CZ376099A3

CZ376099A3 - Izolovaný polynukleotid, expresní vektor, buňka, konstrukce DNA, fúzní protein, izolovaný polypeptid, způsob produkce, způsob detekce a protilátka

Info

Publication number: CZ376099A3
Application number: CZ19993760A
Authority: CZ
Inventors: Si Lok; Stephen R. Jaspers
Original assignee: Zymogenetics, Inc.
Priority date: 1998-05-01
Filing date: 1998-05-01
Publication date: 2000-03-15

Abstract

Polynukleotidové a polypeptidové molekuly nové lidské prohormonové konvertázy 4. Polynukleotidy kódující lidskou prohormonovoukonvertázu 4 jsou umístěny na 19. Chromozomu a mohou být např. použity pro určování oblasti v genomu, kteráje spojena s lidskými chorobnými stavy. Způsoby produkce protinů a protilátektéto lidské prohormonové konvertázy 4.

Description

Izolovaný polynukleotid, expresní vektor, buňka, konstrukce DNA, fúzní protein, izolovaný polypeptid, způsob produkce, způsob detekce a protilátka.

Oblast techniky

Mnoho proteinů a hormonů, syntetizovaných ve formě prekurzorů, je přeměňováno na své zralé formy pomocí vysoce specifických proteolytických enzymů ze skupiny prohormonových konvertáz. Tato skupina savčích endoproteáz provádí v buňce štěpení na COOH konci dibazického místa svých substrátových polypeptidů.

Dosavadní stav techniky

Členy této skupiny prohormonových konvertáz (PC) jsou Ca⁺⁺-dependentní serinové proteázy, příbuzné endoproteáze Kex2, jež je specifická pro dibazická místa (Smeekins, S. P., Bio/Technology 11: 182-186, 1993). Mimoto jsou jejich katalytické domény organizovány podobně, jako u bakteriálních subtilyzinů. Bylo nalezeno nejméně šest savčích prohormonových konvertáz a to PC2, PC/3/PC1, PC4, PC5/6, furin/PACE a PACE4 (Smeekins, S. P., Bio/Technology 11: 182-186, 1993, Seidah, N.

G. a kol., Biochimie (France) 76:197-209,1994).

Savčí prohormonové konvertázy působí na široké spektrum prekurzorových molekul, které mají rozmanité biologické aktivity. Jako první substrátový prekurzor byl zjištěn prohormon proinzulínu. Následovalo objevení přes 150 substrátů v organizmech počínaje od kvasinek až po savce; jedná se o neuropeptidy, peptidové hormony, růstové faktory a jejich receptory, plazmatické a koagulační proteiny, obalové proteiny retrovirů a buněčné toxiny, např. antrax. Štěpná místa obsahují bazické aminokyseliny, přičemž ke štěpení dochází u párů bazických zbytků, obvykle za Lys-Arg nebo Arg-Arg, méně často Arg-Lys nebo Lys-Lys (Smeekins, S. P., Bio/Technology 11: 182-186, 1993).

Prohormonové konvertázy patřící do této skupiny vykazují tkáňově specifickou expresi a jsou v buňce rozmístěny na určitých místech (v kompartmentech), což může souviset s biologickou funkcí. Např. PC 1/3 a PC2 jsou exprimovány pouze v neuroendokrinních tkáních. Biologické aktivity těchto proteinů jsou spojeny s regulační sekretorickou dráhou v neuroendokriních buňkách, specielně v sekrečních granulích a obě hrají důležité role při zpracování prekurzorů v granulích jako je proglukagon, proopiomelanokortin (POMC) a proinzulín. Vnitrobuněčná lokalizace a • · · • * ·

tkáňová specificita se tedy zdají odrážet to, kde se projevují biologické aktivity těchto proteáz.

PC4 vykazuje vysoce specifickou tkáňovou selektivitu genové exprese. PC4 byla izolována z myší a krys a je exprimována pouze ve varlatech. U myší nastává exprese PC4 genu okolo 20. dne březosti, což odpovídá prvním stádiím spermatogeneze. Vysoké hladiny exprese PC4 mRNA jsou nacházeny v zárodečných buňkách, nikoli však v Leydigových, Sertoliho nebo peritubulárních buňkách. Hybridizace in šitu ukazuje expresi mRNA ve spermatocytech, které jsou v pachytenním stádiu miózy, a také v okrouhlých spermatidech, nikoli však v prodloužených spermatidech (N. G. Seidach a kol., Mol. Endocrinol. 6: 1559-1570, 1992). Navíc byly jak v myších tak v krysách pozorovány tři druhy PC4 mRNA; tyto RNA jsou pravděpodobně odvozeny pomocí různého sestřihu anebo jako důsledek přeskoku exonů. Biologická funkce myších a krysích proteinů PC4, odvozených pomocí základního nebo alternativního sestřihu mRNA není známa.

Spermatogeneze je postupný proces, odehrávající se v semenných kanálkách, kde zárodečné buňky (nebo pohlavní buňky) nakonec dozrávají ve spermie. Peptidy vytvářené uvnitř varlat jsou potenciální parakrinní a autokrinní faktory, zprostředkující interakce mezi buňkami varlat. Většina z těchto známých potenciálních peptidových substrátů je produkována uvnitř v Leydigových a Sertoliho buňkách, které nejsou zárodečnými buňkami. Sertoliho buňky, umístěné uvnitř semenných kanálků, jsou v kontaktu se zárodečnými buňkami a mohou přímo produkovat faktory specifické pro varlata, které ovlivňují dozrávání zárodečných buněk. Ostatní faktory, které ovlivňují zárodečné buňky mohou být parakrinní nebo autokrinní faktory; mnoho z těchto molekul produkovaných vně semenných kanálků je transportováno do bezprostředního okolí zárodečných buněk pomocí transportních a vazebných proteinů, exprimovaných Sertoliho buňkami. Navíc parakrinní faktory, které procházejí buněčnou bariérou a vstupují do bezprostředního okolí zárodečných buněk, obsahují molekuly vylučované z Leydigových buněk. Leydigovy buňky jsou umístěny v prostoru mezi semennými kanálky a produkují několik faktorů, jež mohou hrát důležitou roli v procesech zrání, jako je testosteron, Leydigův faktor, IGF-1, inhibin a prohibin. Tyto a jiné faktory mohou působit specificky v průběhu určitého stádia spermatogenního cyklu. Navíc některé peptidové hormony, exprimované v zárodečných buňkách, které jsou umístěny v těsné blízkosti Sertoliho buněk, jsou potenciální parakrinní a autokrinní faktory,

• · · ·

zprostředkující interakce mezi buňkami varlat. Např. peptidy opioidů, POMC a proenkefalin jsou exprimovány a pravděpodobně zpracovány v zárodečných buňkách. Zajímavé je, že myší proenkefalin má v průběhu spermatogeneze podobný průběh exprese mRNA jako myší PC4 (S. Torii a kol., FEBS Let. 316: 12-16, 1993). Exprese myší PC4, závislá na časovém intervalu, ukazuje na biologickou roli při zpracování prohormonových faktorů z varlat. Ačkoli je předpokládáno, že PC4 má roli v průběhu spermatogeneze, přesná funkce PC4 není známa.

Proto je tedy hledán lidský homolog. Předkládaný vynález popisuje způsob izolace lidského analogu k myšímu PC4.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález popisuje izolovaný polynukleotid, kódující lidský polypeptid prohormonu konvertázy 4, který obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším z 90 % shodná s některou aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny, která obsahuje:

a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 443 (Ala);

b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 755 (Thr);

c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr) a

d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) po aminokyselinu číslo 755 (Thr).

V jiném provedení, izolovaný polynukleotid lidského prohormonu konvertázy 4, uvedený výše, je vybrán ze skupiny, která obsahuje:

a) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 400 po nukleotid 1389;

b) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 400 po nukleotid 2325;

c) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 118 po nukleotid 2325 a

d) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 61 po nukleotid 2325;

V jiném provedení, izolovaný polynukleotid lidského prohormonu konvertázy 4, uvedený výše, obsahuje nukleotid 1 až nukleotid 2325 ze SEQ ID NO; 3. V jiném provedení, izolovaný polynukleotid lidského prohormonu konvertázy 4, uvedený výše, kóduje polypeptid lidského prohormonu konvertázy 4, který obsahuje v podstatě sekvenci aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID NO; 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) do aminokyseliny číslo 755 (Thr). V jiném provedení, izolovaný polynukleotid uvedený výše, kóduje polypeptid lidského prohormonu konvertázy 4, který obsahuje v podstatě sekvenci aminokyselinových zbytků, která je uvedena v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) do aminokyseliny číslo 755 (Thr).

V druhém ohledu předkládaný vynález poskytuje expresní vektor, který obsahuje následující, operačně vázané elementy: promotor transkripce; segment DNA kódující polypeptid prohormonu konvertázy, který je přinejmenším z 90 % shodný s aminokyselinovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) do aminokyseliny číslo 755 (Thr) a terminátor transkripce. V jiném provedení, výše uvedený expresní vektor dále obsahuje sekretorickou signální sekvenci, operačně vázanou k segmentu DNA.

V třetím ohledu předkládaný vynález poskytuje kulturu buněk, do nichž byl vnesen expresní vektor uvedený výše, přičemž buňky exprimují polypeptid, kódovaný segmentem DNA.

V jiném ohledu předkládaný vynález poskytuje DNA konstrukci kódující fúzní protein, přičemž tato DNA konstrukce obsahuje: první DNA segment kódující polypeptid, který je přinejmenším z 90 % shodný se sekvencí, vybranou ze skupiny, která obsahuje:

a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 1 (Met) po zbytek číslo 21 (Pro);

b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 20 (Arg) po zbytek číslo 113 (Arg);

c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 114 (Ser) po zbytek číslo 443 (Ala);

d) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 444 (Ser) po zbytek číslo 561 (Tyr);

• · ·

e) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 562 (Tyr) po zbytek číslo 755 (Thr);

f) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 114 (Ser) po zbytek číslo 755 (Thr);

g) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 20 (Arg) po zbytek číslo 755 (Thr) a přinejmenším jeden další fragment DNA, kódující další polypeptid, přičemž první a další fragmenty DNA jsou spojeny tak, že jejich čtecí rámec navazuje (in frame); a je tak kódován fúzní protein.

V jiném provedení, předkládaný vynález poskytuje fúzní protein, který je produkován postupem, který obsahuje: kultivaci hostitelských buněk, do nichž byl vnesen vektor, obsahující následující, operačně vázané elementy:

a) promotor transkripce

b) DNA konstrukci kódující fúzní protein popsaný výše a

c) terminátor transkripce a izolaci proteinu, kódovaného DNA segmentem.

V jiném ohledu předkládaný vynález poskytuje izolovaný polynukleotid, který obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším z 90 % shodná s některou aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny, která obsahuje:

V jiném provedení, izolovaný polynukleotid, uvedený výše, obsahuje v podstatě sekvenci aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) do aminokyseliny číslo 755 (Thr). V jiném provedení, izolovaný polynukleotid uvedený výše, je uveden v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) do aminokyseliny číslo 755 (Thr).

V jiném ohledu, předkládaný vynález poskytuje způsob produkce polypeptidů lidského prohormonu konvertázy 4, který obsahuje: kultivaci hostitelské buňky, jak bylo uvedeno výše, a izolaci polypeptidů lidského prohormonu konvertázy, produkovaného buňkou.

V jiném ohledu, předkládaný vynález poskytuje způsob určování prohormonových polypeptidů, které jsou substrátem pro polypeptid lidského prohormonu konvertázy 4, který se skládá z: kultivace buňky, do níž byl vnesen výše uvedený expresní vektor, přičemž buňka exprimuje polypeptid lidského prohormonu konvertázy, kódovaný fragmentem DNA a současně exprimuje polypeptid testovacího prohormonu, sloužícího jako substrát; a detekování štěpných produktů, které jsou výsledkem štěpení testovacího substrátu lidským prohormonem konvertázy 4. V jiném provedení, způsob určování prohormonových polypeptidů, které jsou substrátem pro polypeptid lidského prohormonu konvertázy 4, obsahuje: spojení in vitro polypeptidů prohormonu konvertázy 4 podle patentového nároku 11 s polypeptidem testovacího substrátu; a detekování štěpných produktů, které jsou výsledkem štěpení testovacího substrátu polypeptidem lidského prohormonu konvertázy 4.

V jiném ohledu, předkládaný vynález poskytuje způsob detekování přítomnosti modulátoru aktivity polypeptidů lidského prohormonu konvertázy v testovaném vzorku, který obsahuje: kultivace buňky, do níž byl vnesen výše uvedený expresní vektor, jak bylo uvedeno výše, přičemž buňka exprimuje polypeptid lidského prohormonu konvertázy, kódovaný segmentem DNA a současně exprimuje polypeptid známého indikátorového prohormonu, sloužícího jako substrát, v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku; a porovnání hladin štěpných produktů, které jsou výsledkem štěpení substrátu polypeptidem lidského prohormonu konvertázy 4, v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku, buď pomocí biologického nebo biochemického testu; a z tohoto porovnání určení, zda je v testovaném vzorku přítomen modulátor aktivity lidského prohormonu konvertázy.

V jiném ohledu, předkládaný vynález poskytuje způsob produkce protilátky proti polypeptidů lidského prohormonu konvertázy 4, který sestává z: očkování živočicha polypeptidem, vybraným ze skupiny obsahující:

a) polypeptid obsahující 9 až 755 aminokyselin, kde polypeptid je přinejmenším z 90 % shodný s přilehlým úsekem aminokyselin v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) do aminokyseliny číslo 755 (Ser) £·£££ · ££ ££ £ · £ £££· £ £ £ £ ·£££ £ £ ££££ £ ££ £ £ £ ··£··· • £ £ £ £ « ·££ £·£ £££ £·££ ·£ ·· 7

b) polypeptid uvedený výše

c) polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která je přinejmenším z 90 % shodná ke zbytku číslo 444 (Arg), ke zbytku číslo 561 (Tyr) a

d) polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která je přinejmenším z 90 % shodná ke zbytku číslo 562 (Tyr), ke zbytku číslo 755 (Thr) v SEQ ID NO: 2, kde polypeptid vyvolává u živočicha imunitní odpověď; a izolace protilátky z živočicha.

V jiném provedení, protilátka produkovaná výše popsaným způsobem se váže k polypeptidů lidského prohormonu konvertázy 4. V jiném provedení, výše popsaná protilátka je monoklonální protilátka.

V jiném ohledu, předkládaný vynález poskytuje protilátku, která se specificky váže k výše popsanému polypeptidů.

Tyto a další aspekty vynálezu se stanou zřejmější po odvolání na následující podrobný popis vynálezu a připojení kresby.

Před detailním vyložením vynálezu může být pro jeho pochopení užitečné definovat následující pojmy:

Termín „afinitní značka“ (affinity tag) je zde používán k označení takového segmentu polypeptidů, kterým se může připojit ke druhému polypeptidů a umožní tak jeho purifikaci nebo detekci, nebo poskytuje místo pro připojení druhého polypeptidů k substrátu. V principu jakýkoli peptid nebo protein, pro něž jsou k disposici protilátky nebo jiná specifická vazebná činidla, mohou být použity jako afinitní značka. Afinitní značky zahrnují polyhistidinové úseky, protein A (Nilsson a kol., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson a kol., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), glutathion Stransferáza (Smith a Johnson, Gene 67: 31, 1988), afinitní značka Glu-Glu (Grussenmeyer a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 82: 7952-4, 1985), substance P, peptid Flag™ (Hopp a kol., Biotechnology 6: 1204-1210, 1988; dostupné od Eastman Kodak Co. New Haven, CT), peptid, který váže streptavidin nebo další antigenní epitopy či vazebné domény. Pro obecný přehled viz Ford a kol., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. DNA kódující afinitní značky jsou komerčně dostupné od dodavatelů (např. Pharmacia Biotach, Piscataway, NJ).

