JPH069695A - プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター2のイムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製 - Google Patents
プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター2のイムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製Info
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- JPH069695A JPH069695A JP5103890A JP10389093A JPH069695A JP H069695 A JPH069695 A JP H069695A JP 5103890 A JP5103890 A JP 5103890A JP 10389093 A JP10389093 A JP 10389093A JP H069695 A JPH069695 A JP H069695A
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- C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
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- H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8132—Plasminogen activator inhibitors
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、プラスミノーゲンアクティベータ
ーインヒビター2(PAI−2)のイムノアフィニティ
ークロマトグラフィーによる精製方法およびこの種類の
方法に適当なモノクローナル抗体に関する。 【効果】 胎盤、単球またはPAI−2の遺伝情報を含
有する組換え細胞の抽出物もしくは培養上清のような出
発原料から、その部分変性を生じることのない緩和な条
件での治療用の、高純度の、ネイティブなPAI−2を
高収率で得ることを可能にする。
ーインヒビター2(PAI−2)のイムノアフィニティ
ークロマトグラフィーによる精製方法およびこの種類の
方法に適当なモノクローナル抗体に関する。 【効果】 胎盤、単球またはPAI−2の遺伝情報を含
有する組換え細胞の抽出物もしくは培養上清のような出
発原料から、その部分変性を生じることのない緩和な条
件での治療用の、高純度の、ネイティブなPAI−2を
高収率で得ることを可能にする。
Description
【0001】本発明は、プラスミノーゲンアクティベー
ターインヒビター2(PAI−2)のイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによる精製方法およびこの目的
に適当なモノクローナル抗体に関する。
ターインヒビター2(PAI−2)のイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによる精製方法およびこの目的
に適当なモノクローナル抗体に関する。
【0002】プラスミンは、フィブリン分解、細胞遊
走、細胞分化または組織再造形のような多くの生理学的
過程に関して中心的プロテアーゼである。プラスミンの
活性はとくに、プラスミノーゲンアクティベーターtP
A(組織型プラスミノーゲンアクティベーター)および
ウロキナーゼによるプロ酵素プラスミノーゲンの活性プ
ロテアーゼプラスミンへの蛋白質分解変換によって調節
されている。これらのプロテアーゼの活性は、一方で
は、特異的インヒビターたとえばPAI−1またはPA
I−2によって制御される。
走、細胞分化または組織再造形のような多くの生理学的
過程に関して中心的プロテアーゼである。プラスミンの
活性はとくに、プラスミノーゲンアクティベーターtP
A(組織型プラスミノーゲンアクティベーター)および
ウロキナーゼによるプロ酵素プラスミノーゲンの活性プ
ロテアーゼプラスミンへの蛋白質分解変換によって調節
されている。これらのプロテアーゼの活性は、一方で
は、特異的インヒビターたとえばPAI−1またはPA
I−2によって制御される。
【0003】PAI−2はとくに、ヒト胎盤組織、妊婦
の血漿および単球中に見出される。PAI−2は胎盤か
ら非グリコシル化蛋白質として単離され、SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動で、それぞれ分子量45,0
00および51,000ダルトンの二重バンドとして現
れる。51,000ダルトン型は、ジスルフィド結合の
還元により45,000ダルトン型に変換できる。すな
わち51,000ダルトン型は45,000ダルトン型の
酸化生成物である。PAI−2の部分は、胎盤中に、他
の蛋白質との複合体、たとえばビトロネクチンの型で存
在する。精製した調製物のSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でも、PAI−2オリゴマーが現れ、これは
還元条件下にモノマー型に変換できる。PAI−2は、
妊婦の血漿から分子量約65,000ダルトンのグリコ
シル化蛋白質として単離され、一方、培養単球からはグ
リコシル化および非グリコシル化型の両者が単離でき
る。以上述べたPAI−2型はすべて、ウロキナーゼを
阻害できる。以下、PAI−2の語は、阻害活性を有す
るすべての型(非グリコシル化、グリコシル化、オリゴ
マーおよび他の蛋白質との複合体)を包含する。
の血漿および単球中に見出される。PAI−2は胎盤か
ら非グリコシル化蛋白質として単離され、SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動で、それぞれ分子量45,0
00および51,000ダルトンの二重バンドとして現
れる。51,000ダルトン型は、ジスルフィド結合の
