CN117357474A - 抗人白介素36受体单克隆抗体及液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种抗人白介素36受体单克隆抗体及液体制剂。本申请的抗人白介素36受体(IL‑36R)单克隆抗体包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区。本申请的抗人白介素36受体(IL‑36R)单克隆抗体与抗人IL‑36R单克隆抗体Spesolimab相比，结合人IL‑36R的亲和力相当，在细胞水平的中和活性优于Spesolimab，有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。本申请还公开了包含上述抗人白介素36受体单克隆抗体的液体制剂，该液体制剂的抗人IL‑36R单克隆抗体浓度高、粘度低，可用注射器轻松推注，因此可以用作注射剂，尤其是皮下注射剂。

Description

抗人白介素36受体单克隆抗体及液体制剂
技术领域
本申请涉及抗体药物领域。具体地，本申请涉及针对人白介素36受体(IL-36R)单克隆抗体、包含高浓度的该单克隆抗体的低粘度液体制剂及其应用。
背景技术
白细胞介素-36(IL-36)，属于IL-1家族(IL-1family，IL1F)，由IL-36受体激动剂IL-36α(IL1F6)、IL-36β(IL1F8)、IL-36γ(IL1F9)和IL-36受体拮抗剂IL-36Ra(IL-36receptor antagonist，IL1F5)组成，其结构模式和经典的IL-1家族相似：缺乏信号肽，无法通过经典的高尔基体-内质网途径分泌，通常先形成无活性的前体，继而被蛋白酶水解活化。IL-36可由单核细胞、巨噬细胞、T/B淋巴细胞、角质细胞、上皮细胞等多种细胞产生。IL-36的受体由特异性受体IL-36R(亦称IL-1RL2，Interleukin-1receptor-like 2)和IL-1受体辅助蛋白IL-1RAcP(IL-1receptor accessory protein)组成，皆由3个结构域构成的胞外区，跨膜区、胞内Toll/IL-1受体(Toll/IL-1receptor，TIR)结构域组成。蛋白水解成熟的激动型IL-36配体(α、β、γ)与IL-36R结合形成二元复合物，进而招募IL-1RAcP，组装成功能性三元复合物，IL-36R和IL-1RAcP的胞内TIR相互作用，聚集转导接头蛋白髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)以及白细胞介素-1受体相关激酶(IL-1receptor associated kinase，IRAK)进而激活下游NF-κB(Nuclear factor kappa-B，核因子κB)、MAPK(Mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶)信号通路。当IL-36正常表达时，其可通过炎症反应进行宿主防御，当IL-36表达失调时，会刺激其受体表达细胞(上皮细胞、成纤维细胞、角质细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞)产生炎性细胞因子、趋化因子、黏附分子等，进而介导病理性的炎症反应，参与泛发性脓疱型银屑病、掌跖脓疱病、特应性皮炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病等慢性炎症和自身免疫性疾病的病理过程。
Spesolimab为勃林格殷格翰公司研发的靶向IL-36R的单克隆抗体药物，目前已在美国食品药品监督管理局获得上市批准(规格为450mg(7.5ml)/瓶，给药方式为静脉注射)，并已在中国国家药品监督管理局获得优先评审资格。但是，从降低生物制剂的临床使用成本、提高患者依从性的角度来看，抗人IL-36R单克隆抗体药物的优选剂型是高浓度蛋白水针，用于皮下注射剂。由于皮下注射给药的剂量通常在100mg～600mg范围，而最大皮下注射体积一般被限制在2毫升以下，所以经皮下注射给药的抗人IL-36R单抗注射液中抗人IL-36R单抗的浓度通常需要达到100mg/mL以上，例如100～150mg/mL或120～160mg/mL。
高浓度的单克隆抗体通常造成包含该单克隆抗体的溶液的粘度增加，而过高的粘度将导致无法手动推动注射器推杆将药物注射到皮下。因此，针对不同的抗人IL-36R单克隆抗体，需要特别调整配方，以获得包含高浓度的该单克隆抗体分子的、低粘度的液体制剂，该液体制剂可用作注射剂、特别是皮下注射剂。
[1]Towne J E,Garka K E,Renshaw B R,et al.Interleukin(IL)-1F6,IL-1F8,and IL-1F9 signal through IL-1Rrp2 and IL-1RAcP to activate the pathwayleading to NF-kappaB and MAPKs[J].Journal of Biological Chemistry,2004,279(14):13677-13688.
[2]Gabay C,Towne J E.Regulation and function of interleukin-36cytokines in homeostasis and pathological conditions[J].Journal ofLeukocyte Biology,2015,97(4):645.
[3]Henry C M,Sullivan G P,Clancy D M,et al.Neutrophil-DerivedProteases Escalate Inflammation through Activation of IL-36Family Cytokines[J].Cell Reports,2016,14(4):708-722.
[4]Towne J E,Renshaw B R,Douangpanya J,et al.Interleukin-36(IL-36)Ligands Require Processing for Full Agonist(IL-36α,IL-36β,and IL-36γ)orAntagonist(IL-36Ra)Activity[J].Journal of Biological Chemistry,2011,286(49):42594-602.