Termín „alelická varianta“ (allelic variant) je zde používán k označení kterékoli ze dvou či více alternativních forem genu, které se nacházejí na stejném místě na chromozomu. Alelická variace vzniká přirozeně vlivem mutací a může mít za následek • · · · « ·· fenotypický polymorfizmus v rámci populace. Genové mutace mohou být skryté (žádná mutace v kódovaném peptidu) nebo mohou kódovat polypeptidy se změněnou sekvencí aminokyselin. Termín alelická varianta je zde také používán k označení proteinu, kódovaného alelickou variantou genu.

Termín „amino-konec“ (amino-terminal) a karboxy-konec (carboxy-terminal) jsou zde používány k označení pozicí uvnitř polypeptidů. Kde to kontext umožňuje, jsou tyto termíny použity s odkazem na určitou sekvenci nebo část polypeptidů, aby byla označena blízkost umístění nebo relativní poloha. Např. určitá sekvence, která se nachází uvnitř polypeptidů vzhledem k referenční sekvenci směrem ke karboxy-konci, je umístěna blíže karboxy-konci referenční sekvence, ale ne nezbytně na karboxy-konci celého polypeptidů.

Termín „štěpné produkty“ (cleavage products) je zde používán k označení fragmentů prohormonového polypeptidů, vzniklé štěpením nezpracovaného polypeptidů prohormonu pomocí prohormonové konvertázy.

Termín „pár komplement/antikomplement“ (complement/anti-complement pair) označuje neidentické struktury, které vytvářejí za určitých podmínek nekovalentně vázané, stabilní páry. Např biotin a avidin (anebo streptavidin) jsou prototypem členů takového páru komplement/antikomplement. Jinými příklady párů komplement/antikomplement jsou páry receptor/ligand, protilátka/antigen (nebo hapten či epitop), páry antiparalelních polynukleotidů a podobně. Tam, kde je žádoucí následná disociace páru komplement/antikomplement, je výhodné když má pár komplement/antikomplement vazebnou afinitu <10^θ M¹.

Termín „komplementární polynukleotidové molekula“ (complement of the polynucleotide molecule) je molekula polynukleotidu, která obsahuje komplementární bázovou sekvenci a obrácenou orientaci ve srovnání s referenční sekvencí. Např. sekvence 5' ATGCACGGG 3' je komplementární k 5' CCCGTGCAT 3'.

Termín „degenerovaná nukleotidové sekvence“ (degenerate nucleotide sequence) označuje sekvenci nukleotidů, která obsahuje jeden nebo více degenerovaných kodonů (ve srovnání s referenční polynukleotidovou molekulou, kódující polypeptid). Degenerované kodony obsahují různé triplety nukleotidů, ale obecně kódují stejný aminokyselinový zbytek (např. oba triplety GAU a GAC kódují Asp).

• ftftft · ft ·· ftft ftft • ftft ftftft · · ftftft • ftftft · · ft · · · • ftft · · · ······ • ftftft ftft

Termín „DNA konstrukce“ (DNA construct) je jednovláknová nebo dvojvláknová molekula DNA, lineární nebo kruhová molekula DNA, která obsahuje segmenty DNA spojené a sestavené způsobem, který se nenachází v přírodě. DNA konstrukce jsou výsledkem lidské manipulace a jedná se o klony a jiné kopie zmanipulovaných molekul.

Termín „DNA segment“ (DNA segment) je část z větší molekuly DNA, jež má specifické vlastnosti. Např. DNA segment kódující specifický polypeptid je částí delší molekuly DNA jako je plazmid nebo jeho fragment který, když je čten ve směru 5' —> 3', kóduje sekvenci aminokyselin určitého polypeptidů.

Termín „expresní vektor“ (expression vector) je používán k označení DNA molekuly, lineární nebo kruhové, která obsahuje segment kódující žádaný polypeptid, operativně spojený s dalšími segmenty, které zabezpečují jeho transkripci, takovými dalšími sekvencemi jsou sekvence promotoru a terminátoru, mohou to být také jeden či více počátků replikace, jeden či více selekčních znaků, zesilovač transkripce, signál pro polyadenylaci atd. Expresní vektory jsou obecně odvozeny z virové či plazmidové DNA, neno mohou obsahovat elementy obojího původu.

Termín „izolovaný“ (isolated), pokud je aplikován na polynukleotid označuje, že polynukleotid byl odebrán ze svého přirozeného genetického prostředí a je tak zbaven jiných vnějších nebo nežádoucích kódujících sekvencí a je ve formě vhodné pro použití pro geneticky pozměňované systémy, které produkují proteiny. Tyto izolované molekuly jsou oddělené ze svého přirozeného okolí a jedná se o cDNA klony a genomové klony. Izolované DNA molekuly, připravené podle předkládaného vynálezu, jsou zbaveny ostatních genů s nimiž jsou obyčejně spojeny, ale mohou obsahovat přirozeně se vyskytující 5' a 3' nepřekládané oblasti, jako jsou promotory, terminátory a podobně. Určení připojených oblastí bude zřejmé osobám se zkušenostmi v oboru (viz např. Dynan a Tijan, Nátuře 316: 774-78,1985).

„Izolovaný“ polypeptid nebo protein je takový polypeptid nebo protein, který se nachází v jiných podmínkách, než ve svém přirozeném prostředí, jako je např. mimo krev a živočišnou tkáň. Dává se přednost takové formě, kdy izolovaný polypeptid je v podstatě zbaven jiných polypeptidů, zvláště jiných polypeptidů živočišného původu. Dává se přednost, když je polypeptid poskytován ve vysoce purifikované formě, tj. ve více než 90% čistotě, výhodněji v čistotě vyšší než 99%. Pokud je používán v této souvislosti, termín „izolovaný“ nevylučuje přítomnost téhož polypeptidů v alternativních • 4444 4 44 44 ·4

4 4 4 4 4 4 4 · 4 ·

4444 4 4 4444

44 4 4 4 44444»

4 4 4 4 4

444 444 444 4·44 44 44 fyzikálních formách, jako jsou dimery nebo rozdílně gtykosylované či derivatizované formy.

Termín „operativně vázané“ (operably linked), když je používán pro DNA segmenty, znamená, že segmenty jsou uspořádány tak, že fungují ve shodě s jejich zamýšleným účelem, např. transkripce začíná na promotoru a prochází kódujícím segmentem až k terminátoru.

Termín „ortolog“ (ortholog) označuje polypeptid nebo protein získaný z jednoho druhu, který je funkčním protějškem polypeptidu nebo proteinu z jiného druhu. Sekvenční odchylky mezi ortology jsou důsledkem druhové diferenciace.

„Paralogy“ (paralogs) jsou odlišné, ale strukturálně příbuzné proteiny vytvářené organizmem. Má se za to, že paralogy vznikají pomocí genové duplikace. Např. aglobin, β-globin a myoglobin jsou navzájem paralogy.

„Polynukleotid“ je jednovláknový nebo dvojvláknový polymer ribonukleotidových nebo deoxyribonukleotidových bází, čtený od 5'konce k 3'konci. Polynukleotidy zahrnují DNA a RNA a mohou být izolovány z přírodních zdrojů, syntetizované in vitro nebo připravené kombinací přirozených a syntetických molekul. Velikosti polynukleotidů jsou vyjadřovány v párech baží (zkráceně „bp“), nukleotidech („nt“) nebo kilobazích („kb“). Kde to kontext umožňuje, poslední dva termíny mohou označovat polynukleotidy, které jsou jednovláknové nebo dvojvláknové. Pokud je termín používán pro dvojvláknové molekuly, používá se k popisu celkové délky a je zřejmé, že je ekvivalentní termínu „páry baží“. Osobám se zkušenostmi v oboru bude zřejmé, že dvě vlákna dvojvláknového polynukleotidu se mohou slabě odlišovat délkou a že jejich konce mohou být pozměněny následkem enzymatického štěpení; tedy všechny nukleotidy v dvojvláknové polynukleotidové molekule nemusí být párovány.

„Polypeptid“ je polymer aminokyselinových zbytků spojených peptidovými vazbami, ať jsou vytvořeny přirozeně nebo synteticky. Polypeptidy směně než 10 aminokyselinovými zbytky se obecně označují jako „peptidy“.

Termín „promotor“ (promotér) je zde používán k označení části genu, která obsahuje sekvence DNA, umožňující vazbu RNA polymerázy a zahájení transkripce. Promotorové sekvence jsou obecně, ale nikoli vždy, nacházeny na 5' konci nekódujících oblastí genů.

„Protein“ je makromolekula, obsahující jeden nebo více polypeptidových řetězců. Protein může též obsahovat nebílkovinné složky, jako jsou sacharidové skupiny.

• ΒΒΒΒ Β »» ·* 99 ♦ Β » · · * · Β * Β Β ••99 · 9 9 · 9 ·

Β ΒΒ 9 Β Β ΒΒΒ Β9Α

ΒΒΒΒ Β Β

ΒΒΒ 999 99Β ·«·· 99 ΒΒ

Sacharidy a ostatní nebílkovinné substituenty mohou být přidány k proteinu buňkou, v níž je protein vytvořen a bude varírovat podle typu buňky. Proteiny jsou zde definovány pomocí struktury svých aminokyselin; substituenty jako jsou sacharidové skupiny nejsou většinou upřesněny, nicméně mohou být přítomny.

Termín „sekreční signální sekvence“ (secretory signál sequence) označuje DNA sekvenci kódující polypeptid (sekreční peptid), který jakožto součást většího polypeptidů jej vede sekreční dráhou buňky v níž je syntetizován. Větší polypeptid je běžně během průchodu sekreční drahou štěpen tak, aby byl sekreční peptid odstraněn. Sekreční signální sekvence bude řídit polypeptid na sekreční dráhu buňky, ale může či nemusí řídit polypeptid, obsahující sekvenci, která bude skutečně z buňky vyloučena.

Termín „sestřihová varianta“ (splice variant) je zde používán k označení alternativních forem RNA transkribované z genu. Variace sestřihu vznikají přirozeně tím, že jsou používána různá sestřihová místa v molekule transkribované RNA, nebo méně často mezi odděleně transkribovanými RNA molekulami, a mohou mít za následek několik mRNA transkribovaných z jednoho genu. Sestřihové varianty mohou kódovat polypeptidy se změněnými sekvencemi aminokyselin. Termín sestřihová varianta je zde také používán k označení proteinu, kódovaného sestřihovou variantou mRNA, transkribovanou z genu.

Molekulové hmotnosti a délky polymerů určené nepřesnými analytickými metodami (např. gelovou elektroforézou) budou považovány za přibližné hodnoty. Když je taková hodnota vyjádřena jako „asi“ X nebo „přibližně“ X uvedená hodnota X bude považována za přesnou s rozmezím ±10 %.

Všechny práce, ze kterých zde bylo citováno, jsou zahrnuty v odkazech.

Předkládaný vynález je částečně založen na objevu nové DNA sekvence, která kóduje protein vykazující homologii se skupinou prohormonových konvertáz (např. myší a krysí PC4, PC2, PC1, furin). Tato DNA sekvence byla označena jako lidská prohormonová konvertáza 4, zde zkráceně jako „lidská PC4“. Analýza tkáňové distribuce mRNA, která této nové cDNA odpovídá ukázala, že exprese mRNA je omezena na varlata. Taková tkáňově specifická exprese ukazuje na takovou roli prohormonové konvertázy, která zcela nebo částečně zpracovává prohormonové polypeptidy růstových či diferenciačních faktorů na zralé nebo aktivní formy u typů buněk specifických pro varlata a u typů buněk, které se ve varlatech nevyskytují.

• · • · • · · · · • · · · ·

Savčí prohormonové konvertázy mají společné strukturální rysy. Pro přehled viz Smeekins, S. P. Bio/Technology 11:182-186,1993 a Seidah, N., Methods in Enz., 244: 175-188, 1995. Všechny obsahují na svém N-konci sekreční peptid, který řídí protein na sekreční dráhu. Tato oblast je následována doménou Homo-A, která se pravděpodobně účastní při prostorovém formování proteázy. Odstranění domény Homo-A působením autokatalýzy je podstatné pro proteolytickou aktivaci. Za doménou Homo-A následuje katalytická doména, která je podstatná pro aktivitu. Katalytická doména má nejvyšší shodu aminokyselinové sekvence s katalytickou oblastí bakteriálního subtilysinu. Ke katalytické doméně je domén Homo-B, která je také podstatná pro enzymatickou aktivitu. Za touto oblastí, na C-konci, se prohormonové konvertázy strukturálně liší. Funkční role C-koncových oblastí není známa, ale pravděpodobně se podílí na buněčně specifickém a organelově specifickém působení savčích prohormonových konvertáz.

Předkládaný vynález popisuje novou lidskou prohormonovou konvertázu. Analýza lidské cDNA, kódující prohormonovou konvertázu (SEQ ID NO: 1) ukázala otevřený čtecí rámec kódující 755 aminokyselin (SEQ ID NO: 2), která obsahuje předpokládaný sekreční peptid (viz SEQ ID NO: 2 od zbytku 1 (Met) ke zbytku 19 (Val)) a zralý polypeptid (viz SEQ ID NO: 2 od zbytku 20 (Arg) ke zbytku 755 (Thr)). Jak je ukázáno na obrázku, zralý polypeptid je homologický s ostatními členy skupiny endoproteáz Kex2, která zahrnuje krysí a myší PC4, lidský furin, lidský PC1 a lidský PC2. Jak je popsáno výše, tato skupina proteinů je charakterizována konzervovanou katalytickou doménou, podobnou katalytické doméně subtilyzinu (viz SEQ ID NO: 2 od zbytku 114 (Ser) ke zbytku 443 (Ala)) se kterou na NH₂ a COOH konci sousedí oblasti, které jsou méně konzervativní, označované jako doména Homo-A (viz SEQ ID NO: 2 od zbytku 20 (Arg) ke zbytku 133 (Arg)) a doména Homo-A (viz SEQ ID NO: 2 od zbytku 444 (Arg) ke zbytku 561 (Tyr)) (Nakayama a kol., J. Biochem (Tokyo), 109: 803806, 1991). Zbytky Asp, His a Ser v aktivním místě a katalyticky důležitý zbytek Asn, přítomné v krysím a myším PC4 jsou zachovány v lidském PC4 (viz SEQ ID NO: 2, zbytky Asp-158, His-198, Ser-372 a Asn-300). Na základě porovnání lidských prohormonových konvertáz je předpovězeno, že místo, kde dochází ke štěpení signální peptidázou, je za zbytkem 19 (Val). Zachovaná sekvence Arg-Gly Asp (viz SEQ ID NO: 2, zbytky číslo 503 až číslo 505), nacházené ve všech známých savčích prohormonových konvertáz, je přítomna v lidské PC4 (Nakayama a kol., J. Biochem • φ · (Tokyo), 109: 803-806, 1991, a odkazy tam uvedené). Předpokládá se, že lidská PC4 je syntetizována jako prekurzor enzymu (zymogen), který pak prodělává autokatalytické štěpení na C-koncové straně sekvence Arg-Arg-Val-Lys-Arg (SEQ ID NO: 4; viz také SEQ ID NO: 2 od zbytku číslo 109 (Arg) ke zbytku číslo 113 (Arg)) a tak dojde ke vzniku aktivního enzymu. Podobná aktivace zymogenové sekvence je pozorována u Kex2 a krysího PC4 (Nakayama a kol., J. Biochem (Tokyo), 109: 803-806, 1991). Doména na C-konci (víz SEQ ,D NO: 2 od zbytku 562 (Tyr) ke zbytku 766 (Thr)), jedinečná pro lidskou PC4, má nejvyšší sekvenční shodu sfurinem. Funkce této domény může souviset s buněčnou a organelovou specificitou.

Vysoce konzervované aminokyseliny, např. v katalytické doméně lidské PC4, která připomíná katalytickou doménu subtilysinu, mohou být použity jako nástroj pro určování nových členů této skupiny. Např. reverzně transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) může být použita kamplifikaci sekvencí, kódujících konzervovanou doménu, připomínající katalytickou doménu subtilysinu, z RNA získané z různých tkáňových zdrojů nebo buněčných linií. Pro tento účel jsou zvláště vhodné vysoce degenerované primery, navržené podle sekvencí lidské PC4.