還元により45,000ダルトン型に変換できる。すな
わち51,000ダルトン型は45,000ダルトン型の
酸化生成物である。PAI−2の部分は、胎盤中に、他
の蛋白質との複合体、たとえばビトロネクチンの型で存
在する。精製した調製物のSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動でも、PAI−2オリゴマーが現れ、これは
還元条件下にモノマー型に変換できる。PAI−2は、
妊婦の血漿から分子量約65,000ダルトンのグリコ
シル化蛋白質として単離され、一方、培養単球からはグ
リコシル化および非グリコシル化型の両者が単離でき
る。以上述べたPAI−2型はすべて、ウロキナーゼを
阻害できる。以下、PAI−2の語は、阻害活性を有す
るすべての型(非グリコシル化、グリコシル化、オリゴ
マーおよび他の蛋白質との複合体)を包含する。
【0004】ヒト組織または体液からの高純度の治療用
蛋白質は、ウイルス伝播の危険性を低下させる。培養微
生物からの治療用組換えヒト蛋白質の精製は、抗原性の
宿主蛋白の可能な限り完全な除去を保証するため、極め
て高純度のこれらの蛋白質を生じるものでなければなら
ない。モノクローナル抗体によるアフィニティークロマ
トグラフィーは、著しい高純度の達成を可能にする方法
である。イムノアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製は、複雑な蛋白混合物でもわずかの精製工程を要
するのみであるから、慣用の方法より高い収率も達成で
きる。
蛋白質は、ウイルス伝播の危険性を低下させる。培養微
生物からの治療用組換えヒト蛋白質の精製は、抗原性の
宿主蛋白の可能な限り完全な除去を保証するため、極め
て高純度のこれらの蛋白質を生じるものでなければなら
ない。モノクローナル抗体によるアフィニティークロマ
トグラフィーは、著しい高純度の達成を可能にする方法
である。イムノアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製は、複雑な蛋白混合物でもわずかの精製工程を要
するのみであるから、慣用の方法より高い収率も達成で
きる。
【0005】PAI−2のイムノアフィニティークロマ
トグラフィーによる精製は既に報告されている(Asted
t, B.ら,Thromb, Haemost, 53:122-125, 1985)。し
かしながら、使用される溶出条件、すなわち2mol/リ
ットル KSCN,0.01%トリトンはPAI−2の少
なくとも部分変性を生じる。したがって、記載された方
法はたとえば治療用のネイティブなPAI−2を得るに
は不適当である。
トグラフィーによる精製は既に報告されている(Asted
t, B.ら,Thromb, Haemost, 53:122-125, 1985)。し
かしながら、使用される溶出条件、すなわち2mol/リ
ットル KSCN,0.01%トリトンはPAI−2の少
なくとも部分変性を生じる。したがって、記載された方
法はたとえば治療用のネイティブなPAI−2を得るに
は不適当である。
【0006】本発明の目的は、したがって、胎盤、単球
またはPAI−2の遺伝情報を含有する組換え細胞の抽
出物もしくは培養上清のような出発原料から、イムノア
フィニティークロマトグラフィーによるネイティブPA
I−2の精製方法を開発することにある。
またはPAI−2の遺伝情報を含有する組換え細胞の抽
出物もしくは培養上清のような出発原料から、イムノア
フィニティークロマトグラフィーによるネイティブPA
I−2の精製方法を開発することにある。
【0007】驚くべきことに、PAI−2は固定化モノ
クローナル抗体に結合可能であり、低イオン強度の水溶
液によりまたは蒸留水で活性型として溶出できることが
発見された。
クローナル抗体に結合可能であり、低イオン強度の水溶
液によりまたは蒸留水で活性型として溶出できることが
発見された。
【0008】本発明は、PAI−2を含有する溶液を不
溶性支持体物質に結合させたPAI−2に対するモノク
ローナル抗体と接触させ、アフィニティー物質と液体を
互いに分離し、ついでPAI−2をアフィニティー物質
から生物学的に活性な型で溶出することからなるネイテ
ィブなPAI−2のイムノアフィニティークロマトグラ
フィーによる精製方法に関する。
溶性支持体物質に結合させたPAI−2に対するモノク
ローナル抗体と接触させ、アフィニティー物質と液体を
互いに分離し、ついでPAI−2をアフィニティー物質
から生物学的に活性な型で溶出することからなるネイテ
ィブなPAI−2のイムノアフィニティークロマトグラ
フィーによる精製方法に関する。
【0009】本発明はまた、ネイティブなPAI−2の
イムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製に
適当な、PAI−2に対するモノクローナル抗体に関す
る。PAI−2が特異的に結合し、その生物学的活性を
損わない緩和な条件下に再び解離できることがこのよう
な抗体の特性である。本発明の目的にかなうモノクロー
ナル抗体はまた、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく
知られているモノクローナル抗体の免疫反応性フラグメ
ント、たとえばF(ab')2、FabまたはFvフラグ
メントおよび抗体分子の抗原結合単一鎖である。
イムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製に
適当な、PAI−2に対するモノクローナル抗体に関す
る。PAI−2が特異的に結合し、その生物学的活性を
損わない緩和な条件下に再び解離できることがこのよう
な抗体の特性である。本発明の目的にかなうモノクロー
ナル抗体はまた、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく
知られているモノクローナル抗体の免疫反応性フラグメ
ント、たとえばF(ab')2、FabまたはFvフラグ
メントおよび抗体分子の抗原結合単一鎖である。
【0010】適当なモノクローナル抗体は、本技術分野
