CN113801230A

CN113801230A - 一种人抗Siglec-15抗体及其应用

Info

Publication number: CN113801230A
Application number: CN202111149551.0A
Authority: CN
Inventors: 罗龙龙; 吴佳果; 王志宏; 胡乃静; 时宁; 周阳怡华; 张丁木; 全瑰琪; 吴缘宇; 冯健男; 沈倍奋
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2021-12-17
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN113801230B

Abstract

本发明公开了一种人抗Siglec‑15抗体及其应用。本发明通过噬菌体抗体库技术筛选出的人抗Siglec‑15抗体能高特异性结合表达人Siglec‑15抗原的细胞，本发明的靶向人Siglec‑15的抗体制备方法简单，避免使用杂交瘤技术，获得的抗人Siglec‑15的抗体可以很好地检测肿瘤细胞上表达的Siglec‑15蛋白。本发明的靶向人Siglec‑15的抗体，特异性高，在治疗和/或预防或诊断与Siglec‑15有关的疾病如肿瘤的应用具有很好的前景。

Description

一种人抗Siglec-15抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫治疗生物医药技术领域，具体涉及一种人抗Siglec-15抗体，及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫学的一个重要进展是在TME中存在适应性抵抗机制，以阻止肿瘤免疫的执行。例如，B7-H1或PD-1的特异性单克隆抗体阻断B7-H1/PD-1通路(抗PD疗法)通过解除肿瘤细胞对效应T细胞的抑制，使肿瘤微环境中免疫反应“正常化”，达到消灭肿瘤细胞、治疗癌症的效果，既能减少副反应，又能获得抗肿瘤免疫，打开了肿瘤治疗一扇新的大门。除抗PD疗法外，Siglec受体家族被认为是肿瘤唾液酸聚糖调节肿瘤浸润免疫细胞的许多免疫作用的重要靶点。唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-bindingimmunoglobulin-like lectin，Siglec)可通过识别含有唾液酸的糖链结构，介导细胞与细胞或病原体间的相互作用，在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的调控作用。Siglec家族分为两类:一类是序列保守的Siglecs,包括唾液酸黏附素、CD22、MAG和Siglec-15，它们之间显示出低序列同源性；另一类是与CD33相关的序列可变的Siglecs。Siglec-15编码一段很短的胞外结合域(ECD)，蛋白质序列分析显示，Siglec-15的ECD中包含一个免疫球蛋白可变区(IgV)和一个2型恒定区(IgC2)，与B7基因家族的相似性达到30％以上。已有研究证明，Siglec-15与B7-H1联用有协同效应。Siglec-15在肝癌、肺癌、甲状腺癌、膀胱癌等多种癌症组织中的表达量均大幅提高，且在正常组织中的表达量较低，表明其靶向药物可能副反应较小，是肿瘤免疫治疗潜在靶点。据报道，人Siglec-15能优先识别sialyl-Tn抗原，这种抗原在人类癌症中普遍表达，并在肿瘤相关巨噬中传递促进TGF-β分泌的信号，进而影响肿瘤的发展，而NCI-H157上高表达sialyl-Tn抗原。除sialyl-Tn外，CD44、MAG、LRRC4C也作为Siglec-15的配体发挥作用，在肿瘤微环境中介导免疫逃逸。Siglec-15在人类和小鼠上的促炎功能也已被确认，另外在破骨细胞分化和骨重建中也发挥着重要的作用，小鼠中Siglec-15的缺失会导致骨质疏松症，但其免疫功能尚不清楚。

发明内容

基于此，有必要提供了一种人抗Siglec-15抗体及其应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

1.Siglec-15全人源抗体库的筛选；

2.ELISA鉴定阳性克隆结合活性；

3.抗体真核表达与鉴定；

4.ELISA法测定抗体结合活性；

5.流式细胞术检测抗体的结合活性；

6.抗体的阻断分析；

7.抗体逆转Siglec-15介导的人T细胞中IFN-γ的产生减少。

首先，本发明提供了一种人抗Siglec-15抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，本发明还提供了上述人抗Siglec-15抗体的编码基因，其重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，本发明还提供了含有所述编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

