JP2019504110A - ヒトパピローマウイルスタイプ58のl1タンパク質の突然変異 - Google Patents
ヒトパピローマウイルスタイプ58のl1タンパク質の突然変異 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、少なくとも部分的には、本発明者らの驚くべき発見に基づいている:ヒトパピローマウイルス(HPV)タイプ58のL1タンパク質の特定のセグメントを第2のHPVタイプ(HPV33など)のL1タンパク質の対応するセグメントで置換した後、このようにして得られた突然変異型HPV58 L1タンパク質は、生物におけるHPV58および第2のHPV型(例えばHPV33)に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、HPV58 VLPおよび第2のHPV58タイプのVLPの混合物のものに匹敵し、HPV58に対するその保護効果は、HPV58 VLP単独のものに匹敵し、第2のHPVタイプ(HPV33など)に対するその保護効果は、第2のHPVタイプ単独のVLPのものに匹敵する。
(1)5〜70アミノ酸、例えば5〜60、15〜60、20〜50、30〜45または35〜40アミノ酸のN末端切断;及び
(2)(a)第2のタイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の80〜87位のアミノ酸残基の置換;または
(b)第2のタイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の376〜383位のアミノ酸残基の置換;
ならびに、改変体は、1つ又は複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8または9個)のアミノ酸の置換(好ましくは保存的置換)、付加または欠失のみによる突然変異型HPV58 L1タンパク質とは異なるが、突然変異型HPV58 L1タンパク質の機能、すなわち少なくとも2つのHPVタイプ(例えば、HPV58およびHPV33、またはHPV58、HPV33およびHPV52)に対する中和抗体の生成を誘導する能力を保持する。
(3)第3のタイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の375〜383位のアミノ酸残基の置換;または
(4)第3のタイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の144〜168位のアミノ酸残基の置換。
本発明において、他に特定しない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されているルーチン操作である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義および説明は以下のように提供される。
ベクターは、形質転換、形質導入、または宿主細胞へのトランスフェクションによって、宿主細胞において発現された担持遺伝物質を有することができる。ベクターは、当業者に周知であり、例えば、限定されないが、プラスミド、ファージ、コスミドなどが挙げられる。
研究は、HPV58と他のHPVタイプ(HPV33およびHPV52など)との間に一定の交差防御があるが、そのような交差防御は非常に低く、一般的に、同HPVタイプのVLPの保護レベルの1%より低く、さらには1000分の1、さらには1000分の1であることを示す。したがって、HPV58ワクチンでワクチン接種された対象は、他のHPVタイプ(HPV33およびHPV52など)に感染するリスクがなおも高い。
本発明に関与する配列のいくつかを以下の表1に提供する。
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NPTNAKKL
SDSTYKNE
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KKESTYKNE
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明されるが、これらの実施例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明する目的でのみ使用される。
発現ベクターの構築
HPV33 L1タンパク質由来のセグメントを含む突然変異型HPV58 L1タンパク質をコードする発現ベクターは、マルチサイト突然変異誘発のためのPCRによって構築した。使用した初期鋳型は、プラスミドpTO−T7−HPV58L1N35C(N末端で切断された35アミノ酸を有するHPV58 L1タンパク質をコードする;表2に58L1N35と略記する)であった。各PCRの鋳型およびプライマーを表2に示し、PCRの増幅条件を以下のようにした:94℃で10分間の変性;25サイクル(94℃で50秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、72℃で7.5分間の伸長);最後に72℃で10分間伸長する。使用したPCRプライマーの配列を表3に列挙した。
大腸菌からプラスミドを抽出し、T7プライマーを用いて、プラスミドに挿入された目的の断片のヌクレオチド配列を配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド(発現ベクター)に挿入された目的の断片のヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号18、19、20、21、22、23および24であり、それらのコードされたアミノ酸配列がそれぞれ配列番号4、5、6、7、8、9及び10である(それぞれ、対応するタンパク質をH58N35−33T1、H58N35−33T2−1、H58N35−33T2−2、H58N35−33T2、H58N35−33T3、H58N35−33T4およびH58N35−33T5と記す)ことを示した。