Předkládaný vynález také poskytuje polynukleotidové molekuly, jak DNA tak RNA molekuly, které kódují lidské PC4 polypeptidy, které jsou zde uvedeny. Osoby se zkušenostmi z tohoto oboru snadno poznají, že kvůli degeneraci genetického kódu, jsou možné mezi těmito polynukleotidovými molekulami výrazné variace v sekvencích. SEQ ID NO: 3 je degenerovaná DNA sekvence, která zahrnuje všechny DNA, které kódují polypeptid lidské PC4 ze SEQ ID NO: 2. Osoby se zkušenostmi z tohoto oboru poznají, že degenerovaná sekvence SEQ ID NO: 3 taká poskytuje všechny RNA sekvence, kódující SEQ ID NO: 2 záměnou U za T. Tedy polynukleotidy, kódující polypeptid lidské PC4, obsahující nukleotidy 1 až 2265 ze sekvence SEQ ID NO: 3 a jejich RNA ekvivalenty, jsou zamýšlenými předměty předkládaného vynálezu. Tabulka 1 uvádí jednopísmenkové kódy, užívané v SEQ ID NO: 3 k označení pozic degenerovaných nukleotidů. „Označení“ jsou nukleotidy, označené příslušným písmenem kódu. „Komplement“ uvádí kód pro komplementární nukleotid(y). Např. kód Y označuje buď C nebo T, a jeho komplement R označuje buď A nebo G, kdy A je komplementární k T a G je komplementární k C.

• · · · ···

Tabulka 1

Nukleotid	Označení	Nukleotid	Označení
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
S	G/C	S	G/C
W	A/T	W	A/T
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/T

· · · 4 · · · 4 4 ·· • · 4 · · · · · · · · • 4 44 4 · · 4 4 · • 4· · · 4 ······

Degenerované kodony použité v SEQ ID NO: 3, zahrnující všechny možné kodony pro dané aminokyseliny, jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Amino-	Jednopísmenový	Kodony Degenerovaný
kyselina	kód			kodon
Cys	C	TGC TGT		TGY
Ser	S	AGC AGT	TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC	ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC	CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC	GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC	GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT		AAY
Asp	D	GAC GAT		GAY
Glu	E	GAA GAG		GAR
Gin	Q	CAA CAG		CAR
His	H	CAC CAT		CAY
Arg	R	AGA AGG	CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG		AAR
Met	M	ATG		ATG
Ile	I	ATA ATC	ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC	CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC	GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT		TTY
Tyr	Y	TAC TAT		TAY
Trp	w	TGC		TGC
Ter		TAA TAG	TGA	TRR
Asn/Asp	B			RAY
Glu/GIn	Z			SAR
kterýkoli	X			NNN

• ♦ · ·

Kdo má zkušenosti z tohoto oboru si je vědom, že existují nejednoznačností při označování degenerovaných kodonů, které reprezentují všechny možné kodony, kódující každou aminokyselinu. Např. degenerovaných degenerovaný kodon pro serin (WSN) může, za určitých okolností, kódovat arginin (AGR) a degenerovaný kodon pro arginin (MNG) může, za určitých okolností, kódovat serin (AGY). Podobný vztah existuje mezi kodony kódujícími fenylalanin a leucin. Tedy některé polynukleotidy, obsahující degenerovanou sekvenci, mohou kódovat různé aminokyselinové sekvence, ale osoba se zkušenostmi z tohoto oboru je schopna snadno určit takové variantní sekvence vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 2. Funkčnost těchto variantních sekvencí může být snadno testována, jak je zde dále popsáno.

Kdo má zkušenosti z tohoto oboru si je vědom, že různé druhy mohou vykazovat „přednostní užívání kodonů“, Pro obecný přehled viz Grantham, a kol., Nuc. Acids Res. 8:1893-912,1980; Haas, a kol., Curr. Biol. 6:315-24,1996; Wain-Hobson, a kol., Gene 13: 355-64,1981; Grosjan a Fiers, Gene 1á: 199-209,1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; lkemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Termín „přednostní užívání kodonů“ nebo „přednostně užívané kodony“ je termín z tohoto oboru označující, ty translační kodony, které jsou nejčastěji používány v buňkách určitých druhů, kdy je favorizován jeden nebo více zástupců možných kodonů, kódujících každou aminokyselinu (viz tabulka 2). Např. aminokyselina threonin (Thr) může být kódována ACA, ACC, ACG nebo ACT, ale v savčích buňkách je nejběžněji užívaným kodonem ACC; u jiných druhů, např. ve hmyzích buňkách, kvasinkách, virech nebo bakteriích mohou být přednostně užívané odlišné kodony. Přednostně užívané kodony pro určité druhy mohou být vneseny do polynukleotidů předkládaného vynálezu pomocí různých postupů, v tomto oboru známých. Zavedení sekvencí přednostně užívaných kodonů do rekombinantní DNA může např. zvýšit produkci proteinu tím, že učiní translaci proteinu v určitém typu buňky nebo druhu efektivnější. Proto degenerované kodony, uvedené v SEQ ID NO: 3 slouží jako matrice pro optimalizaci exprese polynukleotidů v různých typech buněk a druzích, obecně v tomto oboru používaných a zde popsaných.

Při výhodném provedení tohoto vynálezu budou izolované polynukleotidy hybridizovat za přísných hybridizačních podmínek s podobně velikými oblastmi v SEQ ID NO: 1 nebo v sekvenci k ní komplementární. Obecně jsou přísné hybridizační podmínky vybrány tak, že jsou o 5 °C nižší než je hodnota tání (T_M) pro určitou sekvenci při definované iontové síle a pH. Tm je taková teplota (při definované iontové • · · · síle a pH), při níž 50 % cílových sekvencí hybridizuje s přesně odpovídající sondou. Typické přísné hybridizační podmínky jsou takové, kdy koncentrace NaCl je nad 0,03 M při pH 7 a teplota je přinejmenším 60 °C.

Jak bylo již dříve zmíněno, izolované polynukleotidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují jak DNA tak RNA. Metody pro přípravu DNA a RNA jsou v oboru dobře známy. Obecně řečeno, RNA je izolována z tkání nebo buněk, které vytvářejí velká množství RNA pro lidskou PC4. Takové tkáně a buňky jsou určovány pomocí blotování typu Northern (Thomas, Proč. Natí. Acad, Sci. USA 77: 5201, 1980) a jedná se o tkáň z varlat a buněčné linie z varlat odvozené. Celková RNA je připravena za pomoct extrakce guanidinem-HCI, po níž následuje centrifugace v gradientu CsCI (Chirgwin a kol., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Z celkové RNA je připravena póly (A)⁺RNA podle metody Aviv a Leder (Proč. Nati. Acad, Sci. USA 69: 1408-1412, 1972). Komplementární DNA (cDNA) je z póly (A)⁺ RNA připravena pomocí známých metod. Jinou možností je izolace genomové DNA. Polynukleotidy, kódující polypeptidy lidské PC4, jsou pak určeny a izolovány např. hybridizaci nebo PCR.

Klon, obsahující celou DNA kódující lidskou PC4, může být získán běžnými klonovacími postupy. Výhodnější jsou klony, obsahující komplementární DNA (cDNA), třebaže pro některé aplikace (např. exprese v transgenních živočiších) může být výhodnější použít genomové klony nebo modifikovat cDNA klon tak, aby obsahoval přinejmenším jeden genomový intron. Metody přípravy cDNA klonů a genomových klonů jsou dobře známy a jsou součástí běžné zkušenosti v tomto oboru, zahrnují využití zde popsaných sekvencí nebo jejich částí pro testování nebo vytváření knihovny. Expresní knihovny mohou být testovány pomocí protilátek proti lidské PC4, pomocí fragmentů receptorů nebo pomocí jiných specifických vazebných molekul. Předkládaný vynález také umožňuje izolaci lidských genomových sekvencí, kódujících lidskou prohormonovou konvertázu 4. Sondy odvozené z SEQ ID NO: 1 se mohou použít pro hromadné průzkum genomových knihoven, připravených z lidských zdrojů při klonování lidských genomových sekvencí lidské PC4, pomocí standardních postupů v tomto oboru známých a zde uvedených.

Osobám se zkušeností v oboru bude zřejmé, že sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 představují jednu alelu lidské PC4 a že je možno očekávat existenci alelické variability a alternativního sestřihu. Alelické varianty této sekvence mohou být klonovány po průzkumu cDNA nebo genomových DNA knihoven pocházejících

• * · • · · ·· ·

z různých jedinců, za použití standardních postupů. Alelické varianty DNA sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, včetně těch, které obsahují skryté mutace a těch, v nichž mutace mají za následek změny v sekvenci aminokyselin, se považují za sekvence patřící do rozsahu předkládaného vynálezu, stejně tak jako proteiny, které jsou alelickými variantami SEQ ID NO: 2.

Předkládaný vynález také poskytuje sestřihové varianty mRNA izolovaných polynukleotidů, které se mohou vyskytovat přirozeně jako výsledek genové exprese lidské prohormonové konvertázy 4. cRNA vytvořené z alternativně sestřižených mRNA, které si zachovají vlastnosti lidského PC4 polypeptidů, se považují za sekvence patřící do rozsahu předkládaného vynálezu, stejně tak jako polypeptidy, které jsou kódované těmito cDNA a mRNA. Sestřihové varianty této sekvence mohou být klonovány po otestování lidských cDNA knihoven, např. lidské knihovny lidské cDNA z varlat, pomocí standardních postupů.

Předkládaný vynález také poskytuje izolované polypeptidy lidské prohormonové konvertázy 4, které jsou v podstatě homologické s polypeptidy ze SEQ ID NO: 2 a jejich orthology. Přednost je dávána formě, kdy izolovaný polypeptid je v podstatě zbaven ostatních polypeptidů, zvláště ostatních polypeptidů živočišného původu. Přednost je dávána tomu, když jsou polypeptidy poskytnuty ve vysoce čištěné formě, např. více než v 95% čistotě, výhodněji více než v 99% čistotě. Termín „v podstatě homologické“ je zde používán pro označení polypeptidů, které mají přinejmenším 85% sekvenční shodu se sekvencemi ukázanými v SEQ ID NO: 2 nebo se sestřihovými variantami SEQ ID NO: 2. Bude výhodnější, když takové polypeptidy budou mít přinejmenším 90% a nejvýhodnější, budou-li mít 95% nebo větší sekvenční shodu s SEQ ID NO: 2 nebo se sestřihovými variantami SEQ ID NO: 2. Procento sekvenční shody je určováno běžnými metodami. Viz např. Altschul a kol., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 a Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 89: 10915-10919, 1992. Krátce řečeno, aminokyselinové sekvence jsou přiřazovány tak, aby bylo optimalizováno porovnávací skóre za použití penalizace mezery faktorem 10, penalizace prodloužení faktorem 1 a vyhodnocovací matrice „blosum 62“ z práce Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 89: 10915-10919, 1992, jak je uvedena v tabulce 3 (aminokyseliny jsou označovány standardními jednopísmenkovými kódy).

tt 99

I · · ·

I · · · ··9 9 9 9

9

9 99 • · » · • ··

O) >

>

i— ω

CL

LL xr r- V cm to

IO <N CM o x}- co <\l CM τ- t- CQ (\j * lilii to T cm cm t- co ηmOCM^-t— τ— x— ^_ ' '-s I I I I l

Lf)T— <Oi— <-)T-COCNCM i i i i i i i •^-CMíxIOCOCMt-CMt^-,—

I *—* I I I | I m-cnco^-ococm-^-co-^-cq ^111111111^1 to CM

M M CM CO CO CM

CM CM CO CO lili

LU m cm _o co co

CN CO y °

CO CM CM

I I I

O tncMCM₀cocM,-o<?'7o-'7^cí¹'7^cí^l

O _CDCO'M-CO<Ot-i-CQi-CMCO-i-’i-CMCMiI I I I I I I I I I I I I I I

Q <ocoocn^t7^t7^<?''Í'''7^c?^c?^t7⁰'7'Í'^<?^c?

Z COt-COoOOt-COCOoCMCOCMx-oV^'?

Tabulka 3

CT. mOCMCOT-oCMoCOCMcMT^-COCM^-T^-COCMtO <^'7CMCMo'7'7^c:,cí^lV'7'7'7^cí^,'7^T-oí?^cí^l0 <O£ZQOOLU0X — -JidSLLQ-Wh-^>>

Procento shody optimálního porovnání je vypočítáno jako:

Celkový počet shod

--------------------------------------------------- x100 (délka delší sekvence plus počet mezer vložených do delší sekvence, aby došlo ke srovnání dvou sekvencí)

Sekvenční shoda molekul polynukleotidů je určována podobnými postupy, za pomoci zlomku uvedeného výše.

Jako variantní polypeptidy lidské PC4 nebo v podstatě shodné polypeptidy lidské PC4 jsou charakterizovány jako ty, které mají jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí. Je výhodné, když se v podstatě jedná o malé změny, to je konzervativní aminokyselinové substituce (viz tabulka 4) a jiné substituce, které neovlivňují podstatně prostorové uspořádání nebo aktivitu polypeptidu; malé delece, typicky jedné až 30 aminokyselin; a malá prodloužení na amino-konci nebo karboxykonci, jako je např. prodloužení na amino-konci o methioninový zbytek, malý linker peptid až do 20 až 30 aminokyselin, nebo afinitní značku, jako je malé prodloužení usnadňující purifikaci, jako je polyhistidinový úsek, antigenní epitop nebo vazebná doména. Pro obecný přehled viz Ford a kol., Protein Expression and Purification 2: 95107, 1991. Polypeptidy obsahující afinitní značky mohou dále obsahovat proteolytické štěpné místo mezi polypeptidem lidské PC4 a afinitní značkou. Taková štěpná místa obsahují např. thrombinová štěpná místa a štěpná místa faktoru Xa.

Φφφφφ φ * · φφ ·Φ φφφ · φ · φ φφφφ φφφφ φ « φφφφ φ φ · φ φ φ φφφφφφ • φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφφ φφφφ φφ φφ

Tabulka 4

Konzervativní substituce aminokyselin

Zásadité;	arginin lyzin histidin
Kyselé:	kyselina glutamová kyselina asparagová
Polární:	glutamin asparagin
Hydrofobní:	leucin izoleucin valin
Aromatické:	fenylalanin tryptofan tyrozin
Malé:	glycin alanin serin threonin methionin

Proteiny, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, mohou také obsahovat aminokyselinové zbytky, které se v přírodě nevyskytují. Aminokyselinové zbytky, které se v přírodě nevyskytují jsou mimo jiné trans-3-methylprolin, 2,4-methanoprolin, cis-4hydroxyprolin, trans-4-hydroxyprolin, N-methylglycin, allo-threonin, methylthreonin, hydroxyetylcystein, hydroxyetylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, kyselina pipekolinová, thiazolidin karboxylová kyselina, dehydroprolin, 3- a 4- methylprolin, 3,3dimethylprolin, terc-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4azafenylalanin a 4-fluorofenylalanin. V obory je známo několik metod jak zabudovat do proteinů aminokyseliny, které se přirozeně nevyskytují. Např. lze použít in vitro systém, kde jsou nonsense mutace potlačeny pomocí chemicky aminoacylovaných supresorových tRNA. Metody pro syntézu aminokyselin a aminoacylování tRNA jsou v oboru známé. Transkripce a translace plazmidů obsahujících nonsense mutace je • · ♦ · • ·· • ♦· ·· ·· • · · · « · · · • · · · · · • · · ······ • · · · ··· *··· ·· ·· prováděna v bezbuněčném systému, který obsahuje extrakt E. coli S30 a komerčně dostupné enzymy a ostatní reagencie. Proteiny jsou čištěny pomocí chromatografie. Viz např. Robertson a kol., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman a kol., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung a kol., Science 259: 806, 1993 a Chung a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 90: 10145-9, 1993). V druhé metodě je translace provedena v oocytech žáby Xenopus pomocí mikroinjekce mutované mRNA a chemicky aminoacylovaných supresorových tRNA (Turcatti a kol., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). V rámci třetí metody jsou buňky E. coli pěstovány v nepřítomnosti těch přirozených aminokyselin, které mají být zaměněny (např. fenylalanin) a za přítomnosti žádané aminokyseliny (aminokyselin), které se přirozeně nevyskytují (např. 2azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylaianin nebo 4-fluorofenylalanin). Aminokyselina, které se přirozeně nevyskytuje, je zabudována do proteinu na místo svého přirozeně se vyskytujícího protějšku. Viz Koide a kol., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky mohou být převedeny na přirozeně se nevyskytující druhy pomocí chemické modifikace in vitro. Chemická modifikace může být spojena s místně cílenou mutagenezi, aby byl dále rozšířen rozsah substitucí (Wynn a Richards, Protein Sci. 2: 395-403,1993).