进一步地，本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括所述的抗体和药学上可接受的辅料。

进一步地，本发明还提供了一种包含所述抗体的检测试剂或试剂盒。

进一步地，本发明还提供了所述抗体或所述重组载体、转基因细胞系或重组菌在制备治疗肿瘤药物中的应用。

进一步地，本发明还提供了所述检测试剂或试剂盒在制备检测肿瘤的试剂盒中的应用。

优选的，所述肿瘤为髓母细胞癌、肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、食道癌、肾癌或乳腺癌。

进一步地，本发明还提供了所述抗体在制备治疗或预防Siglec-15与其配体CD44、MAG、LRRC4C或sialyl-Tn抗原介导的疾病的药物中的应用。

进一步地，本发明还提供了所述抗体在制备调控Siglec-15介导的人T细胞中IFN-γ产生的药物中的应用。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的抗体是人源抗体，具有副作用低、高亲和力、人体内半衰期长的潜能。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体，增加了抗体的多样性，避免使用人工免疫和杂交瘤技术，效率更高，与Siglec-15蛋白结合活性高，特异性好，对于临床上肿瘤的检测、预防或治疗都有积极意义。

附图说明

图1Siglec-15全人源噬菌体抗体库的筛选。利用Siglec-15抗原开展3轮噬菌体筛选，计算每轮筛选投入/产出比，理论上，比值越小针对Siglec-15阳性噬菌体抗体富集越好。

图2ELISA法鉴定各个阳性克隆结合活性。纵坐标为OD450吸光度值。

图3SDS-PAGE和SEC-HPLC对抗体的纯度进行鉴定。图3A为SDS-PAGE电泳图，泳道1-4分别是：1A11，1B4，1D4，3D12。图3B为SEC-HPLC结果图。

图4ELISA法测定表达抗体的结合活性。

图5ELISA法检测抗体与CD44的阻断作用。

图6ELISA法检测抗体与MAG的阻断作用。

图7流式细胞术法检测抗体与293T细胞(LRRC4C+)阻断作用。

图8流式细胞术法检测抗体与NCI-H157细胞(sialyl-Tn抗原)的阻断作用。

图9抗体逆转Siglec-15介导的人T细胞中IFN-γ的产生减少情况分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明实验材料来自以下途径：

Siglec-15蛋白购自近岸蛋白(货号：CY14)；CD44蛋白购自近岸蛋白(货号：C579)；MC579AG蛋白购自近岸蛋白(货号：C897)；Poly(ethylene glycol)购于ChemicalBooSk(货号：25322-68-3)；M13K07辅助噬菌体购自NEB公司(货号：N0315S)；JetPRIME transfectionreagent购于优宁维生物(货号：114-01)；OPM-293CD05培养基购于奥浦迈生物科技股份有限公司(货号：81075-001)；辣根过氧化物酶标记的链霉素(Streptavidin-HRP)购自赛默飞世尔科技有限公司(货号：S911)；APC标记的链霉素(Streptavidin-APC)购自Agilent(货号：SA10-10)；GAH IgG-HRP购自Biolegend(货号：398006)；TMB显色液购自康为世纪生物科技有限公司(货号：CW0050S)；包被液：0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)购于国药集团化学试剂有限公司(碳酸钠货号：10018960；碳酸氢钠货号：1001891922)；PBS购自赛维尔生物科技有限公司(货号：G4200-500ML)；PBST(PBS中加入0.1％吐温20)；anti-M13/HRP购自Sino Biological(货号：11973-MM05T-H)；2-YT培养基(Tryptone 16g，Yeast Extract10g，Nacl 5g，琼脂粉15g，定容至1L)；Tryptone购自上海根生生物科技有限公司(货号：LP0042)；Yeast Extract购自上海根生生物科技有限公司(货号：LP0021)；琼脂粉购自Solarbio(货号：A8190)；脱色液(乙醇250ml，75ml冰乙酸，纯水定容到1000ml)；天然噬菌体库由军事医学研究院毒物药物研究所制备并保存。

