KR20120088215A

KR20120088215A - 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 나노 파이버 유전자 전달체

Info

Publication number: KR20120088215A
Application number: KR1020110009413A
Authority: KR
Inventors: 박인규; 안영근; 정종훈; 조종수; 배인호; 정명호; 김원종
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2011-01-31
Filing date: 2011-01-31
Publication date: 2012-08-08
Also published as: KR101239283B1

Abstract

본 발명은 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 유전자 전달체는 질병세포 또는 조직에 목적 유전자를 안정적으로 전달하고, 표적세포에 대한 선택성을 충분히 나타내면서 정상세포에의 독성을 현저히 줄이고, 지속적인 목적 유전자의 전달이 가능하게 하는 장점 뿐 아니라 일반 저분자량의 유전자 전달체 보다 질병 조직에 대한 선택성이 높아 더 많은 양이 표적 세포 또는 조직에 축적되어, 획기적인 치료 작용을 발휘할 수 있는 장점이 있다.

Description

목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 나노 파이버 유전자 전달체 {Complex composition of nanofiber and target DNA for effective transfection into the cells}

본 발명은 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber) 상에 고정화된 유전자를 포함하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체에 관한 것이다.

관상심장질환 및 심부전과 같은 심장질환은 서구권 선진국의 의료부담의 큰 부분을 차지하고 있다. 미국의 경우 약 700만 명 이상이 심근 경색의 경험이 있으며 490만 명이 울혈성 심부전으로 고통 받고 있다. 심장질환의 치료를 위해 다양한 치료방법 및 의료 기술들이 급속히 발전해오고 있으나, 심장질환발생률은 여전히 증가 추세에 있어 보다 근본적인 치료방법이 절실히 필요한 실정이다.

최근에 골격근 모세포를 심장질환 부위에 이식한 후 심근의 remodeling을 억제하고 수축력 향상에 기여한다는 연구 결과들이 보고되어 심장질환 환자들에게 심장질환 치료에 대한 희망을 제시하고 있다. 그러나 이러한 방법을 수행함에 있어 심실 부정맥 유발 가능성 또는 이식된 근모세포의 심근세포로의 분화 가능성이 낮다는 점으로 인하여 근본적인 심근 재생에 의한 기능 회복으로 보기는 어려운 점 등의 해결점이 남아있다.

한편, 혈관형성은 일반적으로 혈관의 발생 및 분화에 대해 언급된다. 많은 단백질들, 전형적으로 “혈관형성 단백질들”로 언급되는 것들은 혈관형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 상기 혈관형성 단백질들로는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 패밀리, 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF) 패밀리, 인슐린-형 성장인자(IGF) 패밀리 등이 있으며, FGF 및 VEGF 패밀리의 구성원들은 성장 및 발생중에 혈관형성의 조절제로서 인지되고, 성숙한 동물에서의 혈관형성을 촉진하는 역할이 보고된 바 있다.

이러한 혈관형성 단백질을 세포내로 주입하여 심장의 혈관형성을 촉진하는 방법들이 심장질환을 치료하기 위한 치료 방법으로 이용되고 있으며, 심근안으로의 생체내 유전자 전달을 위한 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 다른 벡터들이 사용되고 있다(Barr, et al., Supplement II, Circulation, 84(4): Abstract 1673, 1991: Barr, et al.,Gene Therapy, 1:51-58, 1994; French et al., Circulation, 90(5):2414-2424 (1994); French et al., Circulation,90:1517 Abstract No. 2785 (1994); Giordano et al., Clin. Res., 42:123A (1994); Giordano et al., J. Investigative Med., Supplement 2, 43:287A (1995); Guzman et al., Circulation Research, 73(6):1202-1207 (1993); Kass-Eisler et al., PNAS (USA) 90:11498-11502 (1993); Muhlhauser et al., Human Gene Therapy, 6:1457-1465 (1995); Muhlhauser et al., Circulation Research, 77(6):1077-1086 (1995); French et al., Circulation, 90(5):2402-2413(1994); Rowland et al., Am. Thorao. Surg., 60(3):721-728 (1995)).

