KR102156649B1 - 효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템 - Google Patents

효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템에 관한 것으로, 상기 효소 반응 양친매성 펩티드는 구체적으로 아르기닌(R)-히스티딘(H)-[글리신(G)-페닐알라닌(F)-류신(L)-글리신(G)]n의 서열로 이루어진 펩티드로, 상기 펩티드는 자가조립(self-assembly)에 의해 나노입자를 형성하는데, 친수성 서열인 RH가 바깥쪽으로 향하고, 소수성 서열인 GFLG는 안쪽으로 위치하는 특징이 있으며, 항암제 등의 소수성의 약물을 안쪽에 품은 채로 세포 안으로 이동할 수 있는 특징이 있다. 또한, GFLG는 카텝신-B 효소에 의해 절단되는 특징이 있어 본 발명에 따른 나노입자가 세포막을 투과하여 세포 안으로 들어오면 카텝신-B에 의해 절단되어 약물이 방출되는 것이다.

Description

효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템{Drug delivery system comprising enzyme-responsive amphiphilic peptide}
본 발명은 효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템에 관한 것이다.
펩티드는 우수한 생체 적합성과 생분해성으로 인해 약물전달 시스템으로 연구되고 있을 뿐만 아니라, 펩티드는 중요한 생물학적 메커니즘에 관여하여, 전략적이고 효율적인 펩티드 기반 시스템으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 세포-투과성 펩티드(cell-penetrating peptides; CPP)는 세포 유입을 증진시키는데 적용할 수 있다. 라이신(lysine)과 아르기닌(arginine)은 세포막과의 상호 작용을 유도하고 나노 입자, 작은 분자 및 유전자와 같은 물질을 전달할 수 있다.
유전자 전달 시스템은 효과적인 유전자 발현을 위해서는 핵막의 침투를 요구하기 때문에, 핵 위치 서열(nuclear localization sequence; NLS)은 핵 전달에 의해 세포 핵으로 단백질을 도입하는데 사용될 수 있다. 따라서 NLS는 유전자 전달에 유용하게 사용될 수 있다. 한편, 미토콘드리아 표적 펩티드도 전달 시스템에 유용한 도구로 사용될 수 있다는 것이 보고되어, 새로운 전달 시스템으로서 연구되어왔다.
양친매성 펩티드(AP)의 자가조립 나노 구조는 아미노산 디자인에 의해 유도된 자가조립 능력으로 인해 약물 전달 시스템으로 많은 주목을 받고 있다. 최근 연구에서 coiled-coil helix bundle에 기반한 AP는 계층적 어셈블리를 형성하는 것으로 나타났다. 칼슘 채널에서 유래한 폴리펩티드를 약물 전달 시스템으로 적용하는 것에 대한 연구가 진행되고 있고, siRNA 전달 시스템에서 아르기닌과 발린을 함유한 AP가 보고된 바 있으며, AP를 기반으로 하는 나노 구조는 자기-보조(self-adjuvant) 특성을 나타내기도 하였다. 분지된 양친매성 펩티드 캡슐은 캡슐화된 용질의 세포 흡수 및 보유에 대해 연구가 보고된 바 있다.
양친매성 펩티드를 이용하는 약물 전달 시스템(DDS)은 생체 적합성 및 효율적인 전달 캐리어로서의 가능성을 갖는다. 대부분의 치료제는 소수성이며, 수용액에서의 용해도가 낮아 치료 효능이 낮은 문제점이 있다. 따라서 캡슐화를 통해 약물의 용해도를 향상시킬 필요가 있다. 친수성 헤드와 소수성 코어를 함유한 AP는 소수성 약물을 캡슐화할 수 있으므로 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 상기 펩티드는 생체 적합성 및 생분해성이 우수하여 약물 전달 시스템에서 유리하다. 실제로, 중합체에 기초한 전달 시스템은 낮은 분해성 및 과량의 세포 내 축적 때문에 현저한 세포 독성을 갖는 것으로 보고되었다.
