JP2004523212A - プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

本発明はヒトのプロテアーゼ（ＰＲＴＳ）、およびＰＲＴＳを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＰＲＴＳの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、プロテアーゼの核酸配列及びアミノ酸配列に関する。 本発明はまた、これらの配列を利用した胃腸疾患、心血管疾患、自己免疫／炎症性の疾患、細胞増殖異常、発生障害、上皮疾患、神経系疾患、および生殖系疾患の診断・治療・予防に関する。 本発明はさらに、プロテアーゼの核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価に関する。
【０００２】
（発明の背景）
プロテアーゼは、タンパク質鎖およびペプチド鎖のバックボーンを形成するペプチド結合でタンパク質とペプチドを切断する。タンパク質分解は、細胞の内部および外部において発生する、最も重要で頻発する酵素反応の１つである。タンパク質分解は、新生ポリペプチドの活性化と成熟化、誤ってフォールディングされたタンパク質や破壊されたタンパク質の分解、および細胞内部のペプチドの代謝回転の制御に関与する。プロテアーゼは、胚の発達、傷の治癒、および、通常の発育において、消化、内分泌機能、組織の再構築に関係している。プロテアーゼは、調節タンパク質の半減期に影響することで、調節過程における役割を果たすことができる。プロテアーゼは、炎症、血管形成、腫瘍の分散と転移、循環器疾患、神経系疾患、細菌性感染・寄生性感染・ウイルス性感染などの病状の病因および進行にかかわっている。
【０００３】
プロテアーゼはその基質を切断する場所に基づいて分類分けされ得る。エキソペプチダーゼには、アミノペプチダーゼ、ジペプジルペプチダーゼ、トリペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ペプチジル−ジペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、およびオメガペプチダーゼが含まれ、基質の末端の残基を切断する。エンドペプチダーゼには、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼが含まれ、ペプチド内の残基で切断する。哺乳類のプロテアーゼに関して、活性部位、構造、作用機作、および全体的な３次元構造に基づいて４つの主要なカテゴリーが同定されている（Ｂｅｙｎｏｎ， Ｒ．Ｊ． および Ｊ．Ｓ． Ｂｏｎｄ （１９９４） Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １−５ページを参照）。
【０００４】
セリンプロテアーゼ
セリンプロテアーゼ（ＳＰ）は、サイズが大きく広範囲に存在するタンパク質分解酵素のファミリーで、消化酵素のトリプシンやキモトリプシン、補体カスケードや血液凝固カスケードの成分、細胞内部および細胞外基質において高分子の分解や代謝回転を制御する酵素を含む。２０以上のサブファミリーのうち、ほとんどは６つの一族に分けることができ、そのそれぞれに共通の祖先をもつ。これら６つの一族は、進化の点で少なくとも４つの異なる祖先の系統を引いていると仮定されている。ＳＰという名前は、ほとんどのファミリーの活性触媒部位に見られるセリン残基の存在に由来する。活性部位は、触媒トライアッド、すなわち、触媒にとって重要な保存アスパラギン、ヒスチジン、セリン残基のセットによって定義される。これらの残基は、基質結合を促進する電荷リレーネットワークを形成する。活性部位外部のその他の残基は、触媒中に形成される四面体遷移中間状態を安定化するオキサニオン穴を形成する。ＳＰは広範囲にわたる基質をもち、基質の特異性によって細分できる。主要なサブファミリーの名前は、それらが切断する残基に由来する。すなわち、トリパーゼはアルギニンまたはリジンに、アスパーゼはアスパラギン酸に、キマーゼはフェニルアラニンまたはロイシンに、メターゼはメチオニンに、セラーゼはセリンにそれぞれ由来する（Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ． および Ａ．Ｊ． Ｂａｒｒｅｔｔ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４４：１９−６１）。
【０００５】
哺乳類セリンプロテアーゼのほとんどは、酵素前駆体、すなわち、タンパク質分解によって活性化される不活性な前駆体として合成される。例えば、トリプシノーゲンはエンテロペプチダーゼによって、その活性型であるトリプシンに変換される。エンテロペプチダーゼは、トリプシノーゲンからＮ末端断片を取り除く腸管プロテアーゼである。残った活性断片がトリプシンで、そのトリプシンが他の膵臓酵素の前駆体を活性化する。同様に、トロンビンの前駆体であるプロトロンビンのタンパク質分解は、３つの別々のポリペプチド断片を生成する。Ｎ末端断片は放出されるが、活性なトロンビンを構成するほかの２つの断片は、ジスルフィド結合を介して結合したままになっている。
【０００６】
最大のＳＰサブファミリーは、キモトリプシン（Ｓ１）サブファミリーとサブチリシン（Ｓ８）サブファミリーの２つである。キモトリプシンファミリーのメンバーの中には、このファミリーに特有の２つの構造的ドメインを含んでいるものがある。クリングルドメインは、さまざまなコピー数において見られる、３重ループでジスルフィドとクロスリンクしたドメインである。クリングルは、膜、他のタンパク質、または、リン脂質などのメディエーターの結合、および、タンパク質分解活性の制御の役割を果たしていると考えられている（ＰＲＯＳＩＴＥ ＰＤＯＣ０００２０）。アップル（Ａｐｐｌｅ）ドメインは９０のアミノ酸が繰り返されるドメインで、それぞれが６つの保存されたシステインを含んでいる。３つのジスルフィド結合が、第１と第６、第２と第５、第３と第４のシステインを連結する（ＰＲＯＳＩＴＥ ＰＤＯＣ００３７６）。アップルドメインは、タンパク質どうしの相互作用に関与している。Ｓ１ファミリーのメンバーには、トリプシン、キモトリプシン、凝固第ＩＸ因子から凝固第ＸＩＩ因子、補体のＢ因子、Ｃ因子、Ｄ因子、グランザイム、カリクレイン、組織アクチベーター、および、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターが含まれる。サブチリシンファミリーは、真正細菌、古細菌、真核生物、ウイルスに見られるメンバーをもつ。サブチリシンには、タンパク質プロセシングエンドペプチダーゼのケキシンとフリン、および、下垂体プロホルモン転換酵素のＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、ＰＣ６とＰＡＣＥ４が含まれる（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ、前出）。
【０００７】
ＳＰは、通常の多くのプロセスにおける機能をもち、その内のいくつかは疾病の原因あるいは治療に関係していると推定されている。エンテロキナーゼは腸内消化のイニシエーターで腸の刷子縁に見られ、そこでエンテロキナーゼは酸性プロペプチドをトリプシノーゲンから切断して活性トリプシンを産生する（Ｋｉｔａｍｏｔｏ， Ｙ． 他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：７５８８−７５９２）。アンジオテンシンＩＩおよびアンジオテンシンＩＩＩや［ｄｅｓ−Ａｒｇ９］ブラジキニンといったペプチドを切断するリソソームセリンペプチダーゼであるプロリルカルボキシペプチダーゼは、セリンカルボキシペプチダーゼファミリーおよびプロリルエンドペプチダーゼファミリーのメンバーと配列相同性を共有している（Ｔａｎ， Ｆ． 他 （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１６６３１−１６６３８）。プロテアーゼニューロプシンは、神経シグナル伝達に反応して海馬状隆起でのシナプス形成とニューロン結合性に影響する場合がある（Ｃｈｅｎ， Ｚ．−Ｌ． 他 （１９９５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：５０８８−５０９７）。組織プラスミノゲンアクチベーターは、発作（Ｚｉｖｉｎ， Ｊ．Ａ． （１９９９） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５３：１４−１９）および心筋梗塞（Ｒｏｓｓ， Ａ．Ｍ． （１９９９） Ｃｌｉｎ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ２２：１６５−１７１）の緊急の処置に有効である。いくつかの受容体（ＰＡＲ：プロテイナーゼ活性化受容体）は、消化管全体にわたって高度に発現するが、タンパク質分解による細胞外ドメインの切断によって活性化される。ＰＡＲに対する主要なアゴニストであるトロンビン、トリプシンやマスト細胞トリプターゼは、アレルギーや炎症性の状態の際に放出される。プロテアーゼによるＰＡＲ活性化の制御は、将来性のある治療目標として提案されている（Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ， Ｎ． （２０００） Ａｌｉｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １４：２５７−２６６； Ｒｉｃｅ， Ｋ．Ｄ． 他 （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｐｈａｒｍ． Ｄｅｓ． ４：３８１−３９６）。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺の上皮細胞によってのみ合成され分泌されるカリクレイン様セリンプロテアーゼである。血清ＰＳＡは前立腺癌において増加し、癌進行のモニタリングおよび治療に対する反応に対して最も注意を要する生理学的マーカーである。ＰＳＡはまた、前立腺が転移性腫瘍の起源であると同定できる（Ｂｒａｗｅｒ， Ｍ．Ｋ． および Ｐ．Ｈ． Ｌａｎｇｅ （１９８９） Ｕｒｏｌｏｇｙ ３３：１１−１６）。
【０００８】
シグナルペプチダーゼは、あるタンパク質からシグナルペプチドをプロセシングする役割を果たす、すべての原核細胞および真核細胞のタイプに見られるＳＰの特殊クラスである。シグナルペプチドは、タンパク質のアミノ末端ドメインであり、リボソーム結合部位から特定の細胞内の位置あるいは細胞外の位置にタンパク質を導く。いったんタンパク質が搬出されると、シグナルペプチダーゼによるシグナル配列の切断および翻訳後プロセシング（例えば、グリコシル化あるいはリン酸化）によってタンパク質が活性化する。シグナルペプチダーゼは、酵母と哺乳類の両方でマルチサブユニット複合体として存在する。イヌのシグナルペプチダーゼ複合体は５つのサブユニットから構成され、そのすべてがミクロソーム膜に結合しており、そのミクロソーム膜を１回以上貫通する疎水性領域を含んでいる（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ， Ｇ．Ｓ． および Ｇ． Ｂｌｏｂｅｌ （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：９５１２−９５１９）。これらのサブユニットの中には、複合体を膜の上の適切な位置に固定するのに役立つものもある一方、実際の触媒活性を含むものもある。
【０００９】
活性部位にセリンをもつプロテアーゼの別のファミリーは、その活性をＡＴＰ加水分解に依存している。これらのプロテアーゼは、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合モチーフであるＰ−ｌｏｏｐの存在によって同定されうる調節ＡＴＰａｓｅドメインとタンパク質分解コアドメインを含む（ＰＲＯＳＩＴＥ ＰＤＯＣ００８０３）。このファミリーのメンバーは、真核ミトコンドリアマトリックスプロテアーゼ、Ｃｌｐプロテアーゼ、およびプロテアソームを含む。Ｃｌｐプロテアーゼは元来、植物の葉緑体に見られるが、原核細胞および真核細胞の両方に広がっていると考えられている。早発性捻転ジストニーの遺伝子は、Ｃｌｐプロテアーゼに関連するタンパク質をコードする（Ｏｚｅｌｉｕｓ， Ｌ．Ｊ． 他 （１９９８） Ａｄｖ． Ｎｅｕｒｏｌ． ７８：９３−１０５）。
【００１０】
プロテアソームは、いくつかの細菌やすべての真核細胞に見られる細胞内プロテアーゼ複合体で、細胞生理における重要な役割を果たす。プロテアソームはユビキチン抱合システム（ＵＣＳ）に関連し、このシステムは、転写や細胞周期進行といった細胞プロセスを活性化したり抑圧する機能をもつタンパク質など、全タイプの細胞タンパク質の分解の主要経路となる（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ， Ａ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７９：１３−２１）。ＵＣＳの経路においては、分解を目的とするタンパク質は、熱安定する小さなタンパク質であるユビキチンに抱合される。そして、ユビキチン化されたタンパク質は、プロテアソームによって認識され分解される。結果として得られるユビキチンペプチド複合体は、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素によって加水分解され、遊離ユビキチンはＵＣＳによる再利用のために放出される。ユビキチンプロテアソームシステムは、有糸分裂周期キナーゼ、腫瘍性タンパク質、腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３）、シグナル伝達に関連する細胞表面受容体、転写制御因子、および、変異または損傷したタンパク質の分解に関与すると示唆されている（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、前出）。この経路は、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群を含む数多くの疾病に結びつけられている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ａ．Ｌ． および Ａ． Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５０：５７−７４の概説を参照）。マウスの原腫瘍遺伝子であるＵｎｐは、核ユビキチンプロテアーゼをコードし、その過剰発現はＮＩＨ３Ｔ３細胞の発癌性形質転換を起こさせる。この遺伝子のヒト相同体は、肺の小さな細胞腫瘍や肺腺癌において常に増加している（Ｇｒａｙ， Ｄ．Ａ． （１９９５） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：２１７９−２１８３）。ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素は、リンパ芽球性白血病細胞株が分裂しない成熟な状態に分化することに関与している（Ｍａｋｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６０：５９−６６）。ニューロンでは、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素（ＰＧＰ ９．５）発現は、ヒト神経変性疾患に起こる異常な構造において強度である（Ｌｏｗｅ， Ｊ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １６１：１５３−１６０）。プロテアソームは中心触媒コアから構成される大きな（約２０００ ｋＤａ）マルチサブユニット複合体で、中央の空洞に内向きに面している活性部位をもった４つの七員環状に配列されたさまざまなプロテアーゼと、空洞の外口を覆い基質流入を制御している末端ＡＴＰａｓｅサブユニットを含んでいる（Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ． 他 （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：５８４−５９１の概説を参照）。
【００１１】
システインプロテアーゼ
システインプロテアーゼ（ＣＰ）は、前駆体タンパク質のプロセシングから細胞内分解にわたる多種多様な細胞プロセスに関与している。知られているＣＰの約半数は、ウイルス内にのみ存在する。ＣＰは、触媒がチオエステル中間体を介して進行し近くのヒスチジン残基とアスパラギン残基によって促進される活性部位において、主な触媒残基としてシステインをもつ。グルタミン残基も重要であるが、それはオキサニオン穴の形成を助けるからである。２つの重要なＣＰファミリーには、パパイン様酵素（Ｃ１）およびカルパイン（Ｃ２）がある。パパイン様ファミリーのメンバーは、一般的にリソソームあるいは分泌され、したがって、プロペプチドと同様にシグナルペプチドと合成される。ほとんどのメンバーは、構造的重要性をもつプロペプチドに保存モチーフをもつ（Ｋａｒｒｅｒ， Ｋ．Ｍ． 他 （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：３０６３−３０６７）。パパインファミリーのメンバーの３次元構造は、２つの葉の間に位置する触媒部位をもつ２葉分子を示す。パパインは、カテプシンＢ、Ｃ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、ある植物アレルゲン、およびジペプチジルペプチダーゼを含む（Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｎ．Ｄ． および Ａ．Ｊ． Ｂａｒｒｅｔｔ （１９９４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２４４：４６１−４８６の概説を参照）。
【００１２】
広範に発現するＣＰがある一方で、免疫系細胞によってのみ産生されるＣＰもある。特記すべきは、炎症部位に移動して組織修復に関与している分子を分泌する単球、マクロファージ、および他の細胞によってＣＰが産生されることである。これらの修復分子の過剰はある疾患における役割を果たす。慢性関節リウマチなどの自己免疫性疾患においては、システインペプチダーゼカテプシンＣの分泌は、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、およびその他の骨の細胞外マトリックスに見られる構造的タンパク質を分解する。そのような分解によって弱められた骨はまた、腫瘍浸潤と転移を受けやすくなる。カテプシンＬ発現はまた、リウマチ滑膜の破壊を悪化させる単核細胞の流入に寄与する（Ｋｅｙｓｚｅｒ， Ｇ．Ｍ． （１９９５） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３８：９７６−９８４）。
【００１３】
カルパインは、Ｎ末端触媒ドメインとＣ末端カルシウム結合ドメインの両方を含むカルシウム依存性細胞質エンドペプチダーゼである。カルパインは、それぞれのアイソフォームに特有の触媒サブユニットと異なるアイソフォームに共通の制御サブユニットからなる酵素前駆体ヘテロダイマーとして発現される。各サブユニットは、カルシウム結合ＥＦハンドドメインを有する。制御調節サブユニットはまた、酵素が細胞膜と結合できるようにする疎水性グリシンリッチなドメインを含む。カルパインは増加する細胞質内カルシウム濃度によって活性化され、高次構造に変化を起こさせ、限られた自己分解を誘導する。結果として得られる活性分子は、その活性のためにより低いカルシウム濃度を必要とする（Ｃｈａｎ， Ｓ．Ｌ． および Ｍ．Ｐ． Ｍａｔｔｓｏｎ （１９９９） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ５８：１６７−１９０）。カルパインの発現は、他の組織でも見られるが、主にニューロンに見られる。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病を含むいくつかの慢性神経変性疾患は、増加するカルパイン発現に関連している（Ｃｈａｎ および Ｍａｔｔｓｏｎ、前出）。細胞骨格のカルパイン媒介分解が、頭部外傷による脳損傷に寄与しているという示唆がある（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ， Ｅ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １６：７４９−７６１）。カルパイン３は、主に骨格筋に発現し、肢帯型筋ジストロフィータイプ２Ａの原因である（Ｍｉｎａｍｉ， Ｎ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃｉ． １７１：３１−３７）。
【００１４】
チオールプロテアーゼの別のファミリーはカスパーゼで、アポトーシスの開始段階と実行段階に関与している。プロアポトーシスシグナルは、タンパク質分解カスパーゼカスケードを引き起こすイニシエーターカスパーゼを活性化でき、標的タンパク質の加水分解と典型的な細胞のアポトーシス死に導く。２つの活性部位残基、システインとヒスチジンは、触媒機構に関与すると考えられている。カスパーゼは最も特異的なエンドペプチダーゼの１つで、アスパラギン酸残基の後で切断する。カスパーゼは、不活性酵素前駆体として合成され、この不活性酵素前駆体は、小さなスペーサー領域によって分離される１つの大きな（ｐ２０）サブユニットと１つの小さな（ｐ１０）サブユニット、および、可変Ｎ末端プロドメインからなる。このプロドメインは、アポトーシスを高めたりまたは低めたりして影響しうる補助因子と相互作用する。活性化シグナルは、特異的なアスパラギン酸残基の自己タンパク質分解切断（カスパーゼ１の番号付け規則ではＤ２９７）およびスペーサーとプロドメインの除去を引き起こし、ｐ１０／ｐ２０ヘテロダイマーを残す。これらのヘテロダイマーのうちの２つは、その小さなサブユニットを介して相互作用し、触媒の面で活性化した四量体を形成する。カスパーゼファミリーのいくつかのメンバーの長いプロドメインが、プロカスパーゼの二量体化と自己プロセシングを促進していることが示されている。いくつかのカスパーゼはそのプロドメインに「デスエフェクタードメイン」を含み、それによって、他のカスパーゼおよび死の受容体（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合するＦＡＤＤタンパク質あるいはＴＮＦ受容体複合体とともに、自己活性化複合体にカスパーゼを補充できる。さらに、異なるカスパーゼファミリーのメンバーからの２つの二量体が結合して、結果として得られる四量体の基質特異性を変えることができる。内在性カスパーゼ阻害剤（アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ））もまた存在する。これらすべての相互作用は、アポトーシスの調整に明らかに影響する（Ｃｈａｎ および Ｍａｔｔｓｏｎ、前出； Ｓａｌｖｅｓｏｎ， Ｇ．Ｓ． および Ｖ．Ｍ． Ｄｉｘｉｔ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１０９６４−１０９６７の概説を参照）。
【００１５】
カスパーゼは数多くの疾病に結びつけられる。いくつかのカスパーゼを欠いているマウスは、神経上皮のアポトーシス不全により神経系に重度の欠陥をもっており、致死が早くなる。他のカスパーゼを欠くマウスも炎症性反応に重度の欠陥をもっているが、これはカスパーゼが ＩＬ−１ｂのプロセシングとおそらく他の炎症性サイトカインの原因となっているからである（Ｃｈａｎ および Ｍａｔｔｓｏｎ、前出）。牛痘ウイルスとバキュロウイルスはカスパーゼを標的とし、宿主細胞の死を回避して感染の成功を促進する。さらに、適正ではないアポトーシスの増加は、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、虚血性の外傷で報告されている一方、細胞死の減少は癌に関連している（Ｓａｌｖｅｓｏｎ および Ｄｉｘｉｔ、前出； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ．Ｂ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４５６−１４６２）。
【００１６】
アスパルチルプロテアーゼ
アスパルチルプロテアーゼ（ＡＰ）は、キモシン、レニン、胃ペプシンと同様、リソソームプロテアーゼカテプシンのＤとＥを含む。レトロウイルスは、通常、ｐｏｌポリタンパク質の一部としてＡＰをコードするものがほとんどである。酸プロテアーゼとも呼ばれるＡＰは、２つのドメインからなる単量体酵素で、それぞれのドメインは半分の活性部位とそれ自身の触媒用アスパラギン酸残基を含む。ＡＰはｐＨ２から３の範囲で最も活性が高く、アスパラギン酸残基の１つはイオン化されもう１つは中性になる。ＡＰのペプシンファミリーは分泌酵素を多く含み、すべてシグナルペプチドおよびプロペプチドが付いて合成されるようである。ほとんどのファミリーのメンバーは３つのジスルフィドループをもち、最初の約５残基のループが最初のアスパラギン酸に続き、第２の５〜６残基ループが第２のアスパラギン酸の前にあり、第３で最大のループはＣ末端の方にある。一方、レトロペプシンはペプシンの単一ドメインに類似し、半分の活性部位に寄与する各レトロペプシン単量体をもったホモ二量体として活性化する。レトロペプシンは、ウイルス性ポリタンパク質をプロセシングするのに必要である。
【００１７】
ＡＰは多様な組織における役割をもち、そのいくつかは疾病に関連する。レニンは、電解質バランスと血圧の制御を担っているホルモンアンジオテンシンのプロセシングにおいて第１段階を媒介している（Ｃｒｅｗｓ， Ｄ．Ｅ． および Ｓ．Ｒ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ （１９９９） Ｈｕｍ． Ｂｉｏｌ． ７１：４７５−５０３の概説を参照）。カテプシンの異常な調整と発現は、多様な炎症性の病状において明らかである。カテプシンＤの発現は、慢性関節リウマチおよび骨関節炎の患者から取った滑膜組織において増加している。増加する発現およびカテプシンの示差的制御は、さまざまな癌において潜在的な転移性と関係がある（Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ａ．Ｆ． 他 （１９９３） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｏｎｃｏｌ． ４：９５−１１４）。
【００１８】
メタロプロテアーゼ
メタロプロテアーゼは、活性のために金属イオンを必要とし、通常はマンガンか亜鉛である。マンガン金属酵素の例としては、アミノペプチダーゼＰおよびヒトプロリンジペプチダーゼ（ＰＥＰＤ）が含まれる。アミノペプチダーゼＰは、さまざまな炎症性反応において活性化されるノナペプチドであるブラジキニンを分解できる。アミノペプチダーゼＰは、冠状動脈の虚血および再灌流損傷に関係すると考えられている。アミノペプチダーゼＰ阻害剤の投与は、ラットにおいて心臓を保護する効果をもつことが示されている（Ｅｒｓａｈｉｎ， Ｃ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４：６０４−６１１）。
【００１９】
亜鉛依存メタロプロテアーゼのほとんどは、亜鉛結合ドメインにおける共通の配列をもつ。活性部位は、亜鉛リガンドおよび第１のヒスチジンに対する触媒グルタミン酸Ｃ末端として作用する２つのヒスチジンからなる。このシグネチャ配列を含んでいるタンパク質はメトジンシンとして知られており、アミノペプチダーゼＮ、アンジオテンシン変換酵素、ニューロリシン、マトリックスメタロプロテアーゼ、および、アダマリシン（ＡＤＡＭＳ）が含まれる。代替の配列が亜鉛カルボキシペプチダーゼに見られ、３つすべての保存残基（２つのヒスチジンと１つのグルタミン酸）亜鉛結合に関与している。
【００２０】
アンジオテンシン変換酵素およびアミノペプチダーゼを含む数多くの中性メタロエンドペプチダーゼは、ペプチドホルモンの代謝に関与している。例えば、高いアミノペプチダーゼＢ活性は、高血圧なラットの副腎腺や神経下垂体に見られる（Ｐｒｉｅｔｏ， Ｉ． 他 （１９９８） Ｈｏｒｍ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｓ． ３０：２４６−２４８）。オリゴペプチダーゼＭ／ニューロリシンは、ニューロテンシンと同様にブラジキニンを加水分解できる（Ｓｅｒｉｚａｗａ， Ａ． 他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７０：２０９２−２０９８）。ニューロテンシンは脳の神経伝達物質として作用しうる血管作動性ペプチドで、脳では食物摂取の制限に関与していると考えられる（Ｔｒｉｔｏｓ， Ｎ．Ａ． 他 （１９９９） Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ３３：３３９−３４９）。
