JP2001523112A - ヒトプロホルモンコンバーターゼ4 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規なヒトプロホルモンコンバーターゼ4のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分子を提供する。ヒトプロホルモンコンバーターゼ4をコードするポリヌクレオチドは染色体(19)上に位置し、そして、例えば、ヒトの疾患の状態に関連するゲノムの領域を同定するために使用することができる。本発明は、また、タンパク質およびそれに対する抗体を製造する方法を包含する。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒトプロホルモンコンバーターゼ4
発明の背景
多数のタンパク質およびホルモンは、前駆体として合成され、プロホルモンコ
ンバーターゼのファミリーの高度に特異的なタンパク質分解酵素により、それら
の成熟された形態にプロセスされる。このファミリーの哺乳動物のエンドプロテ
アーゼは、それらの基質のポリペプチド内で二塩基部位のCOOH末端側において、
細胞内切断を実行する。このプロホルモンコンバーターゼ(PC)ファミリーの
メンバーは、酵母の二塩基特異的エンドプロテイナーゼKex2に関係するCa++依
存性セリンプロテアーゼである(Smeekins,S.P.,Bio/Technology 11:182-186,
1993)。そのうえ、それらの触媒ドメインは細菌のスブチリシンと同様に構築さ
れる。PC2、PC3/PC1、PC4、PC5/6フリン/PACEおよびヒトプロホルモンコンバー
ターゼ4を含めて、少なくとも6種の哺乳動物のプロホルモンコンバーターゼが
発見されている(Smeekins,S.P.,ibid.,Seidah.,N.G.et al.,Biochimie(F
rance)76:197-209,1994)。
哺乳動物のプロホルモンコンバーターゼは、広範な種類の多数の生物学的活性
を有する前駆体分子に対して作用する。プロインスリンプロホルモンは、同定さ
れた最初の基質前駆体である。引き続いて、150を超える基質が酵母から哺乳動
物までの生物において見出された;これらの基質は、ニューロペプチド、ペプチ
ドホルモン、成長因子およびそれらのレセプター、血漿および凝固タンパク質、
レトロウイルスのエンベロープタンパク質および細胞のトキシン、例えば、炭痘
を包含する。切断部位は塩基性アミノ酸を包含し、切
断は、通常Lys-ArgまたはArg-Argの後に、いっそう稀にArg-LysまたはLys-Lysの
後において、対合塩基性残基において起こる(Smeekins,S.P.,ibid.)。
プロホルモンコンバーターゼのファミリーは、組織特異的発現および細胞の局
在化(compart mentalization)を示し、これらは生物学的機能に関係づけること
ができる。例えば、PC1/3およびPC2はもっぱら神経内分泌組織において発現され
る。これらのタンパク質の生物学的活性は神経内分泌細胞、詳しくは分泌顆粒に
おける調節された分泌経路に局在化される;そして双方は顆粒、例えば、プログ
ルカゴン、プロピオメラノコルチン(POMC)およびプロインスリンにおける前駆
体のプロセシングにおいて重要な役割を演ずる。こうして、細胞内局在化および
組織特異性は、これらのエンドプロテアーゼの生物学的活性が発現される場合を
反映する。
PC4は遺伝子の発現の高度に特異的な組織選択性を示す。PC4はマウスおよびラ
ットから単離されており、そしてもっぱら精巣において発現される。マウスにお
いて、PC4遺伝子の発現は精子形成の第1段階に対応する妊娠の第20日付近に
おいて起こる。PC4 mRNAの高い発現レベルは胚細胞において見出されるが、レイ
ディッヒ(Leydig)細胞、セルトリ(Sertori)細胞、または特定の細胞において
見出されない。in situハイブリダイゼーションはmRNAの発現をパキテン精母細
胞(pachytene spermatocyte)および丸精子細胞(round spermatid)において示
すが、細長い精子細胞において示さない(N.G.Seida et al.,Mol.Endocrinol.6
:1559-1570,1992)。そのうえ、ラットおよびマウスの双方において、3つのPC4
mRNAが観察される;これらのRNAは多分分別的(differential)スプライスおよ
び/またはエクソンのスキップの事象から誘導される。この原理または別の方法
でスプライスされた形態から誘導されたネズミお
よびラットのPC4タンパク質の生物学的機能は未知である。
精子形成は精細管において起こる順次のプロセスであり、ここで胚(または精
子)細胞は究極的に雄性配偶子に成熟する。精巣内で生産されるペプチドは、睾
丸細胞間の相互作用を仲介する潜在的なパラクリンおよびオートクリン因子であ
る。これらの既知の潜在的ペプチド基質の大部分は、非胚細胞であるレイディッ
ヒ細胞およびセルトリ細胞内で生産される。セルトリ細胞は、精細管内に位置し
、胚細胞と接触し、胚細胞の成熟に影響を及ぼす、精巣特異的因子を生産する。
胚細胞に影響を及ぼす他の因子は、パラクリンまたはエンドクリン因子である;
これらの分子の多数は、精細管の外側で生産され、セルトリ細胞により発現され
る輸送および結合タンパク質により胚細胞の微小環境の中に輸送される。さらに
、パラクリン因子は、細胞のバリヤーを横切り、精子細胞の微小環境に入り、レ
イディッヒ細胞から分泌される分子を包含する。レイディッヒ細胞は精細管の間
に見出される間隙空間の中に位置し、そして成熟プロセスにおいて重要な役割を
演ずることができるいくつかの因子、例えば、テステステロン、レイディッヒ因
子、IGF-1、インヒビンおよびプロヒビンを産生する。これらの因子および他の
因子は、精子形成サイクルにおける定められた段階の間に特異的に作用すること
ができる。そのうえ、胚細胞において発現される、いくつかのペプチドホルモン
は、セルトリ細胞に密接に近接して位置し、睾丸細胞間の相互作用を仲介する潜
在的なパラクリンおよびオートクリン因子である。例えば、オピオイドペプチド
、POMCおよびプロエンケファリンは胚細胞において発現され、多分プロセスされ
る。興味深いことには、ネズミプロエンケファリンは精子形成の間にネズミPC4
に対して同様なmRNA発現プロフィルを有する(S.Torii,etal.,FEBS Let.316:1
2-16,1993)。ネズミPC4の段階特異的発現は、精巣
からのプロホルモン因子のプロセシングにおける生物学的役割と関係がある。精
子形成におけるPC4の役割は示唆されるが、PC4の機能は未知である。
したがって、ヒト相同体が探求されている。本発明は好都合にはネズミPC4に
対するヒト相同体の単離を提供する。
発明の要約
本発明は、下記のアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対し
て少なくとも90%同一であるアミノ酸残基の配列からなるヒトプロホルモンコ
ンバーターゼ4ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供す
る:(a)アミノ酸番号114(Ser)からアミノ酸番号443(Ala)までの配列番号
:2に示すアミノ酸配列;(b)アミノ酸番号114(Ser)からアミノ酸番号755
(Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列;(c)アミノ酸番号20(Arg)か
らアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列;および(d
)アミノ酸番号1(Met)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2に示す
アミノ酸配列。他の態様の範囲内で、前述の単離されたヒトプロホルモンコンバ
ーターゼ4ポリヌクレオチドは、(a)ヌクレオチド400からヌクレオチド1389
までの配列番号:1に示すアミノ酸配列;(b)ヌクレオチド400からヌクレオ
チド2325までの配列番号:1に示すアミノ酸配列;(c)ヌクレオチド118から
ヌクレオチド2325までの配列番号:1に示すアミノ酸配列;および(d)ヌクレ
オチド61からヌクレオチド2325までの配列番号:1に示すアミノ酸配列;から
成る群より選択される。他の態様の範囲内で、前述の単離されたヒトプロホルモ
ンコンバーターゼ4ポリヌクレオチドは、配列番号:3のヌクレオチド1〜ヌク
レオチド2265からなる。他の態様の範囲内で、単離さ
れたヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリヌクレオチドは、アミノ酸番号20(A
rg)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列に対し
て少なくとも90%同一であるアミノ酸残基の配列から本質的に成るヒトプロホ
ルモンコンバーターゼ4ポリペプチドをコードする。他の態様の範囲内で、単離
されたポリヌクレオチドは、アミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr)
までの配列番号:2に示すアミノ酸残基から本質的に成るヒトプロホルモンコン
バーターゼ4ポリペプチドをコードする。
第2の面の範囲内で、本発明は、下記の作用可能に連結された因子からなる発
現ベクターを提供する:転写プロモーター;アミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸
番号755(Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90
%同一であるプロホルモンコンバーターゼポリペプチドをコードするDNAセグメ
ント;および転写ターミネーター。他の態様の範囲内で、前述の発現ベクターは
DNAセグメントに作用可能に連鎖された分泌シグナル配列をさらに含む。
第3の面の範囲内で、本発明は、DNAセグメントによりコードされるポリペプ
チドを発現する、前述の発現ベクターが導入された培養細胞を提供する。
他の面の範囲内で、本発明は、融合タンパク質をコードするDNA構築物を提供
し、前記DNA構築物は下記のDNAセグメントからなる:第1DNAセグメント、ここ
で前記DNAセグメントは、(a)残基番号1(Met)〜残基番号21(Pro)の配列番号
:2のアミノ酸配列;(b)残基番号20(Arg)〜残基番号113(Arg)の配列番号
:2のアミノ酸配列;(c)残基番号114(Ser)〜残基番号443(Ala)の配列番
号:2のアミノ酸配列;(d)残基番号444(Arg)〜残基番号561(Tyr)の配列
番号:2のアミノ酸配列;(e)残基番号562(T
yr)〜残基番号755(Tyr)の配列番号:2のアミノ酸配列;(f)残基番号114
(Ser)〜残基番号755(Tyr)の配列番号:2のアミノ酸配列;(g)残基番号2
0(Arg)〜残基番号755(Tyr)の配列番号:2のアミノ酸配列から成る群より選択
されるアミノ酸残基に対して少なくとも90%であるポリペプチドをコードする
;並びに少なくとも1つの他のDNAセグメント、前記DNAセグメントは追加のポリ
ペプチドをコードし、ここで前記第1および他のDNAセグメントはインフレーム
で接続されており、そして前記融合タンパク質をコードする。他の態様の範囲内
で、本発明は、下記の工程からなる方法により製造された融合タンパクを提供す
る:下記の作用可能に連結された因子:(a)転写プロモーター;(b)前述の
融合タンパク質をコードするDNA構築物;および(c)転写ターミネーター;か
らなるベクターを導入された宿主細胞を培養し、そしてDNAセグメントによりコ
ードされる融合タンパク質を回収する。
他の面の範囲内で、本発明は、下記のアミノ酸配列から成る群より選択される
アミノ酸配列に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸残基の配列からなる
単離されたポリペプチドを提供する:(a)アミノ酸番号114(Ser)からアミノ
酸番号443(Ala)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列;(b)アミノ酸番号
114(Ser)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列
;(c)アミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2
に示すアミノ酸配列;および(d)アミノ酸番号1(Met)からアミノ酸番号755(
Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列。他の態様の範囲内で、前述の単
離されたポリベプチドはアミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr)まで
の配列番号:2に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一であるアミノ
酸残基の配列から本質的に成る。他の態様の範囲内で、前述の単離
されたポリペプチドはアミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr)までの
配列番号:2に示されている。
他の面の範囲内で、本発明は、下記の工程からなるヒトプロホルモンコンバー
ターゼ4ポリペプチドを製造する方法を提供する:前述の細胞を培養し、そして
前記細胞により生産されたヒトプロホルモンコンバーターゼポリペプチドを単
離する。
他の面の範囲内で、本発明は、下記の工程からなるヒトプロホルモンコンバー
ターゼ4ポリペプチドのポリペプチドプロホルモンの基質を決定する方法を提供
する:前述の発現ベクターが導入された細胞を培養し、ここで前記細胞はDNAセ
グメントによりコードされるヒトプロホルモンコンバーターゼポリペプチドを発
現しかつ被験基質のプロホルモンポリペプチドを共発現し、そしてヒトプロホル
モンコンバーターゼ4ポリペプチドによる被験基質の切断から生ずる切断産物を
検出する。他の態様の範囲内で、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチ
ドのポリペプチドプロホルモンの基質を決定する方法は、下記の工程からなる:
in vitroにおいて請求項11に記載のプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチ
ドを被験基質のプロホルモンポリペプチドと一緒にし、そしてヒトプロホルモン
コンバーターゼ4ポリペプチドによる被験基質の切断から生ずる切断産物を検出
する。
他の面の範囲内で、本発明は、下記の工程からなる被験試料中のヒトプロホル
モンコンバーターゼポリペプチド活性のモジュレーターの存在を検出する方法を
提供する:前述の発現ベクターが導入された細胞を培養し、ここで細胞はDNAセ
グメントによりコードされるヒトプロホルモンコンバーターゼポリペプチドを発
現しかつ、被験試料の存在および非存在において、既知のインジケーターのポリ
ペプチドプロホルモンの基質を共発現し、そして被験試料の存在および非存在に
おいて、ヒトプロホルモンコンバーターゼポリペプチドによる前記基質の切断か
ら生ずる切断産物のレベルを生物学的または生化学的アッセイにより比較し、そ
して被験試料中のヒトプロホルモンコンバーターゼ活性のモジュレーターの存在
を前記比較から検出する。
他の面の範囲内で、本発明は、下記の工程からなるヒトプロホルモンコンバー
ターゼ4ポリペプチドに対する抗体を生産する方法を提供する:動物にポリペプ
チドを接種し、ここで前記ポリペプチドは、(a)9〜755アミノ酸から成るポ
リペプチド、ここで前記ポリペプチドはアミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号7
55(Ser)までの配列番号:2中のアミノ酸の隣接配列に対して少なくとも90
%同一である;(b)前述のポリペプチド;(c)配列番号:2の残基番号444
(Arg)〜残基番号561(Tyr)に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配
列を有するポリペプチド;および(d)配列番号:2の残基番号562(Tyr)〜残
基番号755(Thr)に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド;から成る群より選択され、ここで前記ポリペプチドは動物において
免疫応答を引き出し、そして前記動物から抗体を単離する。他の態様の範囲内で
、前述の方法により製造された抗体はヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペ
プチドに結合する。他の態様の範囲内で、前述の抗体はモノクローナル抗体であ
る。
他の面の範囲内で、本発明は、前述のポリペプチドに特異的に結合する抗体を
提供する。
本発明のこれらの面および他の面は、本発明の下記の詳細な説明および添付図
面を参照すると当業者にとって明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明
図面は、ヒトPC1、ヒトPC2、ラットPC4、ネズミPC4、本発明の新規なヒトPC4
、ネズミフリン、およびヒトフリンの多重整列である。
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することはそれらの理解の助
けとなるであろう:
用語「親和性標識」は、第2ポリペプチドの精製または検出を提供するか、あ
るいは基質への第2ポリペプチドの結合部位を提供するすることができるポリペ
プチドのセグメントを表すために使用する。原理的には、抗体または他の適当な
結合因子が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質を親和性標識として使用
することができる。親和性標識は下記のものを包含する:ポリヒスチジントラク
ト、プロテインA(Nilsson et al.,EMBO J.4:1075,1985;Nilsson et al.,Me
thods Enzymol.198:3,1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(Smithおよ
びJohnson,Gene 67:31,1988)、Glu-Glu親和性標識(Grussenmeyer et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952-4,1985)、サブスタンスP,FlagTMペプチド(Hop
p et al.,Biotechnology 6:1204-1210,1988;Eastman Kodak Co.コネチカット
州ニューヘブンから入手可能である)、ストレプチアビジン結合ペプチド、また
は抗原性エピトープもしくは結合ドメイン。一般に、Ford et al.,Protein Exp
ression and Purification 2:95-107,1991、参照。親和性標識をコードするDNA
は、商用供給会社から入手可能である(例えば、Pharmacia Biotech、ニュージ
ャージイ州ピスカタウェイ)。
用語「アレル変異型」は、本明細書において、同一染色体遺伝子
座を占有する遺伝子の2またはそれ以上の代替形態の任意のものを表すために使
用される。アレルの変動は突然変異により天然に起こり、そして集団内に表現型
の多形性を生じさせることかある。遺伝子の突然変異はサイレント(コードされ
たポリペプチドの非変化)であるか、あるいは変更されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードすることができる。アレル変異型という用語はまた、本明
細書において遺伝子のアレル変異型によりコードされるタンパク質を表すために
使用される。
用語「アミノ末端」または「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリ
ペプチド内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語
は近接性または相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を
参照して使用される。例えば、ペプチド内で参照配列に対してカルボキシル末端
に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して辺接して位置
するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。
用語「切断産物」は、プロホルモンコンバーターゼによる非プロセスプロホル
モンポリペプチドの切断から生ずる、プロホルモンポリペプチドのフラグメント
を表すために使用される。
用語「相補体/抗相補体の対」は、適当な条件下に非共有結合的に会合した安
定な対を形成する、同一でない成分を表す。例えば、ビオチンおよびアビジン(
またはストレプチアビジン)は、相補体/抗相補体の対のプロトタイプのメンバ
ーである。他の典型的な相補体/抗相補体の対は、レセプター/リガンドの対、
抗体/抗原(またはハプテンまたはエピトープ)の対、センス/アンチセンスポ
リヌクレオチドの対、およびその他を包含する。相補体/抗相捕体の対の引き続
く解離を望む場合、相補体/抗相補体の対は好ましく
は<109M-1の結合アフィニティーを有する。
用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、相補的塩基配列を有しかつ参照配
