JP2002511766A

JP2002511766A - 新規メタロプロテアーゼ

Info

Publication number: JP2002511766A
Application number: JP51166499A
Authority: JP
Inventors: バンヒュイスドィネン、ロベルタス・アントニアス・マリホーフ
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2002-04-16
Also published as: EP1002104A1; WO1999007856A1; AU9158898A; GB9716755D0

Abstract

(57)【要約】新規タンパク質ADAM16aとADAM16bが同定された、これらは、例えば、避妊用ワクチン、又はスクリーニングに使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】新規メタロプロテアーゼ本発明は、とりわけ新規分子及びその使用に関する。最近、ADAMsと称され、そのメンバーがディスインテグリンとメタロプロテアーゼ(a disintegrin and metalloprotease)ドメインによって特徴づけられるＩ型内在性膜タンパク質に属する新規プロテインファミリーが同定された(Wlofsbe rgら、1995a;Wolfsbergら、1995b;Huovilaら、1996最近のレビュー)。ADAMsは、血液凝固系(crotalid)ヘビ毒ディスインテグリンメタロプロテアーゼ(SVMPs；sn ake venom metalloproteases)とマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP；matrix metalloprotease)ファミリーと関連し、これらのメンバーは、膜貫通ドメインを欠いている。完全長のADAM cDNAは、全て、シグナルペプチドに続き、プロタンパク質、Zn2+-メタロプロテアーゼ、ディスインテグリン、膜貫通領域、及び細胞質尾部(cytoplasmic tail)をコードしている。該ファミリーのメンバーは、哺乳類、アフリカツメガエル(Alfandariら、1997)、ショウジョウバエ(Fambrough ら、1996；Rookeら、1996)、及び線虫（Podbilewicz、1996；GenBank H89394）を含む多くの動物種に見出されているが、単細胞の真核生物又は植物中には未だ見出されていない。また、ADAMの遺伝子は、配列決定された細菌又はサッカロミセス・セレビシアエのゲノム中にも見出されていない。 ADAMの構造ドメインは保存されているにもかかわらず、それらは、成長において様々な役割を果たしているようである。 ADAM12(メルトリン-α(meltrin-α))は、筋芽細胞に含まれ、おそらく破骨細胞融合（Yagami-Hiromasaら、1995）にも含まれることが示された。ADAM14、又はクズバニアン(Kuzbanian)は、ショウジョウバエの軸索の伸長に関与している（Fambroughら、1996；Rookeら、1996）。ADAM11をコードする遺伝子は、原発性乳癌に再編成される（Emiら、1993）。別のADAM、TACE(TNF-αコンベルターゼ)は、その膜結合前駆体からTNF-αを切断するのに必要とされる(Blackら、1997；Mossら、1997a；Mossら、1997b)。ADA M10(MADAM)は、それが生理的な標的か否かは不明であるが、ミエリン塩基性タンパク質を分解することができる(Howardら、1996)。ファーチリン-α/β(fertilin-α/β)又はPH30-α/βとも称されるADAM1及び- 2は、哺乳類の精母細胞の後頭部上に、ヘテロダイマーとして発現され、卵母細胞との接着及び融合に役割を果たしている(Wolfsbergら、1993；Mylesら1994；C arrollら、1995；WlofsbergとWhite、1996；MylesとPrimakoff、1997)。マウスでは、ファーティリンβは、卵母細胞上のα6/β１インテグリンに結合すること、及び該相互作用は精子と卵の結合に不可欠であることが示された(Almeidaら、 1995)。該サブユニットは、成熟タンパク質には存在しない非機能的メタロプロテアーゼドメインをコードする(Blobelら、1990)。αサブユニットは、活性のあるプロテアーゼドメインをコードし、細胞−細胞融合に関与していると推測される融合ペプチド候補をコードしている(Blobelら、1992;White,1992;Mugaら、199 4)。ファーティリンαとβは、ラット、ウサギ、マウス、マカク、及び２種のモルモット中に見出されている。ヒトでは、βサブユニットのみがクローニングされている(Guptaら、1996；Vidaeusら、1997)。驚くべきことに、唯一のヒトファーティリンα遺伝子は、非機能的である（Juryら、1997）。本発明は、ADAMファミリーのメンバーである２つのポリペプチドの同定に基くものであり、本明細書において、これらはADAM 16aとADAM 16bと称される。これらのポリペプチドは、リンパ球シェダーゼ(sheddase)として知られる全く別のタンパク質を発見するための試みの中で、予期せぬ形で同定された。サルのファーティリンαを用いたヒト精巣cDNAライブラリーのダイレクトスクリーニングを含む従前の研究では、何らかの機能的なヒト精巣特異的ADAMを得ることはできなかった(Juryら、1997)。本発明者によるADAM16aとADAM16bの同定は、ヒトの生殖分野に多大な進歩をもたらすものであり、その応用については後述する。 ADAM16aとADAM16bの推定アミノ酸配列は、それぞれ図3Aと図3Bに示されており、図3Aの下線部は、成熟ポリペプチド中には存在しないシグナル配列を表している。本発明の範囲には、ADAM16aとADAM16bのみならず、それらの誘導体も含まれる。従って、本発明は、 (a)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列を含む (b)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を有すが、前記配列とは少なくとも40%のアミノ酸配列の同一性を有する、又は (c)少なくとも10アミノ酸長の上記a)又はb)に示したポリペプチドの断片でああるポリペプチドを提供する。本明細書においては、「ポリペプチド」なる語は、広義に使用され、ペプチド結合で互いに結合された複数のアミノ酸を含む分子を指称する。それ故、「ポリペプチド」は、本明細書中で時折ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と称されることもある物質を、その範囲内に含む。 ADAM16aと16bは、cDNA研究から、本発明者によって同定され、膜メタロプロプロテアーゼのADAMファミリーのメンバーと極めて近縁であることが示された。予想されるそれらの翻訳産物と既知のADAMsとの比較によって、ファーティリン-α 、ファーティリンβ、及びメルトリン-γ(ADAM1,2及び9)と関連していることが示されている。メルトリン-γのmRNAは、広く発現され（Yagami-Hiromasaら、19 95）、特に精巣中でアップレギュレートされているわけではない（データは示さず）。ADAM16aとADAM16が専らヒトの精巣中で発現され、ファーティリン-α及び βと配列が類似しているということは、それらも精子細胞上に発現されており、精子の成熟及び/又は生殖に関わっていることを示唆する。ファーティリンに加えて、他の様々な精巣特異的ADAMsが、マウスでは、ADAM4と５及びシリテスティン(cyritestin)(Wolfsbergら、1995b)、サルでは、tMDC 1-IV(Perryら、1994；P erryら1995b)等、他の種にも見出されている。これらに対するADAM16aとbの類似性は、ファーティリンに対する類似性に比べて低く、このことは、それらが、ヒトに限定された新しいタイプのADAMsであることを示唆している。それらのドメインの分析は、ADAM16aとbが、卵細胞への接着に関与し、又は精子と卵の融合、若しくは他のファーティリンタンパク分解過程(ADAM16a)に役割を果たしているかもしれないということを示唆している。唯一のヒトファーティリンα遺伝子は非機能的なので、ADAM16a又はADAM16bは、該サブユニットを機能的に代替し得るかもしれない。このことは、ファーティリンαと同様に、ADAM16aのcDNAが、機能的なプロテアーゼドメインをコードしており、ADAM16aとADAM16bが、共に融合ペプチドと思われるペプチドをコードし、且つ精巣特異的に転写されるという観察によって支持される。細胞融合を介して複製する４つの異なるウイルスファミリーの中では、ゴルジ内輸送を介する孔の中と同じく、基本(basic)孔形成サブユニットは、トリマーである(レビューとして、White,1992を参照されたい)。同様に、精子と卵の融合には複数のタンパク質が関与しており、ADAM16aとｂの両者が該複合体の一部であることもあり得る。 ADAM16aとbの染色体位置を決定した。それらの遺伝子は、他のADAMsとクラスターを成しているかもしれないと考えた。しかしながら、両ADAM16が14番染色体にマッピングされたという知見は、この考えを支持していない。例えば、ヒトTA CEは、２番染色体にマッピングされている。ADAM11は17番染色体上に存在し(Emi ら、1993)、ファーティリンβは８番染色体上に存在する(Vidaeusら、1997)。最後に、２つのマウスファーティリンαとβ、ADAM4と5、及びシリテスティンをコードする遺伝子は、それぞれヒトの12、8、6、8及び8番染色体の相同領域にマッピングされた(Lemaireら、1994；Choら、1996)。それ故、ADAM16aとbが、これら５つの精巣特異的マウスADAMsと共通の祖先を直接共有している可能性は少ない。