【００２１】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を分解できる少なくとも２３の酵素のファミリーである。ＭＭＰはＮ末端触媒ドメインをもつＺｎ^＋２エンドペプチダーゼである。このファミリーのすべてのメンバーは、ＥＣＭの基質分子または組織によって産生される阻害剤に結合できるヒンジペプチドとＣ末端ドメインをもつ（ＴＩＭＰ：メタロプロテアーゼ組織インヒビター； Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｉ．Ｌ． 他 （１９９９） Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２２：２８５）。フィブロネクチン様リピート、膜貫通ドメイン、またはＣ末端ヘモペキシナーゼ様ドメインの存在は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、および膜タイプＭＭＰサブファミリーにＭＭＰを分類するのに使用できる。不活性型においては、活性部位のＺｎ^＋２イオンはプロ配列のシステインと相互作用する。活性化因子は、Ｚｎ^＋２システイン相互作用、すなわち、「システインスイッチ」を妨害して、活性部位を曝露させる。これは酵素を部分的に活性化し、その酵素がプロペプチドを切断して完全に活性になる。ＭＭＰは、セリンプロテアーゼプラスミンとフリンによって活性化されることがよくある。ＭＭＰは、阻害剤との化学量論的な非共有結合の相互作用によって調整されることがよくある。プロテアーゼの阻害剤に対する量的バランスが、組織恒常性において非常に重要である（Ｙｏｎｇ， Ｖ．Ｗ． 他 （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２１：７５の概説を参照）。
【００２２】
ＭＭＰは、骨関節炎（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｐ． 他 （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：７６１）、抗アテローム硬化性プラーク破裂（Ｓｕｋｈｏｖａ， Ｇ．Ｋ． 他 （１９９９） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：２５０３）、大動脈瘤（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｍａｎ， Ｊ． 他 （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １５２：７０３）、不治の傷（Ｓａａｒｉａｌｈｏ−Ｋｅｒｅ， Ｕ．Ｋ． 他 （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：７９）、骨吸収（Ｂｌａｖｉｅｒ， Ｌ． および Ｊ．Ｍ． Ｄｅｌａｉｓｓｅ （１９９５） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １０８：３６４９）、年齢に関連する黄斑変性症（Ｓｔｅｅｎ， Ｂ． 他 （１９９８） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３９：２１９４）、肺気腫（Ｆｉｎｌａｙ， Ｇ．Ａ． 他 （１９９７） Ｔｈｏｒａｘ ５２：５０２）、心筋梗塞（Ｒｏｈｄｅ， Ｌ．Ｅ． 他 （１９９９） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９：３０６３）、および、拡張型心筋症（Ｔｈｏｍａｓ， Ｃ．Ｖ． 他 （１９９８） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９７：１７０８）を含む数多くの疾病に結びつけられる。ＭＭＰ阻害剤は、ラットにおいては乳癌と実験的腫瘍の転移を阻止し、マウスにおいては、ルイス肺癌、血管腫、およびヒト卵巣癌の異種移植を阻止する（Ｅｃｃｌｅｓ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２８１５； Ａｎｄｅｒｓｏｎ 他 （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：７１５−７１８； Ｖｏｌｐｅｒｔ， Ｏ．Ｖ． 他 （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：６７１； Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ， Ｇ． 他 （１９９５） Ｊ． ＮＣＩ ８７：２９３； Ｄａｖｉｅｓ， Ｂ． 他 （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２０８７）。ＭＭＰはアルツハイマー病において活性である可能性がある。数多くのＭＭＰは多発性硬化症に結びつけられ、ＭＭＰ阻害剤の投与により症状のいくつかを軽減できる（前出のＹｏｎｇの概説を参照）。
【００２３】
メタロプロテアーゼの別のファミリーはＡＤＡＭ（ディスインテグリンメタロプロテアーゼドメイン）で、非常に近縁のアダマリシン（ヘビ毒メタロプロテアーゼ（ＳＶＭＰ））とそのドメインを共有している。ＡＤＡＭは、細胞表面接着分子とプロテアーゼの両方の特徴を組み合せ、プロドメイン、プロテアーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、システインリッチドメイン、上皮成長因子リピート、膜貫通ドメイン、および、細胞質内尾部を含んでいる。上に記した最初の３つのドメインはＳＶＭＰにも見られる。ＡＤＡＭは、４つの潜在的機能、すなわち、タンパク質分解、接着、シグナル伝達、融合をもつ。ＡＤＡＭはメトジンシン亜鉛結合配列を共有し、ＴＩＭＰ−１などのいくつかのＭＭＰアンタゴニストによって抑制される。
【００２４】
ＡＤＡＭは、精子と卵子の結合や融合、筋芽細胞融合、および、タンパク質外部ドメインによるサイトカイン、サイトカイン受容体、接着タンパク質、その他細胞外タンパク質ドメインのプロセシングや分断といったプロセスに関与していると考えられる（Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ， Ｊ． および Ｃ．Ｐ． Ｂｌｏｂｅｌ （１９９９） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １１２：３６０３−３６１７）。クズバニアン（Ｋｕｚｂａｎｉａｎ）タンパク質はＮＯＴＣＨ経路（おそらくＮＯＴＣＨ自身）の基質を切断し、ショウジョウバエの神経発達における側抑制のプログラムを活性化する。２つのＡＤＡＭであるＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ １７）とＡＤＡＭ １０は、脳内のアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおいて類似した役割をもつと提案されている（Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ および Ｂｌｏｂｅｌ、前出）。ＴＡＣＥは酵素を活性化するＴＮＦとしても同定されている（Ｂｌａｃｋ， Ｒ．Ａ． 他 （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８５：７２９）。ＴＮＦは、感染あるいは外傷に反応して宿主防御を起動させるのに重要な多面作用をもつサイトカインであるが、過剰になると重度の損傷を引き起こすことがあり、自己免疫性疾病において過剰産生されることがよくある。ＴＡＣＥは、膜結合型プロＴＮＦを切断して可溶性型を放出する。他のＡＤＡＭは、他の膜結合型分子の同様のタイプのプロセシングに関与している場合がある。
【００２５】
ＡＤＡＭＴＳサブファミリーはＡＤＡＭファミリーのメタロプロテアーゼの全特徴をもち、さらなるトロンボスポンジンドメイン（ＴＳ）を含む。原型のＡＤＡＭＴＳはマウスにおいて同定され、心臓および腎臓において発現するのが発見され、炎症誘発性刺激によって上方制御される（Ｋｕｎｏ， Ｋ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：５５６−５６２）。現在まで、１１のメンバーがヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｕｓｅｒｓ／ｈｅｓｔｅｒ／ａｄａｍｔｓ．ｈｔｍｌ＃Ａｐｐｒｏｖｅｄ）によって認識されている。このファミリーのメンバーは、軟骨に圧縮性などの重要な機械的特性をもたらし、関節炎の発生中に失われる高分子量プロテオグリカンのアグリカンを分解する。したがって、アグリカンを分解する酵素は、関節軟骨の分解を阻止し遅くする魅力的な標的と考えられている（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ， Ｍ．Ｄ． （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１６６４； Ａｂｂａｓｚａｄｅ， Ｉ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２３４４３などを参照）。他のメンバーは、血管新生阻害の可能性（Ｋｕｎｏ 他、前出） とコラーゲンプロセシング（Ｃｏｌｉｇｅ， Ａ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４−２３７４）の両方またはいずれか一方をもつと報告されている。
【００２６】
新しいプロテアーゼおよびそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発達障害、上皮性疾患、神経系疾患、および、生殖系疾患の診断、治療、ならびに予防という点、および、プロテアーゼの核酸配列およびアミノ酸配列の発現における外来性化合物の影響に関する評価という点において有用である新たな組成を提供することにより、当分野における要求を満たす。
【００２７】
（発明の概要）
本発明は、総称して「ＰＲＴＳ」、個別にはそれぞれ「ＰＲＴＳ−１」、「ＰＲＴＳ−２」、「ＰＲＴＳ−３」、「ＰＲＴＳ−４」、「ＰＲＴＳ−５」、「ＰＲＴＳ−６」、「ＰＲＴＳ−７」、「ＰＲＴＳ−８」、「ＰＲＴＳ−９」、「ＰＲＴＳ−１０」、「ＰＲＴＳ−１１」、「ＰＲＴＳ−１２」、「ＰＲＴＳ−１３」、「ＰＲＴＳ−１４」、「ＰＲＴＳ−１５」、「ＰＲＴＳ−１６」、及び「ＰＲＴＳ−１７」と呼ぶプロテアーゼである精製されたポリペプチドを提供する。或る実施態様において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択した、単離されたポリペプチドを提供する。一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。
【００２８】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、を含む群から選択されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を有する群から選択される。
【００２９】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性のある天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を有する群から選択したポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００３０】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる一群から選択されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる一群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する天然のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的に活性な断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７とからなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片とで構成される一群から選択されたポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００３１】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００３２】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド配列、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを有する。
【００３３】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド配列、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む。検出方法は、（ａ）サンプル中の標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、プローブと標的ポリヌクレオチドあるいはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む。
【００３４】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物を含む群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００３５】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含む。一実施例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的ＰＲＴＳの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。別法では、本発明は、この方法によって同定されたアゴニスト化合物と好適な医薬用賦形剤とを含む組成物を提供する。また別の実施態様において、本発明は、機能的ＰＲＴＳの発現低下に関連する疾患または病状を治療する方法を提供し、そのような治療を必要とする患者に対して成分を投与する過程を含む。
【００３７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列のポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。一実施態様で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物の患者への投与を含む、機能的ＰＲＴＳの過剰発現に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。。
【００３８】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００３９】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２１を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片を含むポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性を試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【００４０】
本発明は更に、標的ポリヌクレオチドの変異発現の有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を有する群から選択した配列を含む。スクリーニング方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程とを含む。
【００４１】
本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物からなる群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片と、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【００４２】
（発明を実施するための形態）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００４３】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【００４４】
本明細書中で用いる全ての専門用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００４５】
（定義）
用語「ＰＲＴＳ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＰＲＴＳのアミノ酸配列を指す。
【００４６】
「アゴニスト」という用語は、ＰＲＴＳの生物活性を強化あるいは模倣する分子を指す。このアゴニストは、ＰＲＴＳに直接相互作用するか、或いはＰＲＴＳが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＰＲＴＳの活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００４７】
用語「対立遺伝子変異配列」は、ＰＲＴＳをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変異ＲＮＡまたはポリペプチドからも作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。遺伝子は、天然の対立遺伝子変異体を全く有しないか、１個若しくは数個の天然の対立遺伝子変異体を有し得る。一般に対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に、所定の配列内で１回若しくは数回生じ得る。
【００４８】
ＰＲＴＳをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＰＲＴＳと同じポリペプチド或いはＰＲＴＳの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを指す。この定義には、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされたタンパク質も「変異」し得るものであり、サイレント変化を生ぜしめて結果的に機能的に等価なＰＲＴＳとなるようなアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＰＲＴＳの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似している非荷電極性側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとスレオニンがある。親水性値が近似している非荷電側鎖を有するアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００４９】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００５０】
用語「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。
【００５１】
用語「アンタゴニスト」は、ＰＲＴＳの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストは、ＰＲＴＳに直接相互作用するか、或いはＰＲＴＳが関与する生物学的経路の成分と作用して、ＰＲＴＳの活性を調節する抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【００５２】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合することができる、そのままの免疫グロブリンやその断片、例えばＦａ、Ｆ（ａｂ’）_２ 及びＦｖ断片を指す。ＰＲＴＳポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、そのままのポリペプチド、または関心のある小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じて担体タンパク質に抱合することも可能である。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）等がある。その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【００５３】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体に結合するための無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００５４】
本明細書において「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス成分には、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドや、２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドがある。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が形成した天然の核酸配列と塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味する。
【００５５】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＰＲＴＳ、合成のＰＲＴＳまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００５６】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「５’Ａ−Ｇ−Ｔ３’」は、相補配列「３’Ｔ−Ｃ−Ａ５’」と対を形成する。
【００５７】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この成分には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＰＲＴＳ若しくはＰＲＴＳの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることが可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケの精子のＤＮＡ等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００５８】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにＤＮＡ配列の解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’及び／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を決定する配列もある。
【００５９】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸と、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。

保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【００６０】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００６１】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００６２】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【００６３】
「示差発現」は少なくとも２つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損遺伝子またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、治療後サンプルと未治療のサンプルまたは病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【００６４】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。１つのエキソンがコードされたタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャーを再分類することによって、新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００６５】
用語「断片」は、ＰＲＴＳまたはＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すような最初の２５０または５００アミノ酸（またはポリペプチドの最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【００６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を特定に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の断片の正確な長さ及び断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のある断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７のある断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と一致するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の正確な断片の長さや領域は、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に決定できる。
【００６８】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００６９】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【００７０】
ポリヌクレオチド配列についての用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入するので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００７１】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて決定できる。このプログラムはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージの一部であり、一式の分子生物学分析プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３及びＨｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．他 （１９９２） ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１の文献に記載されている。ポリヌクレオチド配列の対をなすアラインメントの場合、デフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００７２】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）から提供されており（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他 （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）、これはメリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩ及びインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒｉｌ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｎを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００７３】

