JPH069695A - プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター２のイムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製 - Google Patents
プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター２のイムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製Info
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- C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
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- H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8132—Plasminogen activator inhibitors
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、プラスミノーゲンアクティベータ
ーインヒビター２（ＰＡＩ−２）のイムノアフィニティ
ークロマトグラフィーによる精製方法およびこの種類の
方法に適当なモノクローナル抗体に関する。 【効果】 胎盤、単球またはＰＡＩ−２の遺伝情報を含
有する組換え細胞の抽出物もしくは培養上清のような出
発原料から、その部分変性を生じることのない緩和な条
件での治療用の、高純度の、ネイティブなＰＡＩ−２を
高収率で得ることを可能にする。
ーインヒビター２（ＰＡＩ−２）のイムノアフィニティ
ークロマトグラフィーによる精製方法およびこの種類の
方法に適当なモノクローナル抗体に関する。 【効果】 胎盤、単球またはＰＡＩ−２の遺伝情報を含
有する組換え細胞の抽出物もしくは培養上清のような出
発原料から、その部分変性を生じることのない緩和な条
件での治療用の、高純度の、ネイティブなＰＡＩ−２を
高収率で得ることを可能にする。
Description
【０００１】本発明は、プラスミノーゲンアクティベー
ターインヒビター２（ＰＡＩ−２）のイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによる精製方法およびこの目的
に適当なモノクローナル抗体に関する。
ターインヒビター２（ＰＡＩ−２）のイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによる精製方法およびこの目的
に適当なモノクローナル抗体に関する。
【０００２】プラスミンは、フィブリン分解、細胞遊
走、細胞分化または組織再造形のような多くの生理学的
過程に関して中心的プロテアーゼである。プラスミンの
活性はとくに、プラスミノーゲンアクティベーターｔＰ
Ａ（組織型プラスミノーゲンアクティベーター）および
ウロキナーゼによるプロ酵素プラスミノーゲンの活性プ
ロテアーゼプラスミンへの蛋白質分解変換によって調節
されている。これらのプロテアーゼの活性は、一方で
は、特異的インヒビターたとえばＰＡＩ−１またはＰＡ
Ｉ−２によって制御される。
走、細胞分化または組織再造形のような多くの生理学的
過程に関して中心的プロテアーゼである。プラスミンの
活性はとくに、プラスミノーゲンアクティベーターｔＰ
Ａ（組織型プラスミノーゲンアクティベーター）および
ウロキナーゼによるプロ酵素プラスミノーゲンの活性プ
ロテアーゼプラスミンへの蛋白質分解変換によって調節
されている。これらのプロテアーゼの活性は、一方で
は、特異的インヒビターたとえばＰＡＩ−１またはＰＡ
Ｉ−２によって制御される。
【０００３】ＰＡＩ−２はとくに、ヒト胎盤組織、妊婦
の血漿および単球中に見出される。ＰＡＩ−２は胎盤か
ら非グリコシル化蛋白質として単離され、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で、それぞれ分子量４５,０
００および５１,０００ダルトンの二重バンドとして現
れる。５１,０００ダルトン型は、ジスルフィド結合の
還元により４５,０００ダルトン型に変換できる。すな
わち５１,０００ダルトン型は４５,０００ダルトン型の
酸化生成物である。ＰＡＩ−２の部分は、胎盤中に、他
の蛋白質との複合体、たとえばビトロネクチンの型で存
在する。精製した調製物のＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でも、ＰＡＩ−２オリゴマーが現れ、これは
還元条件下にモノマー型に変換できる。ＰＡＩ−２は、
妊婦の血漿から分子量約６５,０００ダルトンのグリコ
シル化蛋白質として単離され、一方、培養単球からはグ
リコシル化および非グリコシル化型の両者が単離でき
る。以上述べたＰＡＩ−２型はすべて、ウロキナーゼを
阻害できる。以下、ＰＡＩ−２の語は、阻害活性を有す
るすべての型（非グリコシル化、グリコシル化、オリゴ
マーおよび他の蛋白質との複合体）を包含する。
の血漿および単球中に見出される。ＰＡＩ−２は胎盤か
ら非グリコシル化蛋白質として単離され、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で、それぞれ分子量４５,０
００および５１,０００ダルトンの二重バンドとして現
れる。５１,０００ダルトン型は、ジスルフィド結合の
還元により４５,０００ダルトン型に変換できる。すな
わち５１,０００ダルトン型は４５,０００ダルトン型の
酸化生成物である。ＰＡＩ−２の部分は、胎盤中に、他
の蛋白質との複合体、たとえばビトロネクチンの型で存
在する。精製した調製物のＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でも、ＰＡＩ−２オリゴマーが現れ、これは
還元条件下にモノマー型に変換できる。ＰＡＩ−２は、
妊婦の血漿から分子量約６５,０００ダルトンのグリコ
シル化蛋白質として単離され、一方、培養単球からはグ