그러나 AP를 이용한 약물 전달 시스템은 아직 폴리머 기반의 약물 전달 시스템에 비해 만족스러운 결과를 얻지 못한 실정이다. 그러므로 전달 시스템의 효율을 높이려면 약물 방출의 안정성과 제어가 개선되어야 할 것이다. .
한편, 본 발명 관련 기술로, 한국등록특허 제1647178호에 효소 절단성 링커 또는 올리고 라이신을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜-리피드를 이용한 안정화된 플라스미드-지질 입자에 관한 기술이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0857389호에 AP-GRR 펩티드 또는 AP-GRR 펩티드를 포함하는 펩티드 사슬 및 이를 포함하는 약물 전달 담체에 관한 기술이 개시되어 있으나, 본 발명의 효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템에 관하여 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 약물 전달체를 제공하고, 본 발명의 펩티드 나노입자는 자가조립하여 약물을 봉합할 수 있으며, 세포독성이 없고, 타겟 약물을 봉합한 펩티드 나노입자가 세포 내로 약물을 전달하여 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 소수성 항암제 전달체를 제공한다.
[일반식 1]
아르기닌(R)-히스티딘(H)-[글리신(G)-페닐알라닌(F)-류신(L)-글리신(G)]n
상기 일반식 1에서, 펩티드를 형성하는 아미노산의 키랄성은 LRH-L(GFLG)n이고, n=3~10인 정수이다.
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본 발명은 효소 반응 양친매성 펩티드를 포함하는 약물전달 시스템에 관한 것으로, 상기 효소 반응 양친매성 펩티드는 구체적으로 아르기닌(R)-히스티딘(H)-[글리신(G)-페닐알라닌(F)-류신(L)-글리신(G)]n의 서열로 이루어진 펩티드로, 상기 펩티드는 자가조립(self-assembly)에 의해 나노입자를 형성하는데, 친수성 서열인 RH가 바깥쪽으로 향하고, 소수성 서열인 GFLG는 안쪽으로 위치하는 특징이 있으며, 항암제 등의 소수성의 약물을 내부에 품은 채로 세포 안으로 이동할 수 있는 특징이 있다. 또한, GFLG는 카텝신-B 효소에 의해 절단되는 특징이 있어 본 발명에 따른 나노입자가 세포막을 투과하여 세포 안으로 들어오면 카텝신-B에 의해 절단되어 약물이 방출되는 것이다. 따라서 본 발명의 약물 전달 시스템은 소수성 약물인 항암제 등의 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 약물전달체의 일례로, RH-(GFLG)3 나노입자를 도식화한 것이다.
도 2는 RH-(GFLG)3 나노입자의 물리적 특성을 확인한 결과이다. (A)는 LL 나노입자의 크기 분포를 나타낸 히스토그램이고, (B)는 LL 펩티드 나노입자의 필드 방사 주사 전자 현미경으로 측정한 이미지이고, (C)는 LL 및 DD 나노입자의 저장기간에 따른 크기 변화를 나타낸 그래프이고, (D)는 LL 및 DD 나노입자의 CD(Circular dichroism) 스펙트럼이고, (E)는 LL 펩티드 나노입자의 최저미셀형성농도(Critical micelle concentration; CMC)를 확인한 결과이다.
도 3은 RH-(GFLG)3 나노입자의의 세포독성을 확인한 결과이다. (A)는 MTT 어세이 결과이고, (B)는 LDH 어세이 결과이며, (C)는 용혈작용(Hemolysis) 어세이 결과이고, (D) 제브라피쉬(Zebra fish) 배아 발생 테스트 결과이다. LL은 LRH-L(GFLG)3이고, LD는 LRH-D(GFLG)3이며, DD는 DRH-D(GFLG)3이고, DL은 DRH-L(GFLG)3이며, PEI 25KD는 양성 대조군으로 양이온성 폴리머이다.
도 4는 나일 레드가 결합된 RH-(GFLG)3 나노입자의 세포 유입 어세이 결과이다. (A)는 공초점 현미경으로 확인한 이미지이고, (B)는 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석 결과이다.