一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００７４】
高度の相同性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００７５】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００７６】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリぺプチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定する。デフォルトの残基重み付け表としてＰＡＭ２５０マトリクスを選択する。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパーセントは、「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００７７】
或いは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２ （Ａｐｒ−２１−２０００）でｂｌａｓｔｐを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００７８】

一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続したヌクレオチドの断片）の長さと比較して一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００７９】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、約６ｋｂ 〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の小染色体である。
【００８０】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００８１】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相同性を共有することを示すものである。アニーリングが許容される条件下で、特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、「洗浄」過程の後もハイブリダイズしたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、更にストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、本技術分野における当業者が慣例的に決定できる。許容条件はハイブリダイゼーション実験の間は一定でよいが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験中に変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子ＤＮＡが含まれる。
【００８２】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びｐＨにおける特異配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度及びｐＨの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２ｘ ＳＳＣ及び約０．１％のＳＤＳの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行う。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異的ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡがある。例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションのような特定条件下では、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド及びヌクレオチドにコードされるポリペプチドに対する類似の役割を強く示唆している。
【００８４】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって、形成された２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基質であって細胞若しくはその核酸が固定される基質）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【００８５】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００８６】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【００８７】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生きている動物に導入すると、免疫反応を引き起こすＰＲＴＳのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なＰＲＴＳのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【００８８】
用語「マイクロアレイ」は、基質上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【００８９】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【００９０】
用語「調節」は、ＰＲＴＳの活性の変化を指す。例えば、調節によって、ＰＲＴＳのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【００９１】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【００９２】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。同一のリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。
【００９３】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、成分に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【００９４】
ＰＲＴＳの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＰＲＴＳの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なり得る。
【００９５】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＰＲＴＳやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【００９６】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【００９７】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他 （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他， （１９８７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｉ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ他 （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ等を参照されたい。ＰＣＲプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【００９８】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得たものを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂａｒａｙ）」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である。（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい。）ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【００９９】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばのＳａｍｂｒｏｏｋらの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部を付加、置換または欠失した変異核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１００】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物ないで防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１０１】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５’及び３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１０２】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１０３】
本明細書において、ＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」とは、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１０４】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＰＲＴＳ、ＰＲＴＳをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１０５】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存していることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１０６】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１０７】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１０８】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビード、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基質は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基質表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１０９】
「転写イメージ」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１１０】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１１１】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の有機体であり、限定するものではないが動植物を含み、有機体の１個若しくは数個の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られている形質転換技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような有機体に移入する技術はよく知られており、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ 他 （１９８９） 等の参考文献に与えられている。
【０１１２】
特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （１９９９年５月７日）を用いるｂｌａｓｔｎによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも４０％と決定された核酸配列のことである。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と表すことができる。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソンの異なるスプライシングによって通常、ポリヌクレオチドがより多くまたはより少数の塩基を有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、与えられた種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１１３】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメータ設定の「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９ （１９９９年５月７日）を用いるｂｌａｓｔｐによって、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少なくとも４０％と決定されたポリペプチド配列のことである。このようなポリペプチド対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１１４】
（発明）
本発明は、新しいヒトプロテアーゼ（ＰＲＴＳ）の発見、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド、および、胃腸障害、心血管疾患、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発達障害、上皮性疾患、神経障害、および、生殖障害の診断、治療、ならびに予防に対するこれらの組成の使用に基づいている。
【０１１５】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１１６】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリペプチド配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、ＧｅｎＢａｎｋの最も近い相同体のＧｅｎＢａｎｋの識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ ：）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体との間の一致を表す確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにＧｅｎＢａｎｋ相同体のアノテーションを示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれている。
【０１１７】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１と列２は、ポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、および、本発明の各ポリペプチドに対して対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１１８】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドがプロテアーゼであることを確立している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はヒトのプレプロカテプシンＬ前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１９０４１８）と８９％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２を参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは４．５ｅ−１６９であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、パパインファミリーのシステインプロテアーゼ活性部位ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。（表３参照）このモチーフの存在がＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮの解析によって確認され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ がパパインファミリーのシステインプロテアーゼであることに対するさらに実証的な証拠を提供している。別の例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、トリプシンファミリーのポリプロテアーゼであるアフリカツメガエルの卵母キマーゼ（ｏｖｏｃｈｙｍａｓｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２９８１６４１） と４４％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは６．４ｅ−２０１であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、いくつかのプロテアーゼ活性部位ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。このモチーフの存在は、ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、およびＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮの分析によって確認されている。これらの分析は、またシグナルペプチドの他にクリングルとＣＵＢのドメインの存在を示している。これらのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ がトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０が、ヒトのユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ６９４１８８８）と５０％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは７．５ｅ−２７３であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はまた、マウスのユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ６９４１８９０）と５１％の同一性を有することがＢＬＡＳＴ解析によって示され、その確立スコアは４．０ｅ−２７１であった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はまた、ユビキチンのカルボキシ末端ヒドロラーゼ（例えば、ユビキチン特異的プロテアーゼ）ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ及びＭＯＴＩＦＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０がユビキチン特異的プロテアーゼであることをさらに確証する証拠を提供する。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６が、アフリカツメガエルのＡＤＡＭ１３（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１９１６６１７）と５２％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．４ｅ−１９８であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６は、レプロリシンファミリの中性亜鉛プロテアーゼの活性部位ドメイン（レプロリシンファミリのプロペプチドの１つ）、及びディスインテグリンドメインのシグネチャを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。このドメインの存在がＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮの解析によって確認され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ がＡＤＡＭファミリーのメタロプロテアーゼであることに対するさらに実証的な証拠を提供している。別の例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７が、ヒトの亜鉛メタロプロテアーゼＡＤＡＭＴＳ６（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ５９２３７８６）と３０％の同一性を有することがＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ分析によって示され、４４％の局所的同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは９．１ｅ−１６４であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７は、また亜鉛メタロプロテアーゼの活性部位ドメイン、レプロリシンファミリのプロペプチド、及びタイプＩトロンボスポンジンドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づいた、保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ がＡＤＡＭＴＳファミリのメタロプロテアーゼある、さらに実証的な証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−９、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−１５は同じような方法で解析し、注釈を付けた。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０１１９】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅ ポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＩＤ）を示す。列３は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さを示す。列４は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４と関連するポリヌクレオチド配列とを区別するためのハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片を示す。列５はｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡから予想されたコード配列（エキソン）及び／またはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを共に有する配列集合に対応する識別番号を示している。これらの配列は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いた。表４の列６および列７はそれぞれ、列５の配列に対応するｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０１２０】
表４の列５の識別番号は、特に例えばＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡとそれに対応するｃＤＮＡライブラリを指す場合もある。例えば、６９１７４６０Ｈ１はＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列の識別番号であり、ＰＬＡＣＦＥＲ０６はそれが由来するｃＤＮＡライブラリの識別番号である。ｃＤＮＡライブラリが示されていないＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、プールされているｃＤＮＡライブラリ（例えば、７２００４３１９Ｖ１）に由来する。または、列５の識別番号は、ポリヌクレオチド配列の組み立てに用いたＧｅｎＢａｎｋのｃＤＮＡすなわちＥＳＴ（例えば、ｇ１３６５１６６）の識別番号の場合もある。さらに、列５の識別番号は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列を同定し得る（即ち「ＥＮＳＴ」命名を含む配列）。或いは、列５の識別番号は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ データベースから由来する場合もあり（即ち「ＮＭ」または「ＮＴ」の命名を含む配列）、またＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓから由来する場合もある（即ち「ＮＰ」の命名を含む配列）。または列５の識別番号は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡ及びＧｅｎｓｃａｎ予想エキソンの両方からなる群を意味する場合がある。例えば、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ_１＿Ｎ_２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ_３＿Ｎ_４ は「ステッチされた」配列であり、その内、ＸＸＸＸＸＸはアルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、ＹＹＹＹＹはアルゴリズムにより生み出される予測の数であり、Ｎ_{１，２，３．．．}がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソンを表す（ 実施例５参照 ）。または、列５の識別番号は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎは「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ識別番号、Ｎは特定のエキソンである（実施例５を参照）。あるＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、ＲｅｆＳｅｑ識別番号（「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表される）が、ＧｅｎＢａｎｋ識別（即ち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用される場合もある。
【０１２１】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。

【０１２２】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために列５に示すような配列の適用範囲と重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの適用範囲が得られたが、それに関連するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０１２３】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列を構築及び確認するために用いられるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列によって最も頻繁に代表されるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリである。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１２４】