リコシル化および非グリコシル化型の両者が単離でき
る。以上述べたＰＡＩ−２型はすべて、ウロキナーゼを
阻害できる。以下、ＰＡＩ−２の語は、阻害活性を有す
るすべての型（非グリコシル化、グリコシル化、オリゴ
マーおよび他の蛋白質との複合体）を包含する。
【０００４】ヒト組織または体液からの高純度の治療用
蛋白質は、ウイルス伝播の危険性を低下させる。培養微
生物からの治療用組換えヒト蛋白質の精製は、抗原性の
宿主蛋白の可能な限り完全な除去を保証するため、極め
て高純度のこれらの蛋白質を生じるものでなければなら
ない。モノクローナル抗体によるアフィニティークロマ
トグラフィーは、著しい高純度の達成を可能にする方法
である。イムノアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製は、複雑な蛋白混合物でもわずかの精製工程を要
するのみであるから、慣用の方法より高い収率も達成で
きる。
蛋白質は、ウイルス伝播の危険性を低下させる。培養微
生物からの治療用組換えヒト蛋白質の精製は、抗原性の
宿主蛋白の可能な限り完全な除去を保証するため、極め
て高純度のこれらの蛋白質を生じるものでなければなら
ない。モノクローナル抗体によるアフィニティークロマ
トグラフィーは、著しい高純度の達成を可能にする方法
である。イムノアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製は、複雑な蛋白混合物でもわずかの精製工程を要
するのみであるから、慣用の方法より高い収率も達成で
きる。
【０００５】ＰＡＩ−２のイムノアフィニティークロマ
トグラフィーによる精製は既に報告されている（Asted
t, B.ら，Thromb, Haemost, 53：122-125, 1985）。し
かしながら、使用される溶出条件、すなわち２mol／リ
ットル ＫＳＣＮ，０.０１％トリトンはＰＡＩ−２の少
なくとも部分変性を生じる。したがって、記載された方
法はたとえば治療用のネイティブなＰＡＩ−２を得るに
は不適当である。
トグラフィーによる精製は既に報告されている（Asted
t, B.ら，Thromb, Haemost, 53：122-125, 1985）。し
かしながら、使用される溶出条件、すなわち２mol／リ
ットル ＫＳＣＮ，０.０１％トリトンはＰＡＩ−２の少
なくとも部分変性を生じる。したがって、記載された方
法はたとえば治療用のネイティブなＰＡＩ−２を得るに
は不適当である。
【０００６】本発明の目的は、したがって、胎盤、単球
またはＰＡＩ−２の遺伝情報を含有する組換え細胞の抽
出物もしくは培養上清のような出発原料から、イムノア
フィニティークロマトグラフィーによるネイティブＰＡ
Ｉ−２の精製方法を開発することにある。
またはＰＡＩ−２の遺伝情報を含有する組換え細胞の抽
出物もしくは培養上清のような出発原料から、イムノア
フィニティークロマトグラフィーによるネイティブＰＡ
Ｉ−２の精製方法を開発することにある。
【０００７】驚くべきことに、ＰＡＩ−２は固定化モノ
クローナル抗体に結合可能であり、低イオン強度の水溶
液によりまたは蒸留水で活性型として溶出できることが
発見された。
クローナル抗体に結合可能であり、低イオン強度の水溶
液によりまたは蒸留水で活性型として溶出できることが
発見された。
【０００８】本発明は、ＰＡＩ−２を含有する溶液を不
溶性支持体物質に結合させたＰＡＩ−２に対するモノク
ローナル抗体と接触させ、アフィニティー物質と液体を
互いに分離し、ついでＰＡＩ−２をアフィニティー物質
から生物学的に活性な型で溶出することからなるネイテ
ィブなＰＡＩ−２のイムノアフィニティークロマトグラ
フィーによる精製方法に関する。
溶性支持体物質に結合させたＰＡＩ−２に対するモノク
ローナル抗体と接触させ、アフィニティー物質と液体を
互いに分離し、ついでＰＡＩ−２をアフィニティー物質
から生物学的に活性な型で溶出することからなるネイテ
ィブなＰＡＩ−２のイムノアフィニティークロマトグラ
フィーによる精製方法に関する。
【０００９】本発明はまた、ネイティブなＰＡＩ−２の
イムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製に
適当な、ＰＡＩ−２に対するモノクローナル抗体に関す
る。ＰＡＩ−２が特異的に結合し、その生物学的活性を
損わない緩和な条件下に再び解離できることがこのよう
な抗体の特性である。本発明の目的にかなうモノクロー
ナル抗体はまた、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく
知られているモノクローナル抗体の免疫反応性フラグメ
ント、たとえばＦ（ａｂ')2、ＦａｂまたはＦｖフラグ
メントおよび抗体分子の抗原結合単一鎖である。
イムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製に
適当な、ＰＡＩ−２に対するモノクローナル抗体に関す
る。ＰＡＩ−２が特異的に結合し、その生物学的活性を
損わない緩和な条件下に再び解離できることがこのよう
な抗体の特性である。本発明の目的にかなうモノクロー
ナル抗体はまた、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく
知られているモノクローナル抗体の免疫反応性フラグメ
ント、たとえばＦ（ａｂ')2、ＦａｂまたはＦｖフラグ
メントおよび抗体分子の抗原結合単一鎖である。
【００１０】適当なモノクローナル抗体は、本技術分野
の熟練者にはそれ自体よく知られているKoehler ＆ Mil
stein(Naturw 256：285-308）または彼らの方法の多く
変法（たとえば、Goding, J.W., Immunol. Meth. 39：2
85-308, 1980）によって製造できる。たとえば次の通り
である。
の熟練者にはそれ自体よく知られているKoehler ＆ Mil
stein(Naturw 256：285-308）または彼らの方法の多く
変法（たとえば、Goding, J.W., Immunol. Meth. 39：2
85-308, 1980）によって製造できる。たとえば次の通り
