CH2CH2NH-), 4.679 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH-), 7.145 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH-), 7.95 (히스티딘 -HCCH2CCHNCHNH-).
실시예 3 : 아가로스 겔 지연(Agarose Gel Retardation)을 통한 KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2와 플라스미드 DNA의 폴리플렉스 형성 분석
본 발명의 조성물은 양전하를 띠게 되어 음전하를 띠는 DNA를 포함한 다양한 핵산들과 복합체(폴리플렉스)를 형성하게 되고, 이를 통해 세포 내부로 핵산을 전달하는 역할을 하게 된다.
이를 위해 0.5 ㎍ pDNA (플라스미드 DNA, pCN-luc)와 본 발명의 조성물이 중량비 별로 혼합되었을 때, 아가로스 겔 지연분석을 통해 PAMAM 유도체와 pDNA의 복합체 (폴리플렉스)형성 여부를 확인하였다.
먼저, HEPES buffer (125 mM, pH 7.4) 상에서 중량비대로 준비한 뒤, 30분 동안 상온에서 complex시켰다. 0.7 % 아가로스겔에 EtBr 0.5 ㎍/μl를 처리해서 100 V에서 15분 동안 전기영동을 수행하였다. 이와 별개로, 30분의 complex 후 각각 3차 증류수를 첨가하여 Zetasizer Nano ZS (Malvern instruments Ltd, Malvern, UK)로 측정하였다.
gel 전기영동상의 실험 결과는 다음과 같이 표 1에 나타내었다.
폴리플렉스 형성 혼합비
KKRK-PAMAM-G2 : pDNA 8:1
KKRKH-PAMAM-G2 : pDNA 1:1
RKRAR-PAMAM-G2 : pDNA 2:1
RKRARH-PAMAM-G2 : pDNA 2:1
표 1을 참고하면, 각 혼합비가 적어도 폴리머 : pDNA이 8:1 이내에서 폴리플렉스가 형성되는 것으로 확인되어, 본 발명의 핵산 전달용 폴리머의 상태가 매우 양호한 조성물인 것으로 확인된다.
한편, 세포 내로 유전자가 이입되기 위해서 폴리플렉스는 300 nm 이하의 나노사이즈를 가지는 것이 중요하며, 본 발명의 핵산 전달용 폴리머는 하기 표 2와 같이 이 조건을 충족하였고, 제타 포텐셜(전위)가 약 115.50±1.93mV인 pDNA와 비교하여 핵산 전달용 폴리머의 폴리플렉스에서 +21 내지 +34의 값을 갖는 것으로 나타났다. 제타 포텐셜(zeta potential)이란 대전된 입자표면에 붙어 있는 불가동수분과 입자로부터 쉽게 떨어져 나갈 수 있는 가동수분의 확산 이중층에서의 양전하 밀도차이에서 유래되는 전기역학적인 전위차를 의미한다. 세포표면과 주변 배양액 사이의 전기적 전위차 또는 제타전위로 나타내기도 한다.
8:1 혼합물 폴리플렉스 size (nm) Zeta potential (mV)
KKRK-PAMAM-G2 : pDNA 176 +26.13±0.47
KKRKH-PAMAM-G2 : pDNA 178 +33.80±2.61
RKRAR-PAMAM-G2 : pDNA 282 +20.21±3.21
RKRARH-PAMAM-G2 : pDNA 286 +21.34±2.52
실시예 4 : 세포 내 독성 실험
HepG2, NIH3T3, Neuro-2A 세포주에서 세포독성을 확인하기 위해 WST-8 assay (Biomax, Quanti-Max)를 수행하였다. 각 세포를 96 well plate에 18,000 세포/well 로 분주한 뒤, 37 ℃, 5% CO2, 95% 습도조건에서 배양하였다. 18시간 후, 다양한 농도로 준비된 PEI 25 kDa, PAMAM-G2, KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2를 세포에 처리하고 24시간 동안 동일 조건에서 배양하였다. 다양한 폴리머들의 처리시간 24시간에 도달하기 2시간 전에 Ez-Cytox reagent WST-8 시약을 각 well 당 10 ㎕씩 처리한 후, 2시간 동안 반응시켰다. 이 후, ELIZA (VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450 ㎚의 흡광도에서 측정하였다.
그 결과 도 3a 내지 3d의 결과와 같이 세포독성이 가장 낮은 것은 KKRKH-PAMAM-G2와 RKRARH-PAMAM-G2인 것으로 확인된다.
이를 통해 KKRK 서열과 RKRAR 서열에 접합한 히스티딘이 세포 내로의 유입시 세포독성을 낮춰주는 역할을 하는 것으로 확인된다.
실시예 5. 세포 내 유전자 전달 효율 실험
KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 세포 내 유전자 전달 효율을 확인하기 위해 HepG2와 NIH3T3 세포주에서 진행하였다. 각 세포를 96 well plate에 18,000 세포/well 로 분주한 뒤, 37 ℃, 5% CO2, 95% 습도조건에서 배양하였다. Complex test와 동일한 방식의 중량비로 세포 배양액을 첨가하여 30 ㎕의 폴리플렉스를 만들고, 세포가 분주된 후 18시간에 도달할 때 세포에 처리하였다. 폴리플렉스가 처리된 후 24 시간이 되었을 때, 세포 배양액을 제거하고 DPBS로 씻어준 후 Reporter Lysis Buffer (Promega)를 상온에 30분간 반응시켜 세포를 용해시킨다. 13200 rpm, 10분간 원심분리기를 이용해서 상층액을 분리시키고, 상층액을 사용하여 Micro BCATM 79 Protein Assay(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용해서 생성된 단백질을 정량하고 Lumat LB 9507(Berthold Technology, Bad Wildbad, Germany)로 luciferin agent (Promega)를 처리하여 루시페라아제 활성을 측정하였다. 최종적으로 RLU/㎍ protein의 단위로 나타내었다.
이에 대한 결과는 도 4a 내지 4d에 나타내었는데, KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 유전자 전달 효율이 모두 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 공초점 형광현미경 확인을 통한 핵산 전달 확인
세포 내로 pDNA가 잘 들어갔는지 확인하기 위해 공초점 형광현미경을 사용하였다. pDNA는 Alexa 546 Nucleic Acid Labeling Kit의 protocol에 명시된 것과 동일하게 형광표지 하였다. NIH3T3 세포주를 1 μ-Slide 8 well(Ibidi)에 30,000세포/well 분주한 뒤, 37 ℃, 5% CO2, 95% 습도조건에서 24시간 동안 배양한다. 그 이후 형광표지된 pDNA와 PEI 25 kDa, PAMAM-G2, KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2의 폴리플렉스를 세포에 처리해준다. 24시간 동안 배양한 후, 공초점 현미경으로 분석하기 30분 전에 세포핵을 Hoechst 33342으로 10분간 반응시켜 염색하고 Zeiss LSM 5 Live scanning microscope(Carl Zeiss, Jena, Germany)를 통해 관찰하였다.
공촛점 이미지 확인 결과는 도 5에 나타내었는데, KKRK-PAMAM-G2, KKRKH-PAMAM-G2, RKRAR-PAMAM-G2 및 RKRARH-PAMAM-G2와 pDNA(pCN-Luci)와의 각각의 폴리플렉스가 각 세포에서 잘 작용하는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 모든 결과를 종합해 볼 때, PAMAM-G2 유도체에 결합된 펩타이드가 핵수송 펩타이드 유래인 KKRK- 또는 RKRAR- 가 결합될 경우, pDNA의 전달율이 매우 우수함을 확인할 수 있었고, 이 중에서도 세포 독성이 거의 없는 상태로 pDNA를 전달할 수 있기 위해 각 펩타이드에 히스티딘을 결합하는 것이 가장 효율적임을 알 수 있었다.
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Claims (8)