그러나 일반적으로, 상기 보고된 방법들은 하나 또는 그 이상의 다음의 결함들을 가지고 있었다: 부적절한 형질도입 효율 및 트랜스유전자 발현; 염증 및 조직 괴사를 포함한, 사용된 벡터에 대한 현저한 면역 반응; 및 중요한 것은, 형질도입 및 트랜스유전자 발현을 심장에 대해 표적화하지 못하는 상대적인 무능력(즉, 유전자 전달이 또한 트랜스유전자가 시험 동물의 간, 신장, 폐, 뇌 및 고환과 같은 비-심장 부위에 전달되는 것을 초래함).

뿐만 아니라 새로운 혈관을 형성을 위한 단백질의 효과적인 흡수 및 촉진에 요구되는 적절한 형태, 농도가 요구 및 혈관형성을 위한 단백질의 반복된 주입이 요구되는 어려움 점이 있다.

본 발명자들은 혈관신생을 효과적으로 유도할 수 있는 물질을 생체 내 효율적으로 전달하기 위한 시스템을 개발하고자 연구를 지속적으로 한 결과, 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber) 상에 고정화된 유전자를 포함하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제조하고, 상기 유전자 전달체가 효율적으로 세포내로의 지속적인 유전자를 전달 및 전달된 유전자의 고효율 발현을 가능케 함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 질병세포 또는 조직에 지속적인 유전자를 안정적으로 전달하고, 전달된 유전자의 고효율 발현을 가능케 하는 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber) 상에 고정화된 유전자를 포함하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 유효 성분으로 포함하는, 혈관신생용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber) 상에 고정화된 유전자를 포함하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기 유전자 전달체를 유효 성분으로 포함하는, 혈관신생용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI) 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL)을 포함하는 고분자 용액을 전기 방사하여 제조한 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber)상에 목적 유전자가 고정화된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 목적 유전자가 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화된(complexed) 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 것으로, 보다 상세하게는 목적 유전자를 심장세포로 전달하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 혈관신생 인자(angiogenic factor) 유전자를 세포로 전달하기 위한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 혈관신생 인자는 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린-유사 성장인자, 에리쓰로포리에틴 및 산화질소 합성효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생용 약학 조성물로서, 관상 동맥 질환(coronary artery disease)을 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI) 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL)을 포함하는 고분자 용액을 전기 방사하여 제조한 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber); 및

상기 나노 파이버상에 고정화된 목적 유전자:

를 포함하는, 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 유전자 전달체는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine) 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL)을 포함하는 고분자 용액을 전기 방사하여 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber)를 제조하는 단계; 및

상기 나노 파이버 상에 목적 유전자를 고정화하는 단계:

를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 고분자 용액은 폴리에틸렌이민과 폴리카프로락톤의 몰비가 1:1 내지 5인 것을 특징으로 한다.

상기 고분자는 전기방사가 가능할 정도의 수평균분자량을 갖는 것으로 10,000 내지 100,000인 것이 바람직하며, 결정성이든 비정질성이든 상관없이 사용될 수 있다, 또한, 전기방사를 위한 고분자 용액의 용매는 해당 고분자를 용해시킬 수 있고, 전기방사가 가능한 것이면 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 사용된 전기방사법은 전기장 내에서 대전된 고분자 용액의 제트를 가속시킴으로써 100 ㎚ 내지 10 ㎛이며 범위의 직경을 가진 나노 파이버(fiber)를 제조하는 방법이다. 방사 초기에 표면 장력으로 인해 고분자 용액이 미세노즐의 말단에서 액체 방울을 형성하는데 전기장에 노출되면 고분자 용액의 표면에 전하가 유도된다.