組換えプラスミドpTO−T7−H58N35−33T1、pTO−T7−H58N35−33T2、pTO−T7−H58N35−33T3、pTO−T7−H58N35−33T4、pTO−T7−H58N35−33T5、pTO−T7−H58N35−33T1−52S1、pTO−T7−H58N35−33T1−52S2、pTO−T7−H58N35−33T1−52S3、及びpTO−T7−H58N35−33T1−52S4をそれぞれ含む大腸菌を−70℃の冷蔵庫から取り出し、カナマイシンを含有する100mLのLB液体培地に播種し、200rpmおよび37℃で約8時間インキュベートした。次に、培養物をカナマイシンを含む500mLのLB培地に移し(1mlの細菌溶液を移した)、さらにインキュベートした。細菌の濃度が約0.6のOD600に達したとき、培養温度を25℃に下げ、各培養ボトルに500μLのIPTGを添加した。インキュベーションをさらに8時間行った。インキュベーションが終了した後、細菌を遠心分離によって回収した。H58N35−33T1、H58N35−33T2、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3およびH58N35−33T1−52S4タンパク質を発現する細菌をそれぞれ得た。
得られた細菌は、1gの細菌1g/10mLの溶解緩衝液(20mM Tris緩衝液、pH7.2、300mM NaCl)の比で再懸濁された。細菌は、超音波装置を用いて30分間破砕された。破砕された細菌を含む溶解溶液を13500rpm(30000g)で15分間遠心分離し、上清(すなわち、破砕された細菌の上清)を得た。
装置:GE Healthcare(すなわち、元のAmershan Pharmacia Co.)によって製造されたAKTA Explorer 100分取液体クロマトグラフィーシステム;
クロマトグラフィー媒体:SP Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare Co.)、CHT−II(Bio−RADから購入)およびButyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare Co.);
緩衝液:20mMリン酸緩衝液、pH8.0、20mM DTT;20mMリン酸緩衝液、pH8.0、20mM DTT、2M NaCl;
試料:上記で得られたH58N35−33T1、H58N35−33T2、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3およびH58N35−33T1−52S4を含む破砕された細菌の上清。
(1)SP Sepharose 4 Fast Flowによる破砕した細菌の上清の陽イオン交換精製:試料をカラムに装填し、次に、400mM NaClを含む緩衝液で不要なタンパク質を溶出し、続いて、800mM NaClを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出した。800mM NaClを含む緩衝液で溶出された画分を回収した。
(2)CHTII(ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー)による、工程(1)で得られた溶出画分のクロマトグラフィーによる精製:工程(1)で得られた溶出画分は、NaCl濃度が0.5Mになるように希釈されるように希釈され;試料をカラムに装填し、500mMのNaClを含む緩衝液で溶出した後、1000mMのNaClを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、1000mMのNaClを含む緩衝液で溶出した画分を回収した;
(3)HIC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)による、工程(2)で得られた溶出画分の精製:試料をカラムに装填し、次に、不要なタンパク質を1000mM NaClを含む緩衝液で溶出した後、200mMのNaClを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、200mMのNaClを含む緩衝液で溶出された画分を回収した。
H58N35−33T1、H58N35−33T2、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3、およびH58N35−33T1−52S4は、上記の方法で精製し、電気泳動を行った。電気泳動後、HPV L1タンパク質に対する広域スペクトル抗体4B3を用いてウェスタンブロットアッセイを行い、その結果を図2に示した。結果は、H58N35−33T1、H58N35−33T2、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3、H58N35−33T1−52S4が、広域スペクトル抗体4B3によって特異的に認識され得ることを示した。
HPBウイルス様粒子のアセンブリ
所定体積(約2ml)のタンパク質H58N35−33T1、H58N35−33T2、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3またはH58N35−33T1−52S4は、(1)2L保存緩衝液(20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、0.5M NaCl);(2)2L再生緩衝液(50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0、2mM CaCl2、2mM MgCl2、0.5M NaCl);及び(3)20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、0.5M NaClに対して連続的に透析した。透析は3つの緩衝液のそれぞれで12時間行った。