本発明はまた、ＰＲＴＳの変異体も含む。好適なＰＲＴＳの変異体は、ＰＲＴＳアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約９０％、さらには少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ＰＲＴＳの機能的または構造的特徴を少なくとも１つ含む変異体である。
【０１２５】
本発明はまた、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例において、本発明は、ＰＲＴＳをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択した配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。配列表に示したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のポリヌクレオチド配列は、窒素系塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる等価ＲＮＡ配列を含む。
【０１２６】
本発明はまた、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、ＰＲＴＳの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１２７】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＰＲＴＳをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のＰＲＴＳのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【０１２８】
ＰＲＴＳをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は一般に、好適に選択されたストリンジェントな条件下で、天然のＰＲＴＳのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然のコドンを含めるなどの実質的に異なった使い方のコドンを有するＰＲＴＳ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作ることは有利となり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＰＲＴＳ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【０１２９】
本発明はまた、ＰＲＴＳ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後、当分野でよく知られている試薬を用いて、この合成配列を任意の様々な入手可能な発現ベクター及び細胞系中に挿入し得る。更に、合成化学を用いてＰＲＴＳまたはその任意の断片をコードする配列に突然変異を誘導し得る。
【０１３０】
更に本発明には、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４及びそれらの断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７、Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１を参照）。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１３１】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もＤＮＡシークエンシング方法を用いて実施可能である。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いることができる。或いは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ 或いは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７．７ユニット、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページを参照）。
【０１３２】
当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法で、部分的なヌクレオチド配列を利用して、ＰＲＴＳをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する方法である（Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−３２２等を参照）。別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列からなる制限酵素断片から得る（Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６：８１８６等を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法に関与している（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９等を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、未知の配列を検索するために用い得る別の方法については当分野で知られている（Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０等を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー及びＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（商標）ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１３３】
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０１３４】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１３５】
本発明の別の実施例では、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にＰＲＴＳ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＰＲＴＳのクローン化及び発現に利用可能である。
【０１３６】
種々の目的でＰＲＴＳをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１３７】
本発明のヌクレオチドを、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術を用いてシャフリングして、ＰＲＴＳの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのＰＲＴＳの生物学的特性を変更或いは改良することができる。ＤＮＡシャッフリングは、遺伝子断片のＰＣＲを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、その遺伝子変異体を所望の特性に同定するような選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。従って、人工的な育種及び急速な分子の進化によって多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所定の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、指図された制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１３８】
別の実施例によれば、ＰＲＴＳをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＰＲＴＳ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４等を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更にＰＲＴＳのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１３９】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１等を参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページ等を参照）。
【０１４０】
生物学的に活性なＰＲＴＳを発現させるために、ＰＲＴＳをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＰＲＴＳをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＰＲＴＳをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。発現の効率は、用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを包含することによって高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． ら （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２．等を参照）。
【０１４１】
当業者に周知の方法を用いて、ＰＲＴＳをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章１−４章を参照）。
【０１４２】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＰＲＴＳをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系などの微生物等がある（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． 及び Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯＪ． ６：３０７−３１１、『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． 及び Ｔ． Ｓｈｅｎｋ （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクターまたは種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他 （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他 （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他 （１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１４３】
本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＰＲＴＳをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ． および Ｓ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９ 等を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＰＲＴＳが必要な場合は、ＰＲＴＳの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導Ｔ５バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１４４】
酵母の発現系を使用してＰＲＴＳを産出し得る。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質を分泌或いは細胞内への保持のいずれかに誘導し、安定した増殖のために外来配列の宿主ゲノムへの組込みを可能にする（前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５）、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他 （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６５４４、 Ｓｃｏｒｅｒ， Ｃ．Ａ． 他 （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４等を参照）。
【０１４５】
植物系を使用してＰＲＴＳを発現することも可能である。ＰＲＴＳをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独あるいはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合せて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターによって促進される。或いは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他 （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１１６８０、 Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． 他 （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８８４３、 Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． 他 （１９９１） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５１０５等を参照）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ等を参照）。
【０１４６】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＰＲＴＳをコードする配列を連結し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞にＰＲＴＳを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１４７】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなＤＮＡの断片を輸送することもできる。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０１４８】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＰＲＴＳの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＰＲＴＳをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１４９】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ⁻細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２、Ｌｏｗｙ， Ｉ． 他 （１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他 （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４ 等を参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤは、文献に記載されている（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及び Ｒ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７−８０５１等を参照）。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１等を参照）。
【０１５０】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＰＲＴＳをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＰＲＴＳをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＰＲＴＳをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１５１】
一般に、ＰＲＴＳをコードする核酸配列を含み且つＰＲＴＳを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法がある。
【０１５２】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてＰＲＴＳの発現の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で公知である。このような技術の例としては、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。ＰＲＴＳ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他 （１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ．（１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ等を参照）。
【０１５３】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＰＲＴＳをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０１５４】
ＰＲＴＳをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＰＲＴＳの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１５５】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１５６】
本発明の別の実施例では、ＰＲＴＳをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列にライゲーションさせる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＰＲＴＳタンパク質が、ＰＲＴＳ活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及び赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＰＲＴＳをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＰＲＴＳが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） １０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０１５７】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＰＲＴＳの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば^３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１５８】
本発明のＰＲＴＳまたはその断片を用いて、ＰＲＴＳに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＰＲＴＳへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１５９】
ある実施態様では、このように同定された化合物は、例えばリガンドやその断片などのＰＲＴＳの天然のリガンド、または天然の基質、構造的または機能的な擬態性パートナーまたは自然結合パートナーに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： ５章などを参照）。同様に、化合物は、ＰＲＴＳが結合する天然受容体、あるいは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連する場合がある。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。ある実施態様では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質あるいは細胞膜上のタンパク質のいずれか一方としてＰＲＴＳを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。ＰＲＴＳを発現する細胞またはＰＲＴＳを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、ＰＲＴＳまたは化合物のいずれかの結合、刺激または阻害を分析する。
【０１６０】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたＰＲＴＳと結合させるステップと、ＰＲＴＳとこの化合物との結合を検出するステップを含む場合がある。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１６１】
本発明のＰＲＴＳまたはその断片を用いて、ＰＲＴＳの活性を調整する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、或るいは部分的または逆アゴニスト等が含まれる。ある実施態様では、ＰＲＴＳの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも１つの試験化合物をＰＲＴＳと混合し、試験化合物の存在下でＰＲＴＳの活性を試験化合物不在下でのＰＲＴＳの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＰＲＴＳの活性の変化は、ＰＲＴＳの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別の実施態様において、試験化合物をＰＲＴＳの活性に適した条件下でＰＲＴＳを含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞再構成系と結合させてアッセイを実施する。これらアッセイのいずれかにおいて、ＰＲＴＳの活性を調整する試験化合物は間接的に結合することが可能であり、試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１６２】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、ＰＲＴＳまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号及び第５，７６７，３３７号等を参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞株等のマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３ ３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を決め、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０１６３】
ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１ １４７）。
【０１６４】
ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別の実施態様において、例えばＰＲＴＳを乳汁内に分泌するなどＰＲＴＳを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０１６５】
（治療）
ＰＲＴＳのある領域とプロテアーゼの領域との間に、例えば配列およびモチーフの内容における化学的および構造的類似性が存在する。更に、ＰＲＴＳの発現は、消化器系組織、肺組織、神経系組織、胃腸組織、心血管組織、泌尿器組織、生殖系組織、線維芽組織、発生組織、および内皮組織に密接に関連し、また、前立腺癌及びその他の腫瘍組織に密接に関連する。したがって、ＰＲＴＳは、胃腸障害、心血管障害、自己免疫／炎症疾患、細胞増殖異常、発達障害、上皮性疾患、神経障害、および、生殖障害における役割を果たすようである。ＰＲＴＳの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＰＲＴＳの発現または活性を低下させることが望ましい。ＰＲＴＳの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＰＲＴＳの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１６６】
従って、一実施例において、ＰＲＴＳの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＰＲＴＳまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定されるものではないが、胃腸障害の内には、腸疾患、消化性食道炎、食道攣縮、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化不良、胃炎、胃癌、摂食障害、吐き気、嘔吐、胃不全麻痺、胞状浮腫および幽門浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、腸閉塞、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁鬱滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、肝硬変、肝臓の受動的鬱血、肝臓癌、伝染性大腸炎、潰瘍大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリーワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性大腸症候群、短腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、腸疾患、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝臓脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α１アンチトリプシン欠乏症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝臓梗塞、門脈閉塞および血栓症、小葉中心性壊死、肝紫斑症、肝静脈血栓症、肝中心静脈閉塞症、子癇前症、子癇、急性妊娠脂肪肝、妊娠肝内胆汁鬱滞、肝腫瘍（結節過形成、腺腫、および癌）があり、また心血管疾患として、動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患が含まれ、自己免疫／炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、アテローム性プラーク破裂、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、関節軟骨の変性、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病、神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）、脳性小児麻痺）、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、上皮性疾患には、発汗異常性湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、毛孔性角化症、肝斑、白斑、光線性角化症、基底細胞癌、扁平細胞癌、脂漏性角化症、毛嚢炎、単純疱疹、帯状疱疹、水痘、カンジダ症、皮膚糸状菌症、疥癬、虫刺され、サクランボ色血管腫、ケロイド、皮膚線維腫、先端線維性軟疣、蕁麻疹、一過性棘融解性皮膚症、乾燥症、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、手湿疹、貨幣状湿疹、慢性単純性苔癬、皮脂減少性湿疹、鬱血性皮膚炎および鬱血性潰瘍化、脂漏性皮膚炎、乾癬、扁平苔癬、薔薇色粃糠疹、膿痂疹、膿瘡、皮膚糸状菌症、癜風、疣、尋常性座瘡、赤鼻、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、疱疹状皮膚炎、リニアＩｇＡ病、後天性表皮水疱症、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、強皮症、紅皮症、脱毛症、修飾皮膚損傷、毛細血管拡張、色素脱失、色素沈着過剰、小胞／水疱、発疹、皮膚薬物反応、丘疹結節皮膚損傷、慢性不治傷、光過敏症、単純型表皮水疱症、表皮剥離性角質増殖症、表皮溶解性掌蹠角皮症および非表皮溶解性掌蹠角皮症、シーメンス水疱性魚鱗癬、剥脱性魚鱗癬、手掌角化症および足底角化症、掌蹠角化症、掌蹠角皮症、点状角化症、メースマン角膜ジストロフィー、先天性爪肥厚、白色海綿状母斑、多発性皮脂嚢腫症、上皮性母斑／表皮溶解性角質増殖型、連珠毛、裂毛症、慢性肝炎／特発性肝硬変、および、結腸直腸過形成が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びＧｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（ＳＡＤ）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房が含まれる。