両ADAM16が14番染色体上の同じ遺伝子座にマッピングされたという事実は、それらが遺伝子重複によって生じたことを強く示唆する。２つの観察は、ヒトファーティリンα遺伝子は、ヒトの進化過程において、極めて最近になって、不活化されたことを示唆している。第一に、他の霊長類を含む他の５つの哺乳類種では機能的な遺伝子として見出されている。第二に、多くの偽遺伝子とは異なり、「コード領域」が複数のフレーム外突然変異を有するにもかかわらず、ヒトのファーティリンαのRNAは、未だ転写されている（Juryら、1997）。他方、よく研究されているマカクにさえ、ADAM16aとbのオーソログは存在しないので(Perryら、1994；Perry1995a；Perryら、1995b)、それらは、ヒトの進化において最近現れたようである。マカクとヒトへ進化していった分岐後に、これらの両現象が起こったに違いないという事実は、ADAM16aとbが、ヒトのファーティリンα類縁体へと進化したという考えをさらに支持する。哺乳類に精巣特異的ADAMsが多数存在し、それらが遺伝的に余り保存されていないということは驚くべきことであり、精子の適合性自体のみからは説明することが困難である。この状態は、例えば、転写因子が高度に保存されていることと著しく対照を成すが(Liら、1992)、免疫応答に関連する遺伝子のような、急速に共進化する宿主−病原体系関連遺伝子に、より類似している。考え得る説明は、精子関連ADAMsは、それらのプロテアーゼ又はおそらくインテグリン結合活性を介して、種内での直接的な精子の競争にも役割を果たしているということである。このような役割は、ヒトが隠された発情期(concealed oestrus)を進化させる以前には、非常に適切であったと思われる。この進化的浮動の理由が何であれ、このような精巣ADAMsの多様性から、非ステロイドベースの避妊薬又は免疫性避妊抗原は、動物モデルをベースとするよりも、むしろ本発明のポリペプチドをベースとし得ると帰結される。精巣特異的AD AMsが、明確に同定できる機能を有する別個の機能的ドメインから構成されるということは、薬物開発のための長所となり得る。ここで、その完全な範囲を理解可能できるように、本発明の様々な側面を述べる。本発明の好ましいポリペプチドは、以下の機能的領域： a)メタロプロテアーゼ領域(これは、自己触媒的な切断、又はファーティリン βのプロセッシングに関与していると考えられている) b)ディスインテグリン領域（これは、卵母細胞を認識するのに関与していると考えられている） c)融合ペプチド領域（これは、精子と卵の融合に関与していると考えられている）を一以上含むポリペプチドである。他の領域、例えば以下の領域、 d)シグナルペプチド領域 e)プロタンパク質領域 f)ディスインテグリン領域 g)システイン−リッチ領域 h)EGF様リピート領域 i)膜貫通領域 j)細胞質領域が一以上存在してもよい。当業者であれば、あるポリペプチド中に、上記の領域a)〜j)の何れかが存在しているかどうかを決定することができる。これらの領域は、配列の比較によって、最も容易に決定される。配列は、例えば、ウィスコンシン・シークエンス・アナリシス・パッケージGCG8.0に組み込まれたBLAST、BestFlt、若しくはCLUSTAL 、又はエジュケーショナル・アンドサイエンティフィック・ソフトウェアの「Al ign Plus」のような適切なソフトウェアを用いて、配列を並置する。問題の配列は、例えば、EMBLパブリックデータサービスのGenBankのような配列データベースと比較することができる。ファーティリン類の並置の例は、Wolfsbergら、199 5bに示されている。本発明のポリペプチドを利用するのに、上記領域の全てが存在することが不可欠でないことは理解できよう。例えば、シグナルペプチド領域とプロタンパク質領域は、成熟した活性ポリペプチド中には存在しない。膜貫通領域は、膜結合ポリペプチドよりも可溶性ポリペプチドを提供することを望む場合には、必要でない；細胞質領域は、もし、ある機能に細胞質活性がないか、又は必要とされないのであれば、必要ない。本発明のポリペプチドは、当業者に公知の手法によって製造し得る。例えば、このようなポリペプチドをコードする核酸配列を提供するために、遺伝子クローニング手法を使用し得る。このような手法については、本発明の核酸分子と関連して、この後より詳細に論述する。あるいは、本発明のポリペプチドを製造するために、化学合成手法を使用し得る。このような手法は、−般的には、固相合成を利用する。特定の配列を有するポリペプチドを製造するための化学合成手法は、現在では自動化されている。長いポリペプチドを化学的に合成できる装置は、例えば、アプライド・バイオシステムズから市販されている。しかしながら、もし希望するのであれば、まず短いポリペプチドを合成し、その後連結して、より長いポリペプチドを製造することもできる。本発明のポリペプチドは、実質的に純粋な形態で製造し得る。このため、本発明のポリペプチドが、存在する主要なポリペプチド成分である組成物の中に提供し得る（すなわち、重量／重量ベースで決定したときに、組成物中に存在する総ポリペプチドの50%超、好ましくは組成物中に存在する総ポリペプチドの75%超、 90%超、又は95%超のレベルで存在する）。前に説明したように、本発明のポリペプチドは、 (a)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列を含むか、 (b)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を有するが、前記配列とは少なくとも40%のアミノ酸配列の同一性を有するか、又は (c)少なくとも10アミノ酸長の上記a)又はb)に示したポリペプチドの断片であある。ここで、本発明をより完全に理解するために、上記a)、b)、及びc)のそれぞれの範囲に属するポリペプチドをより詳細に論述する。 a)の範囲に属するポリペプチド a)の範囲に属するポリペプチドは、図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線を付されていないアミノ酸配列からなり得、又はN末端アミノ酸配列、及び／又はC末端アミノ酸配列が付加されていてもよい。 N末端又はC末端に付加される配列は、様々な理由で与えられ得る。このような付加配列を与える手法は、本分野において周知である。これらには、ポリペプチド又はその一部をコードする核酸分子を互いに連結した後、連結によって産生された核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現する遺伝子クローニング手法を使用することが含まれる。付加配列は、あるポリペプチドの特性を変化させるために与え得る。これは、ある発現システムでの発現、又は発現の調節を改善するのに有用であり得る。例えば、付加配列は、タンパク質分解による切断に対して幾らかの保護を与え得る。これは、ホルモンであるソマトスタチンに対し、そのN末端に、βガラクトシダーゼ酵素の一部を融合させることによって、行われてきた(Itakwaら、Science 198105-63(1977))。付加配列は、同定、輸送、又は精製を助けるように、ポリペプチドの特性を変化させる上でも有用であり得る。例えば、シグナル配列は、細胞内のある部位にポリペプチドの輸送を誘導するために、又は細胞からポリペプチドを排出させるために存在させ得る（例えば、図3Aの下線部が存在し得る）。様々な発現システムのために、様々なシグナル配列を使用することができる。付加配列を付与する別の例は、アフィニティークロマトグラフィーによって単離し得る部分に、ポリペプチドを連結させる場合である。該部分は、抗原又はエピトープであり得、アフィニティーカラムは、前記抗原又はエピトープを結合する固定化された抗体又は固定化された抗体断片（高度の特異性を有することが望ましい）を包含し得る。適切な緩衝液を添加することによって、通常は、カラムから融合タンパク質を溶出することができる。しかしながら、N末端又はC末端の付加配列は、単に、本発明の物質を取得するために用いた手法の結果として存在してもよく、何ら有用な特徴を与えなくてもよい。 b)の範囲に属するポリペプチドここで、上記b)に記載したポリペプチドについて説明を加えるが、当業者であれば、これらは、上記a)に示されたポリペプチドの変異体であることが理解できよう。当業者であれば、時には、ある種の活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列に様々な変化を加えて、前記活性を保持した変異体（しばしば、「mutein」としても知られる）を産生し得ることが理解できよう。上記a)に記載されたこのようなポリペプチドの変異体は、本発明の範囲に属し、以下のセクション(1)〜(iii) で、より詳細に論述される。それらには、対立遺伝子変異体と非対立遺伝子変異体が含まれる。 (i)置換本発明の変異体の例は、一以上のアミノ酸が一以上の他のアミノ酸で置換された点が異なる上記a)に記載されたポリペプチドである。当業者であれば、様々なアミノ酸が類似の特性を有していることに気づくであろう。ポリペプチドの一以上のこのようなアミノ酸は、しばしば、そのポリペプチドの所望の特性を喪失させずに、一以上のこのような他のアミノ酸と置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン等のアミノ酸は、多くの場合、互いに置換することができる（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）これらの可能な置換の中では、（相対的に短い側鎖を有しているので）グリシンとアラニンを用いて互いに置換することが好ましく、（より大きな脂肪族側鎖を有し、疎水性なので）、バリン、ロイシン、及びイソロイシンを用いて互いに置換することが好ましい。