[5]Buhl,A L,Wenzel,J.Interleukin-36in Infectious and InflammatorySkin Diseases[J].Frontiers in Immunology,2019.01162
发明内容
本申请的目的在于提供一种新的抗人IL-36R单克隆抗体、包含该单克隆抗体的药物组合物以及包含高浓度的该单克隆抗体的低粘度液体制剂。
本申请的技术方案包括：
1.一种抗人IL-36R单克隆抗体，其包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)，其中：
CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(NYAMG)所示；
CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(YISGGGSAYYASWAKG)所示；
CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(WAIKSYFFGMDL)所示；
CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(QASEYISSYLA)所示；
CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(QASTLAS)所示；
CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QTNNAIHTYGGA)所示。
2.根据项1所述的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列为
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其氨基酸序列为
3.一种分离的核酸，其编码前述任一单克隆抗体。
4.一种宿主细胞，其包含根据项3所述的核酸。
所述核酸可以存在于载体上。载体可以属于任意类型，例如，重组载体诸如表达载体。可以使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据项4所述的宿主细胞从而生产前述任一单克隆抗体。
所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗人IL-36R单克隆抗体的重组载体，从而生产所述单克隆抗体。在某些实施方案中，所述方法包括培养包含编码所述抗人IL-36R单克隆抗体的核酸的宿主细胞，从而表达所述核酸。所述方法可以进一步包括从宿主细胞培养物或宿主细胞培养基回收所述抗人IL-36R单克隆抗体。
6.一种药物组合物，其包含前述任一单克隆抗体和药学上可接受的载体。
所述药物组合物可以进一步包含另外的治疗剂(例如，不同的抗人IL-36R抗体)。
7.根据项6所述的药物组合物，其用于治疗IL-36R介导的信号转导相关疾病。
8.根据项7所述的药物组合物，其中，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自皮炎、银屑病、炎性肠病、关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肺病和慢性肾病，
优选地，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自泛发性脓疱型银屑病、掌跖脓疱病、特应性皮炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病、寻常型银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、硬皮病、哮喘或强直性脊柱炎。
9.前述任一单克隆抗体在制备用于治疗IL-36R介导的信号转导相关疾病的药物中的用途。
10.根据项9所述的用途，其中，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自皮炎、银屑病、炎性肠病、关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肺病和慢性肾病，
优选地，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自泛发性脓疱型银屑病、掌跖脓疱病、特应性皮炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病、寻常型银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、硬皮病、哮喘或强直性脊柱炎。
11.一种治疗IL-36R介导的信号转导相关的疾病的方法，其包括：
向有此需要的受试者给药根据前述任一项所述的单克隆抗体或根据前述任一项所述的药物组合物。
12.根据项11所述的方法，其中，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自皮炎、银屑病、炎性肠病、关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肺病和慢性肾病，
优选地，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自泛发性脓疱型银屑病、掌跖脓疱病、特应性皮炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病、寻常型银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、硬皮病、哮喘或强直性脊柱炎。
13.一种液体制剂，其包含抗人白介素36受体(IL-36R)单克隆抗体、粘度调节剂和缓冲盐，
所述抗人白介素36受体单克隆抗体的浓度为50mg/mL以上，进一步的，所述抗人IL-36R单克隆抗体浓度为为50～300mg/mL(例如50～200mg/mL、或100～150mg/mL、或110～160mg/mL、或120～170mg/mL、或130～180mg/mL、或140～190mg/mL、或150～200mg/mL、或160～210mg/mL、或170～220mg/mL、或180～230mg/mL、或190～240mg/mL)，进一步的，所述抗人IL-36R单克隆抗体浓度为120mg/mL以上，进一步的，所述抗人IL-36R单克隆抗体浓度为120～300mg/mL，进一步的，所述抗人IL-36R单克隆抗体浓度为120～200mg/mL，进一步的，所述抗人IL-36R单克隆抗体浓度为120～160mg/mL，
所述粘度调节剂浓度为10-500mM(例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330mM、或50～150mM)，
所述抗人白介素36受体单克隆抗体包含三个重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3和三个轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3，并且，
所述CDR-H1的氨基酸序列如NYAMG(SEQ ID NO：1)所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如YISGGGSAYYASWAKG(SEQ ID NO：2)所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如WAIKSYFFGMDL(SEQ ID NO：3)所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如QASEYISSYLA(SEQ ID NO：4)所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如QASTLAS(SEQ ID NO：5)所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如QTNNAIHTYGGA(SEQ ID NO：6)所示。