도 5는 MALDI-TOF 질량분석을 이용한 효소 민감도 어세이 결과이다. (A) LL 펩티드(control), (B) 카텝신 B(cathepsin B)를 처리한 LL 펩티드; (C) LD 펩티드(control) (D) 카텝신 B(cathepsin B)를 처리한 LD 펩티드; (E) DL 펩티드(control) (F) 카텝신 B(cathepsin B)를 처리한 DL 펩티드; (G) DD 펩티드(control) (H) 카텝신 B(cathepsin B)를 처리한 DD 펩티드.
도 6은 효소 처리에 의한 LL-Dox 및 DD-Dox로부터 방출된 약물(독소루비신)의 누적 방출량을 나타낸 결과이다.
도 7은 HeLa 세포에서, 독소루비신(Dox)이 봉합된 RH-(GFLG)3 나노입자의 세포 유입 어세이 결과이다.
도 8은 HeLa 및 SW480 세포에서, Dox-RH-(GFLG)3 나노입자의 항암활성을 확인한 결과이다. (A)는 SW480 세포에서 48시간 동안 인큐베이션 한 후의 세포 생존율이고, (B)는 HeLa 세포에서 72시간 동안 인큐베이션 한 후의 세포생존율이다. ** 및 ***은 독소루비신 단독을 처리한 것에 대비하여 본 발명의 Dox-RH-(GFLG)3 나노입자의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, **는 p<0.01이며, ***는 p<0.001이다.
도 9는 Dox-RH-(GFLG)3 나노입자의 항암 활성을 확인한 결과이다.
본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.
[일반식 1]
아르기닌(R)-히스티딘(H)-[글리신(G)-페닐알라닌(F)-류신(L)-글리신(G)]n
상기 일반식 1에서, n은 3~10인 정수이다.
상기 펩티드는 자가조립(self-assembly)하여 바깥쪽으로 친수성의 아르기닌(R)-히스티딘(H)의 아미노산 서열이 위치하고, 안쪽으로 소수성 잔기의 글리신(G)-페닐알라닌(F)-류신(L)-글리신(G)의 아미노산 서열이 위치하는 미셀 형태의 나노입자를 형성하는 것이 특징이다.
상기 펩티드를 형성하는 아미노산의 키랄성(chirality)은 L-형 또는 D-형일 수 있으나, 바람직하게는 친수성의 아르기닌 및 히스티딘 아미노산이 L- 또는 D-형일 수 있으며, 마찬가지로 소수성의 글리신, 류신, 페닐알라닌 및 글리신 아미노산이 L- 또는 D-형일 수 있고, 더 바람직하게는 상기 펩티드를 형성하는 아미노산의 키랄성(chirality)은 LRH-L(GFLG)n, LRH-D(GFLG)n 또는 DRH-L(GFLG)n(DL)인 것이며, 가장 바람직하게는 LRH-L(GFLG)n인 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 미셀의 안쪽에 소수성 항암제를 함유할 수 있으며, 상기 소수성 항암제는 독소루비신, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 캠프토테신 및 액티노마이신 D 중에서 선택된 하나 이상의 항암제인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 독소루비신이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 펩티드는 카텝신 B(Cathepsin B) 효소에 의해 절단되는 것이 특징이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 펩티드의 나노입자 의 형성
RH-GFLG(서열번호 1), RH-(GFLG)2(서열번호 2), LRH-L(GFLG)3(LL)(서열번호 3), LRH-D(GFLG)3(LD)(서열번호 3), DRH-L(GFLG)3(DL)(서열번호 3), 및 DRH-D(GFLG)3(DD)(서열번호 3)는 펩트론에서 구매하였고, 상기 펩티드 중에서, 이성질체가 포함된 LD, DL, DD 펩티드는 대조군으로 사용하였다.
펩티드는 최종 농도가 1~10mg/㎖이 되도록 물에 녹여 준비한 후, 15분 동안 초음파 처리하여 펩티드 나노입자를 형성시키고, 4℃에서 하루 동안 보관한 후 사용하였다.