多くの場合、互いに置換できる他のアミノ酸には、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）アスパラギン酸とグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）アスパラギンとグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）システインとメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。この種の置換は、しばしば、「保存的な」、又は「半保存的な」アミノ酸置換と称される。 ii)欠失所望の特性を保持しながら、ポリペプチドの全長と分子量を減少できるので、アミノ酸の欠失は有用であり得る。これによって、ある目的のために必要とされるポリペプチドの量を減らすことが可能となる。例えば、もし該ポリペプチドを医薬に使用するのであれば、投薬レベルを減らすことができる。前に説明したように、図3Aと3Bに示されているポリペプチドは、様々な異なる領域を有しているので、本発明の様々な使用においては、これらの領域の多くは必要とされないであろう。 iii挿入上記a)に記載されたポリペプチドに対して、アミノ酸を挿入することもできる。これは、ポリペプチドの特性を変化させるために（例えば、融合タンパク質に関して上述したように、同定、精製、又は発現を助けるために）、なし得る。上記a)に記載されたポリペプチドの配列にアミノ酸の変化を備えたポリペプチドは（置換、欠失、又は挿入の何れであれ）、任意の適切な手法を用いて作成できる。例えば、所望の配列変化を備えた核酸配列は、位置指定突然変異導入によって作り出すことができる。続いて、これは、アミノ酸配列中に対応する変化を有するポリペプチドを発現させるために使用し得る。如何なるアミノ酸の変化が作られるのであれ、本発明の好ましいポリペプチドは、図3A又は3Bに示されたアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸と少なくとも50%のアミノ酸配列の同一性を有する。より好ましい配列の同一性の程度は、少なくとも75%である。少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性が最も好ましい。高度の配列同一性が存在する場合には、アミノ酸配列には、相対的に殆ど相違が存在しない場合もり得る。この場合、例えば、20未満、10未満、又は5未満の相違が存在し得る。本発明のためには、配列の同一性は、例えば、ウィスコンシン・シークエンス・アナリシス・パッケージGCG8.0の「BestFit」を用いて、２つの配列を最適に並列することによって決定できる。 c)の範囲に属するポリペプチド上述したように、ポリペプチドの長さを減らすことは、しばしば有用である。それ故、本発明の特徴c)は、少なくとも10アミノ酸長である上記ポリペプチドa) 又はb)の断片をカバーする。望ましくは、これらの断片は、少なくとも20、少なくとも50、又は少なくとも100アミノ酸長である。本発明の好ましいポリペプチド本発明の範囲に属する好ましいポリペプチドには、それぞれ図3A及び3Bに示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドADAM16aとADAM16b；これらの配列を含むより大きなポリペプチド、ADAM16aとADAM16bの断片；及びADAM16bの全部又は一部に融合されたADAM16aの全部又は一部を具備するキメラが含まれる。本発明のポリペプチドの使用 A)医薬への使用本発明のポリペプチドは、医薬に使用し得る。動物の治療が除外されるわけではないが、好ましい治療は、ヒトの治療である。該治療は予防的なもの、すなわち既存の状態に関するものであり得る。例には、以下のものが含まれる。避妊処置本発明の範囲に属するポリペプチドは、精子細胞の重要な機能に関与しているものと思われる。例えば、ディスインテグリン領域を含むポリペプチドは、卵母細胞の認識に関与し：融合ペプチド領域を含むポリペプチドは、精子と卵の融合に関与し、メタロプロテアーゼ領域を含むポリペプチドは、自己触媒的な切断、又はファーティリンβのプロセッシングに関与しているかもしれない。本発明のポリペプチドは、上述した機能のうち一以上の機能の有効性を阻害するか、少なくとも抑制し得る免疫応答を促進することによって、男性及び／又は女性に対して有効であり得る避妊用ワクチンを提供するために使用し得る。ワクチンに使用されるポリペプチドは、一以上のエピトープを具備するであろう。本発明の一以上のポリペプチドは、一つのワクチン中に存在し得る。このように、多成分ワクチンを製造してもよい（例えば、ADAM16aの全部又は一部は、ADA M16bの全部又は一部と共に存在し得る）。一以上のエピトープを含むポリペプチドは、ADAM16a又はADAM16b上に存在する何れのエピトープを含有しなくてもよい別のポリペプチドに融合されて、融合ポリペプチドに改善された抗原性を供与し得る。 ADM16bの全部又は一部に融合されたADAM16aの全部又は一部を含むハイブリッド分子を提供してもよい。生殖治療本発明のポリペプチドは、インビトロでの生殖を助けるために使用し得る。このように、それらは、精子細胞及び／又は卵母細胞と共に与え得る本発明のポリペプチドは、上述した任意の治療のための医薬を製造するのに使用し得る。該医薬は、通常、薬学的に許容される担体を含有してもよい薬学的組成物の一部として供給されるであろう。該薬学的組成物は、一般的には、密閉した容器中に滅菌した形態で製造されるであろう。それは、単位投薬形態で製造され、一般的には密閉された容器内に製造されて、キットの一部として生産され得る。このようなキットは、本発明の範囲に属する。それは、使用のための説明書を含むのが通常であろう（しかし、必ずしも常に含むものではない）。複数の単位投薬形態を提供してもよい。本発明の範囲に属する薬学的組成物には、以下のうちの一以上：防腐剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香料、塩（本発明の物質は、それ自身、薬学的に許容される塩の形態で提供され得る）、緩衝液、コーティング剤、又は抗酸化剤を含み得る。本発明の薬学的組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、治療的な活性成分を含有してもよい。それらは、少なくとも一週間、より好ましくは少なくとも一ヶ月の間にわたって有効なように、例えば、制御された放出形態で製造してもよい。本発明の好ましい薬学的組成物には、避妊用ワクチンが含まれる。本発明のワクチンは、望ましくは、アジュバント、例えば、アルミニウム塩をベースとするアジュバントを含む。授与経路本発明の範囲に属する薬学的組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口(頬又は舌下を含む)、直腸、経鼻、局所(頬、舌下、又は経皮を含む)、膣、又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内を含む)経路による投与に適合し得る。このような組成物は、薬学の分野において公知である任意の方法、例えば、滅菌条件下で、活性成分を適切な担体と混合することによって調製し得る。投薬量本発明のポリペプチドの投薬量は、治療の性質、治療を受ける個体の年齢及び状態等に応じて、大幅に変わり得るものであり、最終的には、医者が、使用すべき適切な投薬量を決定することになろう。しかしながら、ある特定の投薬量に拘泥するものではないが、経口投与の場合には、本発明のポリペプチドの一日の投薬量は、kg体重当り１μg〜1mgが適切であり得る。投薬は、適切な回数反復して行ってもよい。もし副作用が生じたら、GCPに従って、投薬の量及び／又は回数を減少すればよい。 B)診断への使用上述した医薬用途に加えて、本発明のポリペプチドは、診断に使用することもできる。例えば、それらは、不妊を診断するのに有用であり得る。不妊の男性及び女性には、ある種の配偶子抗原に対する(自己)抗体を有している者がいることが知られている。本発明のポリペプチドは、このような抗体を同定するのに使用できる。本発明のポリペプチドは、スクリーニングにも使用できる。例えば、精子の生殖力を阻害する避妊物質をスクリーニングするためにも使用し得る。プロテアーゼ領域を含むポリペプチド（例えば、亜鉛プロテアーゼのようなメタロプロテアーゼ領域）は、微生物中で発現することができ、ファージ・ディスプレー・アッセイを用いて適切な標的を選択できる。（この手法では、各々、外部「スパイク」中にランダムなペプチド配列を担持するファージライブラリーを用いる）。これらのツールは、プロテアーゼを阻害する化合物をスクリーニングするのに使用できる(例えば、Smith，M.M.，Shi,L．and Navre,M.，（1995）Rap id Identification of highly active and selective substrates for stromely sin and matrilysin using bacteriophage peptide display libraries.J.Biol. Chem.270(12)6440-6449;Matthews，D.J．and Wells，J.A.(1993)Substrate Phag e:selection of protease substrates by monovalent phage display．Science 260(5111)1113-1117;又はMatthews,D.J.,Goodman,L.J.,Gorman,C.M.and Wells,J .A.（1994）A survey of furin substrate specificity using substrate phage display．Protein Sci．3(8)1197-1205)。一度このような標的を見出せば、該標的ペプチドに共有結合された色素をミクロタイタープレートに固定し、これをAD AM16プロテアーゼとインキュベートすることが可能となる。もし化学物質が該プロテアーゼを阻害すれば、色素はELISAプレートに結合したままであり、そうでなければ色素は洗浄除去され得るであろう。