14.根据项13所述的液体制剂，其中，所述IL-36R单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列如EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSNYAMGWVRQAPGKGLEWVGYISGGGSAYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWAIKSYFFGMDLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASEYISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQTNNAIHTYGGAFGGGTKVEIK(SEQ IDNO：8)。
15.根据项13或14所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为氨基酸保护剂。
16.根据项15所述的液体制剂，其中，所述氨基酸保护剂为盐酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或它们的组合，优选为盐酸精氨酸。
17.根据项16所述的液体制剂，其中，所述氨基酸保护剂为盐酸精氨酸，进一步，其浓度为10～500mM(例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330mM、或50～150mM)，还可以为40～200mM(例如40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM)。
18.根据项13或14所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为氯化钠，进一步，其浓度为50-200mM(例如50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200mM)。
19.根据项13或14所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为蔗糖，进一步，其浓度为10～100mg/mL(例如20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL)。
20.根据项13或14所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为山梨醇，进一步，其浓度为40-50mg/mL(例如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50mg/mL)。
21.根据项13～20任一项所述的液体制剂，其中，所述缓冲盐为醋酸钠、醋酸或它们的组合。
22.根据项21所述的液体制剂，其中，所述缓冲盐浓度为15～15mM(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25mM)，优选为20mM。
23.根据项13～22任一项所述的液体制剂，优选所述液体制剂中不含杂蛋白，进一步的，所述液体制剂中杂蛋白的浓度<100ppm。
24.根据项13～23任一项所述的液体制剂，其pH为5.0～6.5(例如5.0、5.2、5.5、5.8或6.0)。
25.根据项13～24任一项所述的液体制剂，其粘度为10cP以下。
26.根据项13或14所述的液体制剂，在超滤期间加入终浓度50～300mmol/L的粘度调节剂母液，来降低抗人白介素36受体单克隆抗体蛋白浓度范围在120mg/ml～200mg/ml时的粘度值,并提高蛋白分子的稳定性。
27.根据项26所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为氨基酸保护剂，进一步，为盐酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或它们的组合。
28.根据项27所述的液体制剂，其中，所述氨基酸保护剂为100～200mM(例如150mM)盐酸精氨酸、2～50mM甲硫氨酸(例如10mM)和10～50mM(例如20mM)组氨酸的组合
29.根据项13或14所述的液体制剂，在超滤换液工艺中加入粘度调节剂降低粘度值的方法，优选的所述粘度调节剂为精氨酸或盐酸精氨酸，其中在高浓度浓缩前的药液缓冲液体系为20mM的组氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠-醋酸缓冲液。
30.根据项13或14所述的液体制剂，在超滤换液工艺中加入粘度调节剂降低粘度值的方法，其特征为所述药液缓冲液的pH为5.0-6.5。
31.根据项13或14所述的液体制剂，其包含180mg/mL以上的抗IL-36单克隆抗体，且其粘度为15cP以下。
32.根据项13或14所述的液体制剂，其包含150mg/mL以上的抗IL-36单克隆抗体，且其粘度为10cP以下。
33.一种液体制剂，其包含：120mg/mL以上(优选300mg/mL以下、更优选200mg/mL以下、更优选160mg/mL以下)的项1或2所述的抗人IL-36单克隆抗体，和10～500mM的氨基酸保护剂以及表面活性剂。
34.项13～33任一项所述的液体制剂在制备用于治疗IL-36R介导的信号转导相关疾病的药物中的用途。
35.根据项34所述的用途，其中，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自皮炎、银屑病、炎性肠病、关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肺病和慢性肾病。
36.根据项34所述的用途，其中，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自泛发性脓疱型银屑病、掌跖脓疱病、特应性皮炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病、寻常型银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、硬皮病、哮喘和强直性脊柱炎。
本申请提供了一种新的抗人IL-36R单克隆抗体，其与现有技术中的抗人IL-36R单克隆抗体Spesolimab相比，结合IL-36R的亲和力相当，且细胞水平的中和活性优于Spesolimab。需要说明的是，Spesolimab为勃林格殷格翰公司研发的靶向IL-36R的单克隆抗体药物，Spesolimab治疗成人泛发性脓疱型银屑病的三期临床NAVIGATOR获得成功，目前已在美国食品药品监督管理局获得上市批准，并已在中国国家药品监督管理局获得优先评审资格。
本申请的单克隆抗体(例如QX009N(HZD25-54))可以为IgG1(免疫球蛋白G1)型靶向IL-36R(白介素-36受体)的人源化单克隆抗体，对IL-36R具有高亲和力，能特异性结合IL-36R，阻断IL-36炎症通路信号。HZD25-54与IL-36R结合，竞争性阻断受体激动剂(IL-36α、β、γ)与IL-36R的结合，下调下游促炎信号通路和促纤维化信号通路，抑制上皮细胞/成纤维细胞/免疫细胞介导的炎症反应，从而减少炎性疾病/皮肤疾病中驱动致病的细胞炎症因子的释放，达到控制疾病的目的。
本申请的单克隆抗体，在细胞水平显示出优于Spesolimab(根据专利US9023995B2公开序列表达制备)的中和活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。