である。
【００１１】哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット
を、ＰＡＩ−２を含む液体、好ましくはフロインドアジ
ュバント中精製ＰＡＩ−２乳化液を数回、それぞれ１〜
４週間隔で注射して免疫した。細胞融合の準備のため
に、ＰＡＩ−２は、水性溶液中、細胞融合の予定日の３
〜５日前に、好ましくは腹腔内また静脈内に投与する。
を、ＰＡＩ−２を含む液体、好ましくはフロインドアジ
ュバント中精製ＰＡＩ−２乳化液を数回、それぞれ１〜
４週間隔で注射して免疫した。細胞融合の準備のため
に、ＰＡＩ−２は、水性溶液中、細胞融合の予定日の３
〜５日前に、好ましくは腹腔内また静脈内に投与する。
【００１２】抗体産生細胞を得るには、免疫動物を屠殺
し、リンパ臓器好ましくは脾臓を摘出してリンパ細胞を
単離する。細胞培養で永久に増殖を続ける抗体産生細胞
を得るには、リンパ細胞を不死化しなければならない。
これは様々な方法、たとえばエプシュタイン−バールウ
イルスまたはレトロウイルスによるトランスフォーメー
ションによって実施できる。しかしながら、リンパ細胞
はエミローマ細胞と融合させるのが好ましい。とくに適
当なエミローマ細胞系は免疫グロブリンを分泌しないＢ
ＡＬＢ／ｃマウスからの細胞系、たとえば細胞系ＳＰ２
／０−Ａｇ１４またはＸ６３−Ａｇ８.６５３である。
細胞は、分子量１０００〜６０００のポリエチレングリ
コール３０〜６０％濃度の溶液中でインキュベートして
融合するが、他の方法たとえば電気融合も適している。
リンパ細胞とミエローマ細胞のハイブリッド（ハイブリ
ドーマ）を選択し、適当な栄養培地中での培養により増
殖させる。細胞融合１〜３週後にハイブリドーマについ
て特異的抗体の産生を試験する。このためには、本技術
分野の熟練者にはよく知られている多数の試験システム
が利用できる。固相にＰＡＩ−２を吸着させるＥＬＩＳ
Ａ試験システムの使用が好ましい。ハイブリドーマ細胞
の上清を最初ＰＡＩ−２と接触させ、ＰＡＩ−２特異的
抗体を、マウスＩｇＧに対する酵素標識抗体とのインキ
ュベーションついで標識酵素に対する発色性基質の添加
により検出する。ＰＡＩ−２に対する特異的抗体を産生
する細胞を、顕微鏡検査による平板分離または限定希釈
法によってクローン化する。クローン化細胞系を増殖さ
せてインビトロで抗体を得る。モノクローナル抗体は培
養培地から得ることができる。このためには、多数の方
法を利用できるが、固定化プロテインＡまたはＰＡＩ−
２上でアフィニティークロマトグラフィーを行うことが
好ましい。
し、リンパ臓器好ましくは脾臓を摘出してリンパ細胞を
単離する。細胞培養で永久に増殖を続ける抗体産生細胞
を得るには、リンパ細胞を不死化しなければならない。
これは様々な方法、たとえばエプシュタイン−バールウ
イルスまたはレトロウイルスによるトランスフォーメー
ションによって実施できる。しかしながら、リンパ細胞
はエミローマ細胞と融合させるのが好ましい。とくに適
当なエミローマ細胞系は免疫グロブリンを分泌しないＢ
ＡＬＢ／ｃマウスからの細胞系、たとえば細胞系ＳＰ２
／０−Ａｇ１４またはＸ６３−Ａｇ８.６５３である。
細胞は、分子量１０００〜６０００のポリエチレングリ
コール３０〜６０％濃度の溶液中でインキュベートして
融合するが、他の方法たとえば電気融合も適している。
リンパ細胞とミエローマ細胞のハイブリッド（ハイブリ
ドーマ）を選択し、適当な栄養培地中での培養により増
殖させる。細胞融合１〜３週後にハイブリドーマについ
て特異的抗体の産生を試験する。このためには、本技術
分野の熟練者にはよく知られている多数の試験システム
が利用できる。固相にＰＡＩ−２を吸着させるＥＬＩＳ
Ａ試験システムの使用が好ましい。ハイブリドーマ細胞
の上清を最初ＰＡＩ−２と接触させ、ＰＡＩ−２特異的
抗体を、マウスＩｇＧに対する酵素標識抗体とのインキ
ュベーションついで標識酵素に対する発色性基質の添加
により検出する。ＰＡＩ−２に対する特異的抗体を産生
する細胞を、顕微鏡検査による平板分離または限定希釈
法によってクローン化する。クローン化細胞系を増殖さ
せてインビトロで抗体を得る。モノクローナル抗体は培
養培地から得ることができる。このためには、多数の方
法を利用できるが、固定化プロテインＡまたはＰＡＩ−
２上でアフィニティークロマトグラフィーを行うことが
好ましい。
【００１３】ついで精製されたモノクローナル抗体につ
いて、イムノアフィニティークロマトグラフィーに対す
る適性を試験する。このためには、抗体を、本技術分野
の熟練者には慣用の方法により、適当な不溶性支持体物
質にカップリングさせる。アフィニティークロマトグラ
フィーに使用される支持体は様々な物質、たとえばアガ
ロース、ポリアクリルアミドまたはセルロースの誘導体
からなる。抗体は、たとえばシアノーゲンブロミドまた
はカルボジイミドで支持体を活性化したのちにカップリ
ングさせることができる。その他に種々の支持体物質お
よびカップリング方法が当該技術者に知られている。原
理的には、支持体としてはすべての慣用の物質が、また
カップリングした抗体の活性が有意に変化しないすべて
のカップリング方法が適当である。ついで、アフィニテ
ィーゲルについて、ＰＡＩ−２の精製に対する適性が試
験される。このためには、ＰＡＩ−２含有溶液をアフィ
ニティーゲル上にポンプで送り、通過したＰＡＩ−２活
性を測定する。ＰＡＩ−２が吸着されたゲルが免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーに適している。
いて、イムノアフィニティークロマトグラフィーに対す
る適性を試験する。このためには、抗体を、本技術分野
の熟練者には慣用の方法により、適当な不溶性支持体物
質にカップリングさせる。アフィニティークロマトグラ
フィーに使用される支持体は様々な物質、たとえばアガ
ロース、ポリアクリルアミドまたはセルロースの誘導体
からなる。抗体は、たとえばシアノーゲンブロミドまた
はカルボジイミドで支持体を活性化したのちにカップリ
ングさせることができる。その他に種々の支持体物質お