Omezený počet nekonzervativních aminokyselin, aminokyselin, které nejsou kódovány genetickým kódem, aminokyseliny, které se přirozeně nevyskytují a jiné nepřirozené aminokyseliny mohou být substituovány za zbytky aminokyselin v lidské PC4.

Podstatné aminokyseliny v polypeptidech předkládaného vynálezu mohou být určeny pomocí postupů známých v tomto oboru, jako je místně cílená mutageneze nebo mutageneze spojená s vyhledáváním alaninu (Cunningham a Wells, Science 244, 1081-1085, 1989; Bass a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 88: 4498-502, 1991). V posledně jmenované technice je na každém zbytku alaninu v molekule zavedena mutace a u výsledných mutovaných molekul je testována jejich biologická aktivita, jak je popsáno dále, aby byly zjištěny aminokyselinové zbytky, které jsou rozhodující pro aktivitu molekuly. Viz též Hilton a kol., J. Biol. Chem. 271: 4699-708, 1996. Místa v katalytické doméně lidské PC4, důležitá pro interakci se svým substrátem (substráty), mohou být také určena fyzikální analýzou struktury, provedenou takovými technikami jako je nukleární magnetická rezonance, krystalografie, elektronová difrakce nebo fotoafínitní značení, ve spojení s mutacemi na místech domnělých kontaktních ft ftftft· • ft · ftft · • ft ftft • ftft ft • ftft · • ftft ftftft • · aminokyselin. Viz např. de Vos a kol., Science 255: 306-12,1992; Smith a kol., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver a kol., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Na totožnost podstatných aminokyselin může být také usouzeno osobou se zkušenostmi v oboru, na základě homologii s příbuznými prohormonovými konvertázami.

Mohou být provedeny mnohočetné záměny aminokyselin a posléze testovány, za pomoci známých metod mutageneze a hromadného vyšetřování, jako jsou např. uvedené v Reidhaar-Olson a Sauer (Science 241: 53-57, 1988) nebo Bowie a Sauer (Proč. Nati. Acad, Sci. USA 86: 2152-2156,1989). V krátkosti řečeno, tito autoři popsali metody pro současné náhodné obsazení dvou a více pozic v polypeptidů, výběr funkčního polypeptidů a poté sekvenování mutovaných polypeptidů, aby bylo určeno spektrum možných substitucí na každé pozici. Ostatní metody, které lze použít, zahrnují ukázku fága (např. Lowman a kol., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner a kol., U.S. Patent č. 5 223 409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) a mutagenezi zaměřenou do určité oblasti (Derbyshire a kol., Gene 46: 145, 1986; Ner a kol., DNA 7: 127, 1988).

Varianty popsaných sekvencí polypeptidů a DNA pro lidskou PC4 mohou být vytvářeny pomocí metody promíchání DNA (DNA shuffling), jak je popsáno Stemmerem, Nátuře 370: 389-91, 1994; Stemmer, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 91: 10747-51, 1994 a ve WIPO Publication WO 97/20078. Krátce řečeno, varianty DNA jsou vytvářeny in vitro homologní rekombinací náhodně fragmentovaných rodičovských DNA, po které následuje znovusestavení pomocí PCR, což má za následek vnesení náhodných bodových mutací. Tato technika může být dále modifikována, aby byla do procesu vnesena další variabilita tím, že se použije skupina rodičovských DNA, jako jsou alelické varianty nebo DNA z různých druhů. Výběr nebo hromadné testovávání při zjišťování požadované aktivity, následovaný dalšími opakovanými kroky mutageneze a testování, umožňuje rychlou „evoluci“ sekvencí tím, že jsou vybírány požadované mutací a současně selektováním odstraňovány nežádoucí změny.

Metody mutageneze, jak jsou zde uvedeny, mohou být kombinovány s automatizovanými vyhledávacími metodami, schopnými zpracovat velké množství vzorků, aby byla detekována aktivita klonovaných, mutovaných polypeptidů v hostitelských buňkách. Mutované molekuly DNA, které kódují aktivní polypeptidy (např. štěpí známý indikátorový polypeptidový substrát), mohou být získány z hostitelské buňky a pomocí moderního vybavení rychle určena jejich sekvence. Tyto

ΦΦ φφ • φ φ φ • φ φ φ φφ φ φ φ φ • φ φφ φφ metody umožňují rychlé určení důležitosti jednotlivých aminokyselinových zbytků ve studovaném polypeptidu a tyto poznatky mohou být aplikovány na polypeptidy s neznámou strukturou. Navíc, tyto mutační metody lze použít pro vytváření proteinů se změněnou reakční kinetikou, omezit či rozšířit jejich substrátovou specificitu nebo změnit tkáňovou a buněčnou lokalizaci polypeptidu, jako je lidská prohormonová konvertáza 4.

Za použití metod probíraných výše, mohou osoby se zkušenostmi v oboru připravit rozmanité polypeptidy, které jsou v podstatě homologní ke zbytkům 1 až 755 v SEQ ID NO: 2 nebo alelických variantách či sestřihových variantách této sekvence, a zachovat přitom aktivitu divokého typu proteinu.

Navíc, za použití metod popsaných v tomto oboru, jsou konstruovány fúzní proteiny nebo hybridní proteiny prohormonových konvertáz, za použití oblastí nebo domén v tomto vynálezu uvedené lidské prohormonové konvertázy 4 v kombinaci s oblastmi nebo doménami jiných známých nebo neznámých proteinů prohormonových konvertáz (např. PC2 a PC1) nebo heterologních proteinů (Sambrook a kol., tamtéž, Altschul a kol., tamtéž, Pickard, D., Cur. Opin. Biology 5: 511-515, 1994 a tam uvedené odkazy). Tyto metody umožňují určovat biologickou důležitost větších domén nebo oblastí ve studovaném polypeptidu. Takové hybridy mají změněnou reakční kinetiku, omezenou či rozšířenou substrátovou specificitu, změněnou tkáňovou a buněčnou lokalizaci polypeptidu, a mohou být použity na polypeptidy s neznámou strukturou.

Fúzní proteiny lze připravit postupy, které jsou známy osobám, majícím zkušenosti z tohoto oboru. Polynukleotidy, kódující jednotlivé složky fúzního proteinu s vhodným čtecím rámcem mohou být připraveny známými postupy a exprimovány pomocí metod zde popsaných. Např. část nebo celá doména nesoucí biologickou funkci, může být zaměněna mezi lidskou PC4, která je předmětem tohoto vynálezu, za odpovídající doménu z jiné prohormonové konvertázy, jako je např. PC2 nebo PC1. Takové domény jsou mimo jiné sekreční signální sekvence, Homo-A doména, katalytická doména, Homo-B doména a C-koncová část molekuly, které jsou zde popsány. Jedna nebo několik domén, takových, jako jsou popsány výše, může být zaměněno tím, že jsou spojeny polynukleotidové úseky s vhodným čtecím rámcem, čímž je vytvořen úsek DNA kódující několik domén fúzního proteinu. Postupu pro vytvoření takového fúzního proteinu jsou v oboru dobře známy (Sambrook a kol., tamtéž, Altschul a kol., tamtéž, Pickard, D., tamtéž). Tyto fúzní proteiny obsahují • ·· ·· ·· • · · · · £ £ £ £ « £ £ £ £ • £ · £·£££· £ £ £ £ £·· ···· ££ ££ přinejmenším jednu doménu z lidské PC4 a dá se očekávat, že jejich funkční profil se shoduje nebo je podobný polypeptidům, které jsou předmětem tohoto vynálezu, nebo jiným známým nebo neznámým proteinům prohormonových konvertáz (např. PC2 a PC1), v závislosti na způsobu konstrukce fúze. Navíc mohou takové fúzní proteiny vykazovat jiné vlastnosti, jak bylo uvedeno výše.

Pro kterýkoli polypeptid lidské PC4, včetně variant a fúzních proteinů, může osoba s běžnou zkušeností z tohoto oboru za pomoci informací zde popsaných a výše uvedených v tabulkách 1 a 2, snadno vytvořit plně degenerovanou polynukleotidovou sekvenci, kódující tuto variantu.

Polynukleotidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, včetně polypeptidů o plné délce, biologicky aktivních fragmentů a fúzních polypeptidů, mohou být pomocí běžných postupů produkovány v geneticky manipulovaných hostitelských buňkách. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou takové typy buněk, které mohou být transformovány nebo transfekovány pomocí exogenní DNA a rostou v kulturách, jedná se mimo jiné o bakterie, buňky hub a kultivované vyšší eukaryotické buňky. Přednost mají eukaryotické buňky, zvláště kultivované buňky mnohobuněčných organizmů. Techniky pro manipulování s klonovanými DNA molekulami a vnášení exogenní DNA do rozličných hostitelských buněk jsou uvedeny v Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Ausubai a kol., eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987.

Obecně řečeno, DNA sekvence, kódující polypeptid lidské prohormonové konvertázy 4 je operativně vázán k jiným genetickým elementům v expresním vektoru, které jsou vyžadovány pro jeho expresi, obecně se jedná o transkripční promotor a terminátor. Vektor také bude obecně obsahovat jeden nebo více selekčních znaků a jeden nebo více počátků replikace, ačkoli osobám se zkušenostmi z tohoto oboru je zřejmé, že u některých systémů se selekční znaky nacházejí na oddělených vektorech, a replikace exogenní DNA může být umožněna začleněním do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, selekčních znaků, vektorů a ostatních elementů je záležitost běžného navrhování, závisejícího na úrovni zkušenosti v oboru. Mnoho těchto elementů je popsáno v literatuře a jsou dostupné od komerčních dodavatelů.

Pro zavedení polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4 do sekreční dráhy hostitelské buňky poskytuje expresní vektor sekreční signální sekvenci (také známa • 44 ·· ·· • · · 4 4 · · 4 • 4 4 · · · • 4 4 444444 • · 4 4

444 4444 44 44 jako „leader“ sekvence, „prepro“ sekvence nebo „pre“ sekvence). Sekreční signální sekvence může být přímo z polypeptidu lidské prohormonové konvertázy 4, nebo může být odvozena od jiného proteinu, směřujícího do sekreční dráhy (např. t-PA) nebo může být syntetizována de novo. Sekreční signální sekvence je připojena k DNA sekvenci lidské prohormonové konvertázy 4 ve správném čtecím rámci a umístěna tak aby řídila nově syntetizovaný polypeptid do sekreční dráhy hostitelské buňky. Sekreční signální sekvence jsou obecně umístěny proti směru přepisu od DNA sekvence, kódující žádaný polypeptid, třebaže určité sekreční signální sekvence mohou být umístěny ve studované DNA sekvenci jinde (viz např. Welch a kol., U.S. Patent No. 5 037 743; Holland a kol., U.S. Patent No. 5 143 830).

Jinou možností je použít sekreční signální sekvenci, obsaženou v polypeptidech, které jsou předmětem tohoto vynálezu, k zavedení jiných polypeptidů na sekreční dráhu. Signální fúzní polypeptid může být vytvořen, když sekreční signální sekvence, kódující aminokyselinové zbytky 1 (Met) až 19 (Val) ze SEQ ID NO: 2, je za pomoci metod známých v tomto oboru a zde uvedených, operativně spojena s DNA úsekem, kódujícím jiný polypeptid. Je výhodné, když sekreční peptid, obsažený ve výsledných fúzních polypeptidech, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je připojen k amino-konci přidaného peptidu, aby mohl nasměrovat přidaný peptid na sekreční dráhu. Takové konstrukce mají mnoho uplatnění, známých v tomto oboru. Např. tyto nové fúzní konstrukce se sekreční signální sekvencí mohou řídit např. sekreci vylučování aktivních složek proteinů, normálně zcela nevylučovaných, jako receptor na buněčném povrchu, nebo jiný nevylučovaný protein. Tyto fúzní konstrukce mohou být použity in vivo nebo in vitro pro řízení peptidů sekreční dráhou.

Kultivované savčí buňky jsou vhodnými hostiteli pro účely tohoto vynálezu. Metody pro vnesení vnější DNA do savčí hostitelské buňky zahrnují transfekci za pomocí fosforečnanu vápenatého (Wigler a kol., Cell 14: 725, 1978; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham a Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporace (Neumann a kol., EMBO J. 1: 841-845, 1982), transfekci za pomocí DEAE-dextranu (Ausubel a kol., EMBO J. 1: 841-845, 1982) a transfekci zprostředkovanou lipozómy (Hawley-Nelson a kol., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone a kol., Focus 15: 80, 1993 a virovými vektory (Miller a Rosman, BioTechniques 7: 98090, 1989; Wang a Finer, Nátuře Med. 2: 714-6, 1996). Vytváření rekombinantních polypeptidů v kultivovaných savčích buňkách je popsáno např. Levinsonem a kol., U.S.

• · » » · • Φ · • · ·· • φ · φ φ φ φ φ • · · * φ · φ φ φ

Φ· φφ

Patent No. 4 713 339; Hagenem a kol., U.S. Patent No. 4 784 950; Palmiterem a kol., U.S. Patent No. 4 577 821 a Ringoldem, U.S. Patent No. 4 656 134. Vhodnými kulturami savčích buněk jsou buněčné linie COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573); Graham a kol., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) a buňky z vaječníků čínských křečků (Chinese hamster ovary celíš) (např. CHO-K1; ATCC No. CCL 61). Další výhodné buněčné linie jsou kultury buněk z varlat, včetně delfíních buněk DBI.Tes (CRL-6258); myších buněk GC-1 spg (CRL-2053); buněk TM3 (CRL1714); buněk TM4 (CRL-1715) a prasečí buňky ST (CRL-1746), dostupné v Americké sbírce typových kultur, Rockwille, MD. Další vhodné buněčné linie jsou v tomto oboru známy a jsou dostupné ve veřejně přístupných sbírkách, jako je Americká sbírka typových kultur, Rockwille, MD. Obecně je dávána přednost silným promotorům transkripce, jako jsou promotory z SV-40 nebo cytomegaloviru. Viz např. U.S. Patent No. 4 956 288. Další vhodné promotory jsou z genů pro metallothionein (U.S. Patent No. 4 579 821 a 4 601 978) a větší pozdní promotor adenoviru.

Pro selekci kultivovaných savčích buněk, do nichž byla vložena cizí DNA, se obecně používají léčiva. Takové buňky jsou obecně označovány jako „transfekované“. Buňky, které byly kultivovány v přítomnosti selekčního činidla a jsou schopny přenášet požadovaný gen do svého potomstva, jsou označovány jako „stabilně transfekované“. Výhodný selekční znak je gen kódující rezistenci k antibiotiku neomycinu. Selekce je provedena v přítomnosti léčiva neomycinového typu, jako je G-418 nebo podobně. Selekční systémy je také možno použít pro zvýšení úrovně transkripce požadovaného genu, tento postup se nazývá „amplifikace“. Amplifikace je provedena tak, že se transfekované buňky pěstují za přítomnosti nízkých hladin selekčního činidla, aby došlo k selekci buněk vytvářejících vysoké hladiny produktů vnesených genů. Výhodný amplifikační selekční znak je dihydrofolát reduktáza, která propůjčuje rezistenci proti methotrexátu. Lze také použít i jiné geny pro rezistenci proti léčivům (např. rezistenci proti hygromycinu, rezistenci proti skupině léčiv a rezistenci proti puromycin acetyltransferáze). Alternativní znaky, které navozují změněný fenotyp, jako je zelený fluorescenční protein nebo proteiny buněčného povrchu jako jsou CD4, CD8, třída I MHC, placentární alkalická fosfatáza, mohou být použity pro odlišení transfekovaných buněk od netransfekovaných pomocí postupů jako je třídění FACS nebo separační technologie založené na magnetických perličkách.