  1. 서열번호 1의 RKRAR 펩타이드 또는 서열번호 2의 KKRK 펩타이드; 및
    덴드라이트형(dendrite)의 덴드리머(dendrimer)의 2세대(generation) 폴리아미도아민(PAMAM);
    으로 이루어진 핵산 전달용 PAMAM 유도체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA 또는 pDNA인 것을 특징으로 하는 PAMAM 유도체.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 RKRAR 펩타이드 또는 서열번호 2의 KKRK 펩타이드에 아미노산 잔기가 결합된 것을 특징으로 하는 PAMAM 유도체.
  4. 제1항의 PAMAM 유도체와 핵산이 결합되어 형성된 세포 내 핵산 전달용 복합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 복합체는 PAMAM 유도체의 질소/pDNA의 인산 비율(N/P 비율)이 1:1 내지 16:1인 것을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 복합체는 300nm 미만의 크기를 가지고, 10~25 mV의 제타 포텐셜 값을 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. 제1항의 PAMAM 유도체를 이용하여 핵산을 세포 내로 전달하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    핵산이 전달되는 세포 내 장소는 세포질(cytoplasm) 및 핵(nucleus)인 것을 특징으로 하는 방법.
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Non-Patent Citations (1)

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Title
미국등록특허 제11111472호 (Delivery of biomolecules to immune cells)

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