よびカップリング方法が当該技術者に知られている。原
理的には、支持体としてはすべての慣用の物質が、また
カップリングした抗体の活性が有意に変化しないすべて
のカップリング方法が適当である。ついで、アフィニテ
ィーゲルについて、ＰＡＩ−２の精製に対する適性が試
験される。このためには、ＰＡＩ−２含有溶液をアフィ
ニティーゲル上にポンプで送り、通過したＰＡＩ−２活
性を測定する。ＰＡＩ−２が吸着されたゲルが免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーに適している。
【００１４】好ましい操作においては、ＰＡＩ−２のイ
ムノアフィニティーゲルとの結合は、pH５.５〜８.５、
温度＋４℃〜＋３７℃において、伝導度≧５mSの溶液か
ら起こる。緩衝液は０.０５mol／リットル リン酸塩ま
たはトリスおよび０〜３.０mol／リットル ＭａＣｌを
含有することがとくに好ましい。
ムノアフィニティーゲルとの結合は、pH５.５〜８.５、
温度＋４℃〜＋３７℃において、伝導度≧５mSの溶液か
ら起こる。緩衝液は０.０５mol／リットル リン酸塩ま
たはトリスおよび０〜３.０mol／リットル ＭａＣｌを
含有することがとくに好ましい。
【００１５】重要な工程はアフィニティーゲルからのＰ
ＡＩ−２の溶出である。抗原−抗体複合体の解離に要す
る条件下では、ＰＡＩ−２活性の不可逆的破壊を生じる
ことが多い。したがって、ＰＡＩ−２活性を保持しなが
ら抗原−抗体複合体の解離を可能にする緩和な溶出条件
を見出すことが必要である。原理的には、このために様
々な溶出液、たとえば有機溶媒、界面活性剤、イオン強
度の極めて低いもしくは極めて高い溶液または各種溶出
液の組合せを使用することが可能である。これらのおよ
び他の溶出方法（たとえば温度依存性）は本技術分野の
熟練者にはよく知られている。ＰＡＩ−２の溶出には、
pH５.５〜８.５において極めて低いイオン強度（伝導度
≦３mS）の溶液、とくに蒸留水の使用が好ましい。溶出
液には、溶出したＰＡＩ−２を安定化するために、様々
な物質、たとえば糖、糖アルコール、多糖、アミノ酸ま
たは蛋白質を加えることができる。
ＡＩ−２の溶出である。抗原−抗体複合体の解離に要す
る条件下では、ＰＡＩ−２活性の不可逆的破壊を生じる
ことが多い。したがって、ＰＡＩ−２活性を保持しなが
ら抗原−抗体複合体の解離を可能にする緩和な溶出条件
を見出すことが必要である。原理的には、このために様
々な溶出液、たとえば有機溶媒、界面活性剤、イオン強
度の極めて低いもしくは極めて高い溶液または各種溶出
液の組合せを使用することが可能である。これらのおよ
び他の溶出方法（たとえば温度依存性）は本技術分野の
熟練者にはよく知られている。ＰＡＩ−２の溶出には、
pH５.５〜８.５において極めて低いイオン強度（伝導度
≦３mS）の溶液、とくに蒸留水の使用が好ましい。溶出
液には、溶出したＰＡＩ−２を安定化するために、様々
な物質、たとえば糖、糖アルコール、多糖、アミノ酸ま
たは蛋白質を加えることができる。
【００１６】以下の例は、本発明を例示するものであ
る。 実施例１ モノクローナル抗体の製造および選択 ａ） マウスの免疫処置 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＡＩ−２（Radtkeら，Bi
ol. Chem. Hoppe-Seyler, 371：1119-1127, 1990の記載
のより調製）５０μｇの完全フロインドアジュバント中
乳化液を皮下注射して免疫処置した（１日目）。２８日
目および５６日目に、それぞれ、不完全フロインドアジ
ュバント中に乳化した３０μｇのＰＡＩ−２を同様に皮
下注射した。ついで、９２日目に、生理食塩水０.５ml
中１００μｇのＰＡＩ−２を腹腔内に注射した。
る。 実施例１ モノクローナル抗体の製造および選択 ａ） マウスの免疫処置 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＰＡＩ−２（Radtkeら，Bi
ol. Chem. Hoppe-Seyler, 371：1119-1127, 1990の記載
のより調製）５０μｇの完全フロインドアジュバント中
乳化液を皮下注射して免疫処置した（１日目）。２８日
目および５６日目に、それぞれ、不完全フロインドアジ
ュバント中に乳化した３０μｇのＰＡＩ−２を同様に皮
下注射した。ついで、９２日目に、生理食塩水０.５ml
中１００μｇのＰＡＩ−２を腹腔内に注射した。
【００１７】ｂ） リンパ細胞とミエローマ細胞の融合 ９５日目に、脾臓を摘出したのち機械的崩壊によりリン
パ細胞（約１×１０8個）を得た。リンパ細胞をダルベ
ッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で洗浄し、ミエロ
ーマ細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４の細胞５×１０7個と
混合し、遠心分離して沈降させた。上清を完全に除去し
たのち、ＤＭＥＭ５％濃度のポリエチレングリコール４
０００溶液０.５mlを、細胞ペレットに１分間を要して
滴下した。
パ細胞（約１×１０8個）を得た。リンパ細胞をダルベ
ッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で洗浄し、ミエロ
ーマ細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４の細胞５×１０7個と
混合し、遠心分離して沈降させた。上清を完全に除去し
たのち、ＤＭＥＭ５％濃度のポリエチレングリコール４
０００溶液０.５mlを、細胞ペレットに１分間を要して
滴下した。
【００１８】懸濁液を３７℃で９０秒間インキュベート
し、ついで７.５mlのＤＭＥＭを５分間を要して添加し
て希釈した。室温で１０分間インキュベートしたのち、
容量をＤＭＥＭで４０mlとし、細胞を遠心分離して沈降
させた。上清を吸引して除き、ついで２０％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ）および１３.６mg／mlヒポキサンチン、０.