• ···· φ ·· ·· φ»

9 9· 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9999

99 9 · 9 999999

9 9 9 9 9

99 99 9 9999999 9 9 9 9

Jako hostitelské buňky lze použít i jiné vyšší eukaryotické buňky, včetně rostlinných buněk, hmyzích buněk a ptačích buněk. Přehled o použití Agrobacterium rhizogenes jako vektoru pro expresí genů v rostlinných buňkách byl publikován v Sinkar a kol., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58,1987. Transformace hmyzích buněk a produkce cizích polypeptidů v nich je uvedena vGuarino a kol., U.S. Patent No. 5 162 222 a v publikaci WIPO WO 94/06463. Hmyzí buňky mohou být infikovány rekombinantním bakulovirem, obecné odvozeným z viru jaderné polyhedrózy (nuclear polyhedrosis virus) Autographa californica (AcNPV). Viz King, L. A. a Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Halí; O'Reilly, D. R. a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; a Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Human Press, 1995. Druhá metoda přípravy rekombinantního bakuloviru s lidskou PC4 používá systém založený na transpozonu a popsaný Luckowem (Luckow, V. A. a kol., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Tento systém, který používá transferové vektory, je prodáván v soupravě Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockwille, MD). Viz Hill-Perkins, M. S. a Possee, R. D., J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning, B. C. a kol., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994 a Chazenbalk, G. D., a Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543, 1995. Navíc transferové vektory mohou obsahovat fúzi v čtecím rámci s DNA kódující epitop tag na C-konci nebo N-konci exprimovaného polypeptidů lidské PC4, např. Glu-Glu epitop tag (Grussenmeyer, T. a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 82: 7952-4, 1985). Za použití postupů známých v tomto oboru, transferový vektor obsahující lidskou PC4 je transformován do E. coli, a získané kolonie testovány na přítomnost bacmidů, které obsahují přerušený gen pro lacZ, což je znamením rekombinantního bakuloviru. DNA bacmidu, obsahujícího rekombinantní bakulovirový genom, je izolována pomocí běžné techniky a použita k transfekci buněk Spodoptera frugiperda, např buněk Sf9. Rekombinantní virus, který exprimuje lidskou PC4 je poté pomnožen. Zásobní štoky rekombinantního viru se pak připraví postupy běžně v oboru používanými.

Rekombinantní virus se používá k infekci hostitelských buněk, typicky buněk odvozených z Spodoptera frugiperda. Pro obecný přehled viz Glick a Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Dalšími vhodnými buněčnými liniemi je buněčná linie High FiveO™ (Invitrogen) odvozená zTrichoplusia ni (U.S. Patent #5 300 435). Pro • ···· * 99 99 99 • · 9 ·· · · 9 9*9 • ··· · 9 9 9 9 9 • · · 9 9 · 999 999 • t 9 9 9 9

999 999 999 9999 99 99 růst a udržování buněk jsou používána komerčně dostupné média bez séra. Vhodná média jsou Sf900 II™ (Life Technologies) nebo ESF 921™ (Expression Systems) pro buňky Sf9; a Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) nebo Express FiveO™ (Life Technologies) pro buňky T. ni. Buňky jsou pěstovány z očkovací hustoty přibližně 2-5 χ 10⁵ buněk, až na hustotu 1-2 χ 10⁶ buněk a v této době je přidán stok rekombinantního viru o multiplicitě infekce (MOI) 0,1 až 10, obyčejně okolo 3. Používané postupy jsou běžně popisované v dostupných příručkách (King, L. A. a Posse, R. D., tamtéž; O'Reilly, D. R. a kol., tamtéž; Richardson, C. D., tamtéž). Následné čištění polypeptidů lidské PC4 ze supernatantu může být dosaženo zde popsanými postupy.

Buňky hub, včetně kvasinkových buněk, mohou být také použity v rámci předloženého vynálezu. Druhy kvasinek, které jsou z tohoto hlediska zvláště zajímavé, jsou Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Pichia methanolica. Postupy pro transformování buněk S. cerevisiae exogenní DNA a produkci rekombinantních polypeptidů v nich jsou uvedeny např. vKawasaki U.S. Patent No. 4 599 311; Kawasaki a kol., U.S. Patent No. 4 931 373; Brake, U.S. Patent No. 4 870 008; Welch a kol., U.S. Patent No. 5 037 743 a Murray a kol., U.S. Patent No. 4 845 075. Transformované buňky jsou vybírány podle fenotypu, určeného selektivním znakem, běžně pomocí rezistence k léčivu nebo schopnosti růst v nepřítomnosti určité živiny (např. leucinu). Vektorový systém výhodný pro použití u Saccharomyces cerevisiae je vektorový systém popsaný Kawasaki a kol. (U.S. Patent No. 4 931 373), který umožňuje, aby transformované buňky byly selektovány růstem v médiu, obsahujícím glukózu. Mezi promotory a terminátory, vhodnými pro použití v kvasinkách, jsou takové, které jsou odvozené z genů glykolytických enzymů (viz např. Kawasaki U.S. Patent No. 4 599 311; Kingsman a kol., U.S. Patent No. 4 615 974 a Bitter, U.S. Patent No. 4 977 092) a genů pro alkohol dehydrogenázy. Viz též U.S. Patent Nos. 4 990 446; 5 063 154; 5 139 936 a 4 661 454. Transformační systémy pro jiné kvasinky, jako jsou Hansenuia polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluveromyces fragilis, Ustilago maydis Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii a Candida maltosa jsou v tomto oboru známé. Viz např. Gleeson a kol., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 a Cregg, U.S. Patent No. 4 882 279. Při použití metod McKnight a kol., U.S. Patent No. 4 935 349 mohou být využity buňky Aspergillus. Postupy pro transformaci Acremonium chrysogenum jsou uvedeny v Sumino a kol., U.S. Patent No. 5 162 228.

Postupy pro transformaci Neurospora jsou uvedeny v Lambowitz, U.S. Patent No. 4 486 533.

Použití Pichia methanolica jako hostitelských buněk pro produkci rekombinantních proteinů je uvedeno v publikacích WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 a WO98/02565. DNA molekuly, používané pro transformování P. methanolica jsou běžně připravovány jako dvojvláknové, kruhové plazmidy, které jsou s výhodou před transformací linearizovány. Pro produkci v P. methanolica je výhodné, když promotor a terminátor v plazmidů pochází z genu P. methanolica, jako je třeba gen P. methanolica pro využití alkoholu (AUG1 nebo AUG2). Jiné vhodné promotory jsou z dihydroxyaceton syntetázy (DHAS), dehydrogenázy kyseliny mravenčí (FMD) a z genů pro katalázy (CAT). Aby se usnadnila integrace DNA do hostitelských chromozómů, je výhodné mít celý expresní segment plazmidů, se kterým na obou koncích sousedí DNA sekvence hostitele. Výhodný selekční znak pro použití v Pichia methanolica je gen ADE2 z P. methanolica, který kóduje fosforibozyl-5-aminoimidazol karboxylázu (AIRC; EC 4.1.1.21), která umožňuje ade2 hostitelským buňkám růst v nepřítomnosti adeninu. Pro průmyslové procesy velkých rozměrů, kdy je žádoucí minimalizovat použití metanolu, je výhodné použít hostitelské buňky, které mají odstraněny oba geny pro využití metanolu (AUG1 a AUG2). Pro produkci sekretovaných proteinů jsou výhodné buňky, kterým chybí geny pro vakuolární proteázu (PEP4 a PRB1). Pro usnadnění vstupu plazmidů, obsahujícího DNA kódující požadovaný polypeptid do buněk P. methanolica, je používána elektroporace. Je výhodné transformovat buňky P. methanolica pomocí elektroporace, která užívá exponenciálně klesající, pulzní elektrické pole, které má napětí mezi 2,5 a 4,5 kV/cm, s výhodou 3,75 kV/cm a konstantní čas (t) od 1 do 40 milisekund, nejvýhodněji 20 milisekund. Buňky P. methanolica jsou pěstovány v médiu obsahujícím vhodné zdroje uhlíku, dusíku a stopových živin, při teplotě 25 °C až 35 °C. Tekutým kulturám je poskytováno dostatečné provzdušňování běžnými způsoby, jako je třepání v malých lahvičkách nebo probublávání fermentátorů vzduchem. Výhodné médium pro P. methanolica je YEPD (2% D-glukóza, 2% Bacto™ Pepton (Difco Laboratories, Detroit, Ml), 1% Bacto™ kvasničný extrakt (Difco Laboratories), 0,004% adenin a 0,006% Lleucin).

Prokaryotické hostitelské buňky, včetně kmenů Escherichia coli, Bacillus a jiných rodů, jsou také vhodné použít jako hostitelské buňky v rámci předkládaného vynálezu.

··· 99 9

9 ti 9 9 9

Techniky transformace těchto hostitelů a expresi cizích DNA sekvencí v nich klonovaných, jsou v oboru dobře známy (viz např. Sambrook a kol., tamtéž). Když je exprimován polypeptid lidské PC4 v bakteriích jako je E. coli, polypeptid může být zadržen v cytoplazmě, typicky jako nerozpustné granule, nebo může být přesunut do periplazmatického prostoru pomocí bakteriální sekreční sekvence. V prvém případě jsou buňky lyžovány, granule izolovány a denaturovány pomocí např. guanidin izothiokyanátu nebo močoviny. Denaturovaný polypeptid může být potom znovu prostorově uspořádán a dimenzován tím, že se denaturační činidlo zředí, např. dialýzou proti roztoku močoviny a směsi oxidovaného a redukovaného glutathionu, následovanou dialýzou proti pufrovanému fyziologickému roztoku. Ve druhém případě může být polypeptid získán z periplazmatického prostoru v rozpustné a funkční formě tím, že jsou buňky rozrušeny (pomocí např. sonikace nebo osmotického šoku) aby se uvolnil obsah periplazmatického prostoru a získán tak protein, čímž se odstraní nutnost denaturace a znovuuspořádání proteinu.

Transformované a transfekované hostitelské buňky jsou pěstovány běžnými postupy v kultivačním médiu, obsahujícím živiny a ostatní složky, vyžadované pro růst zvolených hostitelských buněk. V tomto oboru jsou známa různá vhodná média, jako jsou definovaná a komplexní média, a obecně obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, vitaminy a minerály. Média mohou také obsahovat, pokud je to vyžadováno, takové složky, jako jsou růstové faktory nebo sérum. Růstové médium bude obyčejně selektovat buňky, obsahující vnesenou DNA, např. pomocí selekce léčivy nebo nedostatkem esenciálních živin, které jsou komplementovány selekčním znakem, neseným na expresním vektoru nebo kotransfekovaným do hostitelské buňky.

Je výhodné čistit polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, do čistoty nejméně 80%, výhodněji nejméně 90%, ještě výhodněji nejméně 95% a zvláště výhodný je farmaceuticky čistý stav, to je více než 99,9% čistota vzhledem na kontaminující makromolekuly, zvláště ostatní proteiny a nukleové kyseliny a zbavené infekčních a pyrogenních činidel. Je výhodné, když je protein v podstatě zbaven jiných polypeptidů, zvláště ostatních polypeptidů živočišného původu.

Polypeptidy lidské prohormonové konvertázy 4, připravené podle tohoto vynálezu, jsou čištěny metodami běžně známými v tomto oboru, jako jsou afinitní čištění a oddělování, založené na velikosti, náboji, rozpustnosti a ostatních vlastnostech proteinu. Když je protein produkován v kultivovaných savčích buňkách, je .«· ···>· ···« • ··· · · · · · ·

Z · · · · ♦ ··· ··· « · · · · · »·· ··· ··· ···· ·* ·* výhodné pěstovat tyto buňky v kultivačním médiu bez séra, aby bylo omezeno množství kontaminujících proteinů. Buňky jsou odebrány, lyžovány a frakcionovány. Výhodné metody frakcionace jsou afinitní chromatografie, Q-Fast Flow Sepharose, MonoQ pryskyřice, FPLC, phenyi Sepharose, hydroxylapatit, MonoS anebo S-Sepharose. Proteiny mohou být také čištěny pomocí imobilizovaných afinitních skupin (polyhistidin, substance P nebo jiný polypeptid či protein, pro který je dostupná protilátka nebo jiné specifické vazebné činidlo). Může existovat specifické štěpné místo mezi požadovaným proteinem a afinitních skupinou. Výhodné afinitní skupiny jsou mimo jiné např. polyhistidinové úseky, která dovolují purifikaci fúzních proteinů na immobilizovaný nikl (Houchuli a kol., BioTechnol. 6: 1321-1325, 1988). Mohou být také konstruovány zkrácené formy polypeptidu, např. ty kterým chybí transmembránové doména nebo sekvence sekreční signální domény a použity pro snazší purifikaci katalyticky aktivních prohormonových konvertáz (Nakayama, K. Methods in Enz. 244: 167-175, 1995). V prokaryotických expresních systémech může být výhodné použít fúze s proteinem, který váže maltózu (MBP), jakožto s afinitní skupinou. Když má být protein získán z cytoplazmy nebo periplazmatického prostoru hostitelské buňky, buňky jsou nejprve rozrušeny a získaný hrubý extrakt obsahující protein je podroben dalším purifikačním krokům. Navíc jsou polypeptidy substrátů lidských prohormonových konvertáz a jejich štěpné produkty, které jsou výsledkem štěpení podle předkládaného vynálezu, čištěny pomocí postupů obecně v oboru známých, jak byly uvedeny výše, pouze s malými zavedenými změnami. Např. sekretované proteiny, jako jsou štěpné produkty, jsou získány z média po kultivaci buněk, výhodně po koncentraci takového média. Výběr určitých purifikačních kroků a následnost těchto kroků bude založena částečně na zvoleném typu hostitelských buněk a vybraném expresním systému. Tento výběr závisí na úrovni zkušenosti v oboru. Výběr určitých metod je záležitostí běžného návrhu postupu a je určen částečně vlastnostmi zvolené náplně. Viz např. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.

Polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být izolovány za využití jejich strukturních a biochemických vlastností. Např. absorbční chromatografie na immobilizovaných kovových iontech (IMAC) může být použita pro purifikaci proteinů, bohatých na histidin, včetně takových, které obsahují polyhistidinové úseky jako značky. Krátce řečeno, gel je nejprve nasycen dvojmocnými kovovými ionty, které vytvoří chelát (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7,1985). Proteiny bohaté na histidin se budou na tuto náplň absorbovat s rozdílnými afinitami, které budou záviset na použitých kovových iontech a budou eluovány pomocí kompetitivní eluce, snižováním pH nebo silných chelatačních činidel. Jinými metodami purifikace jsou purifikace glykosylovaných proteinů pomocí afinitní chromatografie na lektinech a iontoměnná chromatografie (Methods in Enzymol., Sv. 182, „Guide to Protein Purification“, M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, str. 529-39). V rámci dalších provedení vynálezu mohou být pro usnadnění purifikace konstruovány fúzní proteiny mezi žádaným polypeptidem a některou afinitní značkou (např. proteinem, který váže maltózu, imunoglobulinovou doménou).

Polypeptidy lidské PC4 mohou být též využity pro přípravu protilátek, které se specificky váží k epitopům, peptidům nebo polypeptidům lidské PC4. Polypeptidy lidské PC4 nebo její fragmenty slouží jako antigen (imunogen), který je očkován živočichům a vyvolává pak imunní odpověď. Vhodné antigeny zahrnují různé polypeptidové domény lidské PC4 zde uvedené a kódované sekvencí SEQ ID NO: 2 nebo přilehlým 9 až 755 aminokyselinovým fragmentem, kódovaným SEQ ID NO: 2. Polyklonální a monoklonální protilátky, vytvářené při této imunní odpovědi, jsou izolovány a čištěny pomocí postupů dobře v tomto oboru známých. Viz např. Current Protocols in Immunology, Cooligan a kol., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, lne., 1995; Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Editon, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, lne., Boča Raton, FL, 1982.