透析した試料を、1120コンパクトLC高速液体クロマトグラフィーシステム(Agilent Technologies)によるモレキュラーシーブクロマトグラフィー分析に供し、分析カラムは、TSK Gel PW5000xl 7.8x300mmであった。分析結果を図3A〜3Lに示した。結果は、タンパク質H58N35−33T1、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3およびH58N35−33T1−52S4を含む試料の最初のタンパク質ピークは約12分で現れ、これはHPV58N35 VLP、HPV33N9 VLPおよびHPV52N40 VLPのそれに匹敵することを示した。これは、これらの全てのタンパク質がVLPにアセンブルすることができたことを示した。しかし、タンパク質H58N35−33T2を含む試料の最初のタンパク質ピークは約16分で現れ、これはHPV58 L1タンパク質の5量体の保持時間に匹敵し、タンパク質がVLPにアセンブルできないことを示している。
沈降速度分析のための装置は、光学検査システム及びAn−50Ti及びAn−60Tiローターを備えたBeckman XL−A Analytical Ultracentrifugeであった。H58N35 VLP、HPV33N9 VLPおよびH58N35−33T1 VLPの沈降係数を沈降速度法により分析した。結果を図4A〜4Fに示す。結果は、H58N35−33T1 VLP、H58N35−33T1−52S1 VLPおよびH58N35−33T1−52S4 VLPの沈降係数はそれぞれ109S、113Sおよび109Sであり、一方、HPV58N35 VLP、HPV33N9 VLPおよびHPV52N40 VLPの沈降係数はそれぞれ118S、133Sおよび131Sであることを示した。これは、H58N35−33T1、H58N35−33T1−52S1およびH58N35−33T1−52S4が、サイズおよび形態に関して野生型VLPに類似したウイルス様粒子にアセンブルすることができることを示した。
VLPを含む試料100μLを透過型電子顕微鏡(TEM)で観察した。使用した装置は、JEOL Ltd.によって供給された100kV透過電子顕微鏡(倍率100,000倍)であった。要するに、13.5μLの試料を2%リンタングステン酸(pH7.0)で陰性に染色し、炭素被覆した銅グリッドに固定し、次いでTEMで観察した。結果を図5A〜5Lに示す。結果は、H58N35−33T1、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3およびH58N35−33T1−52S4がウイルス様粒子にアセンブルし得ることを示した。さらに、これらの結果はまた、これらの突然変異型タンパク質によってアセンブルした粒子が約30nmの半径を有し、サイズが均一であることを示した。これは、これらの突然変異型タンパク質がHPV33、HPV58およびHPV52のL1タンパク質に類似しており、均一なサイズのVLPにアセンブルすることができたことを示した。H58N35−33T2は五量体を形成し得ただけであるが、ウイルス様粒子にアセンブルすることはできなかった。
H58N35−33T1、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3およびH58N35−33T1−52S4により形成されたVLPは、GE Company(すなわち、MicroCal Co.)から購入した示差走査熱量計VPキャピラリーDSCを用いてそれらの熱安定性について評価した。タンパク質の保存緩衝液を対照として使用し、タンパク質を10℃〜90℃の温度範囲内で1.5℃/分の加熱速度で走査した。
検出結果を図6A〜6Fに示した。結果は、タンパク質によって形成されたこれらのVLPのすべてが非常に高い熱安定性を有することを示した。
H58N35−33T1、H58N35−33T3、H58N35−33T4、H58N35−33T5、H58N35−33T1−52S1、H58N35−33T1−52S2、H58N35−33T1−52S3、およびH58N35−33T1−52S4によって形成されたVLPの免疫防御をマウスで評価した。ワクチン接種のための動物は、5〜6週齢のBALB/cマウス(正常な等級)(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.LTDから購入)であった。
H58N35−35T1 VLPのED 50
6週齢のBalB/c雌性マウス(8匹のマウス)に単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントを接種した。実験群にH58N35−33T1 VLPを用い、HPV58N35 VLP単独またはHPV33N9 VLP単独を対照群に用いた。免疫化用量は0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μgまたは0.004μgであった。免疫容量は1mLであった。ワクチン接種後の5週目に、眼球から静脈血を採取した。血液中のHPVに対する抗体が検出され、Reed−Muench法(Reed LJ MH、50%終点を推定する簡単な方法、Am J Hyg.1938;27:493−7)によって、セロコンバージョンを誘導する(すなわち、マウスにおける抗体の生成を誘導する)ためのED50を各試料について計算した。結果を表6〜8に示す。