１８mg／mlアミノブテリン、３.９mg／mlチミジンを含
むＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）中に再懸濁し、６個のマイク
ロタイタープレート上に接種した（ウエルあたり２００
μｌ）。培地は３〜４日間隔で再交換し、１０日後にＨ
ＡＴ培地をＨＴ培地に換えた。
し、ついで７.５mlのＤＭＥＭを５分間を要して添加し
て希釈した。室温で１０分間インキュベートしたのち、
容量をＤＭＥＭで４０mlとし、細胞を遠心分離して沈降
させた。上清を吸引して除き、ついで２０％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ）および１３.６mg／mlヒポキサンチン、０.
１８mg／mlアミノブテリン、３.９mg／mlチミジンを含
むＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）中に再懸濁し、６個のマイク
ロタイタープレート上に接種した（ウエルあたり２００
μｌ）。培地は３〜４日間隔で再交換し、１０日後にＨ
ＡＴ培地をＨＴ培地に換えた。
【００１９】ｃ） ＰＡＩ−２に対する抗体の試験 融合１４日後に、細胞の培養上清について、エンザイム
イムノアッセイによりＰＡＩ−２に対する抗体を試験し
た。すなわち、ポリスチレンマイクロテストプレート
を、０.１mol／リットル ＮａＣｌ、０.１mol／リット
ル 酢酸ナトリウム、pH５.５中、０.１μｇ／mlのＰＡ
Ｉ−２とインキュベートした（４℃，２４時間）。次
に、細胞培養上清を適用し（３７℃，２時間）、続いて
マウスＩｇＧに対するペルオキシダーゼ接合抗体とイン
キュベートした。使用した基質は、０.１mol／リットル
クエン酸、０.１mol／リットル Ｎａ2ＨＰＯ4、pH４.
５中、０.１％（重量／容量）２′，２′−アジノジ
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）お
よび０.０１２％（重量／容量）Ｈ2Ｏ2の溶液とした。
３７℃で３０分間インキュベートしたのち、４０５nmに
おける吸収を測定した。各インキュベーション工程の間
には、アッセイプレートのウエルをＰＢＳ／Rツイーン
で洗浄した。
イムノアッセイによりＰＡＩ−２に対する抗体を試験し
た。すなわち、ポリスチレンマイクロテストプレート
を、０.１mol／リットル ＮａＣｌ、０.１mol／リット
ル 酢酸ナトリウム、pH５.５中、０.１μｇ／mlのＰＡ
Ｉ−２とインキュベートした（４℃，２４時間）。次
に、細胞培養上清を適用し（３７℃，２時間）、続いて
マウスＩｇＧに対するペルオキシダーゼ接合抗体とイン
キュベートした。使用した基質は、０.１mol／リットル
クエン酸、０.１mol／リットル Ｎａ2ＨＰＯ4、pH４.
５中、０.１％（重量／容量）２′，２′−アジノジ
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）お
よび０.０１２％（重量／容量）Ｈ2Ｏ2の溶液とした。
３７℃で３０分間インキュベートしたのち、４０５nmに
おける吸収を測定した。各インキュベーション工程の間
には、アッセイプレートのウエルをＰＢＳ／Rツイーン
で洗浄した。
【００２０】ｄ） 抗体産生細胞系のクローニング 上述のエンザイムイムノアッセイにおいて強い陽性反応
（吸着＞１.５）を示した上清の細胞を限定希釈法でク
ローン化した。これには、２０％ＦＣＳおよび５％ヒト
内皮培養上清（Costarより）を含み約６０個の細胞を含
有するＤＭＥＭを細胞培養プレートの９６個のウエルに
分配した。単一のクローンを顕微鏡下に確認し、抗体産
生を試験した。クローニングは２回反復した。
（吸着＞１.５）を示した上清の細胞を限定希釈法でク
ローン化した。これには、２０％ＦＣＳおよび５％ヒト
内皮培養上清（Costarより）を含み約６０個の細胞を含
有するＤＭＥＭを細胞培養プレートの９６個のウエルに
分配した。単一のクローンを顕微鏡下に確認し、抗体産
生を試験した。クローニングは２回反復した。
【００２１】ｅ） モノクローナル抗体の精製 抗体の製造には、クローン細胞系をローラーボトルに移
し、イスコベック改良ダルベッコ培地中で培養した。細
胞を遠心分離および濾紙を通しての濾過で除去し、限外
濾過により約１０倍に濃縮した。濃縮液をプロテインＡ
−RセファロースＣＬ−４Ｂに通して、結合したＩｇＧ
を０.２mol／リットル グリシン／ＨＣｌ、pH３.０で溶
出した。蛋白質含有分画を０.１mol／リットル クエン
酸、pH６.５に対して透析し、限外濾過により約５mg／m
lに濃縮した。
し、イスコベック改良ダルベッコ培地中で培養した。細
胞を遠心分離および濾紙を通しての濾過で除去し、限外
濾過により約１０倍に濃縮した。濃縮液をプロテインＡ
−RセファロースＣＬ−４Ｂに通して、結合したＩｇＧ
を０.２mol／リットル グリシン／ＨＣｌ、pH３.０で溶
出した。蛋白質含有分画を０.１mol／リットル クエン
酸、pH６.５に対して透析し、限外濾過により約５mg／m
lに濃縮した。
【００２２】ｆ） イムノアフィニティークロマトグラ
フィーのための抗体の選択 イムノアフィニティークロマトグラフィーに適した抗体
は、改良サンドイッチＥＬＩＳＡで選択した。３個のマ
イクロテストプレートを、ＰＡＩ−２に対するモノクロ
ーナル抗体（０.１mol／リットル ＮａＣｌ、０.１mol