Jak by bylo zřejmé osobám s běžnou zkušeností v tomto oboru, polyklonální protilátky se mohou vytvářet po očkování rozličných teplokrevných živočichů, jako jsou koně, krávy, kozy, ovce, psi, kuřata, králíci, myši a krysy, polypeptidy lidské PC4, nebo jejich fragmenty. Imunogenicita polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4 může být zvýšena při použití adjuvans, jako je alum (hydroxid hlinitý) nebo Freudovo kompletní či nekompletní adjuvans. Mezi polypeptidy použitelné pro imunizaci patří též fúzní polypeptidy, jako jsou fúze mezi lidskou prohormonovou konvertázou 4 nebo její částí s polypeptidem imunoglobulinu nebo s proteinem, který váže maltózu. Polypeptidovým imunogenem může být jak celá molekula proteinu, tak i její část. Jestliže část polypeptidů je haptenového typu, může být taková část pro imunizaci ·44· ·· 44 44 ··· · · · · 4*4«

4444 4 4 4 4 4 4 « · « 4 4 4 ·····# • • 4 4 4 4 ······ ·«····· «· 44 s výhodou připojena k makromolekulárnímu nosiči (jako je hemokyanin z červa keyhole limpet (KLH), hovězí sérumalbumin (BSA) nebo tetanový toxin).

Termín „protilátky“, jak je zde používán, zahrnuje polyklonální protilátky, afinitně čištěné polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a fragmenty, které vážou antigen, jako jsou proteolytické fragmenty F(ab')₂ a Fab'. Zahrnuty jsou také geneticky modifikované intaktní protilátky nebo fragmenty, jako jsou chimerní protilátky, fragmenty Fv, jednořetězcové protilátky a podobně, stejně jako syntetické peptidy či polypeptidy, které vážou antigen. Protilátky, které nejsou lidského původu, mohou být zušlechtěny připojením oblastí CDR, které nejsou lidského původu, k lidským podpůrným a konstantním oblastem lidských protilátek, nebo zabudováním celých variabilních domén, které nejsou lidského původu (případně pořízením jakoby lidského povrchu protilátek tím, že jsou zaměněny exponované zbytky, přičemž výsledkem je pozměněná protilátka). V některých případech si mohou zušlechtěné protilátky podržet v podpůrných doménách lidské variabilní oblasti aminokyselinové zbytky, které nejsou lidského původu, protože tím dojde k posílení vhodných vazebných charakteristik. Zušlechtěním protilátek může dojít k prodloužení jejich biologického poločasu a ke snížení sklonu k vyvolávání nepříznivých imunních reakcí po podání lidem.

Alternativní zde užitečná technika pro vytvoření nebo selekci protilátek je založena na in vitro expozici lymfocytů polypeptidu lidské konvertázy 4 nebo peptidu z ní pocházejícího, a výběr v protilátkových knihovnách ve fágách nebo podobných vektorech (např. za použití imobilizovaného nebo označeného proteinu či peptidu lidské PC4). Geny kódující polypeptidy, které mají vazebné domény polypeptidů potenciálně lidských PC4, mohou být získány hromadným prověřováním knihoven náhodných peptidů, vystavených na povrchu fágů (phage display) nebo na bakteriích, jako je E. coli. Nukleotidové sekvence kódující polypeptidy mohou být získány řadou způsobů, jako třeba náhodnou mutagenezi a náhodnou syntézou polynukleotidů. Knihovny vystavující náhodné peptidy mohou být použity pro hledání peptidů, které interagují se známou cílovou strukturou, což může být protein nebo polypeptid, jako je ligand nebo receptor, biologická nebo syntetická molekula, nebo organické či anorganické látky. Techniky pro vytváření a hromadné testování takových knihoven vystavujících náhodné peptidy jsou v tomto oboru známy (Ladner a kol., U.S. Patent No. 5 223 409; Ladner a kol., U.S. Patent No.4 946 778; Ladner a kol., U.S. Patent No.5 403 484 a Ladner a kol., U.S. Patent No.5 571 698) a knihovny vystavující • · · · • · · ♦ · · * · · · * • ··· · · * · · · • « · · · · ······ φ · · · · · • ť)« ··· ··· ·!·· <· · * náhodné peptidy a soupravy pro hromadné testování takových knihoven jsou komerčně dostupné, např. od Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen lne. (San Diego, CA), New England Biolabs, lne. (Beverly, MA) a Pharmacia LKB Biotechnology lne. (Piscataway, NJ). Aby bylo možno určit proteiny, které se vážou k lidské PC4, mohou být knihovny vystavující náhodné peptidy hromadně testovány pomocí sekvencí lidské PC4, které jsou zde uvedené. Tyto „vazebné proteiny“, které interagují s polypeptidy lidské PC4 lze použít pro označování buněk; pro izolaci homologických polypeptidů pomocí afinitní purifikace; mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně. Tyto vazebné proteiny mohou být také využity v analytických metodách, jako např. pro hromadné testování expresních knihoven a jako zdroj neutralizační aktivity. Vazebné proteiny mohou být také využity v diagnostických testech pro určení hladin polypeptidů v tkáních; pro určení nebo kvantifikaci polypeptidů jako příznaků patologického stavu nebo nemoci. Tyto vazebné proteiny mohou také působit jako „antagonisté“ lidské PC4, to znamená pro blokování aktivity lidské PC4 in vitro a in vivo.

Protilátky se specificky vážou jestliže: 1) vykazují prahovou úroveň vazebné aktivity, a 2) nereagují ve významné míře křížově s příbuznými polypeptidovými molekulami. Zaprvé, zde uvedené protilátky se vážou specificky, pokud se vážou k polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4, peptidu nebo epitopu s afinitou přinejmenším 10křát silněji než je jejich vazebná afinita ke kontrolnímu polypeptidů (PC4 jiného než lidského původu). Je dávána přednost protilátkám vykazujícím vazebnou afinitu (K_a) 10⁶ M'¹ nebo větší, výhodněji 10⁷ M¹ nebo větší, ještě výhodněji 10⁸ M'¹ nebo větší a nejvýhodněji 10⁹ M¹ nebo větší. Vazebná afinita protilátky může být snadno určena osobou s běžnou zkušeností v tomto oboru, např. pomocí analýzy podle Scatcharda (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

Za druhé, protilátky se specificky vážou tehdy, jestliže nereagují ve významné míře křížově s příbuznými polypeptidy. Protilátky nereagují ve významné míře křížově s příbuznými polypeptidy, např. když jsou schopny detekovat lidskou PC4, ale nikoli známý příbuzný peptid za použití standardní Western blotové analýzy (Ausubel a kol., tamtéž). Příkladem známých příbuzných peptidů jsou ortology (např. myší PC4) a paralogy, jako jsou jiné známé lidské prohormonové konvertázy (např. PC1 a PC2), nebo mutované polypeptidy lidské PC4 a prohormonové konvertázy jiného než lidského původu (subtilisin nebo Kex2). Navíc protilátky mohou být hromadně testovány pomocí « 9 Φ Φ « Φ · Φ

Φ · Φ Φ · Φ Φ Φ « Φ Φ · známých příbuzných polypeptidů, aby byla izolována populace, která se specificky váže k polypeptidům, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Např. protilátky, vyvolané proti lidské PC4 se adsorbují k příbuzným peptidům, připojeným k nerozpustnému nosiči; protilátky specifické k lidské PC4 budou protékat skrz nosič za vhodných pufrovacích podmínek. Takové hromadné testování umožňuje izolaci polykionálních a monoklonálních protilátek, které nereagují křížově s blízce příbuznými polypeptidy (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow a Lané (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Cooligan a kol., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, lne., 1995). Hromadné testování a izolace specifických protilátek je v oboru dobře známo. Viz Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff a kol., Adv. in Immunol. 43: 1-98. 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W. (eds.), Academie Press Ltd., 1996; Benjamin a kol., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101,1984.

Rozmanité testy, které jsou známy osobám s běžnou zkušeností v tomto oboru, mohou být použity k nalezení a purifikaci protilátek, které se specificky vážou k proteinům nebo peptidům lidské PC4. Příklady testů jsou podrobně popsány v Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow a Lané (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentativní příklady takových testů obsahují: imunoelektroforézu, radioimunoassay, radioimunoprecipitaci, test ELISA (enzym-linked immunosorbent assay, testy typu dot blot nebo Western blot, inhibiční nebo kompetitivní testy a sendvičový test.

Protilátky mohou být dále hromadně testovány na to, jak se vážou k divokému typu proteinu lidské PC4 ve srovnání s mutovaným proteinem či polypeptidem lidské PC4. Protilátky proti lidské PC4 mohou být použity pro označování buněk, které exprimují lidskou PC4; pro izolaci lidské PC4 pomocí afinitní purifikace; pro diagnostické testy pro určování hladin polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4 v buněčných a tkáňových lyzátech in vitro a in vivo·, pro in šitu imunolokalizaci při určování tkáňové distribuce in vivo; pro detekování a kvantifikaci proteinů lidské prohormonové konvertázy 4 jako příznaků patologického stavu nebo nemoci; v analytických metodách využívajících průtokovou cytometríi nebo FACS; pro testování expresních knihoven; pro vytváření anti-idiotypických protilátek a jako neutralizační protilátky; nebo jako antagonisty pro blokování katalytické aktivity lidské PC4 in vitro a in vivo. Metody pro využívání protilátek tímto způsobem jsou v oboru dobře známy.

« ·· * 4 · 44 ·· ·♦ «·· · · · 4 * » 4 4 «4·· 4 4 4 4 4 4 * · · 4 4 ·«····· · 4 · · · • 44 444 ··· 4444 «4 44

Jako vhodné přímé značky nebo značení se používají radioaktivní izotopy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční značky, chemiluminiscenční značky, magnetické částice a podobně; nepřímé značky nebo značení představuje použití biotin-avidinu nebo jiných párů komplement/antikomplement jako intermediátů. Protilátky zde uvedené mohou být také přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně, a tyto konjugáty používat pro diagnostické nebo léčebné aplikace in vivo. Dále je možno používat protilátky proti lidské PC4 nebo jejím fragmentům pro in vitro detekci denaturované lidské PC4 nebo jejích fragmentů, např. v testech typu Western blot nebo jiných typech testů, známých v tomto oboru.

Modifikační enzym typický pro varlata, jako je lidská prohormonové konvertáza 4, se účastní zpracování prohormonů nebo vazebných proteinů, které jsou exprimovány v buňkách varlat. Lidská prohormonové konvertázy 4 může být užitečná pro zjišťování a určování biologické funkce prohormonů varlat a zjišťování nových prohormonů, jak je diskutováno dále. Na podporu tvrzení, že lidská PC4 může hrát roli v plodnosti nebo v jiné funkci varlat, souvisící se spermatogenezí, lze uvést nedávno publikovanou práci popisující, že myší samci, kteří mají homozygotní mutovanou myší PC4, mají velmi silně poškozenou plodnost (Mbikay, M., a kol., Proč. Nati. Acad, Sci., 94: 6842-6846, 1997). Navíc autoři nepozorovali u těchto mutantních myší zřejmé abnormality ve spermatogenezí, a vajíčka oplozená těmito spermiemi nedospěla do stádia blastocysty, což naznačuje nejenom roli v oplození, ale i v časných stádiích embryonálního vývoje.

Proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou používány pro zpracování nebo částečné zpracování známých nebo neznámých prohormonových polypeptidů na jejich zralé nebo biologicky aktivní formy, které mohou např. stimulovat množení nebo diferenciaci buněk ve varlatech. Navíc, proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jejich antagonisté a agonisté, mohou hrát roli v plodnosti samců. Aby bylo možno otestovat, zda lidská PC4 působí na substrát, potenciální prohormonové polypeptidové substráty mohou být exprimovány současně v téže buňce, jako lidská PC4, nebo mohou být přidány k lidské PC4 in vitro. Metody, jak konstruovat takové buňky nebo kombinovat proteiny in vitro, jsou v oboru známé a jsou zde uvedeny. Štěpné produkty, vznikající jako výsledek aktivity lidské PC4 na potenciální prohormonové substráty. Aktivita proteinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, může být měřena testováním biologické aktivity, která je spojena se štěpnými produkty prohormonového prekurzorového polypeptidu štěpeného prohormonovou konvertázou 4. Dále v případě, « · · · · · · · ftft ftft «·« ··«· « · · v • ftftft · ft · » · u • ft· ft · · ·»···· • ftftft ftft ·····£ ···««·· «· »· kdy biologickou aktivitu štěpných produktů nelze měřit, je možno pro zjištění, zda lidská PC4 rozštěpila substrátový prohormon, použít jiné metody, jako je Western blot.

Polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, lze použít pro zjištění polypeptidových prohormonových substrátů lidské prohormonové konvertázy 4. Za použití postupů, dobře v tomto oboru známých, je možno kultivovat buňky, do nichž byl vnesen expresní vektor, který exprimuje zralou formu lidské prohormonové konvertázy 4 a současně s ní koexprimuje jako substrát polypeptid testovaného prohormonu. Štěpné produkty, vznikající štěpením testovacího substrátu působením lidské prohormonové konvertázy 4, je možno měřit pomocí biologických nebo biochemických testů zde popsaných. Navíc lze takové testování polypeptidů prohormonových substrátů polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4 provádět in vitro. Izolovaný a purifikovaný polypeptid lidské prohormonové konvertázy 4 nebo lyzát buněk, exprimujících lidskou prohormonovou konvertázu 4, mohou být smíchány in vitro s polypeptidem testovaného prohormonu nebo syntetickým polypeptidem, který obsahuje dibazické štěpné místo. Štěpné produkty, vznikající štěpením polypeptidů testovaného substrátového prohormonu působením polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4, je možno měřit pomocí biologických nebo biochemických testů zde popsaných.

Pro zjišťování biologické aktivity štěpných produktů je možno použít rozmanité testy. Např. množení a diferenciace mohou být měřeny za pomoci kultivovaných buněk varlat nebo in vivo tím, že se podávají prohormonové molekuly, buď rozštěpené nebo jinak zpracované působením polypeptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vhodným modelovým živočichům. Kultivované buňky varlat jsou mimo jiné delfíní buňky DBI.Tes (CRL-6258); myší buňky GC-1 spg (CRL-2053); buňky TM3 (CRL-1714); buňky TM4 (CRL-1715) a prasečí buňky ST (CRL-1746), dostupné v Americké sbírce typových kultur, Rockwille, MD. Testy pro měření buněčné proliferace nebo diferenciace jsou v oboru dobře známy. Testy pro měření buněčné proliferace jsou např. test chemosenzitivity k barvičce neutrální červeň (Cavanaugh a kol., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990), inkorporace radioaktivních nukleotidů (Cook a kol., Analytical Biochem. 179:1-7,1989), inkorporace 5-bromo-2'-deoxyuridinu (BrdU) do DNA množících se buněk (Portsmann a kol., J. Immunol. Methods 82: 169179, 1985) a použití tetrazoliových solí (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley a kol., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall a kol., Growth Reg. 5: 6984, 1995 a Scudiero a kol., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988). Testy pro měření • » · £ £ ·· • £ V £ · £ £ ♦ · * * £ · ♦ · £ » £ * £ £ £ « · ·»·£·» • £ · · *£·£«·£ «£ ·£ diferenciace jsou např. zjišťování znaků na buněčném povrchu, které jsou spojeny s expresí, závisející na stádiu diferenciace tkáně, měření enzymatické aktivity, funkční aktivity nebo morfologických změn (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, ESACT, 9.sjezd, 1988).

Testy in vitro pro zhodnocení působení lidské prohormonové konvertázy 4 na polypeptidové faktory varlat jsou v oboru dobře známy. Např. štěpné produkty mohou být podány intraperitoneálně a ponechány působit určitou dobu. Po uplynutí tohoto období jsou zvířata usmrcena, jsou jim vyjmuta varlata a zvážena. Poté jsou varlata homogenizována a zjišťován počet spermatických hlaviček (Meistrich a kol., Exp. Cell Res. 99: 72-78, 1976).

Jiné aktivity, např. chemotaktická aktivita, které mohou být spojeny se štěpnými produkty zpracovaných polypeptidů působením proteinu, který je předmětem tohoto vynálezu, je také možno analyzovat. Např. faktory z pozdních stádií spermatogeneze se mohou účastnit interakcí spermie-vajíčko a ovlivňovat pohyblivost spermií. Jsou známy testy, hodnotící takovéto aktivity (Fuchs, Zentralbl. Gynakol 11: 117-120, 1993; Neurwinger a kol., Andrologia 22: 335-339, 1990; Harris a kol., Human Reprod. 3: 856860, 1988 a Jockenhovel, Andrologica 22: 171-178, 1990).