实施例1Siglec-15全人源噬菌体抗体库的筛选

取10μg Siglec-15蛋白溶解于500μL PBS并加入免疫管4℃包被过夜，同时设置不包抗原的对照管。倒掉包被免疫管液体并用4％牛奶室温封闭1h，同时将5×10¹²个天然噬菌体库稀释于1mL含有4％牛奶中，室温封闭1h。弃掉免疫管中的封闭液，500μL封闭后的噬菌体库溶液分别加入至抗原包被免疫管和对照管，室温孵育1h。使用PBST(PBS中加入0.1％吐温20)洗涤免疫管25次，洗去未结合和非特异结合的噬菌体，用甘氨酸-盐酸(100mM,pH1.7)洗脱特异性结合的噬菌体，Tris碱(pH 8.0)中和后加入处于对数生长期的TG1中37℃孵育0.5h，离心后将沉淀菌涂于2-YT固体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素，2％葡萄糖)上过夜培养；利用50％甘油将菌株从平板上刮下并接种于2-YT液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素，2％葡萄糖)，37℃220r/min培养2.5h，加入M13K07辅助噬菌体，37℃孵育0.5h，离心弃上清，2-YT液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素，80μg/mL卡那青霉素)重悬，28℃220r/min培养16-22小时；用PEG8000沉淀噬菌体，将沉淀物重悬于20％甘油中并保存于-80℃；按照以上方法进行第二轮第三轮的筛选，最终得到有效的富集克隆(图1)。从第3轮噬菌体菌板中随机挑取96个单克隆于深孔板中培养4h，每孔吸出100μL上清用于后续测序使用。在深板中每孔加入5×10¹⁰的M13K07，37℃静置孵育0.5h，离心弃上清，加入1mL 2-YT(含有100μg/mL氨苄青霉素，80μg/mL卡那青霉素)培养基重悬,28℃220r/min培养16-22小时。收集离心上清用于后续实验。

实施例2ELISA法鉴定阳性克隆结合活性

用包被液(0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6))稀释siglec-15蛋白至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板条中，4℃过夜；PBST洗液洗板3次；每孔加入200μL 4％脱脂奶粉，37℃，封闭1h，洗板3次；将上述收集的噬菌体上清1800r/min 4℃离心15min，每孔100μL加入酶联板中，37℃反应1h；洗板3次；每孔加入100μL anti-M13/HRP，室温避光反应45min；洗板4次；每孔加入100μL TMB底物显色液，室温避光反应3min；用2N H₂SO₄终止反应，用酶标仪检测OD450值；结果显示大部分克隆均具有较好的结合活性，挑取数值较高的克隆进行测序分析，经过序列比对和同源性分析最终获得4株候选抗体，我们将其命名为1A11，1B4，1D4，3D12(图2)。

实施例3抗体表达与鉴定

将筛选获得的抗体重链和轻链可变区及人源Fc恒定区基因序列克隆到商业化载体pCDNA3.4中，酶切鉴定克隆正确性，并利用质粒大提试剂盒进行质粒抽提。提前复苏293T细胞，当细胞处于对数生长期，利用JetPRIME transfection reagent转染试剂将抗体表达载体转染至293T细胞中，4小时换完全培养基继续培养12小时，换OPM-293CD05培养基继续培养72小时，离心收集上清，用0.22μM滤芯过滤，利用Protein A层析柱进行纯化,并用SDS-PAGE和SEC-HPLC对抗体进行鉴定，SDS-PAGE还原条件下抗体分子量约60Kda，抗体纯度>95％，内毒素<1(图3)。