／リットル酢酸ナトリウム、pH５.５中５μｇ／ml）と
＋４℃で２４時間インキュベートしてコーティングし
た。次に、２％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ／Rツ
イーン中１μｇ／mlのＰＡＩ−２をコーティングしたウ
エルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。その
後で、各プレートを個々に洗浄操作に付した（５分毎に
洗浄溶液を交換しながら、１５分間洗浄溶液とインキュ
ベーション）。洗浄溶液はＰＢＳ、３mol／リットル Ｎ
ａＳＣＮまたは蒸留水とした。次に、プレートをＰＡＩ
−２に対するペルオキシダーゼ接合ポリクローナル抗体
とインキュベートした（３７℃，２時間）。以下の工程
（洗浄、基質とのインキュベーション、測定）は実施例
１ｃに記載のように実施した。ＰＢＳで洗浄したプレー
トは、ＰＡＩ−２のモノクローナル抗体への結合の陽性
対照として働き、一方ＮａＳＣＮで洗浄したプレート
は、ＰＡＩ−２のモノクローナル抗体からの溶出の陽性
対照として働いた。ＰＢＳ対照中ＰＡＩ−２を結合し
（Ａ405＞１.５）、蒸留水で洗浄後反応を示さなかった
（Ａ405＜０.５）モノクローナル抗体をアフィニティー
ゲルの製造に使用した。
フィーのための抗体の選択 イムノアフィニティークロマトグラフィーに適した抗体
は、改良サンドイッチＥＬＩＳＡで選択した。３個のマ
イクロテストプレートを、ＰＡＩ−２に対するモノクロ
ーナル抗体（０.１mol／リットル ＮａＣｌ、０.１mol
／リットル酢酸ナトリウム、pH５.５中５μｇ／ml）と
＋４℃で２４時間インキュベートしてコーティングし
た。次に、２％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ／Rツ
イーン中１μｇ／mlのＰＡＩ−２をコーティングしたウ
エルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。その
後で、各プレートを個々に洗浄操作に付した（５分毎に
洗浄溶液を交換しながら、１５分間洗浄溶液とインキュ
ベーション）。洗浄溶液はＰＢＳ、３mol／リットル Ｎ
ａＳＣＮまたは蒸留水とした。次に、プレートをＰＡＩ
−２に対するペルオキシダーゼ接合ポリクローナル抗体
とインキュベートした（３７℃，２時間）。以下の工程
（洗浄、基質とのインキュベーション、測定）は実施例
１ｃに記載のように実施した。ＰＢＳで洗浄したプレー
トは、ＰＡＩ−２のモノクローナル抗体への結合の陽性
対照として働き、一方ＮａＳＣＮで洗浄したプレート
は、ＰＡＩ−２のモノクローナル抗体からの溶出の陽性
対照として働いた。ＰＢＳ対照中ＰＡＩ−２を結合し
（Ａ405＞１.５）、蒸留水で洗浄後反応を示さなかった
（Ａ405＜０.５）モノクローナル抗体をアフィニティー
ゲルの製造に使用した。
【００２３】ｇ） アフィニティーゲルの製造 実施例の１ｅのようにして精製し、１ｆのようにして選
択したモノクローナル抗体を、シアノーゲンブロミドで
活性化したRセファロース４Ｂに以下の方法でカップリ
ングさせた。すなわち、シアノーゲンブロミドで活性化
したRセファロース４Ｂ１.５ｇを１mmol／リットル Ｈ
Ｃｌに懸濁し、クロマトグラフィーカラムに充填し３０
０mlのＨＣｌ（１mmol／リットル）で洗浄した。カラム
をついで１０mlのカップリング緩衝液（０.１mol／リッ
トル クエン酸ナトリウム，pH６.５）で平衡化し、ゲル
を４mlの抗体溶液（カップリング緩衝液中５mg／ml）と
ともに密閉可能な容器に移し、２３℃で２時間振盪し
た。ついで、ゲルを再びカラムに取り、５０mlのカップ
リング緩衝液で洗浄し、２０mlのエタノールアミンＨＣ
ｌ（１mol／リットル，pH８.０）とともに密閉可能な容
器に取り、２３℃で２時間振盪した。ゲルを再びカラム
に移し、各１００mlの０.１mol／リットル 酢酸ナトリ
ウム、１mol／リットル ＮａＣｌ、pH４.０および０.１
Ｍトリス、１ＭＮａＣｌ、pH８.０で順次洗浄した。こ
の処理を５回反復した。最後に、ゲルをＰＢＳで平衡化
し、そのまま使用した。
択したモノクローナル抗体を、シアノーゲンブロミドで
活性化したRセファロース４Ｂに以下の方法でカップリ
ングさせた。すなわち、シアノーゲンブロミドで活性化
したRセファロース４Ｂ１.５ｇを１mmol／リットル Ｈ
Ｃｌに懸濁し、クロマトグラフィーカラムに充填し３０
０mlのＨＣｌ（１mmol／リットル）で洗浄した。カラム
をついで１０mlのカップリング緩衝液（０.１mol／リッ
トル クエン酸ナトリウム，pH６.５）で平衡化し、ゲル
を４mlの抗体溶液（カップリング緩衝液中５mg／ml）と
ともに密閉可能な容器に移し、２３℃で２時間振盪し
た。ついで、ゲルを再びカラムに取り、５０mlのカップ
リング緩衝液で洗浄し、２０mlのエタノールアミンＨＣ
ｌ（１mol／リットル，pH８.０）とともに密閉可能な容
器に取り、２３℃で２時間振盪した。ゲルを再びカラム
に移し、各１００mlの０.１mol／リットル 酢酸ナトリ
ウム、１mol／リットル ＮａＣｌ、pH４.０および０.１
Ｍトリス、１ＭＮａＣｌ、pH８.０で順次洗浄した。こ
の処理を５回反復した。最後に、ゲルをＰＢＳで平衡化
し、そのまま使用した。
【００２４】実施例２ 単球細胞系からのアムノアフィニティークロマトグラフ