Vedle toho lze použít standardní biochemické testovací techniky, jako je western blot, pro detekci štěpných produktů, vzniklých zpracováním prohormonových substrátů neznámé aktivity působením lidské PC4 (Sambrook a kol., tamtéž a Ausubel, a kol., tamtéž). Při použiti takových metod je možno zjistit štěpné produkty vylučované z buněk, exprimujících lidskou PC4 a testovaný prohormonový substrát tak, že je testováno kultivační médium, odebrané z buněk.

Proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou také použity pro vyhledávání modulátorů lidské prohormonové konvertázy 4. Modulátory, jako jsou antagonisté a agonisté, mohou ovlivňovat prohormonovou konvertázu několika způsoby, např. její katalytickou aktivitu, genovou expresi nebo interakci s poíypeptidy substrátů. Tyto antagonisté a agonisté by ovlivňovaly prohormonovou konvertázu, která je předmětem tohoto vynálezu tím, že by snižovaly, popřípadě zvyšovaly štěpnou aktivitu lidské PC4. Toto zvýšení nebo snížení je měřeno určováním štěpných produktů zprohormonů, na které lidská PC4 působí. V takovém uspořádání je indikátorový prohormonový substrát, o němž se ví, že je štěpen poíypeptidy, které jsou předmětem ·· ·· » ♦ · · • · · · ··♦ ·♦· • · • · · · tohoto vynálezu, je exprimován v téže buňce, která exprimuje lidskou prohormonovou konvertázu 4. Metody, kterými se konstruují takové buňky jsou v oboru známé a jsou zde uvedeny. Je dávána přednost takovým indikátorovým prohormonovým polypeptidům, které jsou vylučovány z buněk poté, co jsou zpracovány prohormonovou konvertázou a mají snadno měřitelnou biologickou aktivitu, spojenou se štěpnými produkty. Příklady takových testů aktivity jsou uvedeny výše. Antagonisté a agonisté jsou identifikovány pomocí testování výsledných štěpných produktů vylučovaných z buněk, poté co jsou tyto buňky vystaveny přítomnosti různých činidel, o kterých je diskutováno dále. Změny ve zpracování indikátorových substrátů odráží ty aktivity, které mají tato činidla na lidské PC4 proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, projevující se buď zesílením nebo inhibici prohormonové konvertázy, vzhledem ke kontrolním buňkám, které nejsou vystaveny přítomnosti činidla. Např. vzhledem ke kontrole, agonista zvyšující aktivitu lidské PC4 by se projevil zvýšením štěpení a tedy větším množstvím biologicky aktivních štěpných produktů z indikátorového substrátu. Naopak, vzhledem ke kontrole, antagonista snižující aktivitu lidské PC4 by se projevil snížením štěpení a tedy menším množstvím, nebo potenciálně žádnými biologicky aktivními štěpnými produkty z indikátorového substrátu. Zdrojem činidel, která mohou modulovat lidskou PC4 a mohou být hodnoceny nebo použity v testovaném vzorku, jsou mimo jiné kterékoli přírodní nebo chemické zdroje, mimo jiné rostliny, mikrobiální a houbové extrakty, chemické knihovny a kombinační chemické knihovny. Metody pro zavedení a využití tohoto typu buněčných testovacích pokusů jsou v oboru známy.

Tento typ buněčných testovacích pokusů může být použit pro zjištění, zda je v testovaném vzorku přítomen modulátor aktivity polypeptidů lidské prohormonové konvertázy. Buňka, která exprimuje zralý protein lidské PC4 a spolu s ním exprimuje známý indikátorový substrát prohormonového polypeptidů, může být kultivováno v přítomnosti a v nepřítomnosti testovaného vzorku. Konstrukce takových buněk může být dosažena metodami v oboru známými a zde uvedenými. Např. expresní vektor, řídící expresi zralého proteinu lidské PC4 a expresní vektor, řídící expresi známého indikátorového substrátu prohormonového polypeptidů, mohou být vneseny do téže buňky. Buňka pěstovaná v nepřítomnosti testovaného vzorku slouží jako kontrola, vzhledem k jejíž aktivitě je porovnávána aktivita molekuly v přítomnosti testovaného vzorku. Za použití biologických nebo biochemických testů mohou být porovnány hladiny štěpných produktů, pocházejících ze štěpení substrátu pomocí lidské • ·♦♦· ♦ ·· «· ♦· • · · · · * · · ♦ · * • «·· « * * t · * • · * · * ·»···· • · · · · · «·· ··· ··· ···· ·· ·· prohormonové konvertázy 4 v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku. Z takového porovnání může, jak je popsáno dáie, vyplynout přítomnost modulátoru aktivity lidské prohormonové konvertázy v testovaném vzorku.

Polynukleotidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, se také používají pro detekci abnormalit na lidském chromozomu 19, které jsou spojeny s nemocí nebo jinými příznaky. Polynukleotidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mapují do oblasti 19p13.3 na lidském chromozomu 19. Detekovatelné chromozomální aberace na lokusech genů prohormonových konvertáz jsou mimo jiné aneuploidie, změny počtu genových kopií, inzerce, delece, změny v restrikčních místech a změněné uspořádání. Takové aberace lze detekovat pomocí polynukleotidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, při využití molekulárně genetických technik, jako jsou analýza délkového polymorfizmu restrikčních fragmentů (RFLP), analýza krátkých tandemových repetic (STR), využívající techniku polymerázové řetězové reakce (PCR), a jiné techniky analýzy genetické vazby, které jsou v oboru známé (Sambrook a kol., tamtéž; Ausubel a kol., tamtéž; Marian, A. J., Chest 108: 255-265, 1995).

Předkládaný vynález také poskytuje reagencie pro použití v diagnostických aplikacích. Např. lidský gen pro PC4, sonda obsahující DNA nebo RNA lidské PC4, nebo část těchto sekvencí mohou být použity pro určování, zda je gen pro lidskou PC4 přítomen na chromozomu 19 nebo zda nastala mutace. Detekovatelné chromozomální aberace na místě genu pro lidskou PC4 jsou mimo jiné aneuploidie, změny počtu genových kopií, inzerce, delece, změny v restrikčních místech a změněné uspořádání. Tyto aberace mohou nastat uvnitř kódující sekvence, uvnitř intronu nebo uvnitř sousedících sekvencí, včetně promotoru a regulačních oblastí, umístěných proti směru přepisu, a mohou se projevit jako fyzické změny uvnitř kódující sekvence nebo změny v úrovni genové exprese. Analytické sondy obecně budou přinejmenším 30 nukleotidů dlouhé, ačkoli se mohou použít i sondy poněkud kratší (14 až 17 nukleotidů). Primery pro PCR reakci jsou přinejmenším 5 nukleotidů dlouhé, výhodněji 15 nebo více nukleotidů, ještě výhodněji 20 až 30 nukleotidů. Krátké polynukleotidy lze použít, když jsou cílem této analýzy malé oblasti genu. Pro hrubou analýzu genů mohou sondy obsahovat celý exon popřípadě i větší úsek DNA. Sondy budou obecně obsahovat polynukleotid vázaný ke struktuře, která je zdrojem signálu, jako je např. radioizotopem značený nukleotid. Všeobecně řečeno, tyto diagnostické metody se skládají z kroků (a) získání genetického vzorku od pacienta; (b) inkubace genetického vzorku • toto· • ·♦ to toto to» »♦ «•to to · toto to • · to»·· • to · ··« to·to s polynukleotidovou sondou nebo primerem jak bylo uvedeno výše, za podmínek, kdy polynukleotid bude hybridizovat s komplementární polynukleotidovou sekvencí, čímž vznikne první reakční produkt; a (iii) porovnání prvního reakčního produktu s produktem kontrolní reakce. Rozdíl mezi prvním reakčním produktem a kontrolním reakčním produktem je známkou genetické abnormality u pacienta. Genetické vzorky, vhodné pro použití v rámci tohoto vynálezu, jsou DNA, cDNA a RNA. Polynukleotidová sonda nebo primer mohou být z RNA nebo DNA a budou obsahovat část SEQ ID NO: 1, komplementární sekvenci k SEQ ID NO: 1 nebo její ekvivalentní RNA. V tomto ohledu vhodné testovací metody zahrnují molekulárně genetické techniky, známé osobám se zkušenostmi z tohoto oboru, jako jsou analýza délkového polymorfizmu restrikčních fragmentů (RFLP), analýza krátkých tandemových repetic (STR), využívající techniku polymerázové řetězové reakce (PCR), ligační řetězová reakce (Barany, PCR Methods and Applications 1: 5-16, 1991), testy protekce před ribonukleázou a jiné techniky analýzy genetické vazby, které jsou v oboru známé (Sambrook a kol., tamtéž; Ausubel a kol., tamtéž; Marian, A. J., Chest 108: 255-265, 1995). Testy protekce před ribonukleázou (viz např. Ausubel a kol., tamtéž, kap. 4) obsahují hybridizaci RNA sondy se vzorkem pacientovy RNA, a poté je reakční produkt (hybrid RNA-RNA) vystaven působení RNázy. Hybridizované oblasti RNA jsou proti rozštěpení chráněny. V testech, využívajících PCR, je genetický vzorek pacienta inkubován s párem polynukleotidových primerů, a oblast mezi primery je namnožena a tím způsobem získána. Změny ve velikosti nebo množství získaných produktů ukazují na mutace u pacienta. Jiná na PCR založená technika, která může být použita, je analýza jednovláknového konformačního polymorfizmu (single stranded conformational polymorphism - SSCP) (Hayashi, PCR Methods and Applications 1: 34-38, 1991).

Popis obrázků

Na obrázku je porovnání sekvencí lidské PC1, lidské PC2, krysí PC4, myší PC4, nové lidské PC4, která je předmětem tohoto vynálezu, myšího furinu a lidského furinu.

«· · • · Φ · · ♦ · · « · ·♦ · • · · · • · · ♦ ·· ··· ·· ·· ·· 44 · 4 4 9

9 4 4 4

4 44 9 444

4 4

499 4 4 44

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Klonování lidské prohormonové konvertázy 4

A. Souhrn

Hromadné testování lidské, z varlat připravené cDNA knihovny, pomocí sondy z myší PC4 cDNA, odhalilo izolovanou cDNA, klon pSLHPC4-5, jež je homologní k myší PC4 cDNA. Tato cDNA kóduje lidskou prohormonovou konvertázu 4 (lidská PC4).

B. Příprava cDNA knihovny z lidských varlat

Kompletně dlouhá cDNA lidské PC4 byla získána hromadným testováním cDNA knihovny z lidských varlat λΖΑΡ® II (Stratagene, La Jolla, CA). Konstrukce cDNA knihovny z lidských varlat byla následující:

Reakční směs pro první řetězec cDNA obsahovala 15 μΙ lidské poly(A)⁺ mRNA, dvakrát selektované na póly d(T) (Clontech Laboratories) v koncentraci 1,0 pg/μΙ a 3 μΙ 20 pmol/μΙ primeru pro první řetězec ZC6091 (SEQ ID NO: 5), který obsahuje restrikční místo pro Xho I. Směs byla zahřáta na 70 °C po dobu 4 minut a ochlazena na ledu. Syntéza prvního řetězce cDNA byla započata přidáním 12 μΙ pufru pro první řetězec (5x SUPERSCRIPT™ pufr; Life Technologies, Gaithersburg, MD), 6 μΙ 100 mM dithiothreitelu a 3 μΙ roztoku deoxynukleotidtrifosfátů, obsahujícího 10 mM každý zdTTP, dATP, dGTP a 5-methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) ke směsi RNA a primeru. Reakční směs byla inkubována při 37 °C po dobu 2 minut, následovalo přidání 15 μΙ 200 U/μΙ reverzní transkriptázy bez aktivity RNázy H (reverzní transkriptáza RNáza H ) (SUPERSCRIPT II®; Life Technologies). Účinnost syntézy prvního řetězce byla zjišťována v paralelně provedené reakci, přidáním 5 pCi ³²P-adCTP k 5 μΙ alikvotu z jedné z reakčních směsí, aby došlo k označení reakce pro analýzu. Reakce byly inkubovány při 37 °C po dobu 10 minut, dále při 45 °C po dobu 1 hodiny a potom při 50 °C po dobu 10 minut. Neinkorporovaný ³²P-adCTP v radioaktivně značené reakci byl odstraněn chromatografií na gelovém filtračním sloupci s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories). Neinkorporované nukleotidy a primery v neznačené reakci prvního řetězce byly odstraněny chromatografií na gelovém filtračním sloupci s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories). Délka značeného prvního řetězce cDNA byla určena elektroforézou v agaróvém gelu.

• ··♦·

9« 9

9 99 ·

• 9

9

9 ·· 99 ♦ »9 9 • 9 9 9 • 99 9 9 9

9 • · 99

Reakční směs pro druhý řetězec obsahovala 120 μΙ neznačeného prvního řetězce cDNA, 36 μί 5x pufru pro polymerázu I (125 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCI, 25 mM MgCI₂, 50 mM (NH^S&t)), 2,4 μί 100 mM dithiothreitolu, 3,6 μΙ roztoku obsahujícího 10 mM každý deoxynukleotidtrifosfát, 6 μί 5 mM β-NAD, 3,6 μί 3 U/μΙ DNA ligázy E. coli (New England Biolabs; Beverly, MA), 9 μί 10 U/μΙ DNA polymerázy E. coli (New England Biolabs) a 1,8 μΙ 2 U/μΙ RNázy H (Life Technologies). Alikvot 10 μΙ zjedné ze syntetických reakcí druhého řetězce byl označen přidáním 10 μθί ³²PadCTP, aby bylo možno ověřovat efektivitu syntézy druhého řetězce. Reakce byly inkubovány při 16 °C po dobu 2 hodin, poté bylo přidáno 15 μΙ T4 DNA polymerázy (10 U/μΙ, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a inkubovány dalších 5 minut při 16 °C. Neinkorporovaný ³²P-adCTP v radioaktivně značené reakci byl před analýzou pomocí elektroforézy v agarovém gelu odstraněn chromatografií na gelovém filtračním sloupci s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories). Reakce byla ukončena přidáním 20 μΙ 0,5 M EDTA a extrahována směsí fenol-chloroform, poté chloroformem a následovala precipitace etanolem za přítomnosti 2,5 M octanu amonného a 4 pg glykogenového nosiče. Výtěžek cDNA byl stanoven přibližně na 3 pg, přičemž výchozí množství RNA matrice bylo 15 pg.

Na 5'-konce výše popsané cDNA byly přiligovány Eco Rl adaptéry, aby bylo umožněno klonování do expresního vektoru. Alikvot 10 μΙ cDNA (asi 1,5 pg) a 5 μΙ 65 pmol/μΙ Eco Rl adaptéru (Pharmacia LKB Biotechnology lne.) bylo smícháno se 2 μΙ 10x ligázového pufru (660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCI₂), 2 μ110 mp ATP a 1 μΙ 15 U/μΙ T4 DNA ligázy (Promega Corp., Madison, WI). Reakce byla inkubována při 5 °C po dobu 2 hodin, dále při 7,5 °C po dobu 2 hodin, 2 hodiny při 10 °C a potom 10 hodin při 12,5 °C. Reakce byla ukončena inkubaci při 70 °C po dobu 20 minut.

Aby bylo usnadněno klonování cDNA ve správné orientaci do vektoru IZapll® (Stratagene), byla cDNA štěpena Xho /, čímž cDNA získala Eco Rl kohezní konec na 5'-konci a Xho I kohezní konec na 3'-konci. Restrikční místo pro Xho I na 3'-konci cDNA bylo již dříve zavedeno díky použití primeru ZC6091 (SEQ ID NO: 5). Štěpení restrikčním enzymem bylo provedeno v reakční směsi obsahující 20 μΙ výše popsané cDNA, 10 μΙ 10x pufru H (Boehringer Mannheim), 69 μΙ H₂O a 1,0 μΙ 40 U/μΙ Xho I (Boehringer Mannheim). Štěpení bylo provedeno při 37 °C po dobu 40 minut. Reakce byla ukončena inkubací při 70 °C po dobu 10 minut a provedena chromatografie na gelovém filtračním sloupci s velikostí pórů 400 (Clontech Laboratories).