の熟練者にはそれ自体よく知られているKoehler & Mil
stein(Naturw 256:285-308)または彼らの方法の多く
変法(たとえば、Goding, J.W., Immunol. Meth. 39:2
85-308, 1980)によって製造できる。たとえば次の通り
である。
の熟練者にはそれ自体よく知られているKoehler & Mil
stein(Naturw 256:285-308)または彼らの方法の多く
変法(たとえば、Goding, J.W., Immunol. Meth. 39:2
85-308, 1980)によって製造できる。たとえば次の通り
である。
【0011】哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット
を、PAI−2を含む液体、好ましくはフロインドアジ
ュバント中精製PAI−2乳化液を数回、それぞれ1〜
4週間隔で注射して免疫した。細胞融合の準備のため
に、PAI−2は、水性溶液中、細胞融合の予定日の3
〜5日前に、好ましくは腹腔内また静脈内に投与する。
を、PAI−2を含む液体、好ましくはフロインドアジ
ュバント中精製PAI−2乳化液を数回、それぞれ1〜
4週間隔で注射して免疫した。細胞融合の準備のため
に、PAI−2は、水性溶液中、細胞融合の予定日の3
〜5日前に、好ましくは腹腔内また静脈内に投与する。
【0012】抗体産生細胞を得るには、免疫動物を屠殺
し、リンパ臓器好ましくは脾臓を摘出してリンパ細胞を
単離する。細胞培養で永久に増殖を続ける抗体産生細胞
を得るには、リンパ細胞を不死化しなければならない。
これは様々な方法、たとえばエプシュタイン−バールウ
イルスまたはレトロウイルスによるトランスフォーメー
ションによって実施できる。しかしながら、リンパ細胞
はエミローマ細胞と融合させるのが好ましい。とくに適
当なエミローマ細胞系は免疫グロブリンを分泌しないB
ALB/cマウスからの細胞系、たとえば細胞系SP2
/0−Ag14またはX63−Ag8.653である。
細胞は、分子量1000〜6000のポリエチレングリ
コール30〜60%濃度の溶液中でインキュベートして
融合するが、他の方法たとえば電気融合も適している。
リンパ細胞とミエローマ細胞のハイブリッド(ハイブリ
ドーマ)を選択し、適当な栄養培地中での培養により増
殖させる。細胞融合1〜3週後にハイブリドーマについ
て特異的抗体の産生を試験する。このためには、本技術
分野の熟練者にはよく知られている多数の試験システム
が利用できる。固相にPAI−2を吸着させるELIS
A試験システムの使用が好ましい。ハイブリドーマ細胞
の上清を最初PAI−2と接触させ、PAI−2特異的
抗体を、マウスIgGに対する酵素標識抗体とのインキ
ュベーションついで標識酵素に対する発色性基質の添加
により検出する。PAI−2に対する特異的抗体を産生
する細胞を、顕微鏡検査による平板分離または限定希釈
法によってクローン化する。クローン化細胞系を増殖さ
せてインビトロで抗体を得る。モノクローナル抗体は培
養培地から得ることができる。このためには、多数の方
法を利用できるが、固定化プロテインAまたはPAI−
2上でアフィニティークロマトグラフィーを行うことが
好ましい。
し、リンパ臓器好ましくは脾臓を摘出してリンパ細胞を
単離する。細胞培養で永久に増殖を続ける抗体産生細胞
を得るには、リンパ細胞を不死化しなければならない。
これは様々な方法、たとえばエプシュタイン−バールウ
イルスまたはレトロウイルスによるトランスフォーメー
ションによって実施できる。しかしながら、リンパ細胞
はエミローマ細胞と融合させるのが好ましい。とくに適
当なエミローマ細胞系は免疫グロブリンを分泌しないB
ALB/cマウスからの細胞系、たとえば細胞系SP2
/0−Ag14またはX63−Ag8.653である。
細胞は、分子量1000〜6000のポリエチレングリ
コール30〜60%濃度の溶液中でインキュベートして
融合するが、他の方法たとえば電気融合も適している。
リンパ細胞とミエローマ細胞のハイブリッド(ハイブリ
ドーマ)を選択し、適当な栄養培地中での培養により増
殖させる。細胞融合1〜3週後にハイブリドーマについ
て特異的抗体の産生を試験する。このためには、本技術
分野の熟練者にはよく知られている多数の試験システム
が利用できる。固相にPAI−2を吸着させるELIS
A試験システムの使用が好ましい。ハイブリドーマ細胞
の上清を最初PAI−2と接触させ、PAI−2特異的
抗体を、マウスIgGに対する酵素標識抗体とのインキ
ュベーションついで標識酵素に対する発色性基質の添加
により検出する。PAI−2に対する特異的抗体を産生
する細胞を、顕微鏡検査による平板分離または限定希釈
法によってクローン化する。クローン化細胞系を増殖さ
せてインビトロで抗体を得る。モノクローナル抗体は培
養培地から得ることができる。このためには、多数の方
法を利用できるが、固定化プロテインAまたはPAI−
2上でアフィニティークロマトグラフィーを行うことが
好ましい。
【0013】ついで精製されたモノクローナル抗体につ
いて、イムノアフィニティークロマトグラフィーに対す
る適性を試験する。このためには、抗体を、本技術分野
の熟練者には慣用の方法により、適当な不溶性支持体物
質にカップリングさせる。アフィニティークロマトグラ
フィーに使用される支持体は様々な物質、たとえばアガ
ロース、ポリアクリルアミドまたはセルロースの誘導体
からなる。抗体は、たとえばシアノーゲンブロミドまた
はカルボジイミドで支持体を活性化したのちにカップリ
ングさせることができる。その他に種々の支持体物質お
よびカップリング方法が当該技術者に知られている。原
理的には、支持体としてはすべての慣用の物質が、また
カップリングした抗体の活性が有意に変化しないすべて
のカップリング方法が適当である。ついで、アフィニテ
ィーゲルについて、PAI−2の精製に対する適性が試
験される。このためには、PAI−2含有溶液をアフィ
ニティーゲル上にポンプで送り、通過したPAI−2活
性を測定する。PAI−2が吸着されたゲルが免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーに適している。