6週齢のBalB/c雌性マウス(8匹のマウス)に、単回腹腔内注射によってアルミニウムアジュバントをワクチン接種し、ここで、実験的な群でH58N35−33T1−52S1 VLPまたはH58N35−58T1−52S4 VLPを(0.900μg、0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μgまたは0.004μgの免疫化用量で)使用した。HPV33N9 VLP単独、HPV58N35 VLP単独またはHPV52N40 VLP単独(0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μgまたは0.004μgの免疫化用量で)、またはHPV33N9 VLP、HPV58N35 VLPおよびHPV52N40 VLPの混合物(各VLP、免疫化用量は0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μgまたは0.004μgであった)を対照群に用いた。免疫容量は1mLであった。ワクチン接種後の5週目に、眼球から静脈血を採取した。血液中のHPVに対する抗体が検出され、Reed−Muench法(Reed LJ MH.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg.1938;27:493−7)によって、セロコンバージョンを誘導するためのED50(すなわち、マウスにおける抗体の生成)を各試料について計算した。結果を表9〜14に示す。
この実験において、ワクチン接種スケジュールを表15に示した。全てのマウス(6週齢のBalB/c雌性マウス)を4群に分けた:フロイントアジュバントグループ(フロイントアジュバントを用いて1μgの免疫化用量で)、アルミニウムアジュバントグループ1(10μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する)、アルミニウムアジュバントグループ2(1μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する)、アルミニウムアジュバントグループ3(0.1μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する)。各グループをさらに3つのサブグループに分けた。対照サブグループ1および2は、それぞれHPV33N9 VLP単独およびHPV58N35 VLP単独でワクチン接種され、実験サブグループは、H58N35−33T1 VLPでワクチン接種された。
結果は以下を示した:H58N35−33T1 VLPが、マウスにおけるHPV58に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得、その保護効果が、同じ用量でHPV58N35 VLP単独のものに匹敵し、同じ用量でHPV33N9 VLP単独のものより有意に優れていた。マウスのHPV33に対する高力価の中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は同じ用量のHPV33N9 VLP単独のものに匹敵し得、同じ用量のHPV58N35 VLP単独よりも有意に優れていた。これは、H58N35−33T1 VLPが、HPV58およびHPV33に対する良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
この実験では、ワクチン接種スケジュールを表16に示した。すべてのマウス(6週齢のBalB/c雌性マウス)を3つのグループに分けた:アルミニウムアジュバントグループ1(10μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを用いる)、アルミニウムアジュバントグループ2(1μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを用いる)、およびアルミニウムアジュバントグループ3(0.1μgの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを用いる)。各グループはさらに6つのサブグループに分けられた。対照サブグループ1、2および3は、それぞれHPV58N35 VLP単独、HPV33N9 VLP単独およびHPV52N40 VLP単独でワクチン接種された。対照サブグループ4は、HPV58N35 VLP、HPV33N9 VLPおよびHPV52N40 VLPの混合物をワクチン接種された。実験サブグループ1および2は、H58N35−33T1−52S1 VLP単独およびH58N35−33T1−52S4 VLP単独でワクチン接種された。
この実験は、霊長類生物医学研究の雲南研究室で行われた。ワクチン接種スケジュールを表17に示した。14匹のカニクリザルを無作為に2つの群に分けた:対照群は、各VLPについて5μgの用量で、1mLの注射容量で、HPV58N35 VLP、HPV33N9 VLPおよびHPV52N40 VLPの混合物でワクチン接種された。実験群は、H58N35−33T1−52S4 VLP単独、5μgの用量、および1mLの注射容量でワクチン接種された。使用したアジュバントはアルミニウムアジュバントであり、カニクイザルは、筋肉内注射によりワクチン接種された。全てのカニクイザルを第0週に最初のワクチン接種し、次いで第8週に追加免疫を行った。第10週にカニクイザルから血液を採取し、血清中のHPV58、HPV33およびHPV52に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図3に示した。結果は以下を示した:H58N35−33T1−52S4 VLP単独では、カニクイザルにおけるHPV58、HPV33およびHPV52に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、その保護効果は、同用量でHPV58N35 VLP、HPV33N9 VLP及びHPV52N40 VLPの混合物のものに匹敵した。これは、H58N35−33T1−52S4 VLPがHPV58、HPV33およびHPV52に対して良好な交差免疫原性を有し、霊長類においてHPV58、HPV33およびHPV52に対して良好な交差防御を誘導し得ることを示した。