このタイプのスクリーニングは、多数の異なる化合物を自動的に、無作為にスクリーニングするために、製薬産業で一般的なものである。同様に、本発明のポリペプチドは、リガンドの結合を阻害する化合物をスクリーニングするために使用できる。必須ではないが、該ポリペプチドは、ディスインテグリンドメインを含み得る。例えば、ディスインテグリンドメイン又はADAM 16の他の領域を含むポリペプチドを色素と結合し、そのリガンドとして働く卵母細胞構造でコートされたミクロタイターに添加する。これによって、色素によるウェルの染色を阻害する物質を検索できる。最近の研究によって、該ドメインを欠如したファーテイリンαポリペプチドでも卵母細胞を結合できることが示されたので、これは、必ずしも「ディスインテグリン」ドメインを含むことを要しない(Evans J.P.Schutz,R.M.,and Kopf,G.S.,（1997）Characterization of the b inding of recombinant mouse sperm fertilln α subunit to mouse eggs:Evid ence for function as a cell adhesion molecule in sperm-egg binding.Dev.B iol．187 94-106)。融合ペプチド領域を含むペプチドは、蛍光色素を含有する人工的なリポソームの融合を誘導するためにも使用できる。同様の実験は、他の種から取得したファーティリンαについて既に行われている（例えば、Martin,I.And Ruysschaert,J .M.,（1997）Comparison of lipid vesicle fusion induced by the putative f usion peptide of fertilin（a protein active in sperm-egg fusion）and the NH2-terminal domain of the HIV2 gp41．FEBS Lett．405(3)351-355参照)。このようなモデルは、薬物スクリーニングに転換するのが比較的容易である。このようなスクリーニングでは、Martinら(1997)に記載されているような蛍光化合物を含有する脂肪の小胞を使用し得る。マウスのファーティリンαペプチドは、蛍光の変化によって測定できる現象である小胞の融合を誘導できることが示されている。該融合を阻害する多数の化合物を産業的にスクリーニングするために、融合性 (fusogenic)ヒトADAM16ペプチドを用いた同様のモデルをセットアップすることもできるかもしれない。今では、この種の作業の操作の多くは、256ウェルのマイクロタイタープレートを用いて、ロボットにより行われている。本発明の好ましいスクリーニング操作は、自動化される。 D)抗体を産生又は選別するための使用本発明のポリペプチドさらなる用途の一つは、抗体を産生又は選別することである。それ故、本発明は、本発明のポリペプチドを結合する抗体を含む。好ましい抗体は、特異的には、本発明のポリペプチドに特異的に結合する。本発明の範囲に属する抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。ポリクローナル抗体は、本発明の物質を動物中（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ又はサル）に投与して、適切な動物宿主での産生を刺激することによって産生できる。必要であれば、本発明の物質とともに、アジュバントを投与してもよい。該抗体は、続いて、本発明の物質への結合によって精製できる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから産生できる。これらは、不死化した細胞株を形成するためにミエローマ細胞と所望の抗体を産生する脾臓細胞を融合することによって形成できる。このように、周知のケーラーとミルシュタインの手法(Nature 256 52-55(1975))又は該手法の変法を使用できる。あるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を産生する方法は、現在では、本分野において非常に発展している。それらは、標準的な免疫学のテキストブック、例えば、Roittらの「Immunology second edition (1989)，Churchill Livingstone，London」に記載されている。完全な抗体に加えて、本発明には、本発明のポリペプチドに結合できるそれらの誘導体も含まれる。このように、本発明には、抗体断片及び合成構築物も含まれる。抗体断片及び合成構築物の例は、「Dougallらの、Tibtech 123 72-379(Se ptember 1994)」に掲載されている。抗体断片には、例えば、Fab、F(ab')₂、及びFv断片が含まれる（これらは、例えば。上記Roittらに記載されている）。Fv断片は、一本鎖Fv(scFv)分子として知られている合成構築物を産生するように修飾できる。これには、VhとVi領域を共有結合するペプチドリンカーが含まれ、これは分子の安定性に寄与する。使用できる他の合成構築物には、CDRペプチドが含まれる。これらは、抗原結合決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド模倣体(mimetics)を使用してもよい。これらの分子は、通常、CDRループの構造を模倣し、抗原相互作用側鎖を含む、立体的に制限された有機性の環である。合成構築物には、キメラ分子が含まれる。このように、例えば、ヒト化(又は霊長類化)抗体又はその誘導体は、本発明の範囲に属する。ヒト化抗体の例は、ヒトのフレームワーク領域を有するが、超可変領域が齧歯類の抗体である。合成構築物には、抗原の結合に加えて、何らかの所望の特性を分子に与える付加部分を具備する分子も含まれる。例えば、該部分は標識（例えば、蛍光又は放射性標識）であり得る。あるいは、それは、薬学的に活性な物質であり得る。本発明の抗体又はそれらの誘導体は、上記ポリペプチドの精製における使用に加えて、広範で多様な用途を有している。それらは、治療に使用できる。例えば、それらは、 a)受動避妊免疫を与えるため(免疫応答を刺激するための本発明のタンパク質を用いた上記避妊ワクチンを参照)、又は b)(例えばFACSによって)生殖能力のある精子細胞を選別及び／又は濃縮するための生殖治療において使用し得る。それらは、診断に使用できる。例えば、それらは、本発明の範囲に属するポリペプチド（特にADAM16a又はADAM16b又はそれらの一部）が、ある個体中に存在するかどうかを決定するために使用することによって、不妊を診断するために使用し得る。もし、このようなポリペプチドが機能的な形態で存在しなければ、該個体は不妊であるか、又は稔性が低いかもしれない。好ましい抗体又はそれらの誘導体は、ADAM16a又はADAM16b又はそれらの一部に結合する。本発明の核酸分子とその使用核酸本発明は、その範囲に核酸分子も含む。このような核酸分子は、 a)本発明のポリペプチドをコードするか、又は b)上記a)に記載の分子と相補的であるか、又は c)上記a)又はb)に記載の分子とハイブリダイズする。ここで、これらの核酸分子とそれらの使用について、以下、より詳細に記載する。遺伝子コードの周知の縮退を考慮すれば、本発明のポリペプチドは、非常に多様な核酸分子によってコードされ得る。これらのコーディング核酸分子は全て、本発明の範囲に属する。それらは、個体に投与して本発明のポリペプチドを発現させるために使用し得る。このように、それらは、本発明のポリペプチドと同じ処置をするために使用し得る。該核酸分子は、直接使用してもよく、例えば、それらは、（必要に応じて、まずリポソームのような脂肪をベースとする担体中に取り込まんでから）筋肉内に投与してもよい。あるいは、それらは、ベクター中に挿入してもよい。治療に使用するためのベクターには、複製欠損アデノウイルス、レトロウイルス、又はアデノ随伴ウイルスが含まれる。ベクターは、クローニングに使用し得る。それらを宿主細胞に導入して、当業者に公知の手法を用いて、本発明のポリペプチドを発現させることを可能にし得る。あるいは、無細胞発現システムを使用してもよい。適切な発現システムを用いることによって、所望の形態でポリペプチドを産生することができる。例えば、ポリペプチドは、細菌又は酵母のような微生物によって、バキュロウイルスに感染した培養昆虫細胞；（チャイニーズハムスターのような）哺乳類細胞又は、例えば乳汁中にタンパク質を分泌するトランスジェニック動物によって産生し得る。グリコシル化を望む場合には、真核細胞(好ましくは哺乳類の)発現システムが好ましい。他のポリペプチドでは、成熟ポリペプチドはN末端のメチオニン残基を欠如しているが、ある種の発現システムを用いて、N末端メチオニンを含むポリペプチドを作成してもよい。ポリペプチドは、まず、シグナル配列を含有するように発現され得る。異なるシグナル配列は、異なる発現システムを与え得る。あるいは、シグナル配列は存在しないかもしれない。ポリペプチドをクローニングし、発現し、精製する手法は、当業者に周知である。このような様々な手法は、サンブルックらの[Molecular Cloning 2nd Editi on，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]；オールドとプリムローズの［Principles of Gene Manipulation 5th Edition，Blackwell Scientific Publ ications(1994)］；及びストライヤーの［Biochemistry 4th Edition，W H Free man and Company(1995)]のような標準的なテキストブックに開示されている。本発明のポリペプチドをクローニングし、発現し、精製する好ましい方法を以下に略述する。 