いて、イムノアフィニティークロマトグラフィーに対す
る適性を試験する。このためには、抗体を、本技術分野
の熟練者には慣用の方法により、適当な不溶性支持体物
質にカップリングさせる。アフィニティークロマトグラ
フィーに使用される支持体は様々な物質、たとえばアガ
ロース、ポリアクリルアミドまたはセルロースの誘導体
からなる。抗体は、たとえばシアノーゲンブロミドまた
はカルボジイミドで支持体を活性化したのちにカップリ
ングさせることができる。その他に種々の支持体物質お
よびカップリング方法が当該技術者に知られている。原
理的には、支持体としてはすべての慣用の物質が、また
カップリングした抗体の活性が有意に変化しないすべて
のカップリング方法が適当である。ついで、アフィニテ
ィーゲルについて、PAI−2の精製に対する適性が試
験される。このためには、PAI−2含有溶液をアフィ
ニティーゲル上にポンプで送り、通過したPAI−2活
性を測定する。PAI−2が吸着されたゲルが免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーに適している。
【0014】好ましい操作においては、PAI−2のイ
ムノアフィニティーゲルとの結合は、pH5.5〜8.5、
温度+4℃〜+37℃において、伝導度≧5mSの溶液か
ら起こる。緩衝液は0.05mol/リットル リン酸塩ま
たはトリスおよび0〜3.0mol/リットル MaClを
含有することがとくに好ましい。
ムノアフィニティーゲルとの結合は、pH5.5〜8.5、
温度+4℃〜+37℃において、伝導度≧5mSの溶液か
ら起こる。緩衝液は0.05mol/リットル リン酸塩ま
たはトリスおよび0〜3.0mol/リットル MaClを
含有することがとくに好ましい。
【0015】重要な工程はアフィニティーゲルからのP
AI−2の溶出である。抗原−抗体複合体の解離に要す
る条件下では、PAI−2活性の不可逆的破壊を生じる
ことが多い。したがって、PAI−2活性を保持しなが
ら抗原−抗体複合体の解離を可能にする緩和な溶出条件
を見出すことが必要である。原理的には、このために様
々な溶出液、たとえば有機溶媒、界面活性剤、イオン強
度の極めて低いもしくは極めて高い溶液または各種溶出
液の組合せを使用することが可能である。これらのおよ
び他の溶出方法(たとえば温度依存性)は本技術分野の
熟練者にはよく知られている。PAI−2の溶出には、
pH5.5〜8.5において極めて低いイオン強度(伝導度
≦3mS)の溶液、とくに蒸留水の使用が好ましい。溶出
液には、溶出したPAI−2を安定化するために、様々
な物質、たとえば糖、糖アルコール、多糖、アミノ酸ま
たは蛋白質を加えることができる。
AI−2の溶出である。抗原−抗体複合体の解離に要す
る条件下では、PAI−2活性の不可逆的破壊を生じる
ことが多い。したがって、PAI−2活性を保持しなが
ら抗原−抗体複合体の解離を可能にする緩和な溶出条件
を見出すことが必要である。原理的には、このために様
々な溶出液、たとえば有機溶媒、界面活性剤、イオン強
度の極めて低いもしくは極めて高い溶液または各種溶出
液の組合せを使用することが可能である。これらのおよ
び他の溶出方法(たとえば温度依存性)は本技術分野の
熟練者にはよく知られている。PAI−2の溶出には、
pH5.5〜8.5において極めて低いイオン強度(伝導度
≦3mS)の溶液、とくに蒸留水の使用が好ましい。溶出
液には、溶出したPAI−2を安定化するために、様々
な物質、たとえば糖、糖アルコール、多糖、アミノ酸ま
たは蛋白質を加えることができる。
【0016】以下の例は、本発明を例示するものであ
る。 実施例1 モノクローナル抗体の製造および選択 a) マウスの免疫処置 雌性BALB/cマウスに、PAI−2(Radtkeら,Bi
ol. Chem. Hoppe-Seyler, 371:1119-1127, 1990の記載
のより調製)50μgの完全フロインドアジュバント中
乳化液を皮下注射して免疫処置した(1日目)。28日
目および56日目に、それぞれ、不完全フロインドアジ
ュバント中に乳化した30μgのPAI−2を同様に皮
下注射した。ついで、92日目に、生理食塩水0.5ml
中100μgのPAI−2を腹腔内に注射した。
る。 実施例1 モノクローナル抗体の製造および選択 a) マウスの免疫処置 雌性BALB/cマウスに、PAI−2(Radtkeら,Bi
ol. Chem. Hoppe-Seyler, 371:1119-1127, 1990の記載
のより調製)50μgの完全フロインドアジュバント中
乳化液を皮下注射して免疫処置した(1日目)。28日
目および56日目に、それぞれ、不完全フロインドアジ
ュバント中に乳化した30μgのPAI−2を同様に皮
下注射した。ついで、92日目に、生理食塩水0.5ml
中100μgのPAI−2を腹腔内に注射した。
【0017】b) リンパ細胞とミエローマ細胞の融合 95日目に、脾臓を摘出したのち機械的崩壊によりリン
パ細胞(約1×108個)を得た。リンパ細胞をダルベ
ッコ改良イーグル培地(DMEM)中で洗浄し、ミエロ
ーマ細胞系SP2/0−Ag14の細胞5×107個と
混合し、遠心分離して沈降させた。上清を完全に除去し
たのち、DMEM5%濃度のポリエチレングリコール4
000溶液0.5mlを、細胞ペレットに1分間を要して
滴下した。
パ細胞(約1×108個)を得た。リンパ細胞をダルベ
ッコ改良イーグル培地(DMEM)中で洗浄し、ミエロ
ーマ細胞系SP2/0−Ag14の細胞5×107個と
混合し、遠心分離して沈降させた。上清を完全に除去し
たのち、DMEM5%濃度のポリエチレングリコール4
000溶液0.5mlを、細胞ペレットに1分間を要して
滴下した。
【0018】懸濁液を37℃で90秒間インキュベート
し、ついで7.5mlのDMEMを5分間を要して添加し
て希釈した。室温で10分間インキュベートしたのち、
容量をDMEMで40mlとし、細胞を遠心分離して沈降
させた。上清を吸引して除き、ついで20%ウシ胎児血
清(FCS)および13.6mg/mlヒポキサンチン、0.