H58N35−33T1 VLPおよびH58N35−33T1−52S4 VLPの3次元構造は、低温電子顕微鏡法(cryoEM)(Wolf M,Garcea RL,Grigorieff N.et al.Proc Natl Acad Sci USA.(2010),107(14):6298−303)を用いた3次元構造再構成実験によって再構築された。簡単に述べると、H58N35−33T1 VLP(図10A)の低温電子顕微鏡(cryoEM)写真では、コンピュータの重なりおよび構造の再構成のために、均一なサイズおよび50nmより大きい直径を有する581個の粒子を選択し、H58N35−33T1 VLPの三次元構造を得た。得られた三次元構造を図10B(22Åの解像度にて)に示した。さらに、H58N35−33T1−52S4 VLP(図10C)の低温電子顕微鏡(cryoEM)写真では、コンピュータの重なりおよび構造の再構築のために、均一なサイズおよび50nmより大きい直径を有する220個の粒子を選択したH58N35−33T1−52S4 VLPの三次元構造を得た。得られた三次元構造を図10Dに示した(18Åの分解能である)。結果は、H58N35−33T1 VLPおよびH58N35−33T1−52S4 VLPの両方が、72個のキャプソマー(形態学的サブユニット、ペンタマー)からなるT=7の二十面体構造(h=1、k=2)を有することを示した。準同値原理に一致する従来の二十面体ウイルスキャプシドとは異なり、H58N35−33T1 VLPおよびH58N35−33T1−52S4 VLPの構造における構成的サブユニットはすべて、六量体を含まず、五量体であった。さらに、前記2つのVLPは、約60nmの外径を有していた。これらは、以前報告された天然のHPVウイルス粒子および真核生物発現系によって調製されたHPV VLP(例えば、ポックスウイルス発現系)の三次元構造と同様であった(Baker TS,Newcomb WW,Olson NH.et al.Biophys J.(1991),60(6):1445−1456.Hagensee ME,Olson NH,Baker TS,et al.J Virol.(1994),68(7):4503−4505.Buck CB,Cheng N,Thompson CD.et al.J Virol.(2008),82(11):5190−7)。
Claims (11)
- 突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体であって、野生型HPV58 L1タンパク質と比較すると、突然変異したHPV58 L1タンパク質は、以下の突然変異を有する:
(1)5〜70アミノ酸、例えば5〜60、15〜60、20〜50、30〜45または35〜40アミノ酸のN末端切断;そして
(2)(a)第2タイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の80〜87位のアミノ酸残基の置換;または
(b)第2タイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の376〜383位のアミノ酸残基の置換;そして
改変体は、1つまたはいくつか(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8または9個)のアミノ酸の置換(好ましくは保存的置換)、付加または欠失のみによって突然変異型HPV58 L1タンパク質とは異なるが、突然変異型HPV58 L1タンパク質の機能、すなわち、少なくとも2つのHPV型(例えば、HPV58およびHPV33、またはHPV58、HPV33およびHPV52)に対する中和抗体の生成を誘導する能力を保持する;
好ましくは、突然変異型HPV58 L1タンパク質は、(2)(a)で定義されるような突然変異を有し、場合によりさらに以下の突然変異を有する:
(3)第3タイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の375〜383位のアミノ酸残基の置換;または
(4)第3タイプの野生型HPVのL1タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型HPV58 L1タンパク質の144〜168位のアミノ酸残基の置換;
好ましくは、突然変異型HPV58 L1タンパク質は、野生型HPV58 L1タンパク質と比較してN末端で切断された5、15、27、35、40、60または70アミノ酸を有し;
好ましくは、突然変異型HPV58 L1タンパク質は、野生型HPV58 L1タンパク質と比較して、N末端で切断された35アミノ酸を有し;
好ましくは、前記第2タイプの野生型HPVはHPV33であり;好ましくは、(2)(a)に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型HPV33 L1タンパク質の54〜61位のアミノ酸残基であり;好ましくは、(2)(b)に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型HPV33 L1タンパク質の350〜357位のアミノ酸残基であり;
好ましくは、前記第3タイプの野生型HPVはHPV52であり;好ましくは、(3)に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型HPV52 L1タンパク質の380〜388位のアミノ酸残基であり;好ましくは、(4)に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型HPV52 L1タンパク質の146〜170位のアミノ酸残基であり;
好ましくは、前記野生型HPV58 L1タンパク質は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有し;
好ましくは、前記野生型HPV33 L1タンパク質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有し;
好ましくは、前記野生型HPV52 L1タンパク質は、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有し;