列に比較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列3'AT
GCACGGG3'は5'CCCGTGCAT3'に対して相補的である。
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1またはそれ以上の縮重コドンを含むヌク
レオチド配列(ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して
)。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、一般に同一
アミノ酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACのトリプレットの各々はAs
pをコードする)。
「DNA構築物」は、天然に見出されない態様において結合しかつ並置されたDNA
のセグメントからなる、一本鎖または二本鎖の、線状または円形のDNA分子であ
る。DNA構築物は、ヒトの操作の結果として存在し、そして操作された分子のク
ローンおよび他のコピーを包含する。
「DNAセグメント」は、特定された属性を有する、より大きいDNA分子の一部分
である。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNAセグメントは、5’→3’
の方向に読んだとき、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする、より
大きいDNA分子の一部分、例えば、プラスミドまたはプラスミドのフラグメント
である。
用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に
連結された、注目のポリペプチドをコードするセグメントを含んでなる、線状ま
たは円形のDNA分子を表すために使用される。このような追加のセグメントは、
プロモーターおよびターミネーターの配列を包含し、そしてまた、1またはそれ
より多くの複製起点、1またはそれより多くの選択マーカー、エンハンサー、ポ
リアデニル化シグナル、およびその他を包含することができる。発現ベクターは
、一般に、プラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、あるいは双方の因
子を含有するすることができる。
用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチ
ドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして、遺伝子操作されたタンパク
質の産生系内で使用するために適当な形態であることを表す。このような単離さ
れた分子は、それらの自然の環境から分離されたものであり、そしてcDNAおよび
ゲノムのクローンを包含する。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常関
連する他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5’および3’の非翻訳領域、
例えば、プロモーターおよびターミネーター、並びにその他を包含することがで
きる。関連する領域の同定は、当業者にとって明らかであろう(例えば、Dynan
およびTijan,Nature 316:774-78,1985、参照)。
「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その自然環境、例えば、血
液および動物の組織、以外の条件において見出されるポリペプチドまたはタンパ
ク質である。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチ
ド、特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形
態、すなわち、95%より高い純度、より好ましくは99%より高い純度のポリ
ペプチドを提供することが好ましい。この関係において使用するとき、用語「単
離された」は別の物理的形態、例えば、二量体、あるいはグリコシル化または誘
導体化された形態の同一のポリペプチドの存在を排除しない。
用語「作用可能に連結された」は、DNAセグメントについて言及するとき、セ
グメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転
写がプロモーターにおいて開始し、コー
ディングセグメントを通してターミネーターに進行するように、セグメントが配
置されていることを示す。
用語「オーソログ」(ortholog)は、異なる種からのポリペプチドまたはタン
パク質の機能的対応物である、1つの種から得られたポリペプチドまたはタンパ
ク質を表す。オーソログの間の配列の差は種形成の結果である。
「パラログ」(paralog)は、生物により作られた、別個であるがしかし構造的
に関連するタンパク質である。パラログは遺伝子の複製(duplication)を通して
生ずると考えられる。例えは、α−グロビン、β−グロビン、およびミオグロビ
ンは互いにパラログである。
「ポリヌクレオチド」は、5’→3’末端の方向に読んだ、デオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。
ポリヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離されまたはin vitro
で合成されるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造するこ
とができる。ポリヌクレオチドは、塩基対(略号「bp」)、ヌクレオチド(「
nt」)、またはキロ塩基(「kb」)として表される。状況が許す場合、後者
の2つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを記載することがで
きる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、それは全体の長さを表すために
使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解されるであろう。当業者は認識
するように、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は長さが異なることがあり、そ
して酵素の切断の結果その末端は食い違うことがある;こうして、二本鎖ポリヌ
クレオチド内のすべてのヌクレオチドは対合していなことがある。このような不
対末端は、一般に20ntを超えない長さであろう。
「ポリペプチド」は、自然にまたは合成的に生産された、ペプチド結合により
結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基より小さいポリ
ペプチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。
用語「プロモーター」は、本明細書において、RNAポリメラーゼを結合しかつ
転写を開始するDNA配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野において認識
されている意味において使用される。プロモーター配列は普通に、しかし常にで
はないが、遺伝子の5’非コーディング領域の中に見出される。
「タンパク質」は、1またはそれ以上のポリペプチド鎖からなる高分子である
。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば、炭水化物の基を含むことができ
る。炭水化物および他の非ペプチドの置換基は、タンパク質が生産される細胞に
より、タンパク質に付加され、そして細胞の型とともに変化するであろう。タン
パク質は、本明細書において、それらのアミノ酸主鎖の構造により定義される;
置換基、例えば、炭水化物の基は一般に特定されないか、それにもかかわらず、
存在することができる。
用語「分泌シグナル配列」は、ポリペプチド(「分泌ペプチド」)をコードす
るDNA配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの1成分として、より大き
いポリペプチドが合成される細胞の分泌経路にそのポリペプチドを向ける。通常
、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌ペプ
チドが除去される。分泌シグナル配列はポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける
が、細胞から実際に分泌すべき配列を含有するポリペプチドをターゲットするか
、あるいはすることができないであろう。
用語「スプライス変異型」は、本明細書において、遺伝子から転写されたRNA
の別の形態を表すために使用される。スプライス変異
型は転写されたRNA分子内の、あるいはそれ程普通ではないが転写されたRNA分子
の間の、いずれか選択できるスプライス部位の使用により自然に発生し、そして
同一遺伝子から転写されたいくつかのmRNAを生ずることがある。スプライス変異
型は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる
。また、スプライス変異型という用語は、本明細書において、ある遺伝子から転
写されたmRNAのスプライス変異型によりコードされるタンパク質を表すためにも
使用される。
不正確な分析法(例えば、ゲル電気泳動)により決定されたポリマーの分子量
および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Xま
たは「ほぼ」Xとして表すとき、Xの記載する値は±10%の正確さであると理
解されるであろう。
本明細書において引用するすべての参考文献の教示は、それらの全体において
引用することによって本明細書の一部とされる。
本発明は、一部分、プロホルモンコンバーターゼのファミリー(例えば、ネズ
ミおよびラットのPC4、PC2、PC1、フリン)に対する相同性をもつタンパク質を
コードする新規なDNA配列の発見に基づく。このDNA配列はヒトプロホルモンコン
バーターゼ4(本明細書において「ヒトPC4」と略す)と表示された。この新規
なcDNAに対応するmRNAの組織の分布の分析は、mRNAの発現が精庫に制限されるこ
とを示した。このような組織特異的発現はプロホルモンコンバーターゼとしての
役割を示し、そしてこのプロホルモンコンバーターゼは、精巣特異的および非精
巣の細胞型の成熟形態または活性形態への成長因子または分化因子のプロホルモ
ンポリペプチドを完全にまたは部分的にプロセスする。
哺乳動物のプロホルモンコンバーターゼは共通の特徴を共有する。総説につい
ては、下記の文献を参照のこと:Smeekins,S.P.,ib
id.、およびSeidah,N.Methods in Enz.,244:175-188,1995。すべては、タン
パク質を分泌経路に向ける、N−末端の分泌ペプチドを含有する。この領域の後
にホモ−Aドメインが存在し、このドメインは同様にプロテアーゼのフォルディ
ングに関係する。自已触媒反応によるホモ−Aドメインの除去は、タンパク質分
解的活性化に必須である。ホモ−Aドメインの後に触媒ドメインが存在し、この
ドメインは活性のための必須である。触媒ドメインは、細菌のスブチリシン触媒
領域と最高のアミノ酸配列の同一性を有する。触媒ドメインに隣接して、ホモ−
Bドメインが存在し、このドメインもまた酵素活性のために必須である。この領
域を越えて、C末端において、プロホルモンコンバーターゼは構造的に多様であ
る。C末端領域の機能的役割は未知であるが、哺乳動物のプロホルモンコンバー
ターゼの細胞およびオルガネラ特異的ターゲッティングに関係するようである。
本発明は、新規なヒトプロホルモンコンバーターゼを提供する。プロホルモン
コンバーターゼ(配列番号:1)をコードするヒトcDNAの分析は、755アミノ酸
(配列番号:2)をコードするオープンリーディングフレームを明らかにし、こ
れは推定上の分泌ペプチド(配列番号:2参照:残基1(Met)〜残基19(Val))お
よび成熟ポリペプチド(配列番号:2参照:残基20(Arg)〜残基755(Thr))からな
る。図面に示すように、成熟ポリペプチドは、ラットおよびネズミPC4、ヒトフ
リン、ヒトPC1およびヒトPC2を含む、エンドプロテアーゼのKex2ファミリーの他
のメンバーとの相同性を有する。前述したように、このタンパク質ファミリーは
保存されたスブチリシン様触媒ドメイン(配列番号:2参照:残基114(Ser)〜
残基443(Ala))により特徴づけられ、この触媒ドメインはNH2末端およびCOOH末端
において保存程度の低い領域、すなわち、ホモAドメイン
(配列番号:2参照:残基20(Arg)〜残基113(Arg))およびホモBドメイン(配列番
号:2参照:残基444(Arg)〜残基561(Tyr))と呼ぶ領域により挟まれている(Na
kayama et al.,J.Biochem.(Tokyo),109:803-806,1991)。ラットおよびネズミ
PC4の中に存在する活性部位Asp、His、およびSer残基並びに触媒的に重要なAsn
残基はヒトPC4において保存される(配列番号:2参照:残基Asp-158、His-198、
Ser-372およびAsn-300)。シグナルペプチダーゼの切断部位は、ヒトプロホルモ
ンコンバーターゼ類の整列に基づいて、残基19(Val)後に存在することが予測さ
れる。すべての既知の哺乳動物プロホルモンコンバーターゼに見出される保存さ
れたArg-Gly-Asp配列(配列番号:2参照:残基番号503〜残基番号505)が、ヒトP
C4の中に存在する(Nakayama,ibid、およびその中の参考文献)。ヒトPC4は前駆体
酵素(チモーゲン)として合成されることが予測され、この前駆体酵素はArg-Ar
g-Val-Lys-Arg(配列番号:4;また、配列番号:2参照:残基番号109(Arg)〜
残基番号113(Arg))配列のC末端側において自己触媒的切断を行って活牲酵素を
生ずる。同様なチモーゲン活性化配列はKex2およびラットPC4について観察され
る(Nakayama et al.,J.Biochem.(Tokyo),109:803-806,1991)。ヒトPC4につい
てユニークなC末端ドメイン(配列番号:2参照:残基562(Tyr)〜残基755(Tyr
))は、フリンに対して最高の配列の同一性を有する。このドメインの機能は、細
胞およびオルガネラ特異的ターゲッティングに関係するであろう。
例えば、ヒトPC4のスブチリシン様触媒ドメインにおける、高度に保存された
アミノ酸は、ファミリーの新しいメンバーを同定するための道具として使用する
ことができる。例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を使用して、種
々の組織源または細胞系統から得られたRNAからの、保存されたスブチリシン様
触媒ドメイン
をコードする配列を増幅することができる。特に、ヒトPC4配列から設計された
、高度に縮重したプライマーは、この目的に有用である。
本発明は、また、DNAおよびRNA分子を包含する、ポリヌクレオチド分子を提供
する。当業者は容易に認識するように、遺伝暗号の縮重にかんがみて、これらの
ポリヌクレオチド分子の間で、かなりの配列の変動が可能である。配列番号:3
は、配列番号:2のヒトPC4ポリペプチドをコードする、すべてのDNAを包含する
縮重DNA配列である。当業者は認識するように、配列番号:3の縮重配列は、ま
た、TをUで置換することによって、配列番号:2をコードするすべてのDNA配
列を提供する。したがって、配列番号:3のヌクレオチド1〜ヌクレオチド2265
を含んでなる、ヒトPC4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびそれ
らのRNA同等物は本発明に包含される。縮重ヌクレオチドの位置を表すために配
列番号:3内で使用した1文字コードを表1に記載する。「レゾリューション」
は1個のコード文字により表される1又は複数のヌクレオチドである。「相補体
」は1またはそれ以上の相補的ヌクレオチドのコードである。例えば、コードY
はCまたはTを表し、そしてその相補体RはAまたはGを表し、AはTに対して
相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
所定のアミノ酸についてすべての可能なコドンを包含する、配列番号:3にお
いて使用する縮重コドンを、表2に記載する。
当業者は理解するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代
表する、縮重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セ
リン(WSN)縮重コドンは、ある環境において、アルギニン(AGR)をコードすること
ができ、そしてアルギニン(MGN)は、ある環境において、セリン(AGY)をコードす
ることができる。同様な関係はフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコ
ドンの間に存在する。したがって、縮重配列に包含される、いくつかのポリヌク
レオチドは変異型アミノ酸配列をコードすることができるが、当業者は、配列番
号:2のアミノ酸配列を参照することによって、このような変異型配列を容易に
同定することができる。変異型配列は、本明細書において記載するように、機能
性について容易に試験することができる。
また、当業者は理解するように、異なる種は「優先的コドンの使用」を示すこ
とができる。一般に、下記の文献を参照のこと:Grantham,et al.,Nucl.Acids
Res.8:1893-912,1980;Haas,et al.,Curr.Biol.6:315-24,1996;Wain-Hobs
on,et al.,Gene 13:355-64,1981;GrosjeanおよびFiers,Gene 18:199-209,1
982;Holm,Nucl.Acids Res.14:3075-87,1986;Ikemura,J.Mol.Biol.158:573-
97,1982。本発明において使用するとき、用語「優先的コドンの使用」または「
優先的コドン」は、ある種の種の細胞において最も頻繁に使用され、こうして各
アミノ酸をコードする可能なコドンの1つまたはわずかの代表的なものに好んで
使用される、タンパク質翻訳コドンを呼ぶ、この分野の用語である(表2参照)
。例えば、
アミノ酸のスレオニン(Thr)はACA、ACC、ACG、またはACTによりコードされるこ
とができるが、哺乳動物細胞において、ACCは最も普通に使用されるコドンであ
る;他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌において、異なるTh
rコドンが優先的であることができる。特定の種の優先的コドンを、この分野に
おいて知られている種々の技術により、本発明のポリヌクレオチドの中に導入す
ることができる。組換えDNAの中への優先的コドンの導入は、例えば、特定の細
胞の型または種内のタンパク質の翻訳を効率よくすることによって、タンパク質
の産生を増強することができる。したがって、配列番号:3に記載されている縮
重コドンの配列は、この分野において普通に使用されかつ本明細書において開示
する、種々の細胞の型および種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するた
めの鋳型として働く。優先的コドンを、本明細書において開示するように、種々
の種における発現について試験し、発現のために最適化し、そして機能性につい
て試験することができる。
本発明の好ましい態様の範囲内において、単離されたポリヌクレオチドは、ス
トリンジェント条件下に、配列番号:1、またはそれに対して相補的な配列の同
様な大きさの領域にハイブリダイズするであろう。一般に、ストリンジェント条
件は、規定されたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の融点(Tm)よ
りも約5℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50%が完全に合致する
プローブにハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度およびpHにおいて
)である。典型的にはストリンジェント条件は、NaCl濃度がpH7において約0.03M
までであり、かつ温度が少なくとも約60℃である条件である。
前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAおよびRNAを包含
する。DNAおよびRNAを製造する方法は、この分野
においてよく知られている。一般に、RNAは大量のヒトPC4RNAを産生する組織ま
たは細胞から単離される。このような組織および細胞はノザンブロッティングに
より同定され(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201,1980)、そして精巣
組織、および組織由来細胞系統を包含する。全体のRNAは、グアニジンHCl抽出お
よび引き続くCsCl勾配における遠心による単離により製造することができる(Ch
irgwin et al.,Biochemistry 18:52-94,1979)。ポリ(A)+RNAは、Avivおよ
びLeder,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:1408-12,1972)の方法に従い、全体のRN
Aから製造される。相補的DNA(cDNA)は、既知の方法により、ポリ(A)+RNAから