【０１６７】
別の実施態様では、ＰＲＴＳまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与して、上記しだけに限られるものではないが疾患を含むＰＲＴＳの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１６８】
さらに別の実施態様では、実質的に精製されたＰＲＴＳを含む成分を好適な医薬用担体と共に患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むＰＲＴＳの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０１６９】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＰＲＴＳの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＰＲＴＳの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１７０】
更なる実施例では、ＰＲＴＳの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＰＲＴＳのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した胃腸疾患、心血管疾患、自己免疫／炎症性の疾患、細胞増殖異常、発達異常、上皮疾患、神経系疾患、および生殖系疾患が含まれる。一実施態様では、ＰＲＴＳと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＰＲＴＳを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０１７１】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＰＲＴＳの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０１７２】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０１７３】
ＰＲＴＳのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＰＲＴＳを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＰＲＴＳと特異的に結合するものの同定が可能である。ＰＲＴＳの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られた断片が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０１７４】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＰＲＴＳまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０１７５】
ＰＲＴＳに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり且つ小さな天然の分子の全アミノ酸配列を含むことが望ましい。ＰＲＴＳのアミノ酸の短いストレッチは、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１７６】
ＰＲＴＳに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他 （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 他 （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他 （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 他 （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０等を参照）。
【０１７７】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１−４８５１−４８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他 （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＰＲＴＳ特異的一本鎖抗体を生成する。関連特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７等を参照）。
【０１７８】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、或いは免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような非常に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングによっても行い得る（Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他 （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他 （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９等を参照）。
【０１７９】
ＰＲＴＳに対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）_２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）_２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。或いは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、モノクローナルＦａｂ断片を所望の特異性と迅速且つ容易に同定することが可能となる（Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１等を参照）。
【０１８０】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性の検定ための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫学的検定には、ＰＲＴＳとその特異性抗体との間の複合体の計測が含まれる。二つの非干渉性ＰＲＴＳエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０１８１】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＰＲＴＳに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＰＲＴＳ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。多数のＰＲＴＳエピトープに対して親和性が不均一なポリクローナル抗体試薬のＫａは、ＰＲＴＳに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＰＲＴＳエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０^９〜１０^１２ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＰＲＴＳ抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７ｌｉｔｅｒ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＰＲＴＳが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． 及び Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１８２】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体試薬は一般に、ＰＲＴＳ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（例えば、Ｃａｔｔｙ、前出、Ｃｏｌｉｇａｎ 他、前出を参照）。
【０１８３】
本発明の別の実施例では、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、ＰＲＴＳをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ、修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＰＲＴＳをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．， 編集 （１９９６） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪ 等を参照）。
【０１８４】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を発現する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９８） Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５ 及び Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他 （１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６．等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ関連ウイルスベクター等のウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ． （１９９０） Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ． 及び Ｗ． Ｗａｌｔｈｅｒ （１９９４） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７等を参照）。その他の遺伝送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープ及び当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ． （１９９５） Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他 （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６． 等を参照）。
【０１８５】
本発明の別の実施例では、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（ｉ）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ．他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損症（ＳＣＩＤ）−Ｘ１の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損症（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ．他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， ３５ Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｓｏｍｉａ． Ｎ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）を治療し、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｂｌａ， Ｅ．他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及びＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の真菌寄生菌、並びに熱帯熱マラリア原虫及びクルーズトリパノソーマ等の原虫寄生生物に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＰＲＴＳの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＰＲＴＳを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０１８６】
本発明の更なる実施例では、ＰＲＴＳの欠損による疾患や異常症は、ＰＲＴＳをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＰＲＴＳ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏ或いはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、及び（ｖ）ＤＮＡトランスポソンの使用がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． 及び Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９３） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ． （１９９７） Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． 及びＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）。
【０１８７】
ＰＲＴＳの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＰＲＴＳを発現させるために、（ｉ）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 及び Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． 及び Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲ及びＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． 及び Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来するＰＰをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０１８８】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． 及び Ａ．Ｊ． Ｅｂ （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他（１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０１８９】
本発明の別の実施例では、ＰＲＴＳの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢ及びＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他 （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：６７３３−６７３７）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（ＶＰＣＬ）において増殖され、ＶＰＣＬは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはＶＳＶｇ等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。ＲＩＧＧに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばＣＤ４^＋ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他 （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ． （１９９７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ． （１９９７） Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０１９０】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＰＲＴＳの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクターの作製及びパッケージングについては、当業者に公知である。複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子を膵臓の無損傷の膵島内に導入するために可変性であることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Ａｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 及び Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． 及び Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１９１】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＰＲＴＳの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターは、ＨＳＶ親和性の中枢神経細胞にＰＲＴＳを導入する際に特に重要である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｗａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えＨＳＶ ｄ９２についての記載がある。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ２２のために除去される組換えＨＳＶ系統の作製及び使用について開示している。ＨＳＶベクターについては、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ 及び Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なった部分を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０１９２】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いてＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ， ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターがＳＦＶゲノムに基づいていることが分かった（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． 及び Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｎ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、通常はウイルスのキャプシッドタンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡが作り出される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長のゲノムＲＮＡより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてキャプシッドタンパク質が過剰産生される。同様に、ＰＲＴＳをコードする配列をαウイルスゲノムのキャプシッドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＰＲＴＳをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＰＲＴＳが合成される。通常はαウイルスの感染が数日以内での細胞溶解に関係する一方で、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）の持続的な感染を確立する能力は、αウイルスの溶解複製を遺伝子治療に適用できるように好適に変更可能であることを示唆している（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８ ：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＰＲＴＳを導入することできる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡ及びＲＮＡの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０１９３】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９４） ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．及び Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹ， １６３−１７７ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０１９４】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、ヌクレオチド鎖切断に先立つ相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、ＰＲＴＳをコードする配列の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０１９５】
任意のＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０１９６】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。任意の方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＰＲＴＳをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的ＲＮＡを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらｃＤＮＡ産物を、細胞系、細胞または組織内に導入することができる。
【０１９７】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、ＰＮＡの産出に固有のものであり、これら全ての分子に拡大することができる。それには、内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を加えることでできる。
【０１９８】
本発明の更なる実施例は、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。従って、ＰＲＴＳの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＰＲＴＳの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０１９９】
特異ポリヌクレオチドの変異発現における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既存の、市販のまたは専売の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルには例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、無細胞再構成系または再構成生化学系があり得る。ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を変異する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの変異発現に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞系（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２００】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他 （１９９７） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６．等を参照）。
【０２０１】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２０２】
本発明の追加実施例は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する成分の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な処方が通常知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＰＲＴＳ、ＰＲＴＳの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＰＲＴＳのインヒビターなどからなる。
【０２０３】
本発明に用いられる成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２０４】
肺から投与する成分は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような成分は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２０５】
本発明での使用に適した成分には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２０６】
ＰＲＴＳまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、ＰＲＴＳまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質は、マウスモデル系の脳を含む全ての組織の細胞に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２０７】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２０８】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＰＲＴＳまたはその断片、ＰＲＴＳの抗体、ＰＲＴＳのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ_５０（集団の５０％の医薬的有効量）またはＬＤ_５０（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような成分が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ_５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２０９】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。効果的なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、投与量及び投与を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の通常の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の配合、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い成分は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２１０】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２１１】
（診断）
別の実施例では、ＰＲＴＳに特異的に結合する抗体が、ＰＲＴＳの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＰＲＴＳやＰＲＴＳのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＰＲＴＳの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＰＲＴＳを検出する方法が含まれる。抗体は、修飾して或いは修飾しないで使用し、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化し得る。多様なレポーター分子が本技術分野で知られており、それらを用いることができる。幾つかのレポーター分子については上記した。
【０２１２】
ＰＲＴＳを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＰＲＴＳの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＰＲＴＳの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＰＲＴＳに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照、及び疾患生検組織からの各サンプルのＰＲＴＳの発現の量が基準値と比較される。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータとなる。
【０２１３】
本発明の別の実施例によれば、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。このポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＰＲＴＳを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出し定量する。この診断アッセイを用いて、ＰＲＴＳの存在の有無、更に過剰な発現を調べ、治療中のＰＲＴＳ値の調節を監視する。
【０２１４】
一実施形態では、ＰＲＴＳまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＰＲＴＳをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントは、プローブがＰＲＴＳをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０２１５】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＰＲＴＳをコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４の配列、或いはＰＲＴＳ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２１６】
ＰＲＴＳをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＰＲＴＳ及びＰＲＴＳ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、^３２Ｐまたは^３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２１７】
ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＰＲＴＳの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定されるものではないが、このような疾患として、胃腸障害の内には、腸疾患、消化性食道炎、食道攣縮、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化不良、胃炎、胃癌、摂食障害、吐き気、嘔吐、胃不全麻痺、胞状浮腫および幽門浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、腸閉塞、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁鬱滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、肝硬変、肝臓の受動的鬱血、肝臓癌、伝染性大腸炎、潰瘍大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリーワイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性大腸症候群、短腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、腸疾患、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、肝臓脂肪症、血色素症、ウィルソン病、α１アンチトリプシン欠乏症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝臓梗塞、門脈閉塞および血栓症、小葉中心性壊死、肝紫斑症、肝静脈血栓症、肝中心静脈閉塞症、子癇前症、子癇、急性妊娠脂肪肝、妊娠肝内胆汁鬱滞、肝腫瘍（結節過形成、腺腫、および癌）があり、また心血管疾患として、動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、静脈奇形、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術（ｂａｌｌｏｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、血管置換術、大動脈冠動脈バイパス術移植手術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｂｙｐａｓｓ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）などの血管疾患と、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（ｍｉｔｒａｌ ａｎｎｕｌａｒ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症などの心疾患が含まれ、自己免疫／炎症性疾患には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、アテローム性プラーク破裂、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、関節軟骨の変性、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常には日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、発生または発達障害の中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病、神経線維腫症）、甲状腺機能低下症、水頭症、発作障害（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）、脳性小児麻痺）、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、上皮性疾患には、発汗異常性湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、毛孔性角化症、肝斑、白斑、光線性角化症、基底細胞癌、扁平細胞癌、脂漏性角化症、毛嚢炎、単純疱疹、帯状疱疹、水痘、カンジダ症、皮膚糸状菌症、疥癬、虫刺され、サクランボ色血管腫、ケロイド、皮膚線維腫、先端線維性軟疣、蕁麻疹、一過性棘融解性皮膚症、乾燥症、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、手湿疹、貨幣状湿疹、慢性単純性苔癬、皮脂減少性湿疹、鬱血性皮膚炎および鬱血性潰瘍化、脂漏性皮膚炎、乾癬、扁平苔癬、薔薇色粃糠疹、膿痂疹、膿瘡、皮膚糸状菌症、癜風、疣、尋常性座瘡、赤鼻、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、疱疹状皮膚炎、リニアＩｇＡ病、後天性表皮水疱症、皮膚筋炎、紅斑性狼瘡、強皮症、紅皮症、脱毛症、修飾皮膚損傷、毛細血管拡張、色素脱失、色素沈着過剰、小胞／水疱、発疹、皮膚薬物反応、丘疹結節皮膚損傷、慢性不治傷、光過敏症、単純型表皮水疱症、表皮剥離性角質増殖症、表皮溶解性掌蹠角皮症および非表皮溶解性掌蹠角皮症、シーメンス水疱性魚鱗癬、剥脱性魚鱗癬、手掌角化症および足底角化症、掌蹠角化症、掌蹠角皮症、点状角化症、メースマン角膜ジストロフィー、先天性爪肥厚、白色海綿状母斑、多発性皮脂嚢腫症、上皮性母斑／表皮溶解性角質増殖型、連珠毛、裂毛症、慢性肝炎／特発性肝硬変、および、結腸直腸過形成が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、及びＧｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症候群を含む中枢神経系性の精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（ＳＡＤ）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核部変性症、及び家族性の前頭側頭性健忘症とが含まれ、生殖系疾患には、プロラクチン産生障害、不妊症（卵管疾患、排卵欠損症、子宮内膜症）、性周期障害、月経周期障害、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮筋腫、自己免疫疾患、子宮外妊娠、催奇形、乳がん、繊維嚢胞性乳房疾患、乳漏症、精子形成破壊、精子異常生理、精巣癌、前立腺癌、良性前立腺肥大、前立腺炎、パイロニー病、性交不能、男性乳癌、女性化乳房が含まれる。変異ＰＲＴＳの発現を検出するために、患者から採取した体液或いは組織を利用して、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列を、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、およびマルチフォーマトのＥＬＩＳＡ様アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２１８】
ある実施態様では、ＰＲＰＴをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＰＲＰＴをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＰＲＰＴをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２１９】
ＰＲＰＴの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＰＲＴＳをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２２０】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２２１】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２２２】
ＰＲＴＳをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２２３】
或る実施態様において、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型性（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。ＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々の重畳するＤＮＡ断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調整及び統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０２２４】
ＰＲＴＳの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．他（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．他（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６を参照）。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２２５】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効的な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２２６】
別の実施例では、ＰＲＴＳ、ＰＲＴＳの断片、ＰＲＴＳに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０２２７】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る（Ｓｅｉｌｌｉａｍｅｒ らの米国特許第５，８４０，４８４号 「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０２２８】
転写イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、または株化細胞の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０２２９】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５ ３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． 及び Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ （２０００） Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、発現のゲノム全域にわたる測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化するために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。標準化手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャのエレメントへの遺伝子機能を割り当てることは毒性機構の解明に役立つが、毒性の予測につながるシグネチャの統計的な一致には遺伝子機能の知識は必要ではない（例えば２０００年２月２９日にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。従って、中毒学的スクリーニングの際に毒性シグネチャを用いて、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２３０】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２３１】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたはシルバーまたは蛍光染色などの物質を用いてゲルで染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られるタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列が得られる。
【０２３２】
プロテオームのプロファイルは、ＰＲＴＳに特異的な抗体を用いてＰＲＴＳ発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他 （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｒｎ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２３３】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。或る組織の或るタンパク質に対しては、転写とタンパク質の存在量の相関が乏しいこともあるので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． 及び Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ （１９９７） Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがタンパク質のプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写の分析はｍＲＮＡ急速な分解により困難であるので、タンパク質のプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がある。
【０２３４】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２３５】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する反応を示す。
【０２３６】
マイクロアレイは、本技術分野でよく知られている方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） の米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他の （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他の （１９９５） ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他の （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集．（１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載されている。 該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２３７】
本発明の別の実施例ではまた、ＰＲＴＳをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列全体で非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリに対してマッピングされる（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５、Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４、Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４等を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて、例えば病状の遺伝と特定の染色体領域やまたは制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の遺伝とが相関するような遺伝子連鎖地図を作成可能である（Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ． 及び Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ （１９８６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０２３８】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他 （１９９５） 前出のＭｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページ等を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のＰＲＴＳをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関連するＤＮＡ領域の決定に役立つため、更なる位置を決定するクローニングが行われる。
【０２３９】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていない場合でも関連するマーカーを明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患を調査する研究者にとって価値がある。疾患または症候群が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域等、特定の遺伝子領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがなされると、該領域に対する任意のマッピングにより更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を表すことができる（Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他 （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０等を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０２４０】
本発明の別の実施例では、ＰＲＴＳ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することになろう。ＰＲＴＳと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０２４１】
別の薬剤スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高処理能力でスクリーニングするために用いられる（Ｇｅｙｓｅｎ，他 （１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４等を参照）。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基質上で合成する。試験用化合物は、ＰＲＴＳ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したＰＲＴＳを検出する。精製したＰＲＴＳはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２４２】
別の実施例では、ＰＲＴＳと結合可能な中和抗体がＰＲＴＳと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＰＲＴＳと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０２４３】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術で、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存しているならば、ＰＲＴＳをコードするヌクレオチド配列にその新技術を用い得る。
【０２４４】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２４５】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第６０／２３１，０３９号、第６０／２３２，８１２号、第６０／２３４，８５０号、第６０／２３６，５００号、第６０／２３８，７７３号、および第６０／２３９，６５８号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
（実施例）
１ ｃＤＮＡ ライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡは、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリに由来するものであり、表４の列５に列記した。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジニウムイソチオシアネートの単相溶液であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムにおいて遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２４６】
ＲＮＡの純度を高めるため、ＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ＋） ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０２４７】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社へのＲＮＡ提供を行い、対応するｃＤＮＡライブラリをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製することもあった。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ５．１−６．６ユニット等を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ（３００〜１０００ｂｐ）選択は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、或いは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。ＣＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位でライゲーションされた。 好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＰＣＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、或いはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０２４８】
２ ｃＤＮＡ クローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例 １のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ及びＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの中から少なくとも１つを用いて、プラスミドを精製した。プラスミドは、沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２４９】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２５０】
３ シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、或いはその他の本技術分野でよく知られている配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ７．７ユニットに概説）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２５１】
ＩｎｃｙｔｅのｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ（Ａ）配列の除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。その際、ＢＬＡＳＴ、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。ＩｎｃｙｔｅのｃＤＮＡ配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ）及びＰＦＡＭ等隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対して問い合わせた（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照。）問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ及びＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築された。或いは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ及びＣｏｎｓｅｄに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡに基づくプログラムを用いてｃＤＮＡの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ及びＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベース、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【０２５２】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、引用文献、閾値パラメータを表７に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表５の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な引用文献であり、全ての文献はそっくりそのまま引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高ければ高いほど２配列間の相同性が高くなる）。
【０２５３】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列４に示した。
【０２５４】
４ ゲノム ＤＮＡ からのコード配列の同定及び編集
推定上のプロテアーゼは、公共のゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）においてＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは、様々な生物からゲノムＤＮＡ配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． 及び Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． 及び Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ （１９９８） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ推定ｃＤＮＡ配列の内、どの配列がプロテアーゼをコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをＰＦＡＭモデルにおいてプロテアーゼについて問合せて分析した。潜在的なプロテアーゼが、プロテアーゼとしてアノテーションが付けられたＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたＧｅｎｓｃａｎ予測配列は、次にＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｂｐｒｉ及びｇｂｈｔｇと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからヒットしたトップのＢＬＡＳＴと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなどのＧｅｎｓｃａｎにより予測された配列のエラーを修正する。ＢＬＡＳＴ分析はまた、任意のＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたはＧｅｎｓｃａｎ予測配列の公共ｃＤＮＡ適用範囲の発見に用いられるので、転写の証拠を提供する。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列及び／または公共のｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は編集または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に完全に由来する。
【０２５５】
５ ｃＤＮＡ 配列データを使ったゲノム配列データの構築
ステッチ配列（ Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ｃＤＮＡ配列は、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡは、ゲノムＤＮＡにマッピングし、関連するｃＤＮＡ及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたＧｅｎｓｃａｎエキソンを含むクラスタに分解した。ｃＤＮＡ及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライシング変異体を生み出した。区間全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移により等しいと考えられた。例えば、１つのｃＤＮＡ及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられる。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をｃＤＮＡ配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、ＢＬＡＳＴ分析により公共データベースｇｅｎｐｅｐｔ及びｇｂｐｒｉに翻訳されて比較された。Ｇｅｎｓｃａｎにより予測された不正確なエキソンは、ｇｅｎｐｅｐｔからヒットしたトップのＢＬＡＳＴと比較することにより修正した。必要な場合には、追加ｃＤＮＡ配列を用いるかゲノムＤＮＡの検査により配列を更に伸長させた。
【０２５６】
ストレッチ配列（ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ）
部分ＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体をＢＬＡＳＴ分析によりＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に関連して、キメラタンパク質内で挿入または削除が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０２５７】
６ ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を構築するために用いた配列を、ＢＬＡＳＴ及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続及び重複した配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている結果、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０２５８】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関連して測定する。（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）ｃＭ距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｐｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、上記した区間が既に同定されている疾患遺伝子マップ内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２５９】
この方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８は、３３．４〜４２．７センチモルガンの間隔内で染色体１６にマッピングされた。この方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は、２１９．２〜２２２．７センチモルガンの間隔内で染色体１にマッピングされた。
【０２６０】
７ ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出， ７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． 他、前出， ４章及び１６章を参照）。
【０２６１】
ＢＬＡＳＴに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬｉｆｅＳｅｑ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）等のヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の同一を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【数１】

積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の規準化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不適性塩基対に−４を割り当てることにより、ＢＬＡＳＴスコアを計算する。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアの塩基対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的重畳とＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％重畳しているか、他端が８８％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％重畳しているか、他端が７９％一致し、１００％重畳しているかのいずれかの場合に得られる。
【０２６２】
或いは、ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列（実施例３を参照）と少なくとも一部は重畳するように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、心血管系、結合組織、消化系、胚構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肺、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器官、皮膚、顎口腔系、分類不能／混合、または尿管などの１つの生物／組織のカテゴリーに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／病状カテゴリー即ち癌、細胞系、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、鬱血、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＰＲＴＳをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。ｃＤＮＡ配列およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０２６３】
８ ＰＲＴＳをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列もまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用いて、ｃＤＮＡから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【０２６４】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２６５】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液には、ＤＮＡ鋳型、各プライマー２００ｎｍｏｌと、Ｍｇ^２＋、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ 及びβ−メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が含まれていた。 プライマー対ＰＣＩ Ａ、ＰＣＩ Ｂに対して用いたパラメータは次の通りである。
ステップ１ ９４℃で３分間
ステップ２ ９４℃で１５秒間
ステップ３ ６０℃で１分間
ステップ４ ６８℃で２分間
ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６ ６８℃で５分間
ステップ７ ４℃で保存
別法では、プライマー対、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメータで増幅を行った。
ステップ１ ９４℃で３分間
ステップ２ ９４℃で１５秒間
ステップ３ ５７℃で１分間
ステップ４ ６８℃で２分間
ステップ５ ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６ ６８℃で５分間
ステップ７ ４℃で保存
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量するべくプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコート５〜１０μｌを１％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０２６６】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０２６７】
細胞を溶解し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲによってＤＮＡを増幅した。 その際用いたパラメータは次の通りである。
ステップ１ ９４℃で３分間
ステップ２ ９４℃で１５秒間
ステップ３ ６０℃で１分間
ステップ４ ７２℃で２分間
ステップ５ ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６ ７２℃で５分間
ステップ７ ４℃で保存
ＤＮＡは、上記のＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって定量した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０２６８】
同様に、上記手順を用いて完全長ヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて５’調節配列を得る。
【０２６９】
９ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−^３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて十分に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１またはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０２７０】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０２７１】
１０ マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基質は、均一且つ非多孔性の固体とするべきである（Ｓｃｈｅｎａ （１９９９） 前出）。推奨する基質には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似のアレイを利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基質の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、手作業で、または利用可能な方法や機械を用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１．を参照）。
【０２７２】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザ脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調整及び使用について、以下に詳述する。
【０２７３】
組織または細胞サンプルの準備
グアニジウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製する。各ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖合成バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用いて、２００ｎｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを含む２５ｍｌ容量で行う。特異的対照ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプルは、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いて精製する。混合後、２つの反応サンプルは、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム及び３００ｍｌの１００％エタノールを用いてエタノール析出させる。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて乾燥して仕上げ、１４μｌ ５×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０２７４】
マイクロアレイの準備
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートによりベクター含有細菌性細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製される。
【０２７５】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、処理中及び処理後に０．１％のＳＤＳ及びアセトン中で超音波処理をかけ、蒸留水で非常に良く洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、蒸留水中で非常に良く洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、１１０℃の天火で硬化させる。
米国特許第５，８０７，５２２号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。 平均濃度が１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを高速ロボット装置により開口キャピラリープリントエレメントに充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを加える。
【０２７６】
マイクロアレイには、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０．２％ＳＤＳで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０２７７】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応液は、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液にＣｙ３及びＣｙ５標識したｃＤＮＡ合成産物を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体を含めたものである。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ^２ のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡用スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００％に保持する。アレイを含むチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間各々３度洗浄して乾燥させる。
【０２７８】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ７０混合ガス１０Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、２０μｍの解像度でスキャンした。
【０２７９】
２つの異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
スキャンの感度は通常、既知濃度でサンプル混合体に添加されるｃＤＮＡ対照種により発生されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を重量比１：１００，０００でハイブリダイゼーション種と相関させる。異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、２つの蛍光色素で較正するｃＤＮＡのサンプルを標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０２８０】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データはまず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０２８１】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０２８２】
１１ 相補的ポリヌクレオチド
ＰＲＴＳをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のＰＲＴＳの発現を低下させるため即ち阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＲＴＳのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’ 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＰＲＴＳをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０２８３】
１２ ＰＲＴＳの発現
ＰＲＴＳの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＰＲＴＳが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＰＲＴＳを発現する。真核細胞でのＰＲＴＳの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＰＲＴＳをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強い多角体プロモーターによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．等を参照）。
【０２８４】
殆どの発現系では、ＰＲＴＳが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＰＲＴＳからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＰＲＴＳを直接用いて以下の実施例１６、１７、１８、および１９のアッセイを行うことができる。
【０２８５】
１３ 機能的アッセイ
ＰＲＴＳ機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＰＲＴＳをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。選択されるベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐＣＲ ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と９０°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒状性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及び蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ． （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記述がある。
【０２８６】
遺伝子発現におけるＰＲＴＳの影響は、ＰＲＴＳをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。 ｍＲＮＡは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。ＰＲＴＳ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２８７】
１４ ＰＲＴＳに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８１６−３０８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＰＲＴＳを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０２８８】
或いは、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いてＰＲＴＳアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５， １１章等を参照）。
【０２８９】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５ 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＰＲＴＳ活性を検査するには、ペプチドまたはＰＲＴＳを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２９０】
１５ 特異的抗体を用いる天然ＰＲＴＳの精製
天然ＰＲＴＳ或いは組換えＰＲＴＳを、ＰＲＴＳに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＰＲＴＳ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０２９１】
ＰＲＴＳを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＰＲＴＳを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＰＲＴＳとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＰＲＴＳを回収する。
【０２９２】
１６ ＰＲＴＳと相互作用する分子の同定