本申请提供的抗人IL-36R单克隆抗体液体制剂，其包含高浓度(120mg/mL以上，优选150mg/mL以上)的抗人白介素36受体单克隆抗体，并且通过加入适宜的粘度调节剂(优选如盐酸精氨酸、氯化钠、蔗糖、山梨醇或它们的组合)，将相同蛋白浓度条件下的抗体粘度值降至原来的60％以下，使且具有低粘度(小于10cP)，可应用于高粘度下无法使用的超滤膜浓缩工艺，可用注射器轻松推注，因此可以用作注射剂，尤其是皮下注射剂。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1是显示构建HZD25-54瞬转表达质粒的核酸电泳结果图。其中，M：Marker；条带1：PCR产物25VH-Hu12；条带2：pQX2.1，HindIII/BamHI；条带3：PCR产物25VK-Hu17；条带4：pQX2.3，HindIII/BsiWI。
图2是瞬转表达流程图。
图3是QX009N(HZD25-54)的电泳检测图。
图4是显示QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36(α、β、γ)诱导HT29报告基因细胞中STAT3磷酸化活性的结果图。
图5是显示QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36(α、β、γ)诱导的HT29细胞释放CXCL-1、IL-8活性的结果图。
图6是显示QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36(α、β、γ)诱导的A431细胞释放CXCL-1、IL-8活性的图。
图7是显示QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36β诱导PBMC细胞释放IL-8活性的图。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
具体来说，本申请还提供了一种包含抗人白介素36受体(IL-36R)单克隆抗体的液体制剂，所述液体制剂包含蛋白质浓度为50-300mg/ml的抗人白介素36受体(IL-36R)单克隆抗体、浓度为10～500mM的粘度调节剂以及浓度为20mM的缓冲盐；
进一步地，在所述液体制剂中，所述抗人白介素36受体(IL-36R)单克隆抗体的蛋白质浓度可以为100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、200mg/ml等；
进一步地，在所述液体制剂中，所述粘度调节剂浓度可以为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM等。
进一步地，在所述液体制剂中，20mM的缓冲盐可以为醋酸钠、醋酸或它们的组合。
进一步地，所述液体制剂的pH可以为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
本申请提供的上述液体制剂中，所述抗人白介素36受体单克隆抗体包含三个重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3和三个轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3，其中：
a.CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(NYAMG)所示；
b.CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(YISGGGSAYYASWAKG)所示；
c.CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(WAIKSYFFGMDL)所示；
d.CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(QASEYISSYLA)所示；
e.CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(QASTLAS)所示；
f.CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QTNNAIHTYGGA)所示。
在申请中，人白介素-36受体(Human Interleukin-36Receptor，hIL-36R，有些情况下也简写作IL-36R)表示一种源自人的膜受体，其胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中，下划线部分表示信号肽。
SEQ ID NO：9：
在本说明书中，“抗人IL-36R单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人IL-36R，使得所述单克隆抗体可用作靶向人IL-36R的诊断剂和/或治疗剂。
本申请的抗人IL-36R单克隆抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人IL-36R以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本申请的抗人IL-36R单克隆抗体与作为其靶标的人IL-36R的结合能力作为100％的情况下，本申请的抗人IL-36R单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
本申请的抗人IL-36R单克隆抗体与其他动物种属的IL-36R可以不结合。这里，“其他动物种属”是指除人以外的其他动物种属，例如狨猴、食蟹猴、猪、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等；这里，“不结合”是指：在将本申请的抗人IL-36R单克隆抗体与作为其靶标的人IL-36R的结合能力作为100％的情况下，本申请的抗人IL-36R单克隆抗体与其他动物种属的IL-36R的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
本申请的人IL-36R单克隆抗体可以具有例如≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤40nM的平衡解离常数(KD)。
实验结果显示，本申请的抗人IL-36R单克隆抗体可以特异性结合人IL-36R。
本申请的抗人IL-36R单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市同类单抗产品相当、或优于上市同类单抗产品。所述生物活性例如中和人IL-36(α、β、γ)诱导细胞中STAT3磷酸化的活性、中和人IL-36(α、β、γ)诱导细胞释放CXCL-1、IL-8的活性、中和人IL-36β诱导人PBMC细胞释放IL-8的活性等。
在一个具体实施方式中，本申请的抗人IL-36R单克隆抗体的重链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：10所示；轻链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：11所示。
SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：11
其中，SEQ ID NO：10和11均为经人源化的序列。为了去除抗体的ADCC和CDC效应，对骨架区特定位点进行回复突变和CDR区定点突变。
在本说明书中，“分离的”抗体是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
在本说明书中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本申请使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
在本说明书中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。