製造される。別法において、ゲノムDNAを単離することができる。次いで、ヒトP
C4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、ハイブリダイゼーシ
ョンまたはPCRにより、同定および単離する。
ヒトPC4をコードする全長のクローンを、慣用のクローニング手順により、得
ることができる。相補的DNA(cDNA)が好ましいが、ある用途(例えば、トランス
ジェニック動物における発現)のために、ゲノムのクローンを使用するか、ある
いは少なくとも1つのゲノムのイントロンを含むようにcDNAクローンを修飾する
ことが好ましいことがある。cDNAおよびゲノムのクローンを製造する方法はよく
知られておりかつ当業者のレベルの範囲内であり、そして、ライブラリーのプロ
ービングまたはプライミングのための、本明細書において開示する配列およびそ
の一部分の使用を包含する。本発明は、また、ヒトプロホルモンコンバーターゼ
4をコードするヒトゲノム配列の単離を提供する。配列番号:1から誘導される
プローブは、この分野において知られておりかつ本明細書において開示する標準
的手順に従い、ヒト源からゲノムのライブラリーをスクリーニングして、ヒトゲ
ノム配列をクローニングするために使用することがで
きる。
当業者は認識するように、配列番号:1に記載する配列はヒトPC4の単一のア
レルを表し、そしてアレル変異型およびいずれか1つ選択されたスプライシング
が起こることが期待される。この配列のアレル変異型は、標準的手順に従い、異
なる個体からcDNAまたはゲノムのライブラリーをプロービングすることによって
、クローニングすることができる。配列番号:1に示すDNA配列のアレル変異型
は、サイレント突然変異体を含有するものおよび突然変異がアミノ酸配列を変化
させるものを包含し、配列番号:2のアレル変異型であるタンパク質と同様に、
本発明の範囲内に入る。本発明はまた、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4の遺
伝子発現の結男として、天然に存在することができる単離されたポリヌクレオチ
トのmRNAスプライス変異型を提供する。交互にスプライスされたmRNAから発生す
るcDNAは、ヒトPC4ポリペプチドの性質を保持し、このようなcDNAおよびmRNAを
コードするポリペプチドと同様に、本発明の範囲内に入る。この配列のスプライ
ス変異型は、標準的手順に従い、ヒトcDNAライブラリー、例えば、ヒト睾丸cDNA
ライブラリーをプロービングすることによって、クローニングすることができる
。
本発明は、また、配列番号:2のポリペプチドおよびそれらのオーソログに対
して実質的に相同的である、単離されたヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリ
ペプチドを提供する。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは、他の
ポリペプチド、特に動物由来の他のポリペプチド、を実質的に含まない。高度に
精製された形態、すなわち、95%より高い純度、より好ましくは99%より高
い純度のポリペプチドを提供することは好ましい。用語「実質的に相同的」は、
本明細書において、配列番号:2に示す配列または配列番号:2のスプライス変
異型に対して少なくとも85%の配列の
同一性を有するポリペプチドを表すために使用される。このようなポリペプチド
は配列番号:2に示す配列または配列番号:2のスプライス変異型に対してより
好ましくは少なくとも90%同一、最も好ましくは95%またはそれ以上同一で
ある。配列の同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を
参照のこと:Altschul et al.,Bull.Math.Bio.48:603-616,1986、並びにHenik
offおよびHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919,1992。簡単に述
べると、表3(アミノ酸は標準的1文字コードにより示されている)に示すよう
に10のギャップオープニングペナルティー、1のギャップエクステンションペ
ナルティー、およびHenikoffおよびHenikoff(ibid.)の「ブロサム62」スコア
リングマトリックスを使用して、2つのアミノ酸配列を整列させで整列スコアを
最適化する。
最適な整列の同一百分率は、次のようにして計算される:
ポリヌクレオチド分子の配列の同一性は、前述した比を使用する同様な方法に
より、決定される。
変異型ヒトPC4ポリペプチドまたは実質的に相同なヒトプロホルモンコンバー
ターゼ4ポリペプチドは、1またはそれより多くのアミノ酸の置換、欠失または
付加を有するとして特徴付けられる。これらの変化は好ましくは小さい特質を有
する、すなわち、保存的アミノ酸置換(表4参照)およびポリペプチドのフォル
ディングまたは活性に影響を実質的に与えない他の置換;小さい欠失、典型的に
は1〜約30アミノ酸の欠失;および小さいアミノ末端およびカルボキシル末端
の延長、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、約2〜25残基までの小さいリ
ンカーペプチド、または親和性標識、例えば、精製を促進する小さい延長、例え
ば、ポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープまたは結合ドメインを有する。
一般に、下記の文献を参照のこと:Ford et al.,Proteln Expression and Puri
fication 2:95-107,1991。親和性標識を含むポリペプチドは、ヒトPC4ポリ
ペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解切断部位をさらに含むことができ
る。このような切断部位は、例えば、トロンビン切断部位および因子Xa切断部
位を包含する。 本発明のタンパク質は、また、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことがで
きる。天然に存在しないアミノ酸は、限定されずに、下記のものを包含する:ト
ランス−3−メチルプロリン、2,4−メタノプロリン、シス−4−ヒドロキシ
プロリン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−ス
レオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチル
ホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン
酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−および4−メチルプロリ
ン、3,3−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、2−アザフェニ
ルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニン、および4
−フルオロフェニルアラニン。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中
に組込む方法はこの分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル
化されたサプレッサーtRNAを使用してナンセンス突然変異を抑制する、in vitro
系を使用することができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法
はこの分野において知られている。大腸菌(E.coli)S30抽出物および商業的に
入手可能な酵素および他の試薬からなる、無細胞系において、ナンセンス突然変
異を含有するプラスミドの転写および翻訳は実施される。タンパク質をクロマト
グラフィーにより精製する。例えば、下記の文献を参照のこと:Robertson et a
l.,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991;Ellman et al.,Methods Enzymol.202:301
,1991;Chung et al.,Science 259:806-9,1993;およびChung et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。第2の方法において、突然変異されたmRN
Aおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェク
ションにより、キセノプス・オオサイト(Xenopus oocytes)中で翻訳を実施する
(Turcatti et al.,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。第3の方法において、
置換すべき天然のアミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の非存在においてかつ
所望の天然に存在しない1またはそれより多くのアミノ酸(例えば、2−アザフ
ェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニンまたは
4−フルオロフェニルアラニン)の存在下で、大腸菌(E.coli)細胞を培養する
。天然に存在しないアミノ酸をその天然の対応物の代わりにタンパク質の中に組
込まれる。Koide et al.,Biochem.33:747
0-6,1994、参照。in vitro化学的修飾により、天然に存在するアミノ酸残基を
天然に存在しない種に変換することができる。化学的修飾を部位特異的突然変異
誘発と組合わせて、置換の範囲をさらに拡張することができる(WynnおよびRicha
rds,Protein Sci.2:395-403,1993)。
制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、
天然に存在しないアミノ酸、非天然のアミノ酸をヒトPC4アミノ酸残基と置換す
ることができる。
本発明の必須アミノ酸は、この分野において知られている手順、例えば、部位
特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することができ
る(CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085,1989;Bass et al.,Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 88:4498-502,1991)。後者の技術において、単一のアラニ
ンの突然変異を分子中のすべての残基において導入し、そして、後述するように
、生ずる突然変異体分子を生物学的活性について試験して、分子の活性に対して
決定的であるアミノ酸残基を同定する。また、Hilton et al.,J.Biol.Chem.271
:4699-708,1996。また、核磁気共鳴、結晶学、電子回折またはフォトアフィニ
ティーラベリングのような技術と、推定上の接触部位のアミノ酸の突然変異との
組合わせにより決定した、構造の物理的分析により、1またはそれ以上のその基
質との相互作用のために重要なヒトPC4の触媒ドメインの部位を決定することが
できる。例えば、下記の文献を参照のこと:de Vos et al.,Science 255:306-1
2,1992;Smith et al.,J.Mol.Biol.224:899-904,1992;Wlodaver et al.,FEBS
Lett.309:59-64,1992。また、当業者は、関連するプロホルモンコンバーター
ゼとの相同性の分析から必須アミノ酸の同定を推定することができる。
既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記
の文献に記載されている方法により、多数のアミノ酸の置換を行い、試験するこ
とができる:Reidhaar-OlsonおよびSauer,Science 241:53-57,1988;およびBow
ieおよびSauer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156,1989。簡単に述べる
と、これらの著者らは、ポリペプチド中の2またはそれ以上の位置を同時にラン
ダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異したポリペプチ
ドを配列決定して、各位置において許容可能な置換のスペクトルを決定する方法
を開示している。使用できる他の方法は、ファージディスプレイ(例えば、Lowm
an et al.,Biochem.30:10832-10837,1991;Ladner et al.,米国特許第5,223,40
9号;Huse、WIPO公開WO92/06204号)および領域特異的突然変異誘発(Derbyshir
e et al.,Gene 46:145,1986;Ner et al.,DNA 7:127,1988)を包含する。
開示されたヒトPC4DNAおよびポリペプチド配列の変異型は、下記の文献に開示
されているように、DNAシャフリングにより発生させることができる:Stemmer,
Nature 370:389-91,1994;Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-51,199
4;およびWIPO公開WO97/20078号。簡単に述べると、親DNAのランダムフラグメン
ト化によるin vitro相同性組換えおよび引き続くPCRを使用するリアセンブリー
によって、ランダムに導入された点突然変異を生成することによって、変異型DN
Aは発生される。1ファミリーの親DNA、例えば、異なる種からのアレル変異型ま
たはDNAを使用して、追加の変動性をこの方法に導入することによって、この技
術を変更することができる。所望の活性についての選択またはスクリーニング、
および引き続く突然変異誘発の追加の反復およびアッセイは、所望の突然変異体
について選択および同時の有害な変化に対する選択により、配列の急速な「進化
」を提供する。
本明細書において開示するような突然変異誘発法を、高い処理量
の、自動化されたスクリーニング法と組合わせて、宿主細胞におけるクローニン
グされた、突然変異化されたポリペプチドの活性を検出することができる。活性
ポリペプチド(例えば、既知のインジケーターのポリペプチド基質を切断する)
をコードする突然変異化されたDNA分子を宿主細胞から回収し、そして現代的装
置により急速に配列決定することができる。これらの方法は問題のポリペプチド
中の個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能とし、そして未知の構造の
ポリペプチドに適用することができる。そのうえ、これらの突然変異誘発法を使
用して、反応速動態を異にするタンパク質を操作し、基質特異性を圧縮または拡
張し、あるいはポリペプチド、例えば、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4の組
織および細胞の局在化を変更することができる。
前述の方法を使用して、配列番号:2の残基1〜755またはそれらのアレル変
異型またはスプライス変異型に対して実質的に相同性でありかつ野生型タンパク
質の活性を保持する、種々のポリペプチドを製造することができる。
そのうえ、この分野において記載されている方法を使用して、本発明のヒトプ
ロホルモンコンバーターゼ4の領域またはドメインを、他の既知または未知のプ
ロホルモンコンバーターゼのタンパク質(例えば、PC2およびPC1)、または不均質
タンパク質のそれらと組合わせて使用して、ポリペプチドの融合物、またはハイ
ブリッドのプロホルモンコンバーターゼのタンパク質を構築する(Sambrook et
al.,前掲;Altschul et al.,前掲;Picard,D.,Cur.Opin.Biology 5:511-515,
1994、およびその中の文献)。これらの方法は、注目のポリペプチド中のより大
きいドメインまたは領域の生物学的重要性の決定を可能とする。このようなハイ
ブリッドは、反応動態を異にするタンパク質を変更し、基質特異性を圧縮または
拡張し、あ
るいはポリペプチドの組織および細胞の局在化を変更し、そして未知の構造のポ
リペプチドに適用することができる。
融合タンパク質はこの分野において知られている方法により製造することがで
きる。適切なリーディングフレームで融合タンパク質の各成分をコードするポリ
ヌクレオチドを既知の技術で発生させ、本明細書に記載する方法により発現させ
ることができる。例えば、生物学的機能を付与するドメインの一部分またはすべ
てを、本発明のヒトPC4と他のプロホルモンコンバーターゼ、例えば、PC2または
PC1からの対応するドメインとの間で交換することができる。このようなドメイ
ンは、本明細書に記載する分子の分泌シグナル配列、ホモ−Aドメイン、触媒ド
メイン、ホモ−Bドメイン、およびC末端部分を含んでなるが、これらに限定さ
れない。ポリヌクレオチドのセグメントを適切なリーディングフレームで結合し
、融合タンパク質のいくつかのドメインをコードするDNAポリセグメントをつく
ることによって、この融合において、1つまたはいくつかのドメイン、例えば、
前述のドメインを交換することができる。このような融合タンパク質を作る方法
はこの分野においてよく知られている(Sambrook et al.,前掲;Altschul et al
.,前掲;Picard,D.,前掲)。このような融合タンパク質はヒトPC4からの少な
くとも1つのドメインを含有し、そして構築された融合物に依存して、本発明の
ポリペプチドまたは他の既知または未知のプロホルモンコンバーターゼのタンパ
ク質(例えば、PC2またはPC1)と同一であるかあるいは類似する、生物学的機能の
プロフィルを有することが期待されるであろう。そのうえ、このような融合タン
パク質は前述したように他の性質を示すことができる。
変異型および融合タンパク質を包含する、任意のヒトPC4ポリペプチドについ
て、当業者は本明細書に開示する情報および上記表1
および表2に記載する情報を使用して、その変異型をコードする、完全に縮重す
るポリヌクレオチド配列を容易に発生させることができる。
全長のポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、および融合ポリペプチ
ドを含む、本発明のポリペプチドを、慣用の技術に従い、遺伝子操作された宿主
細胞において製造することができる。適当な宿主細胞は、外因的DNAで形質転換
またはトランスフェクトすることができ、培養により増殖させることができる細
胞の型であり、そして細菌、真菌細胞、および培養された高等真核細胞を包含す
る。真核細胞、特に多細胞の微生物の培養された細胞は好ましい。クローニング
されたDNA分子を操作し、外因的DNAを種々の宿主細胞の中に導入する技術は、下
記の文献に記載されている:Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laborator
y Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbo
r,NY,1989、およびAusubel et al.編,Current Protocols in Molecular Biol
ogy,John Wiley and Sons,Inc.,NY,1987。
一般に、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペブチドをコードするDNA配
列は、発現ベクター内で一般に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、
その発現のための必要な他の遺伝因子に、作用可能に連結される。ベクターはま
た、1もしくはそれより多くの選択可能なマーカーおよび1もしくはそれより多
くの複製起点を普通に含有するが、当業者は認識するように、ある種の系内で選
択マーカーを別々のベクター上に提供し、そして宿主細胞のゲノムの中への組込
みにより外因的DNAの複製を設けることかできる。プロモーター、ターミネータ
ー、選択可能なマーカー、ベクターおよび他の因子の選択は、当業者のレベル内
の日常的設計事項である。多数のこのような因子は文献に記載されており、そし
て商業的供給
会社から入手可能である。
ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向け
るために、分泌シグナル配列(また、リーダー配列、プレプロ配列または前配列
として知られている)を発現ベクターの中に準備する。分泌シグナル配列はヒト
プロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドのそれであることができるか、ある
いは分泌経路(例えば、t-PA)に向けられる他のタンパク質から誘導するか、あ
るいは新規に合成することができる。分泌シグナル配列をヒトプロホルモンコン
バーターゼ4DNA配列に正しいリーディングフレームで結合し、新しく合成された
ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるように位置させる。分泌シグナル配
列は普通に注目のポリペプチドをコードするDNA配列に対して5’に配置される
が、ある種の分泌シグナル配列は問題のDNA配列の中のどこかに位置決定するこ
とができる(例えば、Welch et al.,米国特許第5,037,743号;Holland et al.