ADAM16a/bタンパク質をコードするcDNAは、好ましくは、コードされるポリペプチドが６つのヒスチジン残基からなる「タグ」を有するように、GIBCO-BRL、I nVitoroGen、及びその他の会社から購入できる「pFastBac」プラスミド中にサブクローニングできる。組換えプラスミドは、(製造者の指示書に従って)組換えバキュロウイルスを作成して培養昆虫細胞中で発現させるために使用できる。該ポリペプチドは、その後、ヒスチジンが結合されたニッケルイオンを含有するか、又は抗His₆抗体のうちの何れかを用いたアフィニティーカラムによって精製できる。それに対するモノクローナル抗体が存在する他のペプチド「タグ」も存在する。市販の「FastBac」プラスミドの中には、His₆をコードするDNAと昆虫細胞による分泌を引き起こすシグナルペプチドを既に有するものもある。あるいは、例えば、pBAD(Guzman,L.M.,Belin,D.,Carson,M.J.,and Beckwith, Ｊ.（1995）Tight regulation,modulation,and high-level expression byvecto rs containing the arabinose pBAD promoter．J.Bacteriol．177（14）4121-41 30)のような誘導性プラスミドを用いて、細菌中にcDNAを発現させることもできる。もしコードされる産物が、（プロテアーゼの場合しばしば見られることであるが）細菌にとって毒性を有していれば、組換えタンパク質産生の非存在下で細菌を増殖させた後、pBADプロモーターを誘導せしめるためのアラビノースを添加することによって誘導する。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に加えて（本明細書では、「コーディング」核酸分子と称する）、本発明は、それらに相補的な核酸分子も含む。このように、例えば、二本鎖核酸分子の両鎖が、(それらが互いに会合していると否とにかかわらず)本発明の範囲に含まれる。mRNA分子及び相補的DNA分子(例えばcDNA分子)も含まれる。上記した一以上の核酸分子にハイブリダイズし得る核酸分子も本発明によってカバーされる。本明細書では、このような核酸分子は、「ハイブリダイジング」核酸分子と称する。ハイブリダイジング核酸分子は、例えばプローブ又はプライマーとして有用であり得る。プローブは、核酸を精製及び／又は同定するために使用できる。それらは、診断にも使用し得る。例えば、プローブは、ある個体が機能的なADAM16a又はADAM16bをコードする遺伝子を有しているかどうかを決定するために使用し得る。機能的なADAM16a又はADAM16b遺伝子が存在しなければ、不妊の指標となり得る。プライマーは、例えば、(リバースPCRを含む)PCR手法によって核酸又はその一部を増幅するのに有用である。このようなハイブリダイジング分子は、望ましくは少なくとも10ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも25ヌクレオチド長、又は少なくとも50ヌクレオチド長である。好ましいハイブリダイジング分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例では、約0.9Mの塩溶液を用いて、試みるハイブリダイゼーションを約 35℃〜約65℃の温度で実施する。しかしながら、当業者であれば、プローブ長、塩基組成、存在するイオンのタイプ等の変数を考慮に入れて、このようなパラメータを適切に変更することができるであろう。最も好ましくは、本発明のハイブリダイジング核酸分子は、図3A又は3Bに示された配列を有するDNA分子、対応するそれらのRNA、前記した何れかの分子と相補的な配列とハイブリダイズする。本発明に使用される核酸分子には、古典的なDNA又はRNA構造を有するもののみならず、修飾された（非ホスホジエステル）骨格を有する変異体も含まれることに留意しなければならない。現在では、ホスホジエステル結合が置換されているがデオキシリボースが保持された多数の誘導体を利用できる。デオキシリボースホスフェート骨格全体を置換する試みで二つの成功例、モルホリノ誘導体と、 N-(2-アミノエチル)グリシンをベースとする偽ペプチド骨格を含有するペプチド核酸(PNA;peptide nucleic acid)が報告されている(Nielsen,P.E.Annual Review of Biophysics & Biomolecular Structure,24 167-83(1995))。プローブ又はプライマーとして使用される他、本発明のハイブリダイジング核酸分子は、相補的核酸分子に結合することによって、本発明のポリペプチドの発現を変えるためのアンチセンス分子として使用できる（一般的に、これは、正常な状態では翻訳されるRNA分子に結合することにより、二本鎖の形成を通じてその翻訳を妨害する核酸分子（例えばRNA分子）を提供することによって達成できる。）。この手法は、アンチセンス療法に使用し得る。例えば、アンチセンスRN Aを発現する構築物は、（例えば、組換えウイルスを発現べクターとして使用して）ADAM16a又はADAM16bの生産を阻害するために使用することができ、それ故、避妊に利用される。アンチセンス分子は、DNA又はRNA又はそれらの変異型（例えばRNA）の形態であり得る（例えば、PNA）ハイブリダイジング分子は、リボザイムとして提供してもよい。リボザイムは、特定の標的配列を含むRNA分子に結合して、これを切断することによって、発現を調節するために使用できる。本発明の核酸分子ハイブリダイジング核酸分子は、上記a)又はb)の範囲に属する核酸分子と、その長さだけではなく、高度な配列の同一性（例えば、少なくとも50%、少なくとも75%、又は少なくとも90%の配列同一性）をも有し得る。当業者であれば理解できるように、ある一本鎖核酸分子と別の核酸分子との配列の同一性が高いほど、適切な条件において、他の核酸分子と相補的な核酸分子とハイブリダイズする可能性が大きくなる。以上の記述から、当業者であれば、本発明の範囲には、極めて多くの核酸が含まれることが理解できるであろう。それ故、これに反する記述がなければ、本発明の核酸分子は、以下の特徴： 1)それらはDNA又はRNA又はそれらの変異体(例えばPNA)であり得る； 2)それらは一本鎖又は二本鎖であり得る； 3)それらは、組換え形態で、すなわち、自然には存在しないキメラ分子（例えば、ベクター）を与えるために、異種の5'及び／又は3'隣接(flanking)配列に共有結合されて提供され得る； 4)それらは、本来自然に存在する5'及び/又は3'隣接配列を持たずに、提供され得る； 5)それらは、例えば、所望の標的配列を有するクローニングされた分子を単離するためのプローブを用いることによって、又は化学合成手法を用いて、実質的に純粋な形態で与えられ得る（このように、それらは、夾雑タンパク質及び/又は他の核酸が実質的に存在しない形態で提供され得る）； 6)それらは、イントロン有り（例えば、完全長の遺伝子として）、又はイントロンなし（例えばcDNAとして）で与えられ得る；を一以上有し得る。図面の記述ここで、添付の図面を参照しながら、単なる例として、本発明を記載する。図１は、RT-PCR及びメタロプロテアーゼ及びディスインテグリンドメイン用の degenerateオリゴヌクレオチドによって得られたB細胞のcDNA断片の度数分布を示している。メルトリン-γは、GenBank(Bensonら、1997)U41766及びD14665に対応し、TACE：TNF-αコンベルターゼ、GenBank(HSU86755、HSU69611、及びHSU696 12)に対応する。ORF#6は、新規cDNAである（「結果」の部のパート１参照）。さらに、オープンリーディングフレームを全く持たない14断片が見出された。図２は、ADAM16a（パネルA）とADAM16b（パネルB）mRNAの組織分布を示している。ノーザンブロット用のプローブは、それぞれ2.2又は1.8kbpのcDNA配列を含んでいた。露出は、一晩(A)又は５時間(B)であった。Sk．muscleは、骨格筋である。p.b：末梢血。サイズマーカーは、10³ヌクレオチドである。図３は、ADAM16a(A)とADAM16b(B)とそれらの予想されるコード産物の配列を示している。ADAM16aのシグナルペプチドに、下線が付してある。図４は、ADAM16aとbによってコードされる予想産物の比較を示す。両タンパク質が共有するアミノ酸は、ADAM16bに^" ^★★"が付してある；ギャップは、ダッシュで示されている。ADAM16aの予想シグナルペプチドは、ボックスの中に入っている。ギャップは、ダッシュで示されている。様々なドメインの範囲が、破線で示してある。図５は、これまでに特性決定された遺伝子と、ADAM16及びbとの比較を示している。BLAST(Maddenら、1996)アルゴリズムによって決定した、(A)ADAM16aに対する最高のGenBank適合性。fert：fertilinn。(B)ADAM16aとb、及び近縁のADAMs の系統発生樹。この系統発生樹は、CLUSTALアルゴリズムを用いて作成した（Hig ginsら、1996）。Hs:ヒト；Mf:マカク；RN:ラット；Mm:マウス；Oc:ウサギ；Cc: モルモット；fertファーティリン。ADAM9はメルトリン-γ(U41766)である。図６は、ADAM16a(A)とADAM16(B)によってコードされる推定融合性ペプチドのヘリカル−ホイール図を示している。疎水性残基には、影が付してある。図７は、ADAM16aのゲノムマッピングを示す。オリゴヌクレオチドNMPraseN3と C3(A)、又は-Nと-C(B)を用いた、ヒトゲノムDNAの複数の短い断片を担持するハイブリッド細胞株から取得したPCR断片のアガロースゲル。サイズマーカー：「1k bラダー」(Gibco-BRL)。陽性ハイブリドーマの数、及び359bp(A)又は123bp(B)の産物は、矢印で示されている。ADAM16bは、同じハイブリッド群、及び#4に対して陽性であった（データは示していない）。