在本说明书中，“分离的”核酸表示已经与它的天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。
在本说明书中，“分离的编码抗IL-36R单克隆抗体的核酸”表示编码抗体重链和轻链的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子、以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。
在本说明书中，“载体”表示能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。
在本说明书中，“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养”可互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代被包括在本说明书中。
在本说明书中，“药物组合物”表示这样的制品：其呈现使得包含在其中的活性成分的生物活性能够发挥效果的形式，并且所述组合物不含有对所述制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。
在本说明书中，“药学上可接受的载体”表示药物组合物中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在本申请书中，“单克隆抗体”一般为人抗体，其可以使用本领域技术人员公知的技术来制备，例如，人抗体一般描述于van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过向已经经过修饰而对抗原攻击刺激生产完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备抗体，这些动物通常含有一部分或全部的人类免疫球蛋白基因座，其替换了内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合于动物体内。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活，关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.(自然生物技术)23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584描述的XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429描述的技术；美国专利No.7,041,870描述的技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900描述的技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞(参见例如Kozbor,D.,J.Immunol.133:3001-3005(1984)；Brodeur,B.R.等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；Boerner,P.等，J.Immunol.147:86-95(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生产的人抗体也记载于Li,J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-3562(2006)。其他方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)以及Ni,XiandaiMianyixue,26(4)；265-268(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20:927-937(2005)；Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in ExperimentalandClinical Pharmacology 27:185-191(2005)。
还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体，然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。
还可以基于自抗体文库选择人抗体，即可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离人抗体。例如，用于生产噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域已知的。这种方法综述于例如Hoogenboom,H.R.等，Methods in Molecular Biology 178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如McCafferty,J.等，Nature348:552-554(1990)；Clackson,T.等，Nature 352:624-628(1991)；Marks,J.D.等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248:161-175(2003)；Sidhu,S.S.等，J.Mol.Biol.338:299-310(2004)；Lee,C.V.等，J.Mol.Biol.340:1073-1093(2004)；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:12467-12472(2004)；及Lee,C.V.等，J.Immunol.Methods284:119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的全集，并在噬菌体文库中随机重组，然后在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体，如记载于Winter,G.等，Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths,A.D.等，EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom,H.R.and Winter,G.,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
所述抗体也可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature305:537-540(1983)；WO 93/08829；及Traunecker,A.等，EMBO J.10:3655-3659(1991))和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan,M.等，Science229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等，J.Immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如Gruber,M.等，J.Immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt,A.等，J.Immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。
本申请中所述的单克隆抗体还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576)。