나일 레드가 태깅된 펩티드 나노입자는 세포 유입 어세이를 위해 준비하였는데, 나일 레드는 메탄올을 용매로 하여 100nM의 농도가 되도록 준비한 후, 나일 레드:펩티드가 1:105의 몰비가 되도록 상기 펩티드 용액과 나일레드를 혼합하고 15분 동안 초음파 처리하였다. 펩티드에 태깅되지 않은 나일레드는 스핀칼럼으로 제거하고, 나일레드 태깅된 펩티드 나노입자는 4℃에서 보관하였다.
실시예 2. 펩티드 나노입자 의 물리적 특성
펩티드 나노입자의 크기는 0.5mg/㎖의 농도에서 Photal사의 ELS-Z2 동적광산란입도계를 이용하여 분석하였다. 펩티드 나노입자의 표면 전하 값은 Malvern사의 Nano-ZS로 측정하였다. 나노입자의 안정도를 확인하기 위하여, LL 펩티드 나노입자는 30일 동안 동적 광산란 입도계로 지속적으로 분석하였다. LL 펩티드 나노입자의 형태는 히타치사의 주사전자현미경으로 분석하였다. 주사전자현미경 측정을 위하여, 펩티드 나노입자는 실리콘 웨이퍼 위에서 건조한 다음 오스뮴으로 코팅하였다. 준비된 펩티드 나노입자는 5~10kV 전압 조건에서 주사전자현미경으로 분석하였다. 자가조립(self-assembly)으로 형성된 펩티드 나노입자의 구조는 Jasco사의 CD 분석기를 이용하여 측정하였다. LL 및 DD 펩티드 나노입자 용액을 190~260nm 파장 범위에서 측정하였다.
그 결과 도 2의 (A) 및 (B)에 개시한 바와 같이, 본 발명에 따른 LL 펩티드 나노입자의 크기(직경)는 약 100nm 수준으로 나타났으며; 도 2의 (C)는 LL 및 DD 펩티드 나노입자는 4℃에서 30일 정도 저장해도 그 크기(직경)가 약 200nm 정도를 유지한다는 것으로 나타났고; 도 2의 (D)는 LL 펩티드 나노입자의 91.5%가 turn 구조이고, 8.5%가 random 구조라는 것을 확인하였고, DD 펩티드 나노입자의 29.2%가 beta-sheet 구조이며, 15%가 turn 구조이고, 55.8%가 random 구조라는 것을 확인하였다.
실시예 3. 펩티드 나노입자의 임계 미셀 농도 분석
펩티드 나노입자의 임계 미셀 농도는 소수성의 나일레드를 이용하여 분석하였다. 펩티드 나노입자는 0.001~0.3mg/㎖로 1㎖씩 준비하였다. 준비된 나노입자 용액과 40μM의 나일레드 용액 5㎕을 혼합하였다. 나일레드 용액에 포함된 에탄올을 제거하기 위하여, 질소로 날려준 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 시료들은 형광기를 이용하여 515nm에서 여기(excitation)하여 550~750nm에서 측정하였다. 펩티드 나노입자의 임계 미셀 농도는 650nm에서 분석하였다.
그 결과 도 2(E)에 개시한 바와 같이 나노입자의 임계 미셀 농도가 0.02mg/㎖인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 펩티드 나노입자 의 세포 독성 확인
(1) 세포배양
HeLa 세포는 89%의 DMEM, 10%의 FBS 및 0.1mg/㎖의 antibiotic-antimycotic시약이 포함된 상태에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 배양한 HeLa 세포를 이용하여 펩티드 나노입자의 세포독성을 분석하였다.