物質と方法 1 RT-PCR ヒツジの赤血球にロゼット形成することによって精製した扁桃のB細胞から単離したポリA RNAから、オリゴdTをプライマーとしてds cDNAを調製した(Maratho n kit，ClonTech)。総容量100μL中に30mM Tricine pH8.4、2mM MgCl₂、5mM β メルカプトエタノール、0.1mg/mLゼラチン、0.1% Thesit(Ponce and Micol,1992 )、0.2mMの4種の各dNTP(緩衝化された100mMの溶液(Pharmacia)から新しく調製した)、0.3pmol/μLの各オリゴヌクレオチド、及び25u/mL？？のTaq DNAポリメラーゼを含有するPCRで、10ngのDNAをテンプレートとして用いた。緩衝液と酵素70 μL？？は、ワックスビーズ(Perkin-Elmer)を用いて、他の成分から封鎖し、該サンプルに対して、94℃で１分、35℃で１分、72℃で20秒のサイクルを40回繰り返した（45℃又は50℃のアニーリング温度では、全く産物は得られなかった）。使用したオリゴヌクレオチドは、ATA GAA TTC AYG ARI IIG GIC AY A AYTTY GG(Microsynth;1=イノシン；HEXGHNFGをコードする)とGEECDXGをコードするATA GGA TCC III RTC RCA YTC YTC ICCであった。該試料をフェノール抽出し、沈澱させ、水に溶かし、EcoRIとBamHIで消化し、グラス−ミルク(Pharmacia) を用いて、アガロースゲルから200〜400bpの範囲の断片を精製した。pBlueKSII⁺ (BlueScript，Stratagene)プラスミド中に該断片をサブクローニングし、自動化されたABI配列決定機を用いて配列決定した。 2 cDNA「ウォーキング」新たに決定した配列に対応するオリゴヌクレオチドをデザインすることによって、さらなるcDNA配列を得た。続いて、ClonTechの「Marathon RT-PCR」キットとして供給されている、リンカーが連結されたヒト胎盤cDNA及びnested AP-1とA P-2プライマーを用いたPCRに、これらのオリゴヌクレオチドを使用した。該産物をBluescriptプラスミド中にサブクローニングして、配列決定した。該方法は、比較的短い(500-1,000bp)断片を産生する傾向があるので、繰り返して適用しなければならない。３ライブラリースクリーニングヒト精巣のcDNAライブライー(λ gt11，オリゴdTでプライムした、複雑性(com plexlty)10⁵；Clontech#HL1010b)を合計２×10⁶プラークになるように、10個の長方形プレート(それぞれ25×25cm)上の1090Y大腸菌細胞に播種し、cDNAプローブ(図3Aの20〜1,290位)を用いてスクリーニングした。プラークの切り出しとリハイブリダイゼーションを反復して行った後、陽性コロニーを精製した。最後に、2〜10プラークの同cDNAクローンを0.5mLのSM＋50μ Lのクロロホルム中にプールし(Ausubelら、1989)、＞４時間溶出し、Taqの変わりにPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を使用し、アニーリングが55℃、72℃での伸長時間が7.5分であった(35サイクル)ことを除いて、上述したように、10μL をPCRにかけた。λgt11特異的プライマーは、GAT TGG TGG CGA CGA CTC CTとCAA CTG GTA ATG GTA GCG ACであった。産物をフェノール抽出し、EcoRIで消化し、ゲルで精製して、pBlueKSll+中にサブクローニングし、自動ABl配列決定装置を用いて配列決定した。最低一度は、全ての配列の両鎖を読解した。４ハイブリダイゼーション精製したcDNA断片を放射能ラベルし、標準的なプロトコール(Ausubelら、1989) を用いて、50%の蒸留したフォルムアミド(Gibco-BRL)と0.5%のSDSを含有する緩衝液中において、42℃でハイブリダイズさせた。0.2×SSCの中でフィルターを室温で数時間洗浄した後、55℃で１時間洗浄した。ノーザンブロット(ClonTech、c at#7760-1、7754-1、及び7759-1)は、表記の組織から得た２μgのヒトのポリARN Aを含有していた。アクチンプローブを用いて、該ブロットが同じようにローディングされているかテストした(データは示していない) ５ゲノムマッピングスタンフォード・G3・ラディエーション・ハイブリッド・パネル(RHO1.05；Re search Genetics)から得られた各ハムスター／ヒトハイブリッド細胞株のゲノム DNA0.5μL(12.5ng DNA)を含有するように、PCR反応をセットアップした(50μL) 。該サンプルを、94℃で１分、55℃で１分、72℃で30秒、35回のサイクルにかけた。ADAM16aに使用したオリゴヌクレオチドは、NMpraseN3(TGC AAT TGT CAT ATA ATT TC)と-C3(AGC TTC ATG CCT TGT GTG TC)、又はNMpraseN(CAG TGG TGT GTG TGC GAG CTA CAG TGG TGC)とNMpraseC(GAG GCG GTT GAA TAC ATA ATC CAC TAC T GA)であった。ADAM16bに使用したオリゴヌクレオチドは、GTG ACA GTG CCT ACT GCT ATC A及びCTC TCC CAC AAA AGA CAT CAGであった。産物のうち、40μLを真空下で5〜10μLに濃縮し、15%のアガロースゲルで分離し、静止ビデオシステムで観察した。結果１ ADAM16aと16bのcDNAクローニング本研究の所期の目的は、L-セレクチン、ICAM-3、及びTNFαのような接着分子及びサイトカインのシェディング(shedding)に関与しているかもしれない新規AD AMsを同定することであった(Hwangら、1993；del Poz。ら、1994；Bjornbergら、1995；Kishimotoら、1995；Arribasら、1996；Feehanら、1996；Blackら、 1997；Mossら、1997a；Mossら、1997b)。ディスインテグリン−メタロプロテアーゼ、すなわちADAMsがこれらのプロセスに関与しているという証拠及び１つの具体的な例(TACE)が存在しているので、Zn²⁺結合ポケット(HEXGHNFG)コンセンサスと保存されたディスインテグリンドメイン(GEECDXG)をコードするdegenerate オリゴヌクレオチドをデザインした。Ｂ細胞RNAに対するRT-PCRは、オープンリーディングフレーム(ORF)を有する３種の断片、すなわちメルトリン−γ、TACE 、及びデータベースにマッチしないもの(「ORF#6」；図１)を産生した。さらに、ORFを持たない断片が多数得られた（データは示されていない）。ORF#6配列は、何れの公のデータベースにも見出すことができなかったが、他のADAMタンパク質と概ね良好な類似性を示した。5'及び3'RACEプロトコールを用いて、胎盤由来の該cDNAに対して、約2,2kbpのほぼ完全な配列を取得した（物質と方法、２部参照）。２組織分市様々なヒト組織からのポリARNAを含有するノーザンブロットに対して、RT-PCR によって取得した2.2kbp断片をプローブとして用いた。精巣だけに、約2,800nts のmRNAに対する単一のシグナルが得られた（図2A）。cDNA断片は、B細胞と胎盤c DNAから得られたので、該mRNAは、精巣以外の組織でも、極めて低いレベルで発現されているにちがいない。しかしながら、これらの組織においては、ノーザンブロットに対して全くシグナルが見られなかった。その発現が詳細に調べられた全ての精巣特異的なADAMsは、専ら精母細胞に発現されている（例えば、マウスのADAM 1-5、Wolfsbergら、1885b参照）。それ故、ADAM16aとbが、この組織でも発現している可能性は極めて高い。３ライブラリースクリーニング新規mRNAの完全長配列を得るために、RT-PCR断片を用いてヒト精巣cDNAライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングした2×10⁶プラークの中で、ある群(20クローン)が強くハイブリダイズし、より小さい群が（7クローン）が弱くハイブリダイズした。第一の群は、全て元のRT-PCR産物に対応する少なくとも９つの異なるクローンを含んでおり、「ADAM16a」と呼ばれた。第二の群（＞６つの異なるクローン）は、関連するが別個のcDNAに対応しており、「ADAM 16b」と名付けられた。両群から得た最も大きなインサートをサブクローニングして、それらの配列を決定した（図３）。「SignalP V1.1」ワールド・ワイド・ウェブスター(Nielsenら、1997)による分析によって、ADAM 16aタンパク質のN末端配列は、シグナル配列を有していると予想された。ADAM 16aクローンの5'配列は、非コード領域中に配列の多様性を示したが、おそらくディファレンシャルスプライシングによるものと思われる（データは示されていない）。図3Aに示されている配列は、全てのADAM16aクローンに共通であった。該作業は進行中であるが、精巣由来のEST配列(HS1200890)の配列は、図3Aに示したものと重複していると報告された。しかしながら、該EST配列の5'末端はノンコーディングであり、同じく選択的スプライシングの結果によるものと思われる。ADAM16a又は16bのcDNAのコーディング部分には、何れも配列の多様性は見出されなかった。複数組織のノーザンブロットのセットをプローブするために、完全長のADAM16 b配列も使用した（図2B）。ADAM16bの発現パターンは、ADAM16aに見出されたものと同一であった。二つのフィルムを重ねあわせることにより、ADAM16bのmRNA は、ADAM16aのmRNAに比べて、若干短いことが示された。４配列の比較 EST(HS1200890とHS1200798、何れもADAM16a)を除いて、公のデータベースには、ADAM16a又はbに対して正確にマッチするものは見出されなかった。