상기 전기방사 장치나 조건은 한정되지 않으며, 상기 전기방사하여 얻는 나노 파이버의 직경은 1 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 유전자는 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine; PEI)과 복합체화(complexed)되거나 또는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화(complexed) 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화된(complexed) 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(ssPEI/DNA nanoparticles)의 전달체와 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(bPEI/DNA nanoparticles)의 전달체를 이용하여 리로터 유전자인 루시퍼레이즈(luciferase)의 활성 및 혈관내피성장인자(VEGF) 유전자의 발현정도를 조사한 결과, 일반적인 방법(bolus)을 이용한 유전자 전달 효율 보다 본 발명의 유전자 전달체가 유전자 전다 효율이 우수한 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(ssPEI/DNA nanoparticles)의 전달체가 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(bPEI/DNA nanoparticles)의 전달체 보다 높은 유전자 전달 효율과 세포내 독성이 최소화 되는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 유전자는 전달체의 전체 중량 대비 1 내지 95 중량부로 함유되어 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, 유전자 전달체는 목적 유전자를 심장세포로 전달하는 것을 특징으로 하고, 보다 상세하게는 목적 유전자인 혈관신생 인자(angiogenic factor) 유전자를 심장세포로 전달하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 혈관신생 인자는 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 인슐린-유사 성장인자, 에리쓰로포리에틴 및 산화질소 합성효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 포함한다.

상기 본 발명에 따른 유전자 전달체는 일반 저분자량의 유전자 전달체 보다 질병 조직에 대한 선택성이 높아 더 많은 양이 표적 세포 또는 조직에 축적되어, 획기적인 치료 작용을 발휘할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 유전자 전달체는 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber) 상에 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화된(complexed) 목적 유전자가 고정화되어 제조됨으로써 표적세포에 대한 선택성을 충분히 나타내면서 정상세포에의 독성을 현저히 줄이고, 지속적인 목적 유전자의 전달이 가능하게 하는 장점이 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 관상 동맥 질환(coronary artery disease)을 예방 또는 치료하기 위한 것으로, 상기 관상 동맥 질환은 심근경색(Myocardial infarction)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 본 발명에 의한 유전자 전달체이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.

약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립가능 하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다.

또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상투여를 위해 본 발명의 약학 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다.

경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 질병세포 또는 조직에 목적 유전자를 안정적으로 전달하고, 표적세포에 대한 선택성을 충분히 나타내면서 정상세포에의 독성을 현저히 줄이고, 지속적인 목적 유전자의 전달이 가능하게 하는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(ssPEI/DNA nanoparticles)와 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(bPEI/DNA nanoparticles)에 대한 리로터 유전자의 발현정도를 조사한 결과이고,
도 2는 본 발명에 따른 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(ssPEI/DNA nanoparticles)와 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(bPEI/DNA nanoparticles)에 대한 세포로의 형질전환 효율을 비교한 결과이고,
도 3은 본 발명에 따른 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(ssPEI/DNA nanoparticles)와 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(bPEI/DNA nanoparticles)에 대한 세포독성을 확인한 결과이고,
도 4는 본 발명의 제조방법으로 제조된 유전자 전달체를 주사전자현미경으로 확인한 사진이며,
도 5는 YOYO-1 유전자가 고정화된 본 발명의 유전자 전달체의 YOYO-1의 흡광도를 형광현미경으로 확인한 사진이고,
도 6은 근아세포에 부착된 본 발명의 유전자 전달체를 주사전자현미경으로 확인한 사진이며,
도 7은 혈관내피성장인자(VEGF)가 고정화된 본 발명의 유전자 전달체의 VEGF의 mRNA(A) 발현량 및 단백질(B)의 발현량을 조사한 결과이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[제조예]

(1) 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버의 제조

전기방사시스템(CHUNGPAEMT Co., Ltd, Korea)을 이용해 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber)(PCL/PEI 나노 파이버 및 PCL/ssPEI 나노 파이버)를 제조하였다.

Chloroform(C)/Dimethyl Formamide(DMF) 용매 50 ㎖에 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL)(분자량: 10,000) 10 g과 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI)(분자량: 25,000) 또는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)(분자량: 25,000) 5 g을 녹여 고분자 용액을 제조하였다.

전기방사시스템은 1) DC High Voltage Generator(CPS-40K03VIT), 2) Universal Collecting Drum Unit(CPS-UD2S), 3) Universal Collecting Drum Controller(CPS-UC2000), 4) Syringe Pump(kd Scientific, USA)로 구성하였다. 상기 제조한 고분자 용액을 10 mL주사기에 넣었다. 고전압발생기의 (+)극을 주사기 바늘에 설치한 후, 20 ㎕/min의 속도로 주사바늘을 counter electrode에 장착하여 밀어주는 동시에 syringe pump로 전기방사 하여 나노 파이버를 제조하였다. 이때 고전압 발생기의 전압은 14kV를 사용하였다.