(2) WST -1 분석
HeLa 세포를 96웰 마이크로플레이트에 각 웰당 1.0×104 개의 세포를 분주하여 24시간 동안 인큐베이션하였다. PEI 25KD, LL, LD, DL 및 DD는 0.025~0.2㎍/㎕의 농도로 준비하였다. 24시간 동안 안정화 후, 10㎕의 WST-1를 처리하고 2시간 동안 반응시켰다. WST-1 포말잔은 VERASmax 마이크로 리더기를 이용해서 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3의 (A)에 개시한 바와 같이, LL, DD, DL 및 LD 펩티드 나노입자는 세포독성이 거의 없어, 세포 생존률(%)에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
(3) LDH 활성 분석
20%의 Tween-20을 처리한 세포를 LDH 최대 활성을 나타낸 대조군으로 사용하였으며, 각각의 시료를 처리하고 24시간 후, 각 시료의 상층액을 10㎕씩 취한 후, 이 상층액을 0.2mM의 NADH 및 2.5mM의 피브르산나트륨이 포함된 반응 용액과 함께 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 시료는 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3의 (B)에 개시한 바와 같이, LL, DD, DL 및 LD 펩티드 나노입자는 세포막을 손상시키지 않아 LDH 방출이 거의 일어나지 않는 것으로 나타났다.
실시예 5. 나노입자의 용혈작용에 대한 분석
LL, LD, DL, DD 펩티드 나노입자의 용혈분석은 인간의 적혈구를 이용하여 실시하였고, PEI 25KD을 양성대조군으로 사용하였다. 본 실시예 6에서 사용한 혈액은 건강한 지원자로부터 채취하였다. 혈액에 EDTA를 처리하여 응고를 방지한 후, 5000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 혈장으로부터 적혈구를 분리하였다. 분리한 적혈구는 PBS를 이용해서 2번 씻어 준 후, 1㎖ 당 2.0×108 개의 세포로 준비하였다.
용혈 작용을 비교 분석하기 위해서, 0.2%의 트리톤 X-100을 처리한 군을 최대 용혈 대조군으로 설정하였으며, 0.25㎖의 적혈구와 0.25㎖의 시료를 혼합하여, 최종 농도가 0.1 또는 0.2 mg/㎖가 되도록 준비하여 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 반응이 끝난 시료는 5000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액 30㎕을 취하였다. 이 상층액을 PBS로 10배 희석하여 450nm의 파장에서 VERSAmax 마이크로플레이트 리더로 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 3의 (C)에 개시한 바와 같이, LL, DD, DL 및 LD 펩티드 나노입자는 적혈구 세포를 용해하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 6. 세포 유입 어세이
펩티드 나노입자의 세포 유입 능력은 레이카사의 형광현미경, 자이스사의 공초점 현미경 및 BD 바이오사이언스사의 유세포 분석기로 분석하였다. 나일레드로 표지된 LL, DL, LD, DD 펩티드 나노입자들은 최종 농도가 0.2mg/㎖이 되도록 처리하여 6시간 또는 16시간 방치하였다. 그 후에, HeLa 세포는 20μM의 Hoechst 33324를 15분 동안 처리하여 핵을 염색하여 형광현미경과 공초점 현미경으로 분석하였다. 유세포 분석에서는 웰당 1.0×106개의 HeLa 세포를 분주하여 24시간 동안 안정화 한 후, 최종 농도 0.2mg/㎖로 처리하여 16시간 동안 방치하였다. 그 후에, HeLa 세포는 DPBS로 2번 세척한 후 trypsin-EDTA를 이용하여 수확하였다. HeLa 세포를 1500rpm에서 3분 동안 원심분리하여 수확한 후, 500㎕의 PBS로 분산시켜 준 후, 유세포 분석기를 이용하여 세포 유입 여부를 확인하였다.
도 4에 개시한 바와 같이, 나일레드로 염색된 LL, DL, LD, DD 펩티드 나노입자들은 세포질에 유입되었으며, 유입된 정도는 LL > DL, LD >> DD 순으로 나타났다.
실시예 7. 독소루비신이 봉합된 RH-( GFLG ) 3 나노입자의 준비
독소루비신을 펩티드 나노입자에 봉합하여 약물전달체로서의 효능을 평가하기 위하여, 독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자를 준비하였다.