ィーによるＰＡＩ−２の精製 細胞系Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）を１０
％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、細胞培養ボトル（６５０cm
2）を使用して培養した。細胞密度が１〜２×１０6／ml
に達したならば、細胞を２回無血清ＤＭＥＭで洗浄し、
再び細胞培養ボトル中同一培地に接種した。３０ng／ml
の１２−ミリストイル−１３−アセチルホルボールを加
え、細胞をさらに７２時間インキュベートした。澄明化
濾過により細胞上清２リットルを得、これを限外濾過に
より約４０倍に濃縮した。得られた濃縮液をモノクロー
ナル抗体カップリングアフィニティーゲル（例１ｇにお
ける）上にポンプで送った。次に、１００mlの洗浄緩衝
液（１.０mol／リットルＮａＣｌ，０.０２mol／リット
ル Ｎａ2ＨＰＯ4，pH７.４）でカラムから非結合蛋白質
を洗い流した。ついで、ＰＡＩ−２を蒸留水で溶出し
た。溶出液を０.１５mol／リットル ＮａＣｌ，０.０２
mol／リットル グリシン，pH７.２に対して透析し、Ｃ
ｏｎＡ−Rセファロース上にポンプで送った。ＣｏｎＡ
−Rセファロースを、０.１５mol／リットル ＮａＣｌ、
０.０２mol／リットル グリシン、pH７.２で洗浄したの
ち、溶出を同一緩衝液中０.５mol／リットル メチルα
−Ｄ−マンノピラノシドで行った。通過液およびＣｏｎ
Ａ−Rセファロースからの溶出液を、還元条件下に、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。非結合
分画は４５,０００ダルトンのバンドとして現れ、ＰＡ
Ｉ−２の非グリコシル化型に一致した。比活性は１７
０,０００Ｕ／mgであった。溶出液からは同様に分子量
６５,０００ダルトンの単一バンドが現れ、グリコシル
化ＰＡＩ−２に一致した。比活性は１１０,０００Ｕ／m
gであった。ＰＡＩ−２の１単位は１国際単位のウロキ
ナーゼを阻害する量として定義される。
ィーによるＰＡＩ−２の精製 細胞系Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）を１０
％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、細胞培養ボトル（６５０cm
2）を使用して培養した。細胞密度が１〜２×１０6／ml
に達したならば、細胞を２回無血清ＤＭＥＭで洗浄し、
再び細胞培養ボトル中同一培地に接種した。３０ng／ml
の１２−ミリストイル−１３−アセチルホルボールを加
え、細胞をさらに７２時間インキュベートした。澄明化
濾過により細胞上清２リットルを得、これを限外濾過に
より約４０倍に濃縮した。得られた濃縮液をモノクロー
ナル抗体カップリングアフィニティーゲル（例１ｇにお
ける）上にポンプで送った。次に、１００mlの洗浄緩衝
液（１.０mol／リットルＮａＣｌ，０.０２mol／リット
ル Ｎａ2ＨＰＯ4，pH７.４）でカラムから非結合蛋白質
を洗い流した。ついで、ＰＡＩ−２を蒸留水で溶出し
た。溶出液を０.１５mol／リットル ＮａＣｌ，０.０２
mol／リットル グリシン，pH７.２に対して透析し、Ｃ
ｏｎＡ−Rセファロース上にポンプで送った。ＣｏｎＡ
−Rセファロースを、０.１５mol／リットル ＮａＣｌ、
０.０２mol／リットル グリシン、pH７.２で洗浄したの
ち、溶出を同一緩衝液中０.５mol／リットル メチルα
−Ｄ−マンノピラノシドで行った。通過液およびＣｏｎ
Ａ−Rセファロースからの溶出液を、還元条件下に、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。非結合
分画は４５,０００ダルトンのバンドとして現れ、ＰＡ
Ｉ−２の非グリコシル化型に一致した。比活性は１７
０,０００Ｕ／mgであった。溶出液からは同様に分子量
６５,０００ダルトンの単一バンドが現れ、グリコシル
化ＰＡＩ−２に一致した。比活性は１１０,０００Ｕ／m
gであった。ＰＡＩ−２の１単位は１国際単位のウロキ
ナーゼを阻害する量として定義される。
【００２５】実施例３ 組換え酵母細胞からのイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーによるＰＡＩ−２の精製 Antaliaら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 985-98
9, 1988）によって記載されたＰＡＩ−２特異的ｃＤＮ
Ａを、酵母菌／大腸菌シャトルベクターpEMBLyex4（Ces
areni ＆ Murry, in：Genetic Engineering, 9巻, 135-
154頁, J.K. Setlow編，Plenum Press. 1987）中に、Ｐ
ＡＩ−２の発現を調節可能ＧＡＬ／ＣＹＣハイブリッド
プロモーターの制御下に置く方法でクローン化した。新
たな組換えプラスミドｐＰＡＩ−２−Ａ−１０をSaccha
romyces cerevisiae ＣＬ３ＡＢＹＳ８６株にトランス
フォームし、トランスフォームされた酵母菌細胞を選択
培地上で選択した。使用した分子生物学的ならびに微生
物学的技術は、Broekerら（Appl. Microbiol. Biotechn
ol. 34, 756-764, 1991）によって記述されている。S.