本申请中的抗体还可以包括WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO2010/136172、WO 2010/145792、及WO 2010/145793、WO 2011/117330、WO 2012/025525、WO 2012/025530、WO 2013/026835、WO2013/026831、WO 2013/164325、或WO 2013/174873中记载的多特异性抗体。
本申请中所述的单克隆抗体也可以是抗体变体，例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。因此，在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体，用于置换突变的感兴趣的位点包括HVR和FR，例如，可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中并筛选具有所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合性，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
在本申请中，所述“粘度调节剂”为可以有效降低所述抗人白介素36受体(IL-36R)单克隆抗体液体制剂粘度的成分。在一些具体的实施方式中，所述粘度调节剂为氨基酸保护剂(如盐酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或它们的组合)或其他对所述液体制剂具有粘度调节作用的添加剂(如氯化钠、蔗糖、山梨醇等)。
在本申请中，“杂蛋白”表示在目的蛋白纯化过程中残留的除目的蛋白外的其它蛋白质，如外源性宿主蛋白等。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数；所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。所用材料、试剂等如无特殊说明，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1抗人IL-36R单克隆抗体QX009N的制备
荃信生物自制表达的人白介素36受体(hIL-36R-Rabbit Fc)，作为免疫原免疫新西兰兔，运用B细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合人IL-36R并具有人IL-36R抑制活性的单克隆抗体。通过Binding ELISA以及HT29细胞释放IL-8的方法检测细胞上清进行分析、筛选，挑选目标克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。
先后挑选出10个克隆进行重组表达，并测序。经测定，25#克隆的细胞中和活性最好。因此，对25#克隆进行人源化改造。利用NCBI IgBlast进行人IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择IGHV3-66*01作为重链CDR移植模板，将25#克隆重链的CDR区(即CDR-H1(SEQID No:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQ ID No:3))移植入IGHV3-66*01的骨架区；选择IGKV1-12*01作为轻链CDR移植模板，将25#克隆轻链的CDR区(即CDR-L1(SEQ ID No:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5)和CDR-L3(SEQ ID No:6))移植入IGKV1-12*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变和CDR区定点突变，获得本申请的单克隆抗体QX009N可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
上述重链(SEQ ID NO：10)的基因和轻链可变区(SEQ ID NO：8)的基因，利用PCR扩增获得。用HindIII和BamHI双酶切重链表达质粒pQX2.1；用HindIII和BsiWI双酶切轻链表达质粒pQX2.3；用Infusion重组酶将PCR扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒pQX2.1-25VH-Hu12和轻链表达质粒pQX2.3-25VK-Hu17。
通过核酸电泳检测PCR扩增的重链基因片段、轻链可变区基因片段和双酶切的质粒结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链、轻链可变区PCR扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约5000bp，重链约1469bp，轻链可变区约441bp。
将序列正确的重链表达质粒pQX2.1-25VH-Hu12(所表达的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示)和轻链表达质粒pQX2.3-25VK-Hu17(所表达的轻链的氨基酸序列如SEQID NO：11所示)共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×106个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6×106个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。
转染后第6天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用SDS-PAGE电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX009N(HZD25-54)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和25kDa，与重链(49.0kDa)和轻链(23.4kDa)理论分子量一致。
实施例2平衡解离常数(KD)的测定
用Biacore T200检测QX009N(HZD25-54)与人IL-36R的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化Protein A芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择Kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及解离平衡常数KD值。
除此之外，将QX009N(HZD25-54)与目前已经处于临床III期的针对人IL-36R的单克隆抗体，即Spesolimab的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对QX009N进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中Spesolimab根据专利US9023995B2提供的B6序列，构建表达质粒，瞬转ExpiCHO-S细胞自制获得。
表1抗人IL-36R单克隆抗体结合人IL-36R的亲和力
样品名称 ka(105M-1S-1) kd(10-5S-1) KD(10-10M)
QX009N 1.14 3.58 3.13
Spesolimab 0.36 3.11 8.62
表中的数据为：每个样品检测三次，计算平均值的数据。
实施例3QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36(α、β、γ)诱导的HT29报告基因细胞STAT3磷酸化活性