(2) 목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체의 제조

목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체를 제조하기 위하여 2 ㎍/㎠의 비율로 제조된 상기 (1)에서 제조한 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버에 목적 유전자를 부착시켜 제조하였다. 상기 목적 유전자는 PBS 완충액을 사용하였다.

목적 유전자를 나노파이버 표면에 부착시키기 위해서는 나노입자로 유전자를 응축(condensation)시켜야 하며 이러한 목적으로 생분해성을 가진 ssPEI를 사용하였다. 가지달린 폴리에틸렌 이민 (평균분자량 대략 1,200 내외) 용액의 pH를 7.2 정도로 맞춘 후 동결건조하여 파우더를 얻었으며 이 파우더를 질소 환경하에서 메탄올에 용해시킨 후 프로필렌 설파이드 (propylene sulfide)를 첨가하여 반응을 시켰다. 반응물은 감압하에 증발시킨 후 다이에틸 에테르에 2회 침전하여 정제하여 ssPEI를 제조하였다.

즉, 목적 유전자가 폴리에틸렌이민(ssPEI 혹은 PEI)과 복합체화 된(complexed) 유전자 전달체는 폴리에틸렌이민 용액에 목적 유전자(DNA) 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후 상온에서 혼합(PEI/DNA nanoparticles)하여 항온처리 한 후, 상기 (1)에서 제조한 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버 표면에 DNA를 부착하여, 목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체를 제조하였다.

(3) 목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체의 나노파이버 표면 위에 고정화

목적 유전자가 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 유전자 전달체는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민 용액에 목적 유전자(DNA) 용액을 한 방울씩 떨어뜨린 후 상온에서 혼합(ssPEI/DNA nanoparticles)하여 항온처리 한 후, 상기 (1)에서 제조한 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버 표면에 DNA를 부착하여, 목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체를 제조하였다.

[ 실시예 ] 목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체의 목적 유전자의 발현

(1) 나노 파이버에 따른 목적 유전자의 발현조사

상기 목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체에 있어 제조된 나노 파이버의 종류에 따른 목적 유전자의 발현정도를 조사하였다.

이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(ssPEI/DNA nanoparticles)의 전달체와 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(bPEI/DNA nanoparticles)의 전달체를 이용하여 리로터 유전자인 루시퍼레이즈(luciferase)의 활성 및 혈관내피성장인자(VEGF) 유전자의 발현정도를 조사하였다.

유전자 형질전환(transfection)은 섬유세포인 NIH/3T3(ATCC, USA)와 근육세포인 H9C2 세포를 사용하였다. 각각의 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 FBS(소 혈청)이 10% 포함된 DMEM 배양액에서 배양한 세포 5×10⁴개를 상기 2 종류의 유전자 전달체에 처리하였다. 형질전환을 위해 세포를 유전자 전달체에 14시간 동안 부착한 후 루시퍼레이즈와 VEGF의 발현량을 조사하였다. 그 후 24 내지 48시간 후 세포용혈과정을 통해 단백질의 발현양을 정량하고 형광현미경을 통해 발현량을 모니터하였다.

또한, 상기 2 종류의 유전자 전달체를 24시간동안 상온에 방치한 후 섬유세포(NIH/3T3)와 신경세포(A10)에 처리하였다. 그 후 LDH 분석을 통하여 시간에 따른 세포의 생존율을 확인하였다.

그 결과 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있듯이 시간 의존적인 루시퍼레이즈의 발현을 확인할 수 있었고, 상기 제조예의 유전자 전달체가 일반적인 방법(bolus)을 이용한 유전자 전달 효율이 좋은 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(ssPEI/DNA nanoparticles)의 전달체가 폴리에틸렌이민과 복합체화된 목적 유전자(bPEI/DNA nanoparticles)의 전달체 보다 높은 유전자 전달 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 세포 내로 전달된 유전자로 인한 세포독성은 도 3의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 세포독성이 없어 세포성장에 대한 부작용을 초래하지 않음을 확인할 수 있었다.