ＰＲＴＳまたは生物学的に活性なその断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ Ａ．Ｅ．及びＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９を参照）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＰＲＴＳと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＰＲＴＳ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＰＲＴＳ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＰＲＴＳの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０２９３】
別法では、ＰＲＴＳと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）やＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０２９４】
ＰＲＴＳはまた、高処理型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０２９５】
１７ ＰＲＴＳ活性の実証
プロテアーゼ活性は、さまざまな発色分子を抱合された好適な合成ペプチド基質の加水分解によって測定され、加水分解の程度は遊離された発色団の分光測光法（または蛍光測定法）によって定量化される（Ｂｅｙｎｏｎ， Ｒ．Ｊ． および Ｊ．Ｓ． Ｂｏｎｄ （１９９４） Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ２５−５５ページ）。ペプチドの基質はプロテアーゼ活性のカテゴリにしたがって設計される。このカテゴリーには、エンドペプチダーゼ（セリン、システイン、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ）、アミノペプチダーゼ（ロイシンアミノペプチダーゼ）、カルボキシペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ）が含まれる。一般に使われる色素原は、２−ナフチルアミン、４−ニトロアニリンおよびフリルアクリル酸である。アッセイは室温で行い、適切なバッファに一定量の酵素および適切な基質を入れる。反応は光学的キュベットで行い、ペプチド基質の加水分解時に遊離される色素原の吸光度の増加または減少を測定する。このアッセイでは、吸光度の変化は酵素活性に比例する。
【０２９６】
ユビキチン加水分解酵素活性のための代替アッセイは、ユビキチン前駆体の加水分解を測定する。アッセイは室温で実行され、適当なバッファ中に適切な基質及びＰＲＴＳのアリコットを含む。化学的に合成されたヒトユビキチン−バリンは基質として用いられ得る。基質よりのＣ−末端バリン残基の切断が、毛細管電気泳動でモニターされる（Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｋ．他（１９９７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４７ ： ３０５−３０９）。
【０２９７】
別法では、プロテアーゼ活性アッセイは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用する。 ＦＲＥＴは、一つのドナー蛍光色素及び一つのアクセプター蛍光色素が適切なスペクトルの重なりをもち、かつ近接している場合に発生する。ＰＲＴＳに特異的な切断部位を有するフレキシブルなペプチドリンカーは、緑色蛍光タンパク質の、赤色シフト変異体（ＲＳＧＦＰ４）及び青変異体の間で融合する。この融合タンパク質は、エネルギー移動がＢＦＰ５からＲＳＧＦＰ４へと起こっていることを示唆するスペクトル特性を有する。融合タンパク質がＰＲＴＳと共にインキューベートされる場合、基質が切断され二つの蛍光タンパク質が分離される。この分離は、エネルギー移動の顕著な減少を伴い、その減少はＰＲＴＳの添加前後における発行スペクトルを比較することによって定量化される（Ｍｉｔｒａ， Ｒ． Ｄ 他（１９９６） Ｇｅｎｅ １７３：１３−１７）。このアッセイは生細胞内でも行われ得る。このような場合は、蛍光基質タンパク質は細胞中で恒常的に発現され、またＰＲＴＳが誘導ベクターで誘導され、よってＰＲＴＳの存在及び不在の両条件下でＦＲＥＴがモニターされうる（Ｓａｇｏｔ， Ｉ 他 （１９９９） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４４７： ５３−５７）。
【０２９８】
１８ ＰＲＴＳ 基質の同定
ファージディスプレイライブラリは、ＰＲＴＳに対して最適の基質配列を同定するために使用され得る。後にリンカーと既知の抗体エピトープが付いているランダム六量体が、繊維状ファージライブラリの遺伝子ＩＩＩのＮ末端伸長としてクローンされる。遺伝子ＩＩＩはコートタンパク質をコードし、エピトープは各々のファージ粒子の表面に提示される。六量体がＰＲＴＳ分裂部位をコードすると、エピトープが除去されるようなタンパク質分解の条件下でライブラリをＰＲＴＳと共にインキュベートする。エピトープを認識する抗体を固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）したタンパク質Ａとともに加える。なお、エピトープを持つ未切断のファージは遠心分離によって除去する。次に、上澄み液中のファージを増幅し、さらに数回スクリーニングする。その後、個々のファージクローンを単離し、配列決定する。これらのペプチド基質の反応キネティックスは実施例１７のアッセイを用いて調べることができ、最適の切断配列が得られる（Ｋｅ， Ｓ．Ｈ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１６６０３−１６６０９）。
【０２９９】
ｉｎ ｖｉｖｏ のＰＲＴＳ 基質のスクリーニングをするには、この方法を拡大してファージ粒子（Ｔ７ＳＥＬＥＣＴ＃＃＃１０−３ファージディスプレイベクター 、 Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） または酵母細胞（ｐＹＤ１ 酵母ディスプレイベクターキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）の表面に提示されたｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングすることができる。この場合、全体のｃＤＮＡが遺伝子ＩＩＩと好適なエピトープの間に融合される。
【０３００】
１９ ＰＲＴＳインヒビターの同定
実施例１ ７のアッセイで説明したように、検査されるべき化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに注入する。ＰＲＴＳ活性はそれぞれのウェルについて測定し、ＰＲＴＳ活性を阻害するそれぞれの化合物の能力および容量反応キネティックスを決定することができる。ＰＲＴＳ活性を促進する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０３０１】
別の実施例においては、ペプチドＰＲＴＳインヒビターをスクリーニングするためにファージディスプレイライブラリが使われ得る。インヒビターの候補はプロテアーゼに強く結合しているペプチドの内に見つけられる。この場合は、マルチウエルのプレートをＰＲＴＳで被覆して、ランダムファージディスプレーライブラリか、またはサイクリックペプチドライブラリでインキュベートする（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ， Ｅ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７６８−７７４）。非結合ファージは洗い流され、選択されたファージを増幅し、さらに数回再スクリーニングを行う。実施例 １７に記述されたアッセイを使用して、ＰＲＴＳインヒビター活性に関してインヒビター候補を検査する。
【０３０２】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３０３】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３０４】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとそのＧｅｎＢａｎｋ相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３０５】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３０６】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３０７】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０３０８】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３０９】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【表２４】

【表２５】

【表２６】

【表２７】

Claims (88)

1. 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択した単離されたポリペプチド。
   （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７（配列番号１乃至１７）を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
   （ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
   （ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択した請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
3. 請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
4. 請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
5. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４（配列番号１８乃至３４）を有する群から選択した請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
6. 請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
7. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
8. 請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
9. 請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
   （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養するステップと、
   （ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを受容する過程とからなり、前記組換えポリヌクレオチドが、請求項１に記載の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有することを特徴とする方法。
10. 前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
12. 以下の（ａ）乃至（ｄ）を有する群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８−３４を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
    （ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
    （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物
13. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
14. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする方法と、プローブと標的ポリヌクレオチドあるいはその断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法
    （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する方法を含む。
15. 前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
    （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
17. 有効量の請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを有することを特徴とする成分。
18. 前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１７に記載の成分。
19. 機能的なＰＲＴＳの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１７の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
20. 請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
    （ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
21. 請求項２０に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。
22. 機能的なＰＲＴＳの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２１の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
23. 請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
    （ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出するステップとを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
24. 請求項２３に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする成分。
25. 機能的なＰＲＴＳの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２４の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
26. 請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、
    （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
27. 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に結合させる過程と、
    （ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
    （ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
28. 請求項５の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露するステップと、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの変異発現を検出する過程と、
    （ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
29. 試験化合物の毒性を算定する方法であって、
    （ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
    （ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むプローブをハイブリダイズさせるステップであって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドである、前記ステップと、
    （ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量するステップと、
    （ｄ）前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
30. 生物学的サンプル中のＰＲＴＳの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
    （ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項１２に記載の抗体と結合する過程と、
    （ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
31. 前記抗体が、
    （ａ）キメラ抗体
    （ｂ）単鎖抗体
    （ｃ）Ｆａｂ断片
    （ｄ）Ｆ（ａｂ’）_２断片
    （ｅ）ヒト化抗体 のいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
32. 請求項１２に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む化合物。
33. 被検者のＰＲＴＳの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
34. 前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２に記載の化合物。
35. 被検者のＰＲＴＳの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
36. 請求項１２に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
    （ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
    （ｃ）前記単離された抗体をポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
37. 請求項３６に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
38. 請求項３７に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
39. 請求項１２に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
    （ａ）抗体反応を誘発する条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列含むポリペプチドまたはその免疫原性断片を用いて動物を免疫化する過程と、
    （ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
    （ｃ）不死化の細胞を用いて前記抗体産出細胞を融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
    （ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
    （ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するような前記培養モノクローナル抗体から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
40. 請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
41. 請求項４０に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
42. Ｆａｂ発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
43. 組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
44. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する方法であって、
    （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１２に記載の抗体をインキュベートする過程と、
    （ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを示唆することを特徴とする方法。
45. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
    （ａ）前記抗体と前記ポリペプチドの特異結合を許容する条件下で、サンプルを用いて請求項１２に記載の抗体をインキュベートする過程と、
    （ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１７を有する群から選択したアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程を含むことを特徴とする方法。
    ４６． マイクロアレイの少なくとも１つが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマクロアレイ。
46. ポリヌクレオチドを含むサンプルの転写イメージを作製する方法であって、
    ａ） サンプルのポリヌクレオチドを標識する過程と、
    ｂ）ハイブリダイゼーション複合体形成に適した条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメントをサンプルの標識されたポリヌクレオチドと接触させる過程と、
    ｃ）サンプルのポリヌクレオチドの発現を定量化する過程を含むことを特徴とする方法。
47. 固体基質上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を含むアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドと特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドを特徴とするアレイ。
48. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
49. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
50. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
51. 請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
52. 請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
53. 請求項４８に記載のアレイで、リンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基質を連結していることを特徴とするアレイ。
54. 請求項４８に記載のアレイで、基質上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、基質上の固有の物理的位置の各々は、基質上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列とは異なる配列を有するヌクレオチド分子を含むことを特徴とするアレイ。
55. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
56. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
57. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
58. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
59. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
60. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
61. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
62. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
63. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
64. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
65. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
66. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
67. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
68. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
69. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
70. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
71. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
72. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
73. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
74. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
75. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
76. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
77. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
78. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
79. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
80. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
81. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
82. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
83. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
84. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
85. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
86. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
87. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
88. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。