독소루비신 하이드로클로라이드의 염 제거를 위해서 3배의 트리메틸아민(trimethylamine)을 처리하여 16시간 동안 방치하였다. 염이 제거된 독소루비신은 클로로포름으로 5번 정도 추출하여 사용하였다. 펩티드 나노입자에 독소루비신의 봉합효율을 최적화하기 위해서 다양한 몰 비율(0.1~ 2배 정도)을 준비하였다. 클로로포름에 용해된 독소루비신을 유리 바이알에 넣은 후, 질소 가스로 클로로포름을 제거하고, 1㎍/㎕의 펩티드 용액을 넣어주었다. 시료가 잘 섞이도록 볼텍스를 실시한 후, 15분 동안 초음파에 노출시켜 봉합을 진행한 후 하룻밤 냉장보관하였다. 봉합되지 않은 독소루비신을 제거하기 위해서 1000Da 투석막을 이용해서 하룻밤 동안 투석을 진행하였다. 준비된 독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자를 냉장보관하였다.
실시예 8. 효소 민감성 분석
LL, LD, DL, DD 펩티드 나노입자의 효소 민감성을 분석하기 위해서 MALDI-TOF 질량분석기(matrix-assisted laser mass spectroscopy)를 이용하여 분석하였다. LL, LD, DL, DD 펩티드에 0.02μM의 카텝신 B를 37℃에서 6시간 동안 처리하여 준비하였다. 상기 준비된 펩티드들은 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)를 매트릭스로 사용하여 Voyager사의 MALDI-TOF MS를 사용하여 질량분석하였다.
도 5에 개시한 바와 같이 카텝신 B 효소에 대한 민감성은 LL 펩티드 나노입자가 가장 우수한 것으로 나타났다.
실시예 9. 약물 방출능 분석
독소루비신이 포함된 펩티드 나노입자의 약물 방출능을 분석하기 위해서 투석 방법을 사용하였다. 간단하게, 300㎕의 독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자(LL-Dox과 DD-Dox)를 1000Da의 투석용 막에 넣고, 2.7㎖의 PBS에 넣고 37℃에서 흔들면서 시간에 따른 독소루비신 방출량을 분석하였다.
또한, 상기 방법과 동일하게 300㎕의 독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자(LL-Dox과 DD-Dox)와 0.02μM의 카텝신 B를 1000Da의 투석용 막에 넣고, 2.7㎖의 PBS에 넣고 37℃에서 흔들면서 시간에 따른 독소루비신 방출량을 분석하였다.
이때 방출되는 독소루비신(Dox)의 방출량은 마이크로리더를 이용하여 480nm의 파장에서 분석하였다.
그 결과, 도 6에 개시한 바와 같이, LL-Dox+카텝신 B의 독소루비신 방출량이, 나머지 LL-Dox, DD-Dox 및 DD-Dox+카텝신 B의 독소루비신 방출량에 비해 크다는 것을 확인하였다.
실시예 10. 독소루비신이 봉합된 RH-( GFLG ) 3 펩티드 나노입자의 세포 침투성 분석
독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자의 세포 침투성에 대하여 HeLa 세포에서 공초점 현미경으로 분석하였다. HeLa 세포를 1.0×104 개씩 분주해서 8웰의 공초점 현미경용 디쉬에서 안정화시키고, HeLa 세포에 독소루비신, 독소루비신이 봉합된 LL와 DD 펩티드 나노입자를 처리하였다. 이때 세포핵을 20μM의 Hoechst 33324으로 15분 동안 염색하였다. 6시간 및 16시간 이후, 공초점 현미경으로 준비된 상기 시료들을 분석하였다.
또한, 상기 HeLa 세포와 유사하게 3D spheroid 모델을 이용하여 세포 침투성을 분석하였다. 본 실시예에서 사용된 펩티드 나노 입자는 나일레드가 태깅되어 관찰시 빨간색으로 나타나도록 준비한 것이다.
그 결과, 도 7에 개시한 바와 같이, 본 발명의 LL-Dox가 독소루비신 단독으로 처리하였거나, DD 펩티드 나노입자에 카텝신 B가 결합된 DD-Dox에 비해 세포로의 유입이 우수하였다.