利用HT29报告基因细胞系测定QX009N(HZD25-54)拮抗人IL-36(α、β、γ)通过IL-36R-IL-1RAcp介导的胞内信号分子STAT3磷酸化活性：以每孔100μl体积、40000个细胞加入到96孔细胞培养板内，然后在37℃和5％CO2条件下培养过夜。向细胞中加入抗体孵育1h，其中抗体的终浓度范围为0至10000ng/ml，孵育完成后加入50μl/孔重组人IL-36混合物(含2ng/ml重组人IL-36α、1ng/ml重组人IL-36β、40ng/ml重组人IL-36γ)，然后在37℃和5％CO2条件下培养24小时。弃除细胞培养上清液，每孔加入120μl ONE-Glo-LuciferaseReagent检测试剂，作用10min，每孔取80μl至白色96孔板，检测Luminescence荧光信号值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，剂量效应曲线如图4所示。
图4所示的结果显示，QX009N(HZD25-54)能够抑制人IL-36(α、β、γ)诱导HT29报告基因细胞STAT3磷酸化，QX009N(HZD25-54)抑制人IL-36(α、β、γ)诱导的HT29报告基因细胞STAT3磷酸化活性的IC50为2.16ng/ml Spesolimab类似物抑制人IL-36(α、β、γ)诱导的HT29报告基因细胞STAT3磷酸化的IC50为15.67ng/ml。
实施例4QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36(α、β、γ)诱导的HT29细胞释放CXCL-1、IL-8的活性
利用HT29细胞系测定QX009N(HZD25-54)拮抗人IL-36(α、β、γ)通过IL-36R-IL-1RAcp诱导HT29细胞释放CXCL-1、IL-8：以每孔100μl体积、40000个细胞加入到96孔细胞培养板内，然后在37℃和5％CO2条件下培养过夜。向细胞中加入抗体孵育1h，其中抗体的终浓度范围为0至10000ng/ml，孵育完成后加入50μl/孔重组人IL-36混合物(含1ng/ml重组人IL-36α、0.2ng/ml重组人IL-36β、4ng/ml重组人IL-36γ)，然后在37℃和5％CO2条件下培养24小时。收集细胞培养上清，采用夹心ELISA法检测上清中CXCL-1、IL-8的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，其剂量效应曲线如图5所示。
图5所示的结果显示，QX009N(HZD25-54)能够抑制人IL-36(α、β、γ)诱导HT29细胞释放CXCL-1、IL-8，QX009N(HZD25-54)抑制人IL-36(α、β、γ)诱导HT29细胞释放CXCL-1、IL-8的IC50分别为2.21ng/ml、1.53ng/ml，Spesolimab类似物抑制人IL-36(α、β、γ)诱导HT29细胞释放CXCL-1、IL-8的IC50分别为12.29ng/ml、11.47ng/ml。
实施例5QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36(α、β、γ)诱导的A431细胞释放CXCL-1、IL-8的活性
利用A431细胞系测QX009N(HZD25-54)拮抗人IL-36(α、β、γ)通过IL-36R-IL-1RAcp诱导A431细胞释放CXCL-1、IL-8：以每孔100μl体积、40000个细胞加入到96孔细胞培养板内，然后在37℃和5％CO2条件下培养过夜。向细胞中加入抗体孵育1h，其中抗体的终浓度范围为0至10000ng/ml，孵育完成后加入50μl/孔重组人IL-36混合物(含20ng/ml重组人IL-36α、2ng/ml重组人IL-36β、50ng/ml重组人IL-36γ)，然后在37℃和5％CO2条件下培养24小时。收集细胞培养上清，采用夹心ELISA法检测上清中CXCL-1、IL-8的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，其剂量效应曲线如图6所示。
图6所示的结果显示，QX009N(HZD25-54)能够抑制人IL-36(α、β、γ)诱导A431细胞释放CXCL-1、IL-8，QX009N(HZD25-54)能够抑制人IL-36(α、β、γ)诱导A431细胞释放CXCL-1、IL-8的IC50分别为4.12ng/ml、2.89ng/ml，Spesolimab类似物抑制人IL-36(α、β、γ)诱导A431细胞释放CXCL-1、IL-8的IC50分别为22.46ng/ml、16.02ng/ml。
实施例6QX009N(HZD25-54)和Spesolimab类似物中和人IL-36β诱导人PBMC细胞释放IL-8的活性
利用人PBMC细胞测定QX009N(HZD25-54)拮抗人IL-36β通过IL-36R-IL-1RAcp诱导人PBMC细胞释放IL-8活性：按密度梯度离心法从人静脉血(来源于成年健康志愿者)中分离出PBMC，将PBMC以每孔100μl、200000个细胞加入到96孔细胞培养板内，向PBMC中加入抗体孵育1h，其中抗体的终浓度范围为0至5000ng/ml，孵育完成后加入50μl/孔10ng/ml重组人IL-36β，然后在37℃和5％CO2条件下培养24小时，收集细胞培养上清，采用夹心ELISA法检测上清中IL-8的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，其剂量效应曲线如图7所示。
从图7所示的结果显示，QX009N(HZD25-54)能够抑制人IL-36β诱导的人PBMC细胞释放IL-8，QX009N(HZD25-54)抑制人IL-36β诱导的人PBMC细胞释放IL-8活性的IC50为4.69ng/ml，Spesolimab类似物抑制人IL-36β诱导的人PBMC释放IL-8活性的IC50为26.59ng/ml。
实施例7包含高浓度QX009N(HZD25-54)的低粘度液体制剂的制备1
利用CHO细胞作为宿主细胞，在2L规模的生物反应器上进行发酵，生产实施例1所得的抗体QX009N，通过离心机或深层膜包过滤获得澄清发酵液，采用Protein A层析进行目的蛋白的捕获，再经过低pH灭活病毒，最后经过阴离子和阳离子层析去除杂质，即获得待超滤的中间体样品。
超滤浓缩：采用上述中间体样品进行超滤，超滤设备选用默克密理博的Labscale小型超滤仪(夹持两块50cm2 Pellicon XL膜包，截留量30KDa)。以120～300L/m2·h的流速，TMP维持在0.6～1.5bar基础上将上述中间体样品浓缩至约40～60mg/ml，得到浓缩样品。
超滤置换：置换缓冲液选用20mM的醋酸钠-醋酸缓冲，pH值为5.5。使用蠕动泵将醋酸钠-醋酸缓冲溶液泵入至所述浓缩样品中混合得到混合溶液，将所述混合溶液继续超滤，同时调节醋酸钠-醋酸缓冲溶液的泵入速度与透过流速一致，即保持样品的重量恒定，待醋酸钠-醋酸缓冲溶液的体积为浓缩样品重量的7倍时即完成置换，得到超滤置换浓缩液。
二次超滤浓缩：取样测定超滤置换浓缩液中蛋白质的浓度，并计算此时超滤置换浓缩液的理论体积，并加入1/9所述超滤置换浓缩液理论体积的氨基酸添加剂母液，混匀，使得缓冲体系如表2所示，然后使用默克密理博的30kDa的超滤离心管浓缩至蛋白质浓度为表2的浓度得到浓缩溶液。
将所得超滤浓缩液，采用SEC-HPLC法进行分析，确定该样品中活性组分，测定方法如下：
1.采用高效液相色谱仪(Agilent 1260或等效仪器)、色谱柱(Waters，规格：3.5μm，7.8×300mm；或等效色谱柱)，流动相为PBS缓冲液；
2.拧开四元泵管路，在5ml/min流速条件下100％流动相冲洗管路3分钟，拧紧四元泵开关，接上色谱柱，在1.0ml/min流速条件下100％流动相冲洗色谱柱30min；
3.样品分析方法设置：流速为1.0ml/min，分析时间为15min，进样量为50mg；检测波长为280nm；进样前需先检查系统适应性(使用参考品连续进样，进样次数不少于5次，取后5次结果计算)，然后分析1针空白样品，接着分析样品。
4.按照聚合体、主峰及降解产物等顺序依次积分每个样品的色谱峰，所有与空白样品保留时间不一致的色谱峰均应积分，以面积归一法计算各峰比例。