,米国特許第5,143,830号、参照)。
また、本発明のポリペプチドの中に含有される分泌シグナル配列を使用して、
他のポリペプチドを分泌経路に向けることができる。本発明は、このような融合
ポリペプチドを提供する。配列番号:2のアミノ酸残基1(Met)〜残基19(Val)
をコードする分泌シグナル配列が他のポリペプチドをコードするDNAセグメント
に作用可能に連結された、シグナル融合ポリペプチドを、この分野において知ら
れておりかつ本明細書に開示されている方法により作ることができる。好ましく
は、本発明の得られる融合ポリペプチドの中に含有される分泌ペプチドを追加の
ペプチドにアミノ末端において融合させて、追加のペプチドを分泌経路に向ける
。このような構築物はこの分野において知られている多数の用途を有する。例え
ば、これらの新規な分泌シグナル配列の融合構築物は、例えば、常態で完全に分
泌されないタンパク質の活性成分、例えば、細胞表面のレセプター、または他の
非分泌タンパク質の分泌を指令することができる。このような機能をin vivoま
たはin vitroにおいて使用して、ペプチドを分泌経路を通して向けることができ
る。
培養された哺乳動物細胞は、本発明において適当な宿主である。外因的DNAを
哺乳動物の宿主細胞の中に導入する方法目下記の方法を包含する:リン酸カルシ
ウム仲介トランスフェクション(Wigler et al.,Cell 14:725,1978;Corsaroお
よびPearson,Somatic Cell Genetics 7:603,1981;GrahamおよびVan der Eb,V
irology 52:456,1973)、エレクトロポレーション(Neumann et al.,EMBO J.1:
841-845,1982)、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクション(Ausubel et a
l.,ibid.)、およびリポソーム仲介トランスフェクション(Hawley-Nelson et al
.,Focus 15:73,1993;Ciccarone et al.,Focus 15:80,1993)、並びにウイル
スベクター(MillerおよびRosman,BioTechniques 7:980-90,1989;WangおよびF
iner,Nature Med.2:714-6,1996)。培養された哺乳動物細胞中の組換えポリ
ペプチドの産生は、例えば、下記の文献に記載されている:Levinson et al.,米
国特許第4,713,339号;Hagen et al.,米国特許第4,784,950号;Palmiter et al
.,米国特許第4,579,821号;並びにRingold,米国特許第4,656,134号。適当な培養
された哺乳動物細胞は下記のものを包含する:COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7
(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK570(ATCC No.CRL10314)、293
(ATCC No.CRL 1573;Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59-72,1977)およびチャイ
ニーズハムスター卵巣(例えば、CHO-K1;ATCC No.CRL 61)細胞系統。他の好まし
い細胞系統は培養された睾丸細胞、例えば、イルカDB1睾丸細胞(CRL-6258);
マウスGC-lspg細胞(CRL-2053);TM3細胞(CRL-1714);TM4細胞(CRL-1715);
およびブタST細胞(CRL-1746)であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(American Type Culture Collection)米国マリイランド州ロックビ
レ)から入手可能である。追加の適当な細胞系統はこの分野において知られてお
り、そして公衆の寄託機関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから入手可能である。一般に、強い転写プロモーター、例えば、SV-40ま
たはサイトメガロウイルスからのプロモーターは好ましい。例えば、米国特許第
4,956,288号参照。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からプ
ロモーター(米国特許第4,579,821号および米国特許第4,601,978号)およびアデ
ノウイルスの主要な後期プロモーターを包含する。
薬剤選択を一般に使用して、外来DNAが挿入された、培養された哺乳動物細胞
について選択する。このような細胞は普通に「トランスフェクタント」と呼ばれ
る。選択因子の存在において培養され、注目の遺伝子をそれらの子孫に伝えるこ
とができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。好ましい選択
マーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。
選択はネオマイシン型薬剤、例えば、G-418またはその他の存在下で実施される
。また、選択系を使用して、問題の遺伝了の発現レベルを増加することができる
、「増幅」と呼ぶ方法。低いレベルの選択因子の存在においてトランスフェクタ
ントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入された遺伝子の産物を高い
レベルで産生する細胞について選択することによって、増幅は実施される。好ま
しい増幅可能な選択マーカーは、メトトレキセート耐性を付与する、ジヒドロフ
ォレートリダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐
性、多薬剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ)を使用することも
できる。変更された表現型
、例えば、緑色蛍光タンパク質、または細胞表面のタンパク質、例えば、CD4、C
D8、クラスIのMHC、胎盤アルカリ性ホスファターゼを導入するオールタネイテ
ィブマーカーを使用して、FACSソーティングまたは磁気ビーズ分離技術のような
手段により、非形質転換細胞からトランスフェクテッド細胞を選別することがで
きる。
植物細胞、昆虫細胞およびトリを包含する、他の高等真核細胞を宿主細胞とし
て使用することもできる。植物細胞中で迫伝子を発現するのためのベクターとし
てアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenesを使用すること
は、Sinkar et al.,J.Biosci.(Bangalore)11:47-58,1987、において総説され
ている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの産生は、Guarin
o et al.,米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO94/06463号に記載されてい
る。オートグラファト・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病
ウイルス(AcNPV)から普通にから誘導される組換えバキュロウイルスで、昆虫細
胞を感染させることができる。下記の文献を参照のこと:King,L.A.およびPoss
ee,R.D.The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide,London,Ch
apman & Hall,O'Reilly,D.R.et al.,Baculovirus Expression Vectors:A Lab
oratory Manual,New York,Oxford University Press,1994;並びにRichardson
,C.D.編、Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology
,Totowa,NJ,Humana Press,1995。組換えヒトPC4バキュロウイルスを作る第
2の方法は、Luckowが記載するトランスポゾンをベースとする系を利用する(Lu
ckow,V.A.,et al.,J.Virol.67:4566-79,1993)。この系は、転移ベクターを
利用し、Bac-to-BacTMキット(Life Technologies、マリイランド州ロックビレ
)で販売されている。下記の文献を参照のこと:Hill-Perkins,M.S.およびPoss
ee,R.D.,J.Gen.Virol.
71:971-6,1990;Bonning,B.C.,et al.,J.Gen.Virol.75:1551-6,1994;並びに
、Chazenbalk,G.D.,およびRapoport,B.,J.Biol.Chem.270:1543-9,1995。さ
らに、転移ベクターは、発現されたヒトPC4ポリペプチドのC末端またはN末端
におけるエピトープ標識、例えば、Glu-Gluエピトープ標識をコードするDNAとの
インフレーム融合物を含むことができる(Grussenmeyer,T.,et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.82:7952-4,1985)。この分野において知られている技術を使用して
、ヒトPC4を含有する転移ベクターを大腸菌(E.coli)の中に形質転換し、そし
て組換えバキュロウイルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミド(bac
mids)についてスクリーニングする。組換えバキュロウイルスのゲノムを含有す
るバクミドDNAを普通の技術に従い単離し、そしてスポドプテラ・フルギペルダ(
Spodoptera frugiperda)細胞、例えば、Sf9細胞をトランスフェクトする。ヒトP
C4を発現する組換えベクターを引き続いて生成させる。この分野において普通に
使用されている方法により、組換えウイルスのストックを作る。
宿主細胞、典型的にはヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fr
ugiperda)から誘導された細胞系統を感染するために、組換えウイルスを使用す
る。一般に、下記の文献を参照のこと:GlickおよびPasternak,Molecular Biot
echnology:Pr1nciple and Applications of Recombinant DNA,ASM Press,Wash
ington,D.C.,1994。他の適当な細胞系統は、トリコデルマ・ニ(Trichoderma
ni)から誘導されたHigh FiveOTM細胞系統(Invitrogen)である(米国特許第5,
300,435号)。商業的に入手可能な無血清培地を使用して、細胞を増殖しかつ維
持する。適当な培地はSf9細胞についてSf900 IITM(Life Technologies)またはES
F 921TM(Expression System);およびトリコデルマ・ニ(T.ni)細胞について
Ex-c1104
50TM(JRH Bioscience、カンサス州レネクサ)またはExpress FiveOTM(Life Te
chnologies)である。細胞をほぼ2〜5×105細胞の接種密度から1〜2×1
06細胞の密度に増殖させ、この時組換えウイルスのストックを0.1〜10、より典
型的には約3の感染の多重度で添加する。使用する手順は一般に入手可能な実験
室のマニュアルに記載されている(King,L.A.およびPossee,R.D.,ibid.;O'Rei
lly,D.R.,et al.,ibid.;Richardson,C.D.,ibid.)。本明細書に記載する方
法に従い、上清からのヒトPC4ポリペプチドの引き続く精製を実施する。酵母細
胞を包含する真菌細胞を本発明において使用することもできる。これに関して特
に問題の酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびピキア・メタノリカ(Pichia m
etanolica)を包含する。外因的DNAでサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisia
e)を形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産する方法は、例えば、下
記の特許文献に記載されている:Kawasaki,米国特許第4,599,311号;Kawasaki
et al.,米国特許第4,931,373号;Brake,米国特許第4,870,008号;Welch et al.