cerevisiae ＣＬ３ＡＢＹＳ８６〔ｐＰＡＩ−２−Ａ−
１０〕トランスフォーマントを振盪培養で増殖させ、４
日間インキュベーション後、細胞をガラスビーズミルで
破壊した。溶解物の遠心分離および滅菌濾過後に、ウロ
キナーゼ阻害アッセイで培養培地中約４５mg／リットル
濃度の上清ＰＡＩ−２が検出できた。この方法で得られ
た溶解物５０mlを、モノクローナル抗体カップリングア
フィニティーゲル（実施例１ｇにおける）上にポンプで
送った。次に１００mlの洗浄緩衝液（１.０mol／リット
ル ＮａＣｌ，０.０２mol／リットル Ｎａ2ＨＰＯ4，pH
７.４）でカラムから非結合蛋白質を洗い流した。つい
で、ＰＡＩ−２を蒸留水で溶出した。比活性は１４０,
０００〜１６０,０００Ｕ／mgであった。蛋白質は、還
元条件下ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、分子量４５,０００ダルトンの１つのバンドとして
現れた。
ラフィーによるＰＡＩ−２の精製 Antaliaら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 985-98
9, 1988）によって記載されたＰＡＩ−２特異的ｃＤＮ
Ａを、酵母菌／大腸菌シャトルベクターpEMBLyex4（Ces
areni ＆ Murry, in：Genetic Engineering, 9巻, 135-
154頁, J.K. Setlow編，Plenum Press. 1987）中に、Ｐ
ＡＩ−２の発現を調節可能ＧＡＬ／ＣＹＣハイブリッド
プロモーターの制御下に置く方法でクローン化した。新
たな組換えプラスミドｐＰＡＩ−２−Ａ−１０をSaccha
romyces cerevisiae ＣＬ３ＡＢＹＳ８６株にトランス
フォームし、トランスフォームされた酵母菌細胞を選択
培地上で選択した。使用した分子生物学的ならびに微生
物学的技術は、Broekerら（Appl. Microbiol. Biotechn
ol. 34, 756-764, 1991）によって記述されている。S.
cerevisiae ＣＬ３ＡＢＹＳ８６〔ｐＰＡＩ−２−Ａ−
１０〕トランスフォーマントを振盪培養で増殖させ、４
日間インキュベーション後、細胞をガラスビーズミルで
破壊した。溶解物の遠心分離および滅菌濾過後に、ウロ
キナーゼ阻害アッセイで培養培地中約４５mg／リットル
濃度の上清ＰＡＩ−２が検出できた。この方法で得られ
た溶解物５０mlを、モノクローナル抗体カップリングア
フィニティーゲル（実施例１ｇにおける）上にポンプで
送った。次に１００mlの洗浄緩衝液（１.０mol／リット
ル ＮａＣｌ，０.０２mol／リットル Ｎａ2ＨＰＯ4，pH
７.４）でカラムから非結合蛋白質を洗い流した。つい
で、ＰＡＩ−２を蒸留水で溶出した。比活性は１４０,
０００〜１６０,０００Ｕ／mgであった。蛋白質は、還
元条件下ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、分子量４５,０００ダルトンの１つのバンドとして
現れた。
Claims (3)
- 【請求項１】 生物学的活性型の純粋なプラスミノーゲ
ンアクティベーターインヒビター２（ＰＡＩ−２）をイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーによって得る方
法において、ＰＡＩ−２を含有する溶液を支持体物質
（アフィニティー物質）に結合したＰＡＩ−２に対する
モノクローナル抗体と接触させ、アフィニティー物質と
液体を互いに分離し、ついでＰＡＩ−２をアフィニティ
ー物質から生物学的活性型で溶出することからなる方
法。 - 【請求項２】 モノクローナル抗体の免疫反応性フラグ
メントまたは誘導体を支持体物質に結合させる、請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 溶出がpH５.５〜８.５において伝導度が
＜３mSの緩衝液または蒸留水を用いて行われる、請求項
１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4214999:1 | 1992-05-06 | ||
| DE4214999A DE4214999C2 (de) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Reinigung von Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 2 durch Immunaffinitätschromatographie |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH069695A true JPH069695A (ja) | 1994-01-18 |
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ID=6458317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5103890A Pending JPH069695A (ja) | 1992-05-06 | 1993-04-30 | プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター２のイムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0568836A1 (ja) |
| JP (1) | JPH069695A (ja) |
| KR (2) | KR930024353A (ja) |
| AU (1) | AU3837193A (ja) |
| CA (1) | CA2095577A1 (ja) |
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| MX (1) | MX9302629A (ja) |
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| NZ (1) | NZ247533A (ja) |
| ZA (1) | ZA932443B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| KR20010042402A (ko) | 1998-04-01 | 2001-05-25 | 로잘란드 앤 칼도르 | 피부 상처의 치료를 위한 프로테아제 억제제의 용도 |
| US7265248B1 (en) | 2005-04-29 | 2007-09-04 | Technology Innovations, Llc | Compositions and methods for the treatment of malaria |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE3713272A1 (de) * | 1987-04-18 | 1988-11-03 | Behringwerke Ag | Plasminogenaktivator-inhibitor, typ 2 (pai-2) |
| DE3929504A1 (de) * | 1989-09-06 | 1991-03-07 | Behringwerke Ag | Verfahren zur reinigung von plasminogen-aktivator-inhibitor 2 (pai-2) |
| US5204256A (en) * | 1989-09-06 | 1993-04-20 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for the purification of plasminogen activator inhibitor 2 (pai-2) |
| US5444153A (en) * | 1989-12-20 | 1995-08-22 | Biotech Australia Pty Limited | Variants of PAI-2 |
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1992
- 1992-05-06 DE DE4214999A patent/DE4214999C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1993
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