实施例4ELISA法测定抗体结合活性

包被液稀释Siglec-15蛋白至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板条中并置于4℃过夜；PBST洗液洗板3次；配置4％脱脂奶粉，每孔200μL，37℃封闭1h，洗板3次；将抗体四倍梯度稀释，起始浓度为15μg/mL，稀释8个梯度，100μL/孔加入到酶联板中，每个浓度样品设置2个复孔。37℃孵育1h，洗板3次；每孔加入100μL 1：6000稀释的羊抗人二抗，室温孵育45min，洗板4次；每孔加入100μL TMB底物显色液显色，室温避光反应2min；终止液100μL/孔终止；用酶标仪检测OD450值。四株抗体的结合活性如图4所示。

实施例5Siglec-15抗体的阻断作用分析

1)ELISA法检测Siglec-15抗体与CD44的阻断作用

包被液稀释CD44蛋白至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板条中并置于4℃过夜；PBST洗液洗板3次；配置4％脱脂奶粉，每孔200μL，37℃封闭1h，洗板3次；将Siglec-15-Biotin(5μg/mL)与抗体(50μg/mL)各50μL分别加入到酶联板中，设置不加抗体对照，每个样品设置3个复孔，37℃孵育1h，洗板3次；每孔加入100μL 1:6000稀释的Streptavidin-HRP二抗，室温孵育45min，洗板4次；每孔加入100μL TMB底物显色液显色，室温避光反应2min；终止液100μL/孔终止；用酶标仪检测OD450值，计算出抑制率。结果显示四株抗体均有阻断作用，1B4的阻断作用最明显(图5)。

2)ELISA法检测Siglec-15抗体与MAG的阻断作用

包被液稀释MAG蛋白至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板条中并置于4℃过夜；PBST洗液洗板3次；配置4％脱脂奶粉，每孔200μL，37℃封闭1h，洗板3次；将Siglec-15-Biotin(5μg/mL)与抗体(50μg/mL)各50μL分别加入到酶联板中，设置不加抗体对照，每个样品设置3个复孔，37℃孵育1h，洗板3次；每孔加入100μL 1：6000稀释的Streptavidin-HRP二抗，室温孵育45min，洗板4次；每孔加入100μL TMB底物显色液显色，室温避光反应2min；终止液100μL/孔终止；用酶标仪检测OD450值，计算出抑制率。结果显示四株抗体均有阻断作用，1B4的阻断作用最明显(图6)。

3)流式细胞术法检测Siglec-15抗体与293T(LRRC4C+)阻断作用

培养293T细胞，选取对数生长期的细胞，将LRRC4C质粒瞬时转染至细胞中，待培养至48h，做后续实验。用0.25％胰蛋白酶消化细胞并制成单细胞悬液，用FACS缓冲液洗一次，计数，将细胞按5×10⁵分至独立的管中，7200rpm离心1min，弃上清；将Siglec-15-Biotin(5μg/mL)与抗体(100μg/mL)各50μL分别加入到管中，4℃孵育30min；FACS液洗一次，7200rpm离心1min，弃上清；每孔加入100μL 1：3000稀释的Streptavidin-APC二抗，4℃孵育30min；FACS液洗两次，上机检测。结果显示1B4的阳性率最低，证明其阻断作用最强(图7)。

4)流式细胞术法检测Siglec-15抗体与NCI-H157(sialyl-Tn抗原)的阻断作用

培养NCI-H157细胞，选取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化细胞并制成单细胞悬液，用FACS缓冲液洗一次，计数，将细胞按5×10⁵分至独立的管中，7200rpm离心1min，弃上清；将Siglec-15-Biotin(5μg/mL)与抗体(100μg/mL)各50μL分别加入到管中，4℃孵育30min；FACS液洗一次，7200rpm离心1min，弃上清；每孔加入100μL 1：3000稀释的Streptavidin-APC二抗，4℃孵育30min；FACS液洗两次，上机检测。结果显示1B4的阳性率最低，证明其阻断作用最强(见图8)。