,米国特許第5,037,743号;およびMurry et al.,米国特許第4,845,075号。選択
マーカーにより決定された表現型、普通の薬剤耐性または特定の栄養(例えば、
ロイシン)の非存在において増殖する能力により、形質転換された細胞を選択す
る。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において使用す
るために好ましいベクター系は、Kawasaki et al.(米国特許第4,931,373号)
により開示されているPOT1ベクター系であり、これは形質転換された細胞をグル
コース含有培地中の増殖による選択を可能とする。酵母において使用するために
適当なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子(例えば、Kawasa
ki、米国特許第4,599,311号;
Kawasaki et al.,米国特許第4,615,974号;およびBitter,米国特許第4,977,092
号、参照)およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものである。また、
米国特許第4,990,446号;米国特許第5,063,154号;米国特許第5,139,936号およ
び米国特許第4,661,454号、参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula Polym
orPha)、シゾサッカラロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイ
ベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・フラ
ギリス(Kluyveromyces frgilis)、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)、
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia metanolic
a)、ピキア・グイレルモンディイ(Pichia guillermondii)およびカンジダ・マ
ルトサ(Candida maltosa)を包含する、他の酵母のための形質転換系はこの分野
において知られている。例えば、Gleeson et al.,J.Gen.Microbiol.132:3459-3
465,1986およびCregg、米国特許第4,882,279号、参照。McKnight et al.,米国
特許第4,935,3z19号の方法に従い、アスペルギルス(Aspergillus)細胞を利用す
ることができる。アクレモニウム・クリソゲヌム(Acremonium chrysogenum)は
、Sumino et al.,米国特許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラ(N
eurospora)を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示
されている。
組換えタンパク質の生産のための宿主としてピキア・メタノリカ(Pichia meta
nolica)を使用することは、WIPO公開WO97/17450号、WO97/17451号、WO98/02536
号、およびWO98/02565号に開示されている。ピキア・メタノリカ(P.metanolica
)の形質転換において使用するためのDNA分子は二本鎖、円形のプラスミドとし
て普通に製造され、これらは好ましくは形質転換の前に線状化される。ピキア・
メタノリカ(P.metanolica)におけるタンパク質の生産のために、
プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ(P.me
tanolica)の遺伝子、例えば、ピキア・メタノリカ(P.metanolica)のアルコー
ル利用遺伝子(AUG1またはAUG2)のそれであることが好ましい。他の有用なプロ
モーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ホルメートデヒドロゲナ
ーゼ(FMD)、およびカタラーゼ(CAT)遺伝子を包含する。宿主染色体の中へのDN
Aの組込みを促進するために、宿主DNA配列により双方の末端においてフランクさ
れたプラスミドの全体の発現セグメントを有することが好ましい。ピキア・メタ
ノリカ(Pichia metanolica)において使用するために好ましい選択可能なマーカ
ーはピキア・メタノリカ(P.metanolica)のADE2遺伝子であり、これはホスホリ
ボシル−5−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC;EC4.1.1.21)であり、
これはアデニンの非存在においてade2宿主細胞を増殖させる。メタノールの使用
を最小としようとする、大規模の工業的方法のために、双方のメタノール利用遺
伝子(AUG1およびAUG2)が欠失されている、宿主細胞を使用することが好ましい
。分泌されたタンパク質の生産のために、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4および
PRB1)を欠如する宿主細胞は好ましい。問題のポリペプチドをコードするDNAを
含有するプラスミドをピキア・メタノリカ(P.metanolica)細胞の中に導入する
ことを促進するために、エレクトロポレーションを使用する。2.5〜4.5kV/cm、
好ましくは約3.75kV/cmの電界強度を有する、指数的に減衰する、パルス電界、
および1〜40ミリセカント、最も好ましくは約20ミリセカントの時間定数(
t)を使用する、エレクトロポレーションにより、ピキア・メタノリカ(P.meta
nolica)細胞を形質転換することが好ましい。炭素、窒素および微量栄養素の適
切な源を含む培地中で約25℃〜35℃の温度において、ピキア・メタノリカ(
P.metanolica)細胞を培養する。慣
用の手段、例えば、小さいフラスコの震盪または発酵槽のスパージにより、液体
培地を十分にエアレーションする。ピキア・メタノリカ(P.metanolica)のため
に好ましい培地は、YEPD(2%のD−グルコース、2%のBactoTMペプトン(Dif
co Laboratories、ミシガン州デトロイト)、1%のBactoTM酵母エキス(Difco
Laboratories)、0.004%のアデニンおよび0.006%のL−ロイシン)である。
細菌の大腸菌(Escherichia coli)、バシラス(Bacillus)および他の属の菌
株を包含する、原核宿主細胞は、また、本発明において有用な宿主細胞である。
これらの宿主を形質転換し、その中でクローニングされた外来DNA配列を発現さ
せる技術は、この分野においてよく知られている(例えば、Sambrook et al.,前
掲参照)。細菌、例えば、大腸菌(E.coli)中でヒトPC4ポリペプチドを発現さ
せるとき、ポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として、細胞質の中に保持さ
れるか、あるいは細菌の分泌配列によりペリプラスム空間に向けられることがで
きる。前者の場合において、細胞を溶解し、そして粒子を回収し、例えば、グア
ニジンイソチオシアネートまたは尿素を使用して、変性する。次いで、変性され
たポリペプチドは、変性物を希釈することによって、例えば、尿素の溶液および
還元されたグルタチオンと酸化されたグルタチオンとの組合わせに対して透析し
、次いで緩衝化生理食塩水に対して透析することによって、リフォルディングし
、二量体化することができる。後者の場合において、細胞を崩壊させることによ
って(例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより)ペリプラスミック空間
の内容物を解放し、タンパク質を回収し、これにより変性およびリフォルディン
グの必要性を排除することによって、ポリペプチドをペリプラスミック空間から
可溶性の機能的形態で回収することができる。
慣用の手順に従い、選択した宿主細胞の増殖に要求される栄養素および他の成
分を含有する培地中で、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養
する。種々の適当な培地は、規定された培地および複合培地を包含し、この分野
において知られており、そして一般に炭素原、窒素原、必須アミノ酸、ビタミン
および無機質を含む。また、培地は、必要に応じて、成長因子または血清のよう
な成分を含有することができる。外因的に添加されたDNAを含有する細胞のため
に、一般に成長培地を選択する。この選折は、例えば、薬剤選択または必須栄養
素の欠乏により実施され、ここで必須栄養素は発現ベクター上に担持されるか、
あるいは宿主細胞の中に共トランスフェクトされる選択可能なマーカーにより補
足される。
本発明のポリペプチドを≧80%の純度、より好ましくは≧90%の純度、よ
なおより好ましくは≧95%の純度に精製することが好ましく、そして汚染する
高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して99.9%より高い純度であり、か
つ感染因子および発熱因子を含まない、薬学的に純粋な状態は特に好ましい。好
ましくは、精製されたポリペプチドは他のポリペプチド、特に動物由来の他のポ
リペプチドを実質的に含まない。
本発明に従い製造されたヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドは、
この分野において一般に知られている方法、例えば、アフィニティー精製および
タンパク質の大きさ、電荷、スロットブロットおよび他の性質に基づく分離を使
用して、精製される。タンパク質を培養された哺乳動物細胞中で生産するとき、
細胞を無血清培地中で培養して汚染タンパク質の量を制限することが好ましい。
細胞を収集し、溶解し、分画する。好ましい分画法は、アフィニティークロマト
グラフィー、Q-Fast Flow Separose、MonoQ樹脂、FPLC、フェニルSeparose、ヒ
ドロキシアパタイト、MonoSおよびS-Se
paroseを包含する。また、固定化された親和性標識(例えば、ポリヒスチジン、
サブスタンスPあるいは抗体または他の特異的結合因子が利用可能である、他の
ポリペプチドまたはタンパク質を使用して、タンパク質を精製することができる
。問題のタンバク質と親和性標識との間に、特異的切断部位を設けることができ
る。好ましい親和性標識は、例えば、ポリヒスチジンテイルを包含し、これは固
定化されたニッケル上の融合タンパク質の精製を可能とする(Houchuliet al.,
Bio/Technol.6:1321-1325,1988)。ポリペプチドのトランケート形態、例えば
、膜貫通ドメインまたは分泌シグナル配列のドメインを欠如する形態を、また、
構築し、これらを使用して、触媒的に活性なプロホルモンコンバーターゼをいっ
そう容易に精製することができる(Nakayam,K.,Methods in Enz.2/14:167-175
,1995)。原核性発現系において、マルトース結合タンパク質(MBP)融合物を親
和性標識として好都合に使用することができる。タンパク質を宿主細胞の細胞質
またはペリプラスミックから回収すべき場合、細胞をまず崩壊させ、タンパク質
を含有する粗製抽出液を回収し、そしてさらに精製する。そのうえ、前述の、こ
の分野において一般に知られている方法を多少変更した方法に従い、ヒトプロホ
ルモンポリペプチド基質および本発明による切断から生ずる、それらの切断産物
を精製する。例えば、細胞コンディショニングした培地から、好ましくはコンデ
ィショニングした培地の濃縮後に、分泌されたタンパク質、例えば、切断産物を
回収する。特定の分画工程の選択およびそれらの工程の順序は、一部分、宿主細
胞の型および選択した発現系に基づく。このような決定は当業者のレベルの範囲
内である。特定の方法の選択は日常の設計の事項であり、そして一部分選択した
支持体の性質により決定される。例えば、Affinty Chromatography:Principle &
Methods,Pharmacia LKB Biotechnology
、スイス国ウップサラ、参照。
本発明のポリペプチドは、それらの構造的および生化学的性質を利用すること
によって、単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着(IMAC)クロ
マトグラフィーを使用して、ポリヒスチジン標識からなるものを包含する、ヒス
チジンに富んだタンパク質を精製することができる。簡単に述べると、ゲルにま
ず2価の金属イオンを負荷してキレート化剤を形成する(Sulkowsiki,Trends i
n Biochem.3:1-7,1985)。ヒスチジンに富んだタンパクは、使用する金属イオ
ンに依存して、このマトリックスに異なるアフィニティーで吸着され、そして競
合溶離、pHの低下、または強いキレート化剤の使用により溶離されるであろう
。他の精製法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換
クロマトグラフィーによりグリコシル化製造の精製を包含する(Metthods in En
zymol.,Vol.182,”Guide to Protein Purification”,M.Deutscher(編)、A
cademic Press、サンディエゴ、1990;pp.529-39)。本発明の追加の態様の範囲
内において、問題のポリペプチドと親和性標識(例えば、マルトース結合タンパ
ク質、免疫グロブリンドメイン)との融合物を構築して、精製を促進することが
できる。
ヒトPC4ポリペプチドを、また、使用して、ヒトPC4のエピトープ、ペプチドま
たはポリペプチドに特異的に結合する抗体を製造することができる。ヒトPC4ポ
リペプチドまたはそのフラグメントは、動物を接種し、免疫応答を引き出すため
の抗原(免疫原)として働く。適当な抗原は、配列番号:2内にコードされる本
明細書に開示する、種々のヒトPC4ポリペプチドまたは配列番号:2内にコード
される隣接9〜755アミノ酸フラグメントを包含する。この免疫応答から発生す
るポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を、この分野においてよく知ら
れている方法により、単離し、精製す
る。例えば、下記の文献を参照のこと:Current Protocols in Imunology,Cool
igan,et al.(編)、Natonal Institutes of Health,John Wiley & Sons,Inc
.,1995;Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,
Cold Spring Harbor,NY,1989;並びにHurrel,J.G.R.編、Monoclonal Hybridom
a Antibodies:Techniques and Applications,CRC Press,Inc.,フロリダ州ボ
カレイトン,1982。
当業者にとって容易に明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛
、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットにヒトPC4ポ
リペプチドまたはそのフラグメントを接種することによって、ポリクローナル抗
体を発生させることができる。アジュバント、例えば、明礬(水酸化アルミニウ
ム)またはフロインド完全アジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを
使用して、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドの免疫原性を増加す
ることができる。免疫化に有用なポリペプチドは、また、融合ポリペプチド、例
えば、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4またはその一部分と免疫グロブリンポ
リペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチ
ドの免疫原は全長の分子またはその一部分であることができる。ポリペプチドの
一部分が「ハプテン様」である場合、このような一部分は好都合には免疫化のた
めに高分子(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清ア
ルブミン(BSA)または破傷風トキソイド)に結合させることができる。
本明細書において使用するとき、用語「抗体」はポリクローナル抗体、アフィ
ニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合
フラグメント、例えば、F(ab')2およびFab'タンパク質分解フラグメントを
包含する。遺伝子操作された
完全な抗体またはフラグメント、例えば、キメラ抗体、Fvフラグメント、一本
鎖抗体およびその他、ならびに合成抗原結合ペプチドおよびポリペプチドもまた
包含される。非ヒトCDRをヒトフレームワークおよび一定領域の上にグラフト化
するか、あるいは全体の非ヒト可変ドメインを組込む(必要に応じて暴露した残
基を置換することによって、前記ドメインをヒト様表面で「クローキング(cloa
king)」する、ここで「ベニヤ化された」抗体が生ずる)とによって、非ヒト抗
体をヒト化することができる。いくつかの例において、ヒト化抗体はヒト可変領
域のフレームワーク内に非ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強すること
ができる。抗体をヒト化することによって、生物学的半減期を増加することがで
き、そしてヒトへの投与のときの悪い免疫反応の可能性が減少する。
本発明において有用な抗体を発生させるか、あるいは選択する別の技術は、ヒ
トプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドまたはそれからのペプチドに対す
るリンパ球のin vitro暴露、およびファージまたは同様なベクター中の抗体ディ
スプレイライブラリーの選択(例えば、固定化または標識化ヒトPC4タンパク質
またはペプチドの使用による)を包含する。ファージ(ファージディスプレイ)
または細菌、例えば、大腸菌(E.coli)上にディスプレイされた、ランダムペプ
チドライブラリーを選択することによって、潜在的ヒトPC4ポリペプチド結合ド
メインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダム突然変異
誘発およびランダムポリヌクレオチド合成により、得ることができる。これらの
ランダムペプチドディスプレイライブラリーを使用して、ペプチドまたはポリペ
プチドであることができる既知の標的、例えば、リガンドまたはレセプター、生
物学的または合成の高分子、または有機
または無機の物質と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。
このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーをつくり、スクリーニン
グする技術はこの分野において知られており(Ladner et al.,米国特許第5,223,
409号;Ladner et al.,米国特許第4,946,778号;Ladner et al.,米国特許第5,40
3,484号;およびLadner et al.,米国特許第5,571,698号)そしてランダムペプチ
ドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングす
るキットは、例えば、クロンテク(Clontech)(カリフォルニア州パロアルト)、イ
ンビトロゲン・インコーポレーテッド(Invitrogen Inc.)(カリフォルニア州サ
ンディエゴ)、ニュー・イングランド・バイラブズ・インコーポレーテッド(New
England Biolabs Inc.)(マサチュセッツ州ベバーリイ)およびファーマシア(Phar
macia LKB Biotechnology Inc.)(ニュージャージイ州ピスカタウェイ)から商業
的に入手可能である。本明細書に開示するヒトPC4配列を使用して、ランダムペ
プチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、ヒトPC4に結合するタ
ンパク質を同定することができる。これらの「結合タンパク質」は、ヒトPC4ポ
リペプチドと相互作用し、細胞の標識化、アフィニティー精製による相同体ポリ
ペプチドの単離に使用することができ;それらを直接的または間接的に薬剤、ト
キシン、放射性核種およびその他に結合させることができる。これらの結合タン
パク質は、また、分析的方法において、例えば、発現ライブラリーのスクリーニ
ングおよび活性の中和に使用することができる。また、結合タンパク質は、組織
中のポリペプチドのレベルを測定し、そして根元的な病理学または疾患のマーカ
ーとしてポリペプチドを検出または定量する診断アッセイに使用することができ
る。これらの結合タンパク質は、また、ヒトPC4「アンタゴニスト」として作用
して、in vitroおよびin viv
0においてヒトPC4切断活性をブロックすることができる。
抗体は、1)それらが限界のレベルの結合活性を示す場合、そして2)それら
が関係するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合すると
決定される。第1に、本発明における抗体が、(非ヒトPC4)ポリペプチドをコン
トロールする結合アフィニティーよりも少なくとも10倍大きい親和性で、ヒト
プロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチド、ペプチドまたはエピトープと結合
する場合、本発明における抗体は特異的結合する。抗体は106M-1またはそれより
大きい、好ましくは107M-1またはそれより大きい、より好ましくは108M-1または
それより大きい、最も好ましくは109M-1またはそれより大きい、結合アフィニテ
ィー(Ka)を示すことが好ましい。抗体の結合アフィニティーは、当業者によ
り、例えば、スキャッチャード分析(Scatchard,G.,Ann.NY Acad.Sci.51:660-6
72,1949)により容易に測定することができる。
第2に、抗体が関係するポリペプチドと有意に交差反応しない場合、抗体は特
異的に結合すると決定される。例えば、標準的ウェスタンブロット分析を使用し
て、抗体がヒトPC4を検出するが、既知の関係するポリペプチドを検出しない場
合、抗体は関係するポリペプチド分子と有意に交差反応しない(Ausubel et al.