실시예 11. 독소루비신이 봉합된 RH-( GFLG ) 3 펩티드 나노입자의 항암 효과
독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자의 항암효과는 HeLa 및 SW480 세포에서 MTT 분석하였다. 상기 HeLa 및 sw480 세포를 1.0×104 개씩 분주하여 96웰 마이크로디쉬에서 24시간 동안 안정화하였다. 준비된 HeLa 및 SW480 세포에 독소루비신(Dox), 독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자(LL-Dox 및 DD-Dox)를 0.25~2μM로 처리한 후, 48시간 후 SW480 세포에 대한 MTT 어세이를 실시하였고, 72시간 후 HeLa 세포에 대한 MTT 어세이를 실시하였다.
그 결과, 도 8의 (A)에 개시한 바와 같이, sw480 세포의 생존률(%)이 약 50% 수준까지 감소한 것을 확인할 수 있으며, 도 8의 (B)에 개시한 바, HeLa 세포에서는 세포 생존률(%)이 약 25% 수준까지 감소한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 독소루비신 단독으로 처리한 경우, 암세포에 대한 항암활성이 미미한 것으로 나타났다.
실시예 12. 제브라피쉬 모델에서의 독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자의 항암 효과 확인
독소루비신이 봉합된 펩티드 나노입자의 항암 효과를 제브라피쉬 모델에서 확인하였다. 제브라피쉬 알을 2일 동안 피쉬 인큐베이터에서 배양하고, 난막을 제거하였다. 한편, SW480 세포에 트래커 green CMFDA를 처리하여 30분 동안 세포배양을 통해 염색한 후, trypsin-EDTA을 이용해서 수득한 후, 10% FBS를 포함하는 PBS로 2번 세척하였다. 이와 같이 준비된 SW480 세포는 제브라피쉬 유충에 마이크로 인젝션하였다. 이후, 제브라피쉬 유충은 96웰 마이크로 플레이트에 분주하여 2일 동안 안정화시켰다. 그리고 나서, 독소루비신 및 독소루비신이 봉합된 LL 및 DD 펩티드 나노입자를 주입하여 2일 동안 다시 안정화시킨 후, 0.04 % tricaine으로 제브라피쉬 유충을 마취하여 레이카사의 형광 현미경으로 분석하였다.
그 결과 도 9에 개시한 바와 같이, 암세포인 sw480을 주입한 제브라피쉬에서 녹색형광을 확인할 수 있었으며, 독소루비신 단독으로 주입한 경우, 녹색 형광의 암세포가 그대로 있어, 주황빛의 형광을 나타냈으나, LL-Dox를 주입한 경우 암세포가 거의 사라졌고, DD-Dox의 경우는 독소루비신 단독에 비해 녹색 형광이 많이 제거되었으나, LL-Dox에 비해 미약하다는 것을 확인할 수 있었다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University <120> Drug delivery system comprising enzyme-responsive amphiphilic peptide <130> PN18213 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RH-[GFLG]1 <400> 1 Arg His Gly Phe Leu Gly 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RH-[GFLG]2 <400> 2 Arg His Gly Phe Leu Gly Gly Phe Leu Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RH-[GFLG]3 <400> 3 Arg His Gly Phe Leu Gly Gly Phe Leu Gly Gly Phe Leu Gly 1 5 10

Claims (6)

  1. 아르기닌(R)-히스티딘(H)-[글리신(G)-페닐알라닌(F)-류신(L)-글리신(G)]3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하며, 상기 펩티드는 자가조립(self-assembly)하여 바깥쪽으로 친수성의 아르기닌(R)-히스티딘(H)의 아미노산 서열이 위치하고, 안쪽으로 소수성 잔기의 글리신(G)-페닐알라닌(F)-류신(L)-글리신(G)의 아미노산 서열이 위치하는 미셀 형태의 나노입자를 형성하며, 상기 펩티드는 카텝신 B(Cathepsin B) 효소에 의해 절단되고, 상기 펩티드를 형성하는 아미노산의 키랄성은 LRH-L(GFLG)3인 것을 특징으로 하는 독소루비신 전달체.
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