それらの予想産物を比較することによって(図4)、ADAM16aとbは、50%の同一性を有することが示された。同一性は、特定のドメイン中にクラスターを成しているようではない。より広い範囲でのADAMsの比較において、同じ観察がなされれている(Wolfsb ergとWhite、1996)。ドメイン全体の組成は、多くのADAMsに見出されているもの：シグナルペプチド、プロタンパク質ドメイン、Zn²⁺結合モチーフを有するメタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリンループと「ヘアピンチップ」を有するディスインテグリンドメイン、システインリッチドメイン、融合ペプチド候補、EGF様リピート、膜貫通領域、及び細胞内ドメイン、と酷似している。 GenBank BLAST(Maddenら、1996)データベースサーチによって、以前に同定されているADAMsとの多数の顕著な類似性が明らかとなった(図5A)。ADAM16aとbの両者とも、メルトリン-γ／ADAM9(U41766)と最も類似性を示し、マカク由来のファーティリン-αIとII(X79808とX79809)、ヒトのファーティリンα偽遺伝子(Y 09232)、及びラット、マウス、ウサギ、及びモルモット由来のファーティリンα が僅差で続き、さらにファーティリンβタンパク質が続いた。このリストで最も類似したタンパク質をグループとして、CLUSTAL(Higginsら、1996)アルゴリズムを用いて比較し、図5Bに樹系図として表した。該樹系図は、ファーティリンβ( 左)とファーティリンα(右下)という二つのクラスターを示している。二つのADA Ms16とADAM9は、これらのクラスターの間に広がり、ファーティリンαグループに最も近い。５配列分析 5.1プロタンパク質ドメイン ADAMsは明確に認識できるドメインからなるが、全てのドメインがタンパク質分解、細胞接着、融合、及び細胞内シグナリングを為し得るとは思われない。多くのADAMSでは、プロタンパク質ドメインは切除され、（機能的な場合には）プロテアーゼドメインの活性化を生じる。可溶性マトリックスメタロプロテアーゼ (MMPs;matrix metalloproteases)と血液凝固系ヘビ毒メタロプロテアーゼ(SVMPs ;snake venom metalloproteases)と共有する該特徴は、触媒ドメイン中のZn²⁺と相互作用すると考えられている対をなしていないシステインを有する短いモチーフである、いわゆる「システインスイッチ」の存在によるものである(van Wart とBirkedal-Hansen、1990；Gramsら、1993)。該スイッチは、ADAM16aのプロタンパク質ドメイン中に見出すことができ、該タンパク質もタンパク分解によるプロセッシングを要することを示唆している（図3A）。TNFαコンベルターゼとADAM1 5では、プロタンパク質切断部位(RVKRRとRRRR)は、くまなく分布しているフリンプロテアーゼの標的として直ちに同定されている(Matthewsら、1994)。従って、 TACEとADAM15タンパク質は、多くの場合、プロセッシングされた形態で見出されている(Blackら、1997；Herrenら、1997)。対照的に、ADAM16aとbは、明らかな切断部位を有しておらず、それらのタンパク分解プロセッシングが制御されていることを示唆している。この状況は、精子産生の後期段階に、精巣上体を通過する間（生殖能力の取得と平行する）でなければプロセッシングされないファーティリンαとファーティリンβに似ている(Blobelら、1990；Huovila ら、1996)。従って、完全長のADAM16aは、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞中で適切にプロセッシングされなかった（データは示していない） 5.2メタロプロテアーゼドメイン ADAM16aメタロプロテアーゼドメイン中のZn²⁺結合部位は、コンセンサス配列H EXGHNLGXXHDに対応する(RawlingsとBarrett、1995)。それ故、ADAM16aは、ファーティリンα、TNFαコンベルターゼ、及びADAM10と同様に、機能的なプロテアーゼであると思われる。Zn²⁺結合部位の後には、Zn²⁺リガンドを折返し、安定させる構造であって、アダマリシン(adamalysin)・メトジンシン(metzincin)ファミリーに属するプロテアーゼの特徴である(StockerとBode、1995)「Metターン」が続いている。対照的に、ADAM16bの配列は、コンセンサスZn²⁺結合部位と２箇所で異なっており、一つは、金属陽イオンと直接相互作用すると考えられている必須ヒスチジン残基とである。これによれば、ADAM16bがプロテアーゼとして機能し得る可能性は少ない。 SVMPには、全て完全なコンセンサスZn²⁺結合部位が見出されているが、ADAMs には僅かしか見出されていない。５つの精巣特異的マウスADAMのうち、ファーティリンαだけが、プロテアーゼ活性を有すると予想されている。 5.3ディスインテグリンドメイン最もよく知られたディスインテグリンドメインは、SVMP由来のものである。これらの多くは、柔軟なディスインテグリンループの先端にRGDトリペプチドを有している。PIIタイプのSVMPは、血小板インテグリンαIIbβIIIaと相互作用し、これにより、血餅の形成を阻害し、ヘビ毒の効力を増強せしめる。他のSVMPは、血管を崩壊して、出血を引き起こす。対照的に、ADAM15(metargidin；Kratzschm arら、1996；Herrenら、1997)を除いて、ADAMsの中にはRGDを発現しているものはなく、一般的に、ADAMディスインテグリンドメインは、細胞−細胞間の相互作用を破壊するよりも、むしろ促進すると考えられている(WolfsbergとWhite、199 6)。該ディスインテグリンドメインは、卵インテグリンα6/β１に対するリガンドとして、マウスのファーティリンβで重要な役割を果たしている(Almeidaら、 1995)。同様に、モルモットのファーティリンβディスインテグリンペプチドは、精子−卵融合をブロックできる(Mylesら、1994)。しかしながら、ディスインテグリンループのトリプレットは、他種由来のファーティリンβ の間では、あまり保存されていない。他のディスインテグリンサブドメインは、インテグリン−リガンド特異性に関与しているので、又は精子細胞は異なる種では、卵の異なるリガンドに結合するので、これがその通りかどうかは明確ではない。これまでに述べたように、トリプレットの三番目の残基は、機能的なディスインテグリン中では酸性でなければならず、従って、ADAM16a(VGE)もADAM16b(VN E)も、共に活性なリガンドをコードしているかもしれない。 5.4融合ペプチド融合ペプチド候補は、ファーティリンαとメルトリンαのシステインリッチドメイン（細胞−細胞融合に関与している）中に同定され(Blobelら、1992；Muga ら、1994；Huovilaら、1996)ている。融合性ウイルスに同定されたものと同様、これらのペプチドは、しばしば一又は二個の中央のプロリン残基で中断され、疎水性と親水性のフェースを有する両親媒性のαヘリックスにフォールディングできるという共通の特徴を有している；それらは短く（16〜26アミノ酸）、膜に付着したサブユニット中に発現されている（White、1992）。ADAM16aとbの両システインリッチドメイン中には、中央にプロリン残基を有する両親媒性ヘリックスを形成し得る短い疎水性のストレッチを見出すことができる（図６）。これは、細胞−細胞融合の媒介におけるADAM16aとbの役割に合致する。 5.5細胞質ドメイン幾つかのADAMsは、比較的長い細胞質尾部を有し、ADAMs8-10、12、13、及び15 は、チロシンキナーゼSH-3結合ドメインを含有している（WolfsbergとWhite、19 96に概説されている）。しかしながら、ADAM16aとbの細胞内ドメインは、極めて短く、チロシン残基とSH-3コンセンサス配列を欠如しており、シグナリングには関与していないと思われる。６ゲノムマッピング ADAM16aとbのゲノムでの局在を決定するために、スタンフォードG3ラディエーション・ハイブリッド・パネルを用いた。該パネルは、ハムスター株とγ照射したヒト細胞との融合によって得られた83個のハイブリッド細胞株からなる。各ハイブリドーマは、短い、複数のヒトのゲノムの断片を含有しているので、所定のcDNAをこれらのハイブリッドのサブセットに割り振ることにより、インシチュハイブリダイゼーション法よりずっと優れた精度でマッピングすることが可能となる(Schulerら、1996)。これらのハイブリッドから得たゲノムDNAをテンプレートして用いるPCRに、二組のオリゴヌクレオチドを使用した。該方法を用いて、A DAM16aのcDNAを14のハイブリッドに割り振った(図７)。この結果は、ラディエーション・ハイブリッド・マップ・サーチ・エンジン(バージョン2.0；スタンフォードヒトゲノムセンター)によって解読され、、染色体14q24.1上のマーカーSHGC -36001(GenBank H64417)と極めて密接な連関を得た(LODスコア12.93)。ADAM16b も同じ方法を用いてマッピングした。該遺伝子に対しては、同じセットのハイブリッドに加えて、ハイブリッド４が陽性であった(データ示していない)。該パターンは、マーカ−SHGC36001と同じである。このように、両遺伝子は、緊密にクラスターをなし、14番染色体の長腕上に存在するマーカーSHGC36001に連結されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年８月２０日（１９９９．８．２０）【補正内容】請求の範囲１．