,ibid.)。既知の関係するポリペプチドの例は、オーソログ(例えば、ネズミPC4
)、およびパラログ、例えば、他の既知のヒトプロホルモンコンバーターゼ(例え
ば、PC1およびPC2)、または突然変異のヒトPC4ポリペプチド、および非哺乳動物
プロホルモンコンバーターゼ(例えば、スブチリシン、またはKex2)である。そ
のうえ、抗体を既知の関係するポリペプチド「に対してスクリーニング」しで、
本発明のポリペプチドに特異的に結合する集団を単離することができる。例えば
、ヒトPC4に対して発生させた抗体は不溶性マトリックスに付
着した関係するポリペプチドに吸着される;ヒトPC4に対して特異的な抗体は適
切な緩衝条件下にマトリックスを通して流れるであろう。このようなスクリーニ
ングは、密接に関係するポリペプチドに対して非交差反応性のポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体の単離を可能とする(Antibodies:A Laboratory Man
l1al,HarlowおよびLane(編),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988;
Current Protocols in Imunology,Cooligan,et al.(編),Natonal Institut
es of Health,John Wiley & Sons,Inc.,1995)。特異的抗体のスクリーニングお
よび単離は、この分野においてよく知られている。下記の文献を参照のこと:Fu
ndamental Immunology,Paul(編),Raven Press,1993;Getzoff et al.,Adv.
in Immunol.,43:1-98,1988;Monoclonal Antibodies:Principle and Practice
,Doding,J.W.(編),Academic Press Ltd.,1996:Benjamin et al.,Ann.Re
v.Immunol.2:67-101,1984。
この分野において知られている種々のアッセイを利用して、ヒトPC4タンパク
質またはポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出し、精製することができる
。典型的なアッセイは、Antibodies:A Laboratory Manual,HarlowおよびLane(
編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988、に詳細に記載されている
。このようなアッセイの代表的な例は下記のものを包含する:並流免疫電気泳動
、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、
ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、
およびサンドイッチアッセイ。
さらに、抗体を野生型/突然変異のヒトPC4タンパク質またはポリペプチドに
対する結合についてスクリーニングすることができる。ヒトPC4を発現する細胞
のターゲッティング;アフィニティー精製によるヒトPC4の単離;in vitroおよ
びin vivoの細胞および組
織のライゼイト中のヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドのレベルを
測定する診断アッセイ;in vivoにおける組織の分布を測定するin situ免疫局在
化;根元的な病理学または疾患のマーカーとしてヒトプロホルモンコンバーター
ゼ4タンパク質の検出または定量;フロー・サイトメトリーを使用する分析方注
;抗イディオタイプ抗体の発生;のために、そして中和性抗体;またはin vitro
およびin vivoにおいてヒトPC4触媒活性をブロックするアンタゴニスト;として
、ヒトPC4に対する抗体を使用することができる。この方法において抗体を利用
する方法は、この分野においてよく知られている。適当な直接的標識は下記のも
のを包含する:放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マ
ーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他;間接的標識は、中間体とし
てビオチン−アビジンまたは他の補体/抗補体の対の使用を特徴とすることがで
きる。本発明における抗体は、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他
と直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの複合体はin viv
oの診断または治療の用途において使用することができる。そのうえ、ヒトPC4ま
たはそのフラグメントに対する抗体をin vitroにおいて使用して、アッセイ、例
えば、ウェスタンブロットアッセイまたはこの分野において知られている他のア
ッセイにおいて、変性されたヒトPC4またはそのフラグメントを検出することが
できる。
精巣特異的プロセシング酵素、例えば、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4は
、睾丸細胞により発現されたプロホルモンまたは結合タンパク質のプロセシング
に関係する。したがって、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4は、後述するよう
に、睾丸のプロホルモンの生物学的機能の同定および決定、および新規なプロホ
ルモンの同定において有用である。ヒトPC4は生殖能、および/または精子形成
に関係する睾丸の機能においてある役割を演ずることができるという提案は、ホ
モ接合性雄ネズミPC4突然変異マウスが高度に損なわれた生殖能を有することを
記載する最近の論文により支持される(Mbikay,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.94:6842-6846,1997)。そのうえ、著者らはこれらの突然変異マウスにおいて
明らかな精子形成の異常を観測せず、そしてこれらの精子により受精した卵は芽
細胞段階に成長することができず、受精においてばかりでなく、かつまた初期の
胚発生における役割を示唆した。
本発明のタンパク質は、既知または未知のプロホルモンポリペプチドをそれら
の成熟した形態または生物学的に活性な形態にプロセスするか、あるいは部分的
にプロセスするために使用され、これにより、例えば、睾丸細胞の増殖または分
化を刺激することができる。そのうえ、本発明のタンパク質、それらのアンタゴ
ニストおよびアゴニストは雄生殖能においてある役割を演ずることかできる。ヒ
トPC4がある基質に作用するかどうかを試験するために、潜在的プロホルモンポ
リペプチドをヒトPC4と同一細胞において共発現させることができるか、あるい
はin vitroにおいてヒトPC4と組合わせることができる。このような細胞を構築
するか、あるいはin vitroにおいてタンパク質を組合わせる方法はこの分野にお
いて知られており、そして本明細書に開示されている。切断産物は、潜在的プロ
ホルモン基質に対するヒトPC4活性から生ずる。本発明のタンパク質の活性は、
プロホルモンコンバーターゼ4により切断されたプロホルモン前駆体ポリペプチ
ドの切断産物に関連する生物学的活性をアッセイすることによって、測定するこ
とができる。さらに、切断産物の生物学的活性を測定できない場合、他の方法、
例えば、ウェスタンブロットを使用して、ヒトPC4が基質のプロホルモンを切断
したかどうかを決定することができる。
本発明のポリペプチドを使用して、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4のポリ
ペプチドプロホルモン基質を決定することができる。この分野においてよく知ら
れている方法を使用して、成熟した形態のヒトプロホルモンコンバーターゼ4を
発現しかつ被験基質のプロホルモンポリペプチドを共発現する、発現ベクターが
導入された細胞を培養することができる。ヒトプロホルモンコンバーターゼ4に
よる被験基質の切断から生ずる切断産物は、本明細書に記載する生物学的または
生化学的アッセイにより測定することができる。そのうえ、ヒトプロホルモンコ
ンバーターゼ4ポリペプチドのポリペプチドプロホルモン基質を決定する、この
ような方法をin vitroで決定することができる。ヒトプロホルモンコンバーター
ゼ4を発現する細胞から単離され、精製されたヒトプロホルモンコンバーターゼ
4ポリペプチドまたはライゼイトを、in vitroにおいて、被験基質のポリペプチ
ド、例えば、被験基質のプロホルモンポリペプチド、または二塩基切断部位を含
有する合成ポリペプチドと組合わせることができる。ヒトプロホルモンコンバー
ターゼ4ポリペプチドによる被験基質のプロホルモンポリペプチドの切断から生
ずる切断産物は、本明細書に記載する生物学的または生化学的アッセイにより検
出することができる。
種々のアッセイを使用して、切断産物の生物学的活性を測定することができる
。例えば、培養された睾丸細胞を使用するか、あるいは本発明のポリペプチドに
より切断またはプロセシングされたプロホルモン分子を適当な動物モデルにin v
ivoにおいて投与することによって、増殖および分化を測定することができる。
培養された睾丸細胞は、イルカDB1.Tes細胞(CRL-6258);マウスGC-1spg細胞(
CRL-2053);TM3細胞(CRL-1714);TM4細胞(CRL-1715);およびブタST細胞
(CRL-1746)を包含し、これらはアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション(マリイランド州ロックビレ)から入手可能で
ある。細胞の増殖または分化を測定する方法は、この分野においてよく知られて
いる。例えば、増殖を測定するアッセイは、下記のようなアッセイを包含する:
赤色色素を中和する化学的感受性(Cavanaugh et al.,Investigation New Drug
8:347-354,1990)、放射能標識化ヌクレオチドの組込み(Cook et al.,Analyt
ical Biochem.179:1-7,1989)、増殖する細胞のDNA中の5−ブロモ−2’−デオ
キシウリジン(BrdU)の組込み(Porstmann et al.,J.Immunol.Methods 82:16
9-179,1985)、並びにテトラゾリム塩の使用(Mosmann,J.Immunol.Methods 65
:55-63,1983;Alley et al.,Cancer Res.48:589-601,1988;Marchall et al.,
Growth Reg.5:69-84,1995;およびScudiero et al.,Cancer Res.48:4827-4833
,1988)。分化を測定するアッセイは、例えば、組織の段階特異的実施例、酵素
活性、機能的活性または形態学的変化に関連する細胞表面のマーカーの測定を包
含する(Watt,FASEB,5:281-284,1991;Francis,Differentiation 57:63-75,1
994;Raes,Adv.Anim.Cell Biol.Technol.Bioprocesses,161-171,ESACT,9th m
eeting,1989)。
精巣ポリペプチド因子に対するヒトプロホルモンコンバーターゼ4の作用を評
価するin vivoアッセイは、この分野においてよく知られている。例えば、切断
産物は、特定の時間期間の間、腹腔内注射することができる。処置期間後、動物
を殺し、精巣を取出し、秤量する。睾丸を均質化す精子の頭部を計数する(Meist
rich et al.,Exp.Cell Res.99:72-78,1976)。
本発明のタンパク質によりプロセスされたポリペプチドの切断産物に関連づけ
ることができる、他の活性、例えば、化学走性活性を分析することもできる。例
えば、精子形成の後期段階の因子は精子
−卵の相互作用および精子の運動性に関係することができる。このような活動を
評価するアッセイは既知である(Fuchs,Zentralbl Gynakol 11:117-120,1993;
Neurwinger et al.,Andrologia 22:335-339,1990;Harris et al.,Human Repr
od.3:856-860,1988;およびJockenhovel,Andrologia 22:171-178,1990)。
さらに、標準的生化学的アッセイ、例えば、ウェスタンブロットを使用して、
未知の活性の基質プロホルモンのヒトPC4のプロセシングから生ずる切断産物を
検出することができる(Sambrook et al.,前掲およびAusubel,et al.,前掲)。
このような方法を使用して、ヒトPC4を発現する細胞から分泌された切断産物お
よび被験プロホルモン基質を、細胞から収集された培地のアッセイにより、検出
することができる。
また、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4のモジュレーターについての細胞を
ベースとするスクリーンにおいて、本発明のタンパク質を使用する。モジュレー
ター、例えば、アンタゴニストおよびアゴニストは、いくつかの方法、例えば、
触媒活性、遺伝子の発現、または基質ポリペプチドとの相互作用において、プロ
ホルモンコンバーターゼに影響を与えることができる。このようなアンタゴニス
トおよびアゴニストは、ヒトPC4の切断活性を、それぞれ、減少または増加させ
ることによって、本発明のプロホルモンコンバーターゼに影響を与えるであろう
。ヒトPC4が作用するプロホルモンからの切断産物をアッセイすることによって
、この増加または減少は測定される。このような用途において、インジケーター
のプロホルモン基質は、本発明のポリペプチドにより切断されることが知られて
おり、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4を発現する同一の細胞において発現さ
れる。このような細胞を構築する方法はこの分野において知られており、そして
本明細書に開示されている。好ましいイ
ンジケーターのプロホルモンポリペプチドは、プロホルモンコンバーターゼによ
りプロセスされるとき、細胞から分泌され、そして切断産物に関連する、容易に
測定できる生物学的活性を有する。このような活性のアッセイの例は、上記にお
いて開示されている。アンタゴニストおよびアゴニストは、種々の後述する因子
の存在に対して暴露した後、細胞から分泌される、生ずる切断産物をスクリーニ
ングすることによって同定される。インジケーターの基質のプロセシングの変化
は、因子に暴露しなかった対照細胞に関して、プロホルモンコンバーターゼを増
強または阻害することによって、本発明のヒトPC4タンパク質に対して因子が有
する活性を反映する。例えば、対照に関して、ヒトPC4の活性を増加させるアゴ
ニストは、切断を増加させ、それゆえ、インジケーター基質からの生物学的に活
性な切断産物を多くするであろう。逆に、対照に関して、ヒトPC4の活性を減少
させるアンタゴニストは、切断を減少させ、それゆえ、インジケーター基質から
の生物学的に活性な切断産物を少なくするか、あるいは切断産物を潜在的にゼロ
とする。ヒトPC4をモジュレートすることができ、そして被験試料において評価
または使用することができる、因子の源は、任意の天然の源または化学的源を包
含するが、これらに限定されず、このような源は下記のものを包含するが、これ
らに限定されない:植物、微生物および真菌の抽出物、化学的ライブラリー、お
よび化学的ライブラリーの組合わせ。この型の細胞をベースとするアッセイを確
立し、使用する方法はこの分野において知られている。
このタイプの細胞をベースとするスクリーニングは、被験試料において、ヒト
プロホルモンコンバーターゼポリペプチドの活性のモジュレーターの存在を検出
するために使用される。成熟ヒトPC4タンパク質を発現しかつ既知のインジケー
ターのプロホルモンポリペ
プチド基質を共発現する細胞を、被験試料の存在およひ非存在において培養する
ことができる。このような細胞の構築はこの分野において知られている方法によ
り達成することができ、そして本明細書に記載されている。例えば、成熟ヒトPC
4タンパク質の発現を指令する発現ベクター、および既知のインジケーターのプ
ロホルモンポリペプチド基質の発現を指令する発現ベクターを、同一細胞の中に
導入することができる。細胞は被験試料の非存在において対照として働き、これ
に対して、被験試料の存在における分子の活性を比較する。生物学的または生化
学的アッセイを使用して、被験試料の存在および非存在において、ヒトプロホル
モンコンバーターゼ4により基質の切断から生ずる切断産物のレベルを比較する
ことができる。この比較から、前述したように、被験試料中のヒトプロホルモン
コンバーターゼの活性のモジュレーターの存在を解明することができる。
また、疾患または他のヒトの特徴に関連するヒト染色体19の異常を検出する
ために、本発明のポリヌクレオチドを使用する。本発明のポリヌクレオチドは、
ヒト染色体19上の19pt3.3にマッピングされる。プロホルモンコンバーターゼ
の遺伝子座における検出可能な染色体異常は、異数性、遺伝子コピー数の変化、
挿入、欠失、制限部位の変化および再配列を包含するが、これらに限定されない
。分子の遺伝子技術、例えば、制限フラグメントの長さの多形性(RFLP)の分析
、PCR技術を用いる短い直列の反復(STR)分析、およびこの分野において知られて
いる他の遺伝的結合分析技術に従い、本発明のポリヌクレオチドを使用して、こ
のような異常を検出することができる(Sambrook et al.,前掲;Ausubel,et al
.,前掲;Marian,A.J.,Chest 108:25 5-265,1995)。
本発明は、また、診断用途において使用する試薬を提供する。例
えば、ヒトPC4遺伝子、ヒトPC4DNAまたはRNAからなるプローブ、またはそれらの
配列を使用して、ヒトPC4遺伝子が染色体19上の存在するかどうか、あるいは
突然変異が起こったかどうかを決定することができる。ヒトPC4遺伝子座におけ
る検出可能な染色体の異常は、異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制
限部位の変化および再配列を包含するが、これらに限定されない。これらの異常
は、コーディング配列内、イントロン内、または上流のプロモーターおよび調節
領域を含む、フランキング配列内に存在することができ、そしてコーディング配