测定超滤浓缩溶液中QX009N纯度结果如表2所示：
表2超滤浓缩溶液中QX009N的纯度
由表2结果可知，QX009N单体大于95％、聚体小于2％、基本不含宿主杂蛋白。
采用紫外分光度法测定该超滤浓缩液中QX009N的浓度，测定方法如下：
1.分光光度计波长调至280nm，用空白缓冲液或水作为对照，进行校零。
2.待测用空白缓冲液或水对样品进行稀释，测定样品在280nm的吸光值(吸光值保证在0.5-1.5之间)，并按照之下公式计算样品浓度(QX009N的消光系数为1.562)
采用锐欧森的μVISC粘度计测定该溶液粘度，其操作步骤如下：
1.取一次性专用注射器，抽取200～400微升待检样品，排尽注射器内气泡，并用无尘纸轻擦残留液体；
2.用将注射器安放至管槽中固定，点击仪器主机界面，设置剪切速率，设置完成后，点击“Run”进行检测，记录粘度值，一般多次测量取平均值；
3.对于多个样品的检测，前一个样品完成检测后，取出注射器，排空管内液体，无尘纸轻柔擦拭管口后及可进行下一个样品的吸取测量。
测得浓缩溶液的抗体浓度和粘度值结果如表3所示：
表3抗人IL-36R抗体不同添加剂降粘度结果汇总
由表3结果可知，随着蛋白浓度的提高，该抗人IL-36R抗体的粘度值也增加，若无粘度调节剂加入，该单抗在浓度为200mg/ml时粘度值会达到22.5cP，如此高的粘度值无法使用常规的超滤膜实现浓缩工艺。通过加入粘度调节剂(盐酸精氨酸、氯化钠、山梨醇或它们的组合)，可以将相同蛋白浓度条件下的抗体粘度值降至原来的60％以下，小于15cP。其中，氨基酸保护剂盐酸精氨酸由于具有额外的抗聚集作用，可以获得更低的粘度值。综上，本申请中提供的QX009N单抗注射液的皮下注射给药浓度至少可以达到150mg/mL。
实施例8包含高浓度QX009N(HZD25-54)的低粘度液体制剂的制备2
通过对表达抗人IL-36单克隆抗体的CHO细胞发酵液进行亲和层析、低pH灭活、阴离子和阳离子交换层析、切向流超滤浓缩等操作，得到了超滤浓缩液。采用紫外分光度法测定该超滤浓缩液中QX009N的浓度约为150mg/mL，采用锐欧森的μVISC粘度计测定该超滤浓缩液的粘度为12.7cP。使用0.2μm滤膜过滤该超滤浓缩液，然后将其与不同浓度的氨基酸保护剂混合或置换，使得样本的缓冲液体系及QX009N蛋白浓度如表4所示，采用同上的方法测定样品的粘度。具体配制方案及粘度值结果如下表4所示。
表4抗人IL-36R抗体不同盐酸精氨酸浓度降粘度结果汇总
一般认为，粘度小于30cP的液体制剂适合用作皮下注射剂。由表4可知，通过增加盐酸精氨酸可以使相同蛋白浓度条件下的抗体粘度值下降，QX009N(HZD25-54)的皮下注射给药浓度至少可以达到120～160mg/mL。
应理解，本申请的范围不预期限制在本申请以上所述的示例性方面，而应包括所有当前已知的和未来开发的等同物。另外，应当指出，在不脱离本申请技术原理的前提下，还可以作出若干改进和修改，这些改进和修改也应被视为本申请的范围。

Claims (12)

1.一种液体制剂，其包含抗人白介素36受体(IL-36R)单克隆抗体、粘度调节剂和缓冲盐，
所述抗人白介素36受体单克隆抗体的浓度为50mg/mL以上，优选为50～300mg/mL，更优选为120～200mg/mL，更优选为120～160mg/mL，
所述粘度调节剂浓度为10-500mM，
所述抗人白介素36受体单克隆抗体包含三个重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3和三个轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3，并且，
所述CDR-H1的氨基酸序列如NYAMG(SEQ ID NO：1)所示；
所述CDR-H2的氨基酸序列如YISGGGSAYYASWAKG(SEQ ID NO：2)所示；
所述CDR-H3的氨基酸序列如WAIKSYFFGMDL(SEQ ID NO：3)所示；
所述CDR-L1的氨基酸序列如QASEYISSYLA(SEQ ID NO：4)所示；
所述CDR-L2的氨基酸序列如QASTLAS(SEQ ID NO：5)所示；
所述CDR-L3的氨基酸序列如QTNNAIHTYGGA(SEQ ID NO：6)所示。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中，所述IL-36R单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列如EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSNYAMGWVRQAPGKGLEWVGYISGGGSAYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWAIKSYFFGMDLWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：7)所示；
所述轻链可变区的氨基酸序列如DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASEYISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQTNNAIHTYGGAFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：8)。
3.根据权利要求1或2所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为氨基酸保护剂，优选的，所述氨基酸保护剂为盐酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或它们的组合，更优选的，所述氨基酸保护剂为盐酸精氨酸。
4.根据权利要求3所述的液体制剂，其中，所述盐酸精氨酸的浓度为10～500mM，优选为40～200mM。
5.根据权利要求1或2所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为氯化钠，优选所述氯化钠的浓度为50-200mM。
6.根据权利要求1或2所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为蔗糖，优选所述蔗糖的浓度为10～100mg/mL。
7.根据权利要求1或2所述的液体制剂，其中，所述粘度调节剂为山梨醇，优选所述山梨醇的浓度为40-50mg/mL。
8.根据权利要求1～7任一项所述的液体制剂，其中，所述缓冲盐为醋酸钠、醋酸或它们的组合，优选所述缓冲盐浓度为15～25Mm，更优选为20mM。
9.根据权利要求1～8任一项所述的液体制剂，其中，所述液体制剂中杂蛋白含量<100ppm。
10.根据权利要求1～9任一项所述的液体制剂，其中，所述液体制剂pH为5.0～6.5。
11.根据权利要求1～10任一项所述的液体制剂，其中，所述液体制剂的粘度为10cP以下。
12.权利要求1～11任一项所述的液体制剂在制备用于治疗IL-36R介导的信号转导相关疾病的药物中的用途，优选所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自皮炎、银屑病、炎性肠病、关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肺病和慢性肾病，更优选的，所述IL-36R介导的信号转导相关疾病选自泛发性脓疱型银屑病、掌跖脓疱病、特应性皮炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病、寻常型银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、硬皮病、哮喘和强直性脊柱炎。
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