以下の領域： a)メタロプロテアーゼ領域 b)ディスインテグリン領域 c)融合ペプチド領域を一以上有するポリペプチドであって、 (a)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列を含む (b)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を有するが、前記配列とは少なくとも75%のアミノ酸配列の同一性を有する、ことを特徴とするポリペプチド。２．図3A又は3Bに示されたアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列からなる請求項１に記載のポリペプチド。３．図3A又は図3Bに示されたアミノ酸配列からなる請求項１に記載のポリペプチド。４．他の部分に共有結合されているときに、請求項１又は２に記載のポリペプチドを含むポリペプチド。５．グリコシル化された形態の場合に、先行する請求項の何れか１項に記載のポリペプチド。６．先行する請求項の何れか１項に記載のポリペプチドを具備する薬学的に許容される組成物。７．ワクチンである、請求項６に記載の薬学的組成物。８．アジュバントを含む、請求項７に記載の薬学的に許容される組成物。９．医薬に使用するための、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチド、又は請求項６〜８の何れか１項に記載の薬学的に許容される組成物。１０．避妊薬の調製における、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１１．受精能改善剤の調製における、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１２．患者が、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドに結合する抗体を有するか否かを決定することを具備する受精能を評価するための方法。１３．リガンドへの結合を阻害する化合物のスクリーニングにおける、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１４．避妊物質のスクリーニングにおける請求項１３に記載の使用。１５．受精能を増大させ得る物質のスクリーニングにおける請求項１３に記載の使用。１６．抗体の産生又は選別における、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１７．請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドに結合する抗体、抗体断片、又はその合成構築物。１８．請求項１７に記載の抗体、抗体断片又はその合成構築物を具備する薬学的許容される組成物。１９．医薬に使用するための、請求項１７に記載の抗体、抗体断片、若しくはその合成構築物、又は請求項１８に記載の薬学的に許容される組成物。２０．避妊薬の調製における、請求項１７に記載の抗体、抗体断片、若しくはその合成構築物の使用。２１．患者が、請求項１７に記載の抗体、抗体断片、又はその合成構築物に結合するポリペプチドを有しているか否かをインビトロで決定することを具備する受精能を評価する方法。２２．a)請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするか、 b)上記a)に記載の分子と相補的であるか、又は c)上記a)又はb)に記載の分子とストリンジエントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、核酸分子。２３．請求項２２に記載の核酸分子を具備するべクター。２４．請求項２２に記載の核酸分子、又は請求項２３に記載のベクターを具備する宿主。２５．前記ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で、請求項２４に記載の宿主をインキュベートした後、前記ポリペプチドを精製することを具備する、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドを取得する方法。２６．医薬に使用するための、それぞれ、請求項２２、２３、又は２４の何れか１項に記載の核酸分子、ベクター、又は宿主。２７．避妊薬の調製における、それぞれ、請求項２２、２３、又は２４の何れか１項に記載の核酸分子、べクター、又は宿主の使用。２８．受精能を増大させ得る物質の調製における、それぞれ、請求項２２、２３、又は２４の何れか１項に記載の核酸分子、べクター、又は宿主の使用。２９．患者から取得した核酸が、請求項２２に記載の核酸分子とハイブリダイズするか否かをインビトロで決定することを具備する受精能を評価する方法。３０．プローブ又はプライマーとしての請求項２２に記載の核酸分子の使用。３１．請求項１３〜１５の何れか１項に記載のスクリーニングによって同定された物質。【手続補正書】【提出日】平成１３年６月１日（２００１．６．１）【補正内容】【図３】【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 15/08 Ａ６１Ｐ 15/18 15/16 Ｃ０７Ｋ 16/40 15/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/64 Ｚ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/64 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．(a)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列を含む (b)図3A又は図3Bに示されているアミノ酸配列のうち下線が付されていないアミノ酸配列に対して、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を有するが、前記配列とは少なくとも40%のアミノ酸配列の同一性を有する、又は (c)少なくとも10アミノ酸長の上記a)又はb)に示したポリペプチドの断片でああるポリペプチド。２．請求項１に記載のポリペプチドであって、 a)メタロプロテアーゼ領域 b)ディスインテグリン領域 c)融合ペプチド領域を一以上含むポリペプチド３．請求項１又２に記載のポリペプチドであって、図3A又は3Bに示されたアミノ酸配列又はその一部からなるポリペプチド。４．他の部分に共有結合されているときに、請求項１又は２に記載のポリペプチドを含むポリペプチド。５．グリコシル化された形態の場合に、先行する請求項の何れか１項に記載のポリペプチド。６．先行する請求項の何れか１項に記載のポリペプチドを具備する薬学的に許容される組成物。７．ワクチンである、請求項６に記載の薬学的組成物。８．アジュバントを含む、請求項７に記載の薬学的に許容される組成物。９．医薬に使用するための、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチド、又は請求項６〜８の何れか１項に記載の薬学的に許容される組成物。１０．避妊薬の調製における、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１１．受精能改善剤を調製における、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１２．患者が、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドに結合する抗体を有するか否かを決定することを具備する受精能を評価するための方法。１３．スクリーニングにおける、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１４．避妊薬をスクリーニングするための請求項１３に記載の使用。１５．受精能を増大させ得る物質のスクリーニングにおける請求項１３に記載の使用。１６．抗体の産生又は選別における、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。１７．請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドに結合する抗体又はその誘導体。１８．請求項１７に記載の抗体又はその誘導体を具備する薬学的許容される組成物。１９．医薬に使用するための、請求項１７に記載の抗体若しくはその誘導体、又は請求項１８に記載の薬学的に許容される組成物。２０．避妊薬の調製における、請求項１７に記載の抗体又はその誘導体の使用。２１．患者が、請求項１７に記載の抗体又はその誘導体に結合するポリペプチドを有しているか否かをインビトロで決定することを具備する受精能を評価する方法。２２．a)請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするか、 b)上記a)に記載の分子と相補的であるか、又は c)上記a)又はb)に記載の分子とハイブリダイズする、核酸分子。２３．請求項２２に記載の核酸分子を具備するベクター。２４．請求項２２に記載の核酸分子、又は請求項２３に記載のベクターを具備する宿主。２５．前記ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で、請求項２４に記載の宿主をインキュベートした後、前記ポリペプチドを精製することを具備する、請求項１〜５の何れか１項に記載のポリペプチドを取得する方法。２６．医薬に使用するための、請求項２２、２３、又は２４の何れか１項に記載の核酸分子、ベクター、又は宿主。２７．避妊薬の調製における、それぞれ、請求項２２、２３、又は２４の何れか１項に記載の核酸分子、ベクター、又は宿主の使用。２８．受精能を増大させ得る物質の調製における、それぞれ、請求項２２、２３、又は２４の何れか１項に記載の核酸分子、ベクター、又は宿主の使用。２９．患者から取得した核酸が、請求項２２に記載の核酸分子とハイブリダイズするか否かをインビトロで決定することを具備する受精能を評価する方法。３０．プローブ又はプライマーとしての請求項２２に記載の核酸分子の使用。３１．請求項１３〜１５の何れか１項に記載のスクリーニングによって同定された物質。