列内の物理的変更または遺伝子の発現レベルの変化として発現することがある。
分析的プローブは一般に少なくとも20ヌクレオチドの長さであるが、多少短い
プローブ(14〜17ヌクレオチド)を使用することができる。PCRプライマー
は少なくとも2つの5ヌクレオチド、好ましくは15またはそれ多いnt、より
好ましくは20〜30ntの長さである。遺伝子の小さい領域が分析のためにターゲッ
トされるとき、短いポリヌクレオチドを使用することができる。遺伝子の全般的
分析のために、ポリヌクレオチドのプローブは全体のエクソンまたはそれ以上を
含むことができる。プローブは一般にシグナル発生部分、例えば、放射能標識化
ヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドからなる。一般に、これらの診断法は
下記の工程からなる:(a)患者から遺伝的試料を取り;(b)ポリヌクレオチ
ドが相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションして、第1反応生成
物を生成する条件下に、遺伝的試料を前述のポリヌクレオチドのプローブまたは
プライマーとインキュベートし;そして(iii)第1反応生成物を対照反応生成物
と比較する。第1反応生成物と対照反応生成物との間の差は、患者における遺伝
的異常性を示す。本発明において使用する遺伝的試料は、ゲノムDNA、cDNA、お
よびRNAを包含する。ポリヌクレオチ
ドのプローブまたはプライマーはRNAまたはDNAであることができ、そして配列番
号:1の一部分、配列番号:1の補体、またはそれらのRNA同等物からなるであ
ろう。これに関して適当なアッセイ法は、当業者に知られている分子遺伝的技術
、例えば、制限フラグメントの長さの多形性(RFLP)分析、PCR技術を用いる短
い直列反復(STR)分析、連結反応連鎖(Barany,PCR Methods and Applications 1
:5-16,1991)、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、およびこの分野において知られ
ている他の遺伝的連鎖分析技術(Sambrook et al.,前掲;A.J.Marian,前掲,19
95)を包含する。リボヌクレアーゼ保護アッセイ(例えば、Ausubel et al.,前
掲,ch.4、参照)は、親RNA試料に対するRNAプローブのハイブリダイゼーション
からなり、その後反応生成物(RNA-RNAハイブリッド)をRNアーゼに対する暴露
する。RNAのハイブリダイゼーションした領域は消化から保護される。PCRアッセ
イにおいて、親遺伝的試料を1対のポリヌクレオチドのプライマーとインキュベ
ートとし、そしてプライマーの間の領域を増幅し、回収する。回収された生成物
の大きさまたは量の変化は、患者における突然変異を示す。使用できる他のPCR
に基づく技術は、一本鎖のコンフォメーション多形性(SSCP)分析である(Haya
shi,PCR Methods a nd Applications 1:34-38,1991)。
実施例
実施例1 ヒトプロホルモンコンバーターゼ4のクローニング
A.要約
ネズミPC4cDNAプローブを使用するヒト精巣cDNAライブラリーの
スクリーニングは、ネズミPC4cDNAプローブに対して相同である、クローンpSLHP
C4-5を明らかにした。このcDNAはヒトプロホルモンコンバーターゼ4(ヒトPC4)
をコードした。
B.ヒト精巣cDNAライブラリーの調製
λZAPR II(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)ヒト精巣cDNAライブラ
リーをスクリーニングすることによって、全長のヒトPC4cDNAを得た。精巣cDNA
ライブラリーを次のようにして構築した 第1鎖cDNAの反応は、15μlのヒト
精巣の2回ポリdT分泌ポリ(A)+mRNA(Clontech Laboratories)を1.0μg/
μlの濃度で含有し、そして3μlの20pmole/μlのXhoI制限部位を有する第
1鎖プライマーZC6091(配列番号:5)を含有した。この混合物を70℃に4分
間加熱し、氷上で冷却した。12μlの第1鎖の緩衝液(5×SUPERSCRIPTTM緩
衝液;Life Technologies、マリイランド州ガイサーバーグ)、6μlの100mMの
ジチオスレイトール、および3μlの10mMの各dTTP、dATP、dGTP、および5−メ
チル−dCTP(Pharmacia LKB Biotechnology、ニュージャージイ州ピスカタウェ
イ)を含有するデオキシヌクレオチドトリホスフェートの溶液をRNA−プライマ
ー混合物に添加することによって、第1鎖cDNAの合成を開始した。反応混合物を
37℃において2分間インキュベートし、15μlの200U/μlのRNアーゼH
-逆転写酵素(SUPERSCRIPT IIR ;Life Technologies)を添加した。平行反応に
おいて5μCiの32P-αdCTPを反応混合物の1つからの5μlのアリコートに添
加することによって、第1鎖の合成の効率を分析した。反応を37℃において1
0分間、45℃において1時間インキュベートし、次いで50℃において10分
間インキュベートした。400孔大き
さゲル濾過カラム(Clontech Laboratories)上のクロマトグラフィーにより、標
識化反応における非組込み32P-αdCTPを除去した。400孔大きさゲル濾過カラム(
Clontech Laboratories)上のクロマトグラフィーにより、非標識化第1鎖の反応
における非組込みヌクレオチドおよびプライマーを除去した。第1鎖cDNAの長さ
をアガロースゲル電気泳動により測定した。
第2鎖の反応は、120μlの非標識化第1鎖cDNA、36μlの5×ポリメラー
ゼI緩衝液(125mMのTris:HCl、pH7.5、500mMのKCl、25mMのMgCl2、50mMの(NH4)2
SO4)、2.5μlの100mMのジチオスレイトール、3.6μlの10mMの各デオキシヌク
レオチドトリホスフェートを含有する溶液、6μlの5mMのβ-NAD、3.6μl3U
/μlの大腸菌(E.coli)DNAリガーゼ(New England Biolabs;マサチュセッツ
州ベバーリイ)、9μlの10U/μlの大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI(Ne
w England Biolabs)、および1.8μlの2U/μlのRNアーゼH(Life Technol
ogies)を含有した。第2鎖の合成反応の1つからの10μlのアリコートを10
μCiの32P-αdCTPの添加により標識化して、第2鎖の合成の効率をモニターし
た。反応を16℃において2時間インキュベートし、次いで15μlのT4DNAポ
リメラーゼ(10U/μl、Boehringer Mannheim、インジアナ州インジアナポ
リス)を添加し、16℃においてさらに5分間インキュベートした。400孔大き
さゲル濾過カラム(Clontech Laboratories)上のクロマトグラフィーにより、非
標識化反応における非組込み32P-αdCTPを除去した後、アガロースゲル電気泳動
による分析を実施した。反応を20μlの0.5EDTAの添加により停止させ、フェ
ノール/クロロホルムで抽出し、次いで2.5Mの酢酸アンモニウムおよび4μgの
グリコーゲン担体の存在においてエタノール沈降を実施した。cDNAの収率を15
μgの出発mRNA鋳型
からほぼ3μgであると推定された。
EcoRIアダプターを前述のcDNAの5’末端上に結合して、発現ベクターの中へ
のクローニングを可能とした。10μlのcDNA(約1.5μg)のアリコートおよ
び5μlの65pmole/μlのEcoRIアダプター(Pharmacia LKB Biotechnology In
c.)を、2μlの10×リガーゼ緩衝液(660mMのTris-HCl、pH7.5、100mMのMgCl2
)、2μlの10mMのATPおよび1μlの15U/μlのT4DNAポリメラーゼ(Promega
Corp.ウイスコンシン州マディソン))と混合した。反応を5℃において2時
間インキュベートし、7.5℃において2時間インキュベートし、10℃において
2時間インキュベートし、そして12.5℃において10時間インキュベートした。
反応を70℃において20時間のインキュベーションにより停止させた。
1ZapIIRベクター(Stratagene)の中へのcDNAの方向性クローニングを促進す
るために、cDNAをXhoIで消化し、5'EcoRI粘着末端および3'XhoI粘着末端を有す
るcDNAを生成させた。ZC6091プライマー(配列番号:5)を使用して、cDNAの3
’末端におけるXhoI制限部位は以前に導入されていた。20μlの前述のcDNA、
10μlの10×H緩衝液(Boehringer Mannheim)、39μlのH2O、および1.0
μlの40U/μlのXhoI(Boehringer Mannheim)を含有する反応混合物中で、制限
酵素の消化を実施した。消化を37℃において40分間実施した。70℃におけ
る10分間のインキュベーションおよび400孔大きさゲル濾過カラム(Clontech L
aboratories)を通すクロマトグラフィーにより反応を停止させた。
cDNAをエタノール沈降させ、70%エタノールで洗浄し、空気乾燥し、14μ
lのH2O、2μlのリガーゼ緩衝液(Promega Corp.、ウイスコンシン州マディ
ソン)、2μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μl、Life Technologie
s)の中に再懸濁させた。3
7℃において30分間インキュベートした後、cDNAを65℃に5分間加熱し、氷
上で冷却し、0.8%低融点アガロースゲル上で電気泳動させた。汚染性アダプタ
ーおよび0.5kbより小さい長さのcDNAをゲルから切除した。電極を逆転させ、も
とのレーン付近に濃縮されるまで、cDNAを電気泳動させた。濃縮されたcDNAを含
有するゲルの区域を切除し、マイクロフージ管の中に入れ、そしてゲルスライス
の近似体積を測定した。ゲルスライスの体積(300μl)のほぼ3倍の水のアリコ
ートおよび30μlの10×β−アガロースI緩衝液(New England Biolabs)を
管に添加し、そして65℃に15分間加熱することによって、アガロースを溶融
させた。試料を45℃に平衡化した後、3μlの1U/μlのβ−アガロースI
(New England Biolabs)を添加し、そしてこの混合物を45℃において60分間
インキュベートしてアガロースを消化した。インキュベーション後、40μlの
3Mの酢酸ナトリウムを試料に添加し、そしてこの混合物を氷上で15分間イン
キュベートした。試料を室温において14,000×gで15分間遠心して未消化のア
ガロースを除去した。cDNAエタノール沈降させ、70%エタノール中で洗浄し、
空気乾燥し、10μlの水の中に再懸濁させた。
EcoRIおよびXhoIで前もって消化し、脱リン酸化したラムダファージベクター
λZapR II(Stratagene)の中に、得られるcDNAをクローニングした。1.0μlの調
製したベクター、1.0μlのヒト精巣cDNA、1.0μlの10×リガーゼ緩衝液(Pro
mega Corp.)、1.0μlの10mMのATP、5μlのH2O、および1.0μlの15U/μlの
T4DNAポリメラーゼ(Promega Corp.)を含有する反応混合物中で、cDNAをλZapR I
Iベクターに結合した。結合混合物を5℃〜15℃の温度勾配で一夜インキュベ
ートした。インキュベーション後、in vitroパッケージング抽出物(GigapackR
III Goldパッケージング
抽出物;Stratagene)を使用して、結合混合物をファージの中にパッケージし、
そして生ずるライブラリーを製造業者の使用説明書に従い力価決定した。
C.ポリヌクレオチドの単離
ヒト精巣λZapR IIライブラリーを使用して大腸菌(E.coli)宿主細胞(XL1-B
lueTMMRF'株;Stratagene)を感染させ、そして1.5×106pfuを150mmのNZYプレー
ト上に約40,00pfu/プレートの密度でプレートした。接種したプレートを37℃
において一夜インキュベートした。製造業者により提供された手順に従い、ナイ
ロン膜(HybondTM-N;Amersham Corp.イリノイ州アーリントンハイツ)を使用し
て、フィルターのプラークのリフトを作った。1.5MのNaClおよび0.5MのNaOHを含
有する溶液中で室温において7分間変性することによって、フィルターをプロセ
シングした。フィルターを短時間ブロットして過剰の変性溶液を除去し、次いで
1MのTris-HCl、pH7.5、および1.5MのNaCl中で5分間中和した。UV架橋装
置(StratalinkerR;Stratagene)中において1,200ジュールのUVエネルギーで、
ファージDNAをフィルター上に固定した。固定後、フィルターをハイブリダイゼ
ーション溶液(5×SSC、5×テンハルト溶液、0.2%のSDSおよび1mMのEDTA)中
のプレハイブリダイゼーションした。加熱変性し、剪断したサケ精子DNAを100μ
g/mlの最終濃度で添加した。フィルターを65℃において一夜プレハイブリ
ダイゼーションした。
配列番号:6のヌクレオチド45〜ヌクレオチド1033に対応するラットのプロ
ホルモンコンバーターゼcDNAコーディング領域を増幅するために、オリゴヌクレ
オチドを使用することによって、プローブをPCR生成物として調製した。最初に
、第1ラウンドのPCR反応
混合物は2μlのZC11,808(配列番号:7)および2μlのZC11,809(配列番号
:8)、1μlの400フェムトグラム/μlのラット精巣cDNA、1μlの10mMのd
NTP、10μlの10×Klentaq緩衝液(Clontech)、83μlの水、および2μ
lのKlentaq DNAポリメラーゼ(Clontech)を含有した。第1ラウンドのPCR反応
を次のようにして実施した:最初の95℃、30秒間;次いで30サイクル、9
5℃、30秒間、57℃、30秒間、68℃、2分間;次いで68℃、10分間
。第1ラウンドのPCR生成物を水で1:200に希釈した。第1ラウンドのPCR生成
物以外内部のDNAを増幅する設計された、ネステッドプライマー、ZC11,870(配
列番号:9)およびZC11,871(配列番号:10)を使用して、1μlの希釈した
第1ラウンドのPCR生成物を第2PCRに付した。第2ラウンドのPCR反応を次のよう
にして実施した:最初の95℃、30秒間;次いで30サイクル、95℃、30
秒間、58℃、30秒間、68℃、2分間;次いで68℃、10分間。ヒト精巣
cDNAライブラリーをヒトPC4についてスクリーニングするためのプローブとして
使用するために、第2ラウンドのPCR生成物を1.5%の低融点アガロースゲル上で
精製した。
製造業者の使用説明書に従い、MEGAPRIMETMDNAライブラリーシステム(Amersh
am)を使用して、ランダムプライミングにより、25ナノグラムのPCR生成物を3 2
P-dCTPで放射能標識化した。プレハイブリダイゼーション溶液を6.5×105cpm/
mlの標識化プローブを含有する新鮮なハイブリダイゼーション溶液と置換し、6
0℃において一夜ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後、
ハイブリダイゼーション溶液を除去し、1×SSC、0.25%のSDSおよび1mMのEDTA
を含有する洗浄溶液で45℃において、フィルターをすすいだ。フィルターをオ
ートラジオグラフのフィルム上に配
置し、増強スクリーンを使用して−70において96時間露出した。
オートラジオグラフを検査すると、標識化プローブとハイブリダイゼーション
した多数の領域が明らかとなった。精製のために、寒天プラグを39領域から取
り上げた。各寒天プラグを0.5mlの1%(v/v)のクロロホルムを含有するSM中で
一夜ソーキングした(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual
、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1
989)。インキュベーション後、各プラグからのファージをSM中で1:1000に希
釈した。50μlのアリコートを大腸菌(E.coli)XL-1 Blue TMMRF'細胞上に配
置した。プレートを37℃において一夜インキュベートし、前述したように、フ
ィルターのリフトを調製し、プレハイブリダイゼーションし、洗浄し、オートラ
ジオグラフィーにかけた。得られるオートラジオグラフを検査すると、10のフ
ィルターリフト上に陽性のシグナルが明らかにされた。寒天プラグをこれらの領
域から取り上げ、追加のラウンドのプラーク精製に付した。
製造業者の使用説明書に従い、ExASSIST/SOLRTM(Stratagene)を使用して、
プラスミドを切除した。インサートの大きさの測定および配列決定のために、こ
れらのプラスミドをPCRにより増幅した。クローン(pSLHPC4-5と表示する)は、配
列番号:1に示す配列を含有することが示された。
実施例2 組織の分布
pSLHPC4-5の全長のコーディング配列からプローブを調製し、ヒト・マルチプ
ル組織ノザンブロット(Human Multiple Tissue Nort
hern Blots)(Clontech)をプローブするために使用した。ノザン分析により、精
巣の中にのみ存在する、ほぼ2.8kbのバンドが明らかにされた。
実施例3 ヒトPC4遺伝子のPCRに基づく染色体のマッピング
商業的に入手可能な「ジーンブリッジ4ラディエイション・パネル(GeneBrid
ge 4 Radiation Hybrid Pnel)」(Research Genetics,Inc.、アラバマ州ハン
ツヴィレ)を使用して、ヒトPC4は染色体19にマッピングされた。ジーンブリ
ッジ4ラディエイション・パネルは、93の放射線ハイブリッドクローンの各々
からのDNA、+2つの対照DNA(HFLドナーおよびA12レシピエント)を含有する。
公衆に入手可能なWWWサーバー(http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/
rhmapper.p1)は、ヒトゲノムのゲノムリサーチの地図のためのホワイトヘッド
研究所/MITセンター(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research'm