18mg/mlアミノブテリン、3.9mg/mlチミジンを含
むDMEM(HAT培地)中に再懸濁し、6個のマイク
ロタイタープレート上に接種した(ウエルあたり200
μl)。培地は3〜4日間隔で再交換し、10日後にH
AT培地をHT培地に換えた。
し、ついで7.5mlのDMEMを5分間を要して添加し
て希釈した。室温で10分間インキュベートしたのち、
容量をDMEMで40mlとし、細胞を遠心分離して沈降
させた。上清を吸引して除き、ついで20%ウシ胎児血
清(FCS)および13.6mg/mlヒポキサンチン、0.
18mg/mlアミノブテリン、3.9mg/mlチミジンを含
むDMEM(HAT培地)中に再懸濁し、6個のマイク
ロタイタープレート上に接種した(ウエルあたり200
μl)。培地は3〜4日間隔で再交換し、10日後にH
AT培地をHT培地に換えた。
【0019】c) PAI−2に対する抗体の試験 融合14日後に、細胞の培養上清について、エンザイム
イムノアッセイによりPAI−2に対する抗体を試験し
た。すなわち、ポリスチレンマイクロテストプレート
を、0.1mol/リットル NaCl、0.1mol/リット
ル 酢酸ナトリウム、pH5.5中、0.1μg/mlのPA
I−2とインキュベートした(4℃,24時間)。次
に、細胞培養上清を適用し(37℃,2時間)、続いて
マウスIgGに対するペルオキシダーゼ接合抗体とイン
キュベートした。使用した基質は、0.1mol/リットル
クエン酸、0.1mol/リットル Na2HPO4、pH4.
5中、0.1%(重量/容量)2′,2′−アジノジ
(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホネート)お
よび0.012%(重量/容量)H2O2の溶液とした。
37℃で30分間インキュベートしたのち、405nmに
おける吸収を測定した。各インキュベーション工程の間
には、アッセイプレートのウエルをPBS/Rツイーン
で洗浄した。
イムノアッセイによりPAI−2に対する抗体を試験し
た。すなわち、ポリスチレンマイクロテストプレート
を、0.1mol/リットル NaCl、0.1mol/リット
ル 酢酸ナトリウム、pH5.5中、0.1μg/mlのPA
I−2とインキュベートした(4℃,24時間)。次
に、細胞培養上清を適用し(37℃,2時間)、続いて
マウスIgGに対するペルオキシダーゼ接合抗体とイン
キュベートした。使用した基質は、0.1mol/リットル
クエン酸、0.1mol/リットル Na2HPO4、pH4.
5中、0.1%(重量/容量)2′,2′−アジノジ
(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホネート)お
よび0.012%(重量/容量)H2O2の溶液とした。
37℃で30分間インキュベートしたのち、405nmに
おける吸収を測定した。各インキュベーション工程の間
には、アッセイプレートのウエルをPBS/Rツイーン
で洗浄した。
【0020】d) 抗体産生細胞系のクローニング 上述のエンザイムイムノアッセイにおいて強い陽性反応
(吸着>1.5)を示した上清の細胞を限定希釈法でク
ローン化した。これには、20%FCSおよび5%ヒト
内皮培養上清(Costarより)を含み約60個の細胞を含
有するDMEMを細胞培養プレートの96個のウエルに
分配した。単一のクローンを顕微鏡下に確認し、抗体産
生を試験した。クローニングは2回反復した。
(吸着>1.5)を示した上清の細胞を限定希釈法でク
ローン化した。これには、20%FCSおよび5%ヒト
内皮培養上清(Costarより)を含み約60個の細胞を含
有するDMEMを細胞培養プレートの96個のウエルに
分配した。単一のクローンを顕微鏡下に確認し、抗体産
生を試験した。クローニングは2回反復した。
【0021】e) モノクローナル抗体の精製 抗体の製造には、クローン細胞系をローラーボトルに移
し、イスコベック改良ダルベッコ培地中で培養した。細
胞を遠心分離および濾紙を通しての濾過で除去し、限外
濾過により約10倍に濃縮した。濃縮液をプロテインA
−RセファロースCL−4Bに通して、結合したIgG
を0.2mol/リットル グリシン/HCl、pH3.0で溶
出した。蛋白質含有分画を0.1mol/リットル クエン
酸、pH6.5に対して透析し、限外濾過により約5mg/m
lに濃縮した。
し、イスコベック改良ダルベッコ培地中で培養した。細
胞を遠心分離および濾紙を通しての濾過で除去し、限外
濾過により約10倍に濃縮した。濃縮液をプロテインA
−RセファロースCL−4Bに通して、結合したIgG
を0.2mol/リットル グリシン/HCl、pH3.0で溶
出した。蛋白質含有分画を0.1mol/リットル クエン
酸、pH6.5に対して透析し、限外濾過により約5mg/m
lに濃縮した。
【0022】f) イムノアフィニティークロマトグラ
フィーのための抗体の選択 イムノアフィニティークロマトグラフィーに適した抗体
は、改良サンドイッチELISAで選択した。3個のマ
イクロテストプレートを、PAI−2に対するモノクロ
ーナル抗体(0.1mol/リットル NaCl、0.1mol
/リットル酢酸ナトリウム、pH5.5中5μg/ml)と
+4℃で24時間インキュベートしてコーティングし
た。次に、2%ウシ血清アルブミンを含むPBS/Rツ
イーン中1μg/mlのPAI−2をコーティングしたウ
エルに加え、37℃で2時間インキュベートした。その
後で、各プレートを個々に洗浄操作に付した(5分毎に
洗浄溶液を交換しながら、15分間洗浄溶液とインキュ
ベーション)。洗浄溶液はPBS、3mol/リットル N
aSCNまたは蒸留水とした。次に、プレートをPAI
−2に対するペルオキシダーゼ接合ポリクローナル抗体
とインキュベートした(37℃,2時間)。以下の工程