好ましくは、突然変異型HPV58 L1タンパク質は、配列番号4、10、11および14からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、上記変異したHPV58 L1タンパク質またはその変異体。 - 請求項1に記載の突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体をコードする単離された核酸。
- 請求項2に記載の単離された核酸を含むベクター。
- 請求項2に記載の単離された核酸および/または請求項3に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1に記載の突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体を含むまたはそれからなるHPVウイルス様粒子。
- 請求項1に記載の突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体、または請求項2に記載の単離された核酸、または請求項3に記載のベクター、または請求項4に記載の宿主細胞、または請求項5に記載のHPVウイルス様粒子を含む組成物。
- 請求項5に記載のHPVウイルス様粒子、及び場合により医薬として許容される担体及び/または賦形剤を含む医薬組成物またはワクチンであって、
好ましくは、HPVウイルス様粒子は、HPV感染またはHPV感染によって引き起こされる疾患の予防に有効な量で存在し;
好ましくは、HPV感染は、1つ以上のHPV型(例えば、HPV58感染、HPV33感染および/またはHPV52感染)による感染であり;
好ましくは、HPV感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌および尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記医薬組成物またはワクチン。 - 請求項1に記載の突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体を調製する方法であって、該方法は、突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体を宿主細胞で発現させ、次に、突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体を宿主細胞の培養物から回収することを含み、
好ましくは宿主細胞は大腸菌であり;
好ましくは、該方法は、突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体を大腸菌で発現させ、次に、大腸菌の溶解物上清を精製することによって突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体を得て;好ましくは、クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび/または疎水性相互作用クロマトグラフィー)によって、突然変異型HPV58 L1タンパク質またはその改変体を大腸菌の溶解物上清から回収することを含む、上記方法。 - 請求項5に記載のHPVウイルス様粒子を医薬として許容される担体および/または賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製する方法。
- 予防的有効量の請求項5に記載のHPVウイルス様粒子または請求項7に記載の医薬組成物もしくはワクチンを対象に投与することを含む、HPV感染またはHPV感染によって引き起こされる疾患を予防する方法であって、
好ましくは、HPV感染は、1つ以上のHPV型(例えば、HPV58感染、HPV33感染および/またはHPV52感染)による感染であり;
好ましくは、HPV感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌および尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記方法。 - HPV感染またはHPV感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、請求項1に記載の突然変異型HPV58 L1タンパク質もしくはその改変体、または請求項5に記載のHPVウイルス様粒子の使用であって、
好ましくは、HPV感染は、1つ以上のHPV型(例えば、HPV58感染、HPV33感染および/またはHPV52感染)による感染であり;
好ましくは、HPV感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌および尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記使用。
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Citations (2)
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Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
US20050058988A1 (en) * | 1998-12-17 | 2005-03-17 | Jansen Kathrin U. | Synthetic virus-like particles with heterologous epitopes |
US20130315943A1 (en) * | 2010-07-16 | 2013-11-28 | Shaowei Li | Truncated l1 protein of human papillomavirus type 58 |
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