ap of human genome)(”WICGR”ヒトゲノム地図)(これはジーンブリッジ4ラデ
ィエイション・パネルを使用して構築された)に関するマッピングを可能とする
。
「ジーンブリッジ4RHパネル」でヒトPC4をマッピングするために、20μlの
PCR反応を96ウェルのマイクロタイタープレート(Stratagene)中で構成し、
「ロボサイクラー・グラディエント(RoboCycler Gradient)96」サーマルサイク
ラー(Stratagene)中で使用した。95のPCR反応の各々は、2μlの10×Kle
n Taq PCR反応緩衝液(Clontech Laboratories,Inc.、カリフォルニア州パロ
アルト)、1.6μlのdNTP混合物(2.5mMの各々、Perkin-Elmer、フォスターシテ
ィー、カリフォルニア州)、1μlのセンスプライ
マー、ZC13,557(配列番号:11)、1μlのアンチセンスプライマー、ZC13,5
58(配列番号:12)、2μlの”RediLoad”(Research Genetics,Inc.、ア
ラバマ州ハンツヴィレ)、0.4μlの50×Advantage KlenTaq Polymerase MIX(
Clontech Laboratories,Inc.)、25ngの個々のハイブリッドのクローンまたは対
照およびDNAおよび20μlの全体積のためのddH2Oから成っていた。PCRサイク
ラーの条件は次の通りであった:最初の1サイクルの5分の95℃における変性
、35サイクルの1分の95℃における変性、1分の68℃におけるアニーリン
グおよび1.5分の72℃におけるエクステンション、次いで最後の1サイクルの
72℃における7分のエクステンション。反応物を3%のNuSieve GTGアガロー
スゲル(FMC Bioproducts、メイン州ロックランド)上の電気泳動により分離した
。
結果により、ヒトPC4はWICGR放射線ハイブリッド地図上の染色体19フレーム
ワークマーカーIB1264から遠位の10.54cR_3000にマッピングされることが示さ
れた。これは、統合されたLBD染色体19地図(The Genetic Location Data base
,University of Southhampton,WWWサーバー;http//cedar.genetics.soton.ac
.uk/public_html/)上の19p13.3領域に、ヒトPC4を位置決定する。
実施例4 ヒトPC4哺乳動物発現ベクターPPC4-5/pHZ1の構築
哺乳動物細胞においてヒトPC4ポリペプチドを発現させるために、発現ベクタ
ーを調製した。哺乳動物の発現ベクターpHZ1は、SV40初期プロモーターの制御下
にネオマイシン遺伝子、SV40ポリアデニル化部位、メタロチオネイン(MT-1)の
制御下に問題の遺伝子を挿入するための多重クローニング部位(ポリリンカー)
、およびヒト
成長ホルモン(hGHポリアデニル化部位を有する。この発現ベクターは、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション(米国マリイランド州ロックビレ、パー
クローンドライブ12301)に受託されている。
ヒトPC4をPHZ1ポリリンカー中のEcoRI/XbaIの中にサブクローニングした。PHZ
1をEcoRIおよびXhoI(Boehringer-Mannheim)で切断し、次いでQiaquickTMカラム
(Qiagen)によりフラグメントの単離により、ベクターフラグメントを調製した
。実施例1におけるヒトPC4クローンから、1644bpのフラグメント(5’フラグ
メント)を制限酵素EcoRIおよびAatIIで切除した。AatIIは、配列番号:1に開
示するように5'UTRを含むヒトPC4配列の5’末端を与える。ほぼ681bpのPCRフラ
グメントを、実施例1におけるヒトPC4クローンから、ヒトPC4のAatII部位をス
パンするプライマーZC13,359(配列番号:13)およびXbaI部位を含有するプラ
イマーZC13,358を使用して増幅して、配列番号:1に開示するように3'UTRを含
むヒトPC4配列の3’末端を得た。PCR反応の条件は次の通りであった:1サイク
ル、94℃、1分;次いで35サイクル、94℃、30秒,50℃、20秒、7
2℃、30秒;次いで1サイクル、72℃、10分間。PCR生成物をAatIIおよび
XbaIで切断し、フラグメントを前述したように精製して、681bpのPCRフラグメン
ト(3’フラグメント)を発生させた。
切除された5’フラグメントおよび3’フラグメントDNAを、pHZ1ベクターの
フラグメントの中にサブクローニングした。ほぼ20ナノグラムのEcoRI/AatII
消化したヒトPC4の5’フラグメント、ほぼ20ナノグラムのAatII/XbaI消化ヒ
トPC4の3’フラグメント、およびほぼ40ngの対応するベクターフラグメントを
、標準的結合反応緩衝液の条件下に、室温において5時間結合させた。この結合
反応において、1μlを25μlのDH10Bコンピテント細胞(GIBCO BRL、マリイ
ランド州ガイサーバーグ)の中に製造業者のインストラクションに従いエレクト
ロポレートし、100mg/mlのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレート
し、37℃においてインキュベートした。
下記の条件下にプライマーZCl2,634(配列番号:15)およびZC12,945(配列
番号:16)を使用するPCRにより、コロニーをスクリーニングした:1サイク
ル、94℃、1分;次いで25サイクル、94℃、20秒、50℃、30秒、7
2℃、1分;次いで1サイクル、72℃、10分。陽性のクローンのインサート
配列を配列の分析により確認した。製造業者のインストラクションに従いQIAGEN
R Maxiプレプキット(Qiagen)を使用して、大規模のプラスミドの製造を実施し
た。
以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で説明したが、
本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更が可能である。したがって
、本発明は添付された請求の範囲による以外限定されない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,
NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,L
S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ
,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL
,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,
BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,E
E,ES,FI,GB,GE,GH,HU,IL,IS
,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,
LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M
N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU
,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TR,
TT,UA,UG,UZ,VN,ZW
(72)発明者 ジャスパーズ,スティーブン アール.
アメリカ合衆国,ワシントン 98026,エ
ドモンズ,サウスウェスト,ワンハンドレ
ッドフィフティース プレイス 5829
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.下記のアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少な くとも90%同一であるアミノ酸残基の配列を含んでなるヒトプロホルモンコン バーターゼ4ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド: (a) アミノ酸番号114(Ser)からアミノ酸番号443(Ala)までの配列番号 :2に示すアミノ酸配列; (b) アミノ酸番号114(Ser)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号 :2に示すアミノ酸配列; (c) アミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号: 2に示すアミノ酸配列;および (d) アミノ酸番号1(Met)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号: 2に示すアミノ酸配列。 2.前記ポリヌクレオチドが、 (a) ヌクレオチド400からヌクレオチド1389までの配列番号:1に示すア ミノ酸配列; (b) ヌクレオチド400からヌクレオチド2325までの配列番号:1に示すア ミノ酸配列; (c) ヌクレオチド118からヌクレオチド2325までの配列番号:1に示すア ミノ酸配列;および (d) ヌクレオチド61からヌクレオチド2325までの配列番号:1に示すア ミノ酸配列; から成る群より選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。 3.前記ポリヌクレオチドが配列番号:3のヌクレオチド1〜ヌクレオチド22 65からなる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレ オチド。 4.前記ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドが、アミノ酸番号20 (Arg)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸配列に対 して少なくとも90%同一であるアミノ酸残基の配列から本質的に成る、請求項 1に記載の単離されたポリヌクレオチド。 5.前記プロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドがアミノ酸番号20(Arg) からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2に示すアミノ酸残基の配列から 本質的に成る、請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。 6.下記の作用可能に連結された因子: 転写プロモーター; アミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号:2に示す アミノ酸配列に対して少なくとも90%同一であるプロホルモンコンバーターゼ ポリペプチドをコードするDNAセグメント;および 転写ターミネーター; を含んでなる発現ベクター。 7.DNAセグメントに作用可能に連結された分泌シグナル配列をさらに含む、 請求項6に記載の発現ベクター。 8.DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、請求項6に 記載の発現ベクターが導入された培養細胞。 9.融合タンパク質をコードし、下記のDNAセグメントを含んでなるDNA構築物 : 第1DNAセグメント、ここでこのDNAセグメントは、 (a) 残基番号1(Met)〜残基番号21(Pro)の配列番号:2のアミノ酸配列; (b) 残基番号20(Arg)〜残基番号113(Arg)の配列番号:2のアミノ酸配 列; (c) 残基番号114(Ser)〜残基番号443(Ala)の配列番号:2のアミノ酸 配列; (d) 残基番号444(Arg)〜残基番号561(Tyr)の配列番号:2のアミノ酸 配列; (e) 残基番号562(Tyr)〜残基番号755(Tyr)の配列番号:2のアミノ酸 配列; (f) 残基番号114(Ser)〜残基番号755(Tyr)の配列番号:2のアミノ酸 配列; (g) 残基番号20(Arg)〜残基番号755(Tyr)の配列番号:2のアミノ酸配 列; から成る群より選択されるアミノ酸残基の配列に対して少なくとも90%同一で あるポリペプチドをコードする;並びに 少なくとも1つの他のDNAセグメント、このDNAセグメントは追加のポリペプチ ドをコードする、 ここで前記第1および他のDNAセグメントはインフレームで接続されており、 そして 前記融合タンパク質をコードする。 10.下記の作用可能に連結された因子: (a) 転写プロモーター; (b) 請求項9に記載の融合タンパク質をコードするDNA構築物;および (c) 転写ターミネーター; を含んでなるベクターが導入された宿主細胞を培養し;そして DNAセグメントによりコードされる融合タンパク質を回収する; ことを含んでなる方法により製造された融合タンパク質。 11.下記のアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少 なくとも90%同一であるアミノ酸残基の配列を含んでなる単離されたポリペプ チド: (a) アミノ酸番号114(Ser)からアミノ酸番号443(Ala)までの配列番号 :2に示すアミノ酸配列; (b) アミノ酸番号114(Ser)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号 :2に示すアミノ酸配列; (c) アミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号: 2に示すアミノ酸配列;および (d) アミノ酸番号1(Met)からアミノ酸番号755(Thr)までの配列番号: 2に示すアミノ酸配列。 12.前記ポリペプチドがアミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Thr) までの配列番号:2に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一であるア ミノ酸残基の配列から本質的に成る、請求項11に記載の単離されたポリペプチ ド。 13.前記アミノ酸残基の配列がアミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755( Thr)までの配列番号:2に示されている、請求項12に記載の単離されたポリ ペプチド。 14.請求項8に記載の細胞を培養し;そして 前記細胞により生産されたヒトプロホルモンコンバーターゼポリペプチドを単 離する; ことを含んでなるヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドを製造する方 法。 15.請求項6に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養し、ここで前記 細胞はDNAセグメントによりコードされるヒトプロホルモンコンバーターゼポリ ペプチドを発現しかつ被験基質のプロホルモンポリペプチドを共発現し;そして ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドによる被験基質の切断から生 ずる切断産物を検出する; ことを含んでなる、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドのポリペプ チドプロホルモンの基質を決定する方法。 16.in vitroにおいて請求項11に記載のプロホルモンコンバーターゼ4ポ リペプチドを被験基質のプロホルモンポリペプチドと一緒にし;そして ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドによる被験基質の切断から生 ずる切断産物を検出する; ことを含んでなる、ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドのポリペプ チドプロホルモンの基質を決定する方法。 17.請求項6に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養し、ここで前記 細胞はDNAセグメントによりコードされるヒトプロホルモンコンバーターゼポリ ペプチドを発現しかつ、被験試料の存在および非存在において、既知のインジケ ーターのポリペプチドプロホルモンの基質を共発現し;そして 被験試料の存在および非存在において、ヒトプロホルモンコンバーターゼポリ ペプチドによる前記基質の切断から生ずる切断産物のレベルを生物学的または生 化学的アッセイにより比較し;そして 前記被験試料中のヒトプロホルモンコンバーターゼ活性のモジュレーターの存 在を、前記比較から検出する; ことを含んでなる、被験試料中のヒトプロホルモンコンバーターゼポリペプチド 活性のモジュレーターの存在を検出する方法。 18.動物にポリペプチドを接種し、ここで前記ポリペプチドは、 (a) 9〜755アミノ酸から成るポリペプチド、ここで前記ポリペプチドは アミノ酸番号20(Arg)からアミノ酸番号755(Ser)ま での配列番号:2中のアミノ酸の連続する配列に対して少なくとも90%同一で ある; (b) 請求項11に記載のポリペプチド; (c) 配列番号:2の残基番号444(Arg)〜残基番号561(Tyr)に対して少 なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド;および (d) 配列番号:2の残基番号562(Tyr)〜残基番号755(Thr)に対して少 なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド; から成る群より選択され、ここで前記ポリペプチドは動物において免疫応答を引 き出し;そして 前記動物から抗体を単離する; ことを含んでなるヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドに対する抗体 を生産する方法。 19.ヒトプロホルモンコンバーターゼ4ポリペプチドに結合する、請求項1 8に記載の方法により製造された抗体。 20.前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項19に記載の抗体。 21.請求項11に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
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