(洗浄、基質とのインキュベーション、測定)は実施例
1cに記載のように実施した。PBSで洗浄したプレー
トは、PAI−2のモノクローナル抗体への結合の陽性
対照として働き、一方NaSCNで洗浄したプレート
は、PAI−2のモノクローナル抗体からの溶出の陽性
対照として働いた。PBS対照中PAI−2を結合し
(A405>1.5)、蒸留水で洗浄後反応を示さなかった
(A405<0.5)モノクローナル抗体をアフィニティー
ゲルの製造に使用した。
フィーのための抗体の選択 イムノアフィニティークロマトグラフィーに適した抗体
は、改良サンドイッチELISAで選択した。3個のマ
イクロテストプレートを、PAI−2に対するモノクロ
ーナル抗体(0.1mol/リットル NaCl、0.1mol
/リットル酢酸ナトリウム、pH5.5中5μg/ml)と
+4℃で24時間インキュベートしてコーティングし
た。次に、2%ウシ血清アルブミンを含むPBS/Rツ
イーン中1μg/mlのPAI−2をコーティングしたウ
エルに加え、37℃で2時間インキュベートした。その
後で、各プレートを個々に洗浄操作に付した(5分毎に
洗浄溶液を交換しながら、15分間洗浄溶液とインキュ
ベーション)。洗浄溶液はPBS、3mol/リットル N
aSCNまたは蒸留水とした。次に、プレートをPAI
−2に対するペルオキシダーゼ接合ポリクローナル抗体
とインキュベートした(37℃,2時間)。以下の工程
(洗浄、基質とのインキュベーション、測定)は実施例
1cに記載のように実施した。PBSで洗浄したプレー
トは、PAI−2のモノクローナル抗体への結合の陽性
対照として働き、一方NaSCNで洗浄したプレート
は、PAI−2のモノクローナル抗体からの溶出の陽性
対照として働いた。PBS対照中PAI−2を結合し
(A405>1.5)、蒸留水で洗浄後反応を示さなかった
(A405<0.5)モノクローナル抗体をアフィニティー
ゲルの製造に使用した。
【0023】g) アフィニティーゲルの製造 実施例の1eのようにして精製し、1fのようにして選
択したモノクローナル抗体を、シアノーゲンブロミドで
活性化したRセファロース4Bに以下の方法でカップリ
ングさせた。すなわち、シアノーゲンブロミドで活性化
したRセファロース4B1.5gを1mmol/リットル H
Clに懸濁し、クロマトグラフィーカラムに充填し30
0mlのHCl(1mmol/リットル)で洗浄した。カラム
をついで10mlのカップリング緩衝液(0.1mol/リッ
トル クエン酸ナトリウム,pH6.5)で平衡化し、ゲル
を4mlの抗体溶液(カップリング緩衝液中5mg/ml)と
ともに密閉可能な容器に移し、23℃で2時間振盪し
た。ついで、ゲルを再びカラムに取り、50mlのカップ
リング緩衝液で洗浄し、20mlのエタノールアミンHC
l(1mol/リットル,pH8.0)とともに密閉可能な容
器に取り、23℃で2時間振盪した。ゲルを再びカラム
に移し、各100mlの0.1mol/リットル 酢酸ナトリ
ウム、1mol/リットル NaCl、pH4.0および0.1
Mトリス、1MNaCl、pH8.0で順次洗浄した。こ
の処理を5回反復した。最後に、ゲルをPBSで平衡化
し、そのまま使用した。
択したモノクローナル抗体を、シアノーゲンブロミドで
活性化したRセファロース4Bに以下の方法でカップリ
ングさせた。すなわち、シアノーゲンブロミドで活性化
したRセファロース4B1.5gを1mmol/リットル H
Clに懸濁し、クロマトグラフィーカラムに充填し30
0mlのHCl(1mmol/リットル)で洗浄した。カラム
をついで10mlのカップリング緩衝液(0.1mol/リッ
トル クエン酸ナトリウム,pH6.5)で平衡化し、ゲル
を4mlの抗体溶液(カップリング緩衝液中5mg/ml)と
ともに密閉可能な容器に移し、23℃で2時間振盪し
た。ついで、ゲルを再びカラムに取り、50mlのカップ
リング緩衝液で洗浄し、20mlのエタノールアミンHC
l(1mol/リットル,pH8.0)とともに密閉可能な容
器に取り、23℃で2時間振盪した。ゲルを再びカラム
に移し、各100mlの0.1mol/リットル 酢酸ナトリ
ウム、1mol/リットル NaCl、pH4.0および0.1
Mトリス、1MNaCl、pH8.0で順次洗浄した。こ
の処理を5回反復した。最後に、ゲルをPBSで平衡化
し、そのまま使用した。
【0024】実施例2 単球細胞系からのアムノアフィニティークロマトグラフ
ィーによるPAI−2の精製 細胞系U−937(ATCC CRL1593)を10
%FCSを含むDMEM中、細胞培養ボトル(650cm
2)を使用して培養した。細胞密度が1〜2×106/ml
に達したならば、細胞を2回無血清DMEMで洗浄し、
再び細胞培養ボトル中同一培地に接種した。30ng/ml
の12−ミリストイル−13−アセチルホルボールを加
え、細胞をさらに72時間インキュベートした。澄明化
濾過により細胞上清2リットルを得、これを限外濾過に
より約40倍に濃縮した。得られた濃縮液をモノクロー
ナル抗体カップリングアフィニティーゲル(例1gにお
ける)上にポンプで送った。次に、100mlの洗浄緩衝
液(1.0mol/リットルNaCl,0.02mol/リット
ル Na2HPO4,pH7.4)でカラムから非結合蛋白質
を洗い流した。ついで、PAI−2を蒸留水で溶出し
た。溶出液を0.15mol/リットル NaCl,0.02
mol/リットル グリシン,pH7.2に対して透析し、C
onA−Rセファロース上にポンプで送った。ConA
−Rセファロースを、0.15mol/リットル NaCl、
0.02mol/リットル グリシン、pH7.2で洗浄したの
ち、溶出を同一緩衝液中0.5mol/リットル メチルα
−D−マンノピラノシドで行った。通過液およびCon
A−Rセファロースからの溶出液を、還元条件下に、S
DSポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。非結合
分画は45,000ダルトンのバンドとして現れ、PA
I−2の非グリコシル化型に一致した。比活性は17
0,000U/mgであった。溶出液からは同様に分子量
65,000ダルトンの単一バンドが現れ、グリコシル
化PAI−2に一致した。比活性は110,000U/m
gであった。PAI−2の1単位は1国際単位のウロキ
ナーゼを阻害する量として定義される。
ィーによるPAI−2の精製 細胞系U−937(ATCC CRL1593)を10
%FCSを含むDMEM中、細胞培養ボトル(650cm
2)を使用して培養した。細胞密度が1〜2×106/ml
に達したならば、細胞を2回無血清DMEMで洗浄し、
再び細胞培養ボトル中同一培地に接種した。30ng/ml
の12−ミリストイル−13−アセチルホルボールを加
え、細胞をさらに72時間インキュベートした。澄明化
濾過により細胞上清2リットルを得、これを限外濾過に
より約40倍に濃縮した。得られた濃縮液をモノクロー
ナル抗体カップリングアフィニティーゲル(例1gにお
ける)上にポンプで送った。次に、100mlの洗浄緩衝
液(1.0mol/リットルNaCl,0.02mol/リット
ル Na2HPO4,pH7.4)でカラムから非結合蛋白質
を洗い流した。ついで、PAI−2を蒸留水で溶出し
た。溶出液を0.15mol/リットル NaCl,0.02
mol/リットル グリシン,pH7.2に対して透析し、C
onA−Rセファロース上にポンプで送った。ConA
−Rセファロースを、0.15mol/リットル NaCl、
0.02mol/リットル グリシン、pH7.2で洗浄したの
ち、溶出を同一緩衝液中0.5mol/リットル メチルα
−D−マンノピラノシドで行った。通過液およびCon
A−Rセファロースからの溶出液を、還元条件下に、S
DSポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。非結合
分画は45,000ダルトンのバンドとして現れ、PA
I−2の非グリコシル化型に一致した。比活性は17
0,000U/mgであった。溶出液からは同様に分子量
65,000ダルトンの単一バンドが現れ、グリコシル
化PAI−2に一致した。比活性は110,000U/m
gであった。PAI−2の1単位は1国際単位のウロキ
ナーゼを阻害する量として定義される。
【0025】実施例3 組換え酵母細胞からのイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーによるPAI−2の精製 Antaliaら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 985-98
9, 1988)によって記載されたPAI−2特異的cDN
Aを、酵母菌/大腸菌シャトルベクターpEMBLyex4(Ces
areni & Murry, in:Genetic Engineering, 9巻, 135-
154頁, J.K. Setlow編,Plenum Press. 1987)中に、P
AI−2の発現を調節可能GAL/CYCハイブリッド
プロモーターの制御下に置く方法でクローン化した。新
たな組換えプラスミドpPAI−2−A−10をSaccha
romyces cerevisiae CL3ABYS86株にトランス
フォームし、トランスフォームされた酵母菌細胞を選択
培地上で選択した。使用した分子生物学的ならびに微生
物学的技術は、Broekerら(Appl. Microbiol. Biotechn
ol. 34, 756-764, 1991)によって記述されている。S.
cerevisiae CL3ABYS86〔pPAI−2−A−
10〕トランスフォーマントを振盪培養で増殖させ、4
日間インキュベーション後、細胞をガラスビーズミルで
破壊した。溶解物の遠心分離および滅菌濾過後に、ウロ
キナーゼ阻害アッセイで培養培地中約45mg/リットル
濃度の上清PAI−2が検出できた。この方法で得られ
た溶解物50mlを、モノクローナル抗体カップリングア
フィニティーゲル(実施例1gにおける)上にポンプで
送った。次に100mlの洗浄緩衝液(1.0mol/リット
ル NaCl,0.02mol/リットル Na2HPO4,pH
7.4)でカラムから非結合蛋白質を洗い流した。つい
で、PAI−2を蒸留水で溶出した。比活性は140,
000〜160,000U/mgであった。蛋白質は、還
元条件下SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、分子量45,000ダルトンの1つのバンドとして
現れた。
ラフィーによるPAI−2の精製 Antaliaら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 985-98
9, 1988)によって記載されたPAI−2特異的cDN
Aを、酵母菌/大腸菌シャトルベクターpEMBLyex4(Ces
areni & Murry, in:Genetic Engineering, 9巻, 135-
154頁, J.K. Setlow編,Plenum Press. 1987)中に、P
AI−2の発現を調節可能GAL/CYCハイブリッド
プロモーターの制御下に置く方法でクローン化した。新
たな組換えプラスミドpPAI−2−A−10をSaccha
romyces cerevisiae CL3ABYS86株にトランス
フォームし、トランスフォームされた酵母菌細胞を選択
培地上で選択した。使用した分子生物学的ならびに微生
物学的技術は、Broekerら(Appl. Microbiol. Biotechn
ol. 34, 756-764, 1991)によって記述されている。S.