实施例6抗体逆转Siglec-15介导的人T细胞中IFN-γ的产生减少

PBS稀释抗人CD3至0.1μg/mL，每孔100μL加入平底96孔板，4℃过夜；吸出孔板内液体，将采用标准方法分离的外周血单个核细胞以2.5×10⁵个/孔的浓度添加到孔中；将siglec-15蛋白添加到孔中，终浓度为5μg/mL，同时将Siglec-15抗体添加到孔中，终浓度为50μg/mL；将96孔板置于37℃CO₂孵箱培养72h；取出细胞上清，使用ELISA MAXTMStandardSet Human kit测量细胞因子IFN-γ的水平，结果显示1B4逆转Siglec-15介导的人T细胞中IFN-γ的产生减少的作用最强(见图9)。

最终筛选出1B4作为人抗Siglec-15抗体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种人抗Siglec-15抗体及其应用

<130> P210223

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Ser

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Asp Ser Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Arg Glu Asp Gly Ile Tyr Val Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Tyr Thr Phe

85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

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<212> DNA

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<400> 3

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cccggcaaag gactggagtg ggtggccggc atttacgaca gcggcagcga aaagtactac 180

gtggatagcg tgaaggggag attcacaatc tcaagagaca acagcaagaa cagtctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagccaga 300

gaggacggaa tctatgtggt gtggggccag ggaacactgg tgaccgtgag ctcc 354

<210> 4

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<212> DNA

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gacatccaga tgacacagag ccctagcacc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacatgca gagctagtca gagcattagc tcatggctgg cctggtatca acagaagccc 120

ggcaaagccc ccaaactgct gatctacgat gccagcaacc tgcagagcgg cgtgcccagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggaacagag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacaact acaccttcgg cggcgggacc 300

aagctggaga ttaag 315

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

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<400> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

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Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

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<212> DNA

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gagcccaaat ctgctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Ser

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Asp Ser Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Arg Glu Asp Gly Ile Tyr Val Val Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

130 135 140

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

210 215 220

Tyr Asn Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 10

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gaggtgcagc tggtggagag cgggggggga ctggtgcagc caggaggaag cctgagactg 60

agctgtgccg ccagcgggtt tacagtgagc aacagctgga tgcactgggt gagacaggcc 120

cccggcaaag gactggagtg ggtggccggc atttacgaca gcggcagcga aaagtactac 180

gtggatagcg tgaaggggag attcacaatc tcaagagaca acagcaagaa cagtctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagccaga 300

gaggacggaa tctatgtggt gtggggccag ggaacactgg tgaccgtgag ctccggcgga 360

ggtggctccg gcggtggcgg aagcggaggt ggcggaagtg acatccagat gacacagagc 420

cctagcaccc tgtctgccag cgtgggcgac agagtgacca tcacatgcag agctagtcag 480

agcattagct catggctggc ctggtatcaa cagaagcccg gcaaagcccc caaactgctg 540

atctacgatg ccagcaacct gcagagcggc gtgcccagca gattcagcgg cagcggctcc 600

ggaacagagt tcaccctgac catcagcagc ctgcagcccg acgacttcgc cacctactac 660

tgccagcaga gctacaacta caccttcggc ggcgggacca agctggagat taaggagccc 720

aaatctgctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggaccccc 840

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1410

Claims

1.一种人抗Siglec-15抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，linker氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，人源Fc恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，完整scFv-Fc抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.编码人抗Siglec-15抗体的基因，其特征在于，其重链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，linker核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，人源Fc恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，完整scFv-Fc抗体核苷酸序列如SEQID NO:10所示。

3.含有权利要求2所述编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

4.一种药物组合物，所述的药物组合物包括权利要求1所述的抗体和药学上可接受的辅料。

5.一种包含如权利要求1所述的抗体的检测试剂或试剂盒。

6.根据权利要求1所述的抗体或权利要求2所述的重组载体、转基因细胞系或重组菌在制备治疗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求5所述的检测试剂或试剂盒在制备检测肿瘤的试剂盒中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为髓母细胞癌、肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、食道癌、肾癌或乳腺癌。

9.权利要求1所述抗体在制备治疗或预防Siglec-15与其配体CD44、MAG、LRRC4C或sialyl-Tn抗原介导的疾病的药物中的应用。

10.权利要求1所述抗体在制备调控Siglec-15介导的人T细胞中IFN-γ产生的药物中的应用。