(2) 나노 파이버상에 고정화된 목적 유전자의 발현조사

상기 제조된 2 종류의 유전자 전달체에 있어, 제조된 나노 파이버상에 고정된 목적 유전자의 발현을 조사하기 위하여 YOYO-1이 표지(초록색의 형광 표지인자)되거나 혈관내피성장인자(VEGF)가 포함된 플라스미드를 상기 제조예의 (2)와 동일한 방법으로 나노 파이버상 표면에 YOYO-1 유전자 및 VEGF 유전자를 부착하였다. 24시간 동안 추가 항온처리한 후 형광현미경과 주사전자현미경을 통하여 부착영상을 확인하였다.

그 결과 도 4 내지 6에서도 확인할 수 있듯이, 상기 제조예의 유전자 전달체는 실린더 형태의 기하구조를 갖으며, 그 황단면이 원형이고, 그 직경이 100 ㎚ 내지 10 ㎛인 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 유전자 전달체에 있어서, 나노 파이버상에 부착된 유전자는 고르게 분포하고 있으며, 근아세포에 부착된 유전자 전달체의 주사전자현미경을 통하여 본 발명의 유전자 전달체는 목적으로 하는 유전자를 직접적으로 세포 내 미세환경으로 전달할 수 있을 뿐 아니라 세포내로의 흡수와 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

(3) 유전자 전달체로부터 세포 내로 전달된 목적 유전자의 발현

VEGF의 발현을 확인하기 위해 역전사 유전자증폭분석(RT-PCR)을 수행하였다. RT-PCR을 통해 하우스키핑(살아있는 세포에 일정한 양이 존재하는 유전자) 유전자인 GAPDH량과 VEGF의 mRNA 발현량을 확인하였고, 면역학적 분석(western blot)을 통해 발현되는 단백질의 양도 정량하였다.

그 결과, 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 세포 내로 전달된 VEGF 유전자의 mRNA 발현량 및 단백질의 발현량 세포 내에서 고 효율로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

상기의 결과로부터 세포성장에 부작용을 초래하지 않으면서 세포내로의 지속적인 유전자 전달 및 전달된 유전자의 고 효율 발현을 가능케 함을 확인할 수 있었다.

또한, 상기의 결과는 본 발명의 유전자 전달체가 정상적인 혈관생성을 주도케 하는 혈관신생 인자(angiogenic factor) 유전자를 선택적으로 발현하게 하여 심장질환 치료에 크게 기여할 수 있음을 확인한 결과이다.

Claims

폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI) 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL)을 포함하는 고분자 용액을 전기 방사하여 제조한 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber); 및
상기 나노 파이버상에 고정화된 목적 유전자:
를 포함하는, 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.
제 1항에 있어서,
상기 고분자 용액은 폴리에틸렌이민과 폴리카프로락톤의 몰비가 1:1 내지 5인 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.
제 1항에 있어서,
상기 목적 유전자는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화된(complexed) 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.
제 1항에 있어서,
상기 목적 유전자는 전달체의 전체 중량 대비 1 내지 95 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.
제 1항에 있어서,
상기 목적 유전자는 혈관신생 인자(angiogenic factor) 유전자인 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.
제 5항에 있어서,
상기 혈관신생 인자는 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 에리쓰로포리에틴 및 산화질소 합성효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.
제 1항에 있어서,
상기 유전자 전달체는 목적 유전자를 심장세포로 전달하는 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 유전자 전달체를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생용 약학 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 약학 조성물은 관상 동맥 질환(coronary artery disease)을 예방 또는 치료하기 위한 것을 특징으로 하는 혈관신생용 약학 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 약학 조성물은 관상 동맥 질환은 심근경색(Myocardial infarction)인 것을 특징으로 하는 혈관신생용 약학 조성물.
폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI) 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL)을 포함하는 고분자 용액을 전기 방사하여 생분해성 폴리에스텔아민 나노 파이버(fiber)를 제조하는 단계; 및
상기 나노 파이버 상에 목적 유전자를 고정화하는 단계:
를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제조하는 방법.