cerevisiae CL3ABYS86〔pPAI−2−A−
10〕トランスフォーマントを振盪培養で増殖させ、4
日間インキュベーション後、細胞をガラスビーズミルで
破壊した。溶解物の遠心分離および滅菌濾過後に、ウロ
キナーゼ阻害アッセイで培養培地中約45mg/リットル
濃度の上清PAI−2が検出できた。この方法で得られ
た溶解物50mlを、モノクローナル抗体カップリングア
フィニティーゲル(実施例1gにおける)上にポンプで
送った。次に100mlの洗浄緩衝液(1.0mol/リット
ル NaCl,0.02mol/リットル Na2HPO4,pH
7.4)でカラムから非結合蛋白質を洗い流した。つい
で、PAI−2を蒸留水で溶出した。比活性は140,
000〜160,000U/mgであった。蛋白質は、還
元条件下SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
て、分子量45,000ダルトンの1つのバンドとして
現れた。
Claims (3)
- 【請求項1】 生物学的活性型の純粋なプラスミノーゲ
ンアクティベーターインヒビター2(PAI−2)をイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーによって得る方
法において、PAI−2を含有する溶液を支持体物質
(アフィニティー物質)に結合したPAI−2に対する
モノクローナル抗体と接触させ、アフィニティー物質と
液体を互いに分離し、ついでPAI−2をアフィニティ
ー物質から生物学的活性型で溶出することからなる方
法。 - 【請求項2】 モノクローナル抗体の免疫反応性フラグ
メントまたは誘導体を支持体物質に結合させる、請求項
1記載の方法。 - 【請求項3】 溶出がpH5.5〜8.5において伝導度が
<3mSの緩衝液または蒸留水を用いて行われる、請求項
1記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4214999:1 | 1992-05-06 | ||
DE4214999A DE4214999C2 (de) | 1992-05-06 | 1992-05-06 | Reinigung von Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 2 durch Immunaffinitätschromatographie |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH069695A true JPH069695A (ja) | 1994-01-18 |
Family
ID=6458317
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5103890A Pending JPH069695A (ja) | 1992-05-06 | 1993-04-30 | プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター2のイムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製 |
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Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0568836A1 (ja) |
JP (1) | JPH069695A (ja) |
KR (2) | KR930024353A (ja) |
AU (1) | AU3837193A (ja) |
CA (1) | CA2095577A1 (ja) |
DE (1) | DE4214999C2 (ja) |
IL (1) | IL105610A0 (ja) |
MX (1) | MX9302629A (ja) |
NO (1) | NO931629L (ja) |
NZ (1) | NZ247533A (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20010042402A (ko) | 1998-04-01 | 2001-05-25 | 로잘란드 앤 칼도르 | 피부 상처의 치료를 위한 프로테아제 억제제의 용도 |
US7265248B1 (en) | 2005-04-29 | 2007-09-04 | Technology Innovations, Llc | Compositions and methods for the treatment of malaria |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5134065A (en) * | 1986-05-16 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator inhibitor and method of purification |
DE3713272A1 (de) * | 1987-04-18 | 1988-11-03 | Behringwerke Ag | Plasminogenaktivator-inhibitor, typ 2 (pai-2) |
DE3929504A1 (de) * | 1989-09-06 | 1991-03-07 | Behringwerke Ag | Verfahren zur reinigung von plasminogen-aktivator-inhibitor 2 (pai-2) |
US5204256A (en) * | 1989-09-06 | 1993-04-20 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for the purification of plasminogen activator inhibitor 2 (pai-2) |
US5444153A (en) * | 1989-12-20 | 1995-08-22 | Biotech Australia Pty Limited | Variants of PAI-2 |
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1992
- 1992-05-06 DE DE4214999A patent/DE4214999C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-05 ZA ZA932443A patent/ZA932443B/xx unknown
- 1993-04-08 EP EP93105854A patent/EP0568836A1/de not_active Withdrawn
- 1993-04-30 JP JP5103890A patent/JPH069695A/ja active Pending
- 1993-05-03 NZ NZ247533A patent/NZ247533A/en unknown
- 1993-05-04 US US08/056,393 patent/US5362857A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1993-05-06 KR KR1019930007716A patent/KR940005284A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
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NO931629L (no) | 1993-11-08 |
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MX9302629A (es) | 1993-11-01 |
AU3837193A (en) | 1993-11-11 |
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NZ247533A (en) | 1994-12-22 |
EP0568836A1 (de) | 1993-11-10 |
CA2095577A1 (en) | 1993-11-07 |
IL105610A0 (en) | 1993-09-22 |
KR930024353A (ko) | 1993-12-22 |
DE4214999A1 (de) | 1993-11-11 |
DE4214999C2 (de) | 1994-07-14 |
ZA932443B (en) | 1993-10-20 |
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