« ·«·· φφ φ φ φφφ φ φ φ φ

Φ· φ φ

• φ cDNA byla vysrážena etanolem, promyta 70% etanolem, vysušena na vzduchu a resuspendována v 14 μΙ H₂O, 2 μΙ ligázového pufru (Promega Corp., Madison WI) a 2 μΙ T4 polynukleotid kinázy (10 U/μΙ, Life Technologies). Po inkubaci při 37 °C po dobu 30 minut byla cDNA zahřáta na 65 °C na dobu 5 minut, ochlazena na ledu a elektroforézována na 0,8% agarózovém gelu s nízkým bodem tání. Kontaminující adaptéry a cDNA kratší než 0,6 kb byly z gelu vyříznuty. Elektrody byly prohozeny a cDNA byla elektroforézována tak dlouho, dokud se nezkoncentrovala opět u výchozí linie. Oblast gelu, obsahující koncentrovanou cDNA, byla vyříznuta, vložena do mikrocentrifugační zkumavky a zjištěn přibližný objem tohoto plátku gelu. Do zkumavky byl přidán objem vody, přibližně trojnásobný než je objem plátku gelu (300 μΙ), 35 μΙ pufru pro 10x β-agarózu I (New England Biolabs) a agaróza byla roztavena zahřátím na 65 °C po dobu 15 minut. Po vyrovnání teploty na 45 °C byly přidány 3 μΙ 1 U/μΙ βagarózy I (New England Biolabs) a směs byla inkubována po dobu 60 minut při 45 °C, aby došlo k natrávení agarózy. Po inkubaci bylo ke vzorku přidáno 40 μΙ 3 μ octanu sodného a směs byla inkubována na ledu po dobu 15 minut. Vzorek byl centrifugován při 14 000 g po dobu 15 minut při teplotě místnosti, aby byla odstraněna nenatrávená agaróza. Poté byla cDNA vysrážena etanolem, promyta 70% etanolem, vysušena na vzduchu a resuspendována v 10 μΙ H₂O.

Získaná cDNA byla klonována do λ-fágového vektoru AZAP® II (Stratagene), který byl předem štěpen EcoRI a Xho I a defosforylován. Ligace cDNA do λΖΑΡ® II byla provedena v reakční směsi obsahující 1,0 μΙ připraveného vektoru, 1,0 μΙ cDNA v lidských varlat, 1,0 μΙ 10x ligázového pufru (Promega Corp.), 1,0 μ110 mM ATP, 5 μΙ H₂O a 1,0 μΙ T4 DNA ligázy o koncentraci 15 U/μΙ (Promega Corp.). Ligační směs byla inkubována při 5-15 °C přes noc v tepelném gradientu. Po inkubaci byla ligační směs zabalena do fága pomocí in vitro zabalovacího extraktu (Gigapack® III Gold packaging extract; Stratagene) a výsledná knihovna byla titrována podle návodu výrobce.

C. Izolace polynukleotidů

Fágová knihovna AZAP® II z lidských varlat byla použita k infikování hostitelských buněk E.coli (kmen XL1-Blue™ MRF'; Stratagene) a 1,5 x 10® pfu bylo vyseto na 150 mm plotny NZY v hustotě 40 000 pfu/plotnu. Očkované plotny byly přes noc inkubovány při 37 °C. Otisky plaků byly provedeny na nylonové membrány (Hybond™-N; Amersham Corp., Arlington Heights, IL), podle postupu poskytnutého výrobcem. Filtry byly denaturovány v roztoku obsahujícím 1,5 M NaCl a 0,5 M NaOH po ♦ I* dobu 5 minut při teplotě místnosti. Filtry byly krátce odsáty na filtračním papíře, aby byl odstraněn nadbytek denaturačního roztoku, pak následovala neutralizace po dobu 5 minut v 1 M tris-HCI, pH 7,5 a 1,5 M NaCl. Fágová DNA byla fixována na filtry pomocí UV energie 1200 pJoulů v zařízení UV Crosslinker (Stratalinker™; Stratagene). Po fixaci byly filtry prehybridizovány v hybridizačním roztoku (5x SSC., 5x Denhardtův roztok, 0,2% SDS a 1 mM EDTA). Byla přidána tepelně denaturovaná a nalámaná DNA z lososího spermatu v konečné koncentraci 100 pg/ml. Filtry byly prehybridizovány přes noc při teplotě 65 °C.

Sonda byla připravena jako PCR produkt, za pomoci olígonukleotidu pro amplifikaci oblasti, kódující cDNA krysí prohormonové konvertázy, která odpovídá nukleotidům 45 až 1033 v SEQ ID NO: 6. Reakční směs počátečního, prvního kola PCR, obsahovala 2 μΙ ZC11,808 (SEQ ID NO: 7) a 2 μΙ ZC11,809 (SEQ ID NO: 8), 1 μΙ 400 femtogramů/μΙ cDNA z krysích varlat, 1 μΙ 10 mM dNTP, 10 μΙ 10x pufru Klentaq (Clontech), 83 μΙ vody a 2 μΙ DNA polymerázy Klentaq (Clontech). První kolo PCR reakce probíhalo takto: úvodních 95 °C po dobu 30 vteřin; potom 30 cyklů při 95 °C po dobu 30 vteřin, 57 °C po dobu 30 vteřin, 68 °C po dobu 2 minut; a nakonec následovalo 68 °C po dobu 10 minut. Produkt prvního kola PCR byl zředěn vodou 1:2000. S jedním μΙ takto zředěného produktu prvního kola PCR byla provedena druhá PCR za použití hnízdových primerů ZC11,870 (SEQ ID NO: 9) a ZC11,871 (SEQ ID NO: 10), navržených tak, aby amplifikovaly vnitřní část DNA produktu prvního kola PCR. PCR reakce druhého kola probíhala takto: úvodních 95 °C po dobu 30 vteřin; potom 30 cyklů při 95 °C po dobu 30 vteřin, 58 °C po dobu 30 vteřin, 68 °C po dobu 2 minut; a nakonec následovalo 68 °C po dobu 10 minut. Produkt druhého kola PCR byl čištěn na 1,5% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání a použit jako sonda pro hledání lidské PC4 v cDNA knihovně, připravené z lidských varlat.

Dvacet pět nanogramů PCR produktu bylo radioaktivně označeno a³²P-dCTP pomocí metody náhodných primerů za použití systému MEGAPRIME™ DNA Labeling Systém (Amersham), podle návodu výrobce. Prehybridizační roztok byl zaměněn čerstvým hybridizačním roztokem, obsahujícím 6,5 χ 10⁵ cpm/ml značené sondy a ponecháno hybridizovat přes noc při teplotě 60 °C. Po hybridizaci byl hybridizační roztok odstraněn a filtry byly opláchnuty v promývacím roztokem, obsahujícím 1 x CSC, 0,25% SDS a 1 mM EDTA při teplotě 45 °C. Filtry byly umístěny na autoradiografický film a exponovány při -70 °C se zesilujícími fóliemi po dobu 96 hodin.

• φ · * 0 0 000 »·· · t · 0 0

ΦΦΦ 000 000 0000 ·· 0«

Vyšetřování autoradiogramů odhalilo mnoho oblastí, které hybridizují se značenou sondou. Z agarových ploten bylo vypícháno 39 oblastí pro purifikaci. Každý odebraný kousek agaru byl ponechán přes noc inkubovat v 0,5 ml SM, obsahujícím 1 % (objem/objem) chloroformu (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Po inkubaci byl fág z každého jednotlivého, odebraného kousku agaru zředěn 1:1000 v SM. Alikvoty 50 μΙ byly očkovány plotny s buňkami E. coli XL-1 Blue™ MRF'. Plotny byly inkubovány přes noc při 37 °C a poté byly připraveny otisky na filtry, prehybridizovány, hybridizovány, promývány a autoradiografovány tak, jak bylo popsáno výše. Vyšetřování výsledných autoradiogramů ukázalo pozitivní signál na 10 filtrových otiscích. Z těchto oblastí byly vypíchány agarové kousky a podrobeny dalšímu kolu plakové purifikace.

Plazmidy byly vyštěpeny pomocí systému ExASSIST/SOL™ (Stratagene) podle návodu výrobce. Tyto plazmidy byly amplifikovány pomocí PCR, aby byla určena velikost inzertu a jeho sekvence. Ukázalo se, že klon označený pSLHPC4-5, obsahuje sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1.

Příklad 2. Tkáňová distribuce

Sonda byla připravena z celé délky kódující sekvence pSLHPC4-5 a použita k sondování lidských Northern blotů, připravených z různých tkání (Human Multiple Tissue Northern Blots) (Clontech). Analýza metodou Northern blotů ukázala fragment přibližně 2,8 kb, který byl přítomen pouze ve varlatech.

Příklad 3. Na PCR založené chromozomální mapování genu lidské PC4

Lidská PC4 byla mapována na chromozom 19 při použití komerčně dostupného panelu „GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel“ (Research Genetics, lne., Huntsville, AL). Tento GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel obsahuje DNA z každého z 93 hybridních klonů plus 2 kontrolní DNA (HFL donor a A23 recipient). Veřejně přístupný WWW server (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) umožňuje mapování ve vztahu k Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research's map of the human genome (lidská genomová mapa „WICGR“), která byla kontruována pomocí panelu „GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel“.

· ♦ · • ·· • ·· ·· ·· ·· · · « · · Φ • · · · · · • · · · · · · · · • · · « *·· ·»·· 99 99

Β.

Pro mapování lidské PC4 za použití panelu „GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel“, byly 20 μΙ reakce umístěny v 96jamkové mikrotitrační destičce (Stratagene) a použity v grádientovém termocykleru „RoboCycIer Gradient 96“ (Stratagene). Každá z 95 PCR reakcí se skládala z 2 μΙ 10x PCR reakčního pufru KlenTaq (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 μΙ směsi dNTP (2,5 mM každý, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1 μΙ primerů ZC13,557 (SEQ ID NO: 11) pro negativní DNA řetězec, 1 μΙ primerů ZC13,558 (SEQ ID NO: 12) pro pozitivní DNA řetězec, 2 μΙ „RediLoad“ (Research Genetics , Inc., Huntsville, AL), 0,4 μΙ směsi 50x Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA z jednotlivých hybridních klonů nebo kontrol a ddH₂O do celkového objemu 20 μΙ. Reakce byly převrstveny stejným objemem minerálního oleje a utěsněny. Podmínky PCR cyklů byly následující: úvodní denaturační cyklus 95 °C po dobu 5 minut; potom 35 cyklů 1 minuta denaturace při 95 °C, 1 minuta teplotní hybidizace při 68 °C a 1,5 minutové prodlužování při 72 °C, nakonec následoval koncový cyklus prodlužování po dobu 7 minut při 72 °C. Reakční produkty byly děleny pomocí elektroforézy na 3% NuSieve GTG agarózovém gelu (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

Výsledky ukázaly, že lidská PC4 mapuje na WICGR hybridní mapě 10,54 cR_3000 od orientačního znaku IB1264 směrem ke konci 19 chromozomu. Tím je lidská PC4 umístěna do oblasti 19p13.3 na integrované LDB mapě chromozomu 19 (The Genetic Location Database, University of Southampton, WWW server: http://cedar.genetics. soton.ac.uk/public_html_).

Příklad 4. Konstrukce savčího vektoru PPC4-5/pHZ1, exprimujícího lidskou PC4

Byl připraven expresní vektor pro expresi polypeptidů lidské PC4 v savčích buňkách. Savčí expresní vektor pHZ1 má neomycinový gen pod kontrolou časného promotoru SV40, polyadenylační místo z SV40 a mnoho klonovacích míst (polylinker) pro vložení požadovaného genu pod kontrolu metallothioninového promotoru (MT-1) a polyadenylačního místa lidského růstového hormonu (hGH). Expresní vektor je uložen v Americké sbírce typových kultur, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD.

Lidská PC4 byla subklonována do EcoRI/Xbal místa vpolylinkeru PHZ1. Fragment vektoru byl připraven štěpením PHZ1 pomocí EcoRI a Xbal (BoehringerMannheim), poté byl fragment izolován pomocí sloupce Qiaquick™ (Qiagen). Fragment • ·** · · · · · ·

9 · 9 · · ······ « 9 · 9 9 9

999 999 999 9999 99 ·· dlouhý 1644 baží (5 fragment) byl vyštěpen z klonu lidské PC4 z příkladu 1 pomocí restrikčních enzymů EcoRI a Aatll, který tvoří 5'konec sekvence lidské PC4 včetně 5'

UTR, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 1. PCR fragment dlouhý 681 bp byl amlifikován pomocí PCR reakce z klonu lidské PC4 z příkladu 1 pomocí primeru ZC13,359 (SEQ ID

NO: 13), který překrývá Aatll místo v lidské PC4 a primer ZC13,358 (SEQ ID NO:

14) ,který obsahuje Xbal místo, které tvoří 3'konec sekvence lidské PC4, včetně 3'UTR, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 1. Reakční PCR podmínky byly: jeden cyklus 94 °C po dobu 1 minuty; potom 35 cyklů 30 vteřin při 94 °C, 20 vteřin při 50 °C, 30 vteřin při 72 °C; nakonec následoval jeden cyklus po dobu 10 minut při 72 °C. PCR produkt byl vyštěpen pomocí Aatll a Xba I a fragment byl čištěn postupem, který byl popsán výše, výsledkem byl PCR fragment dlouhý 681 bázových párů (3'fragment).

Vyštěpený 5'fragment a 3'fragment DNA byly subklonovány do fragmentu pHZ1 vektoru. Asi 20 nanogramů 5'fragmentu lidské PC4, štěpené EcoRI/AatlI, asi 20 nanogramů 3'fragmentu lidské PC4, štěpené Aatll/Xbal a asi 40 nanogramů odpovídajícího fragmentu vektoru bylo ligováno 5 hodin při teplotě místnosti za standardních pufrových podmínek pro ligační reakci. Z této ligační reakce byl 1 μΙ vnesen elektroporézou do 25 μΙ kompetentních buněk DH10B (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) podle návodu výrobce, vyseto na LB plotny obsahující 100 mg/ml ampicilinu a inkubováno přes noc při teplotě 37 °C.

Kolonie byly testovány pomocí PCR za pomoci primerů ZC12,634 (SEQ ID NO:

15) a ZC12.945 (SEQ ID NO: 16), při použití následujících podmínek PCR reakce: jeden cyklus 94 °C po dobu 1 minuty; potom 25 cyklů 20 vteřin při 94 °C, 30 vteřin při 50 °C, 1 minutu při 72 °C; nakonec následoval jeden cyklus po dobu 10 minut při 72 °C. Sekvence inzertu u pozitivních klonů byla ověřena sekvenční analýzou. Příprava plazmidu ve velkém měřítku byla provedena pomocí soupravy QIAGEN® Maxi prep kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

Z toho, co bylo dosud uvedeno je zřejmé, že ačkoli zde byla pro účely ilustrace popsána specifická provedení tohoto vynálezu, mohou se uskutečnit různé modifikace, bez toho, že by došlo k odchýlení od smyslu a rozsahu vynálezu. V souhlase s tím není vynález omezen, s výjimkou připojených patentových nároků.

ttt ♦ ·* • · ·· ··

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález popisuje novou lidskou prohormonovou konvertázu 4. Polynukleotidy kódující tuto konvertázu jsou umístěny na 19. chromozomu a mohou být např. použity pro určování oblasti v genomu, která je spojena s lidskými chorobnými stavy. Vynález též zahrnuje způsoby produkce proteinů a protilátek této lidské prohormonové konvertázy 4.

444

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNE INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: ZymoGenetics, lne.

1201 Eastlake Avenue East

Seattle

WA

USA

98102 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: LIDSKÁ PROHORMONOVÁ KONVERTÁZA 4 (iii) POČET SEKVENCÍ: 11 (lv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: ZymoGenetics, lne.

(B) ULICE: 1201 Easttake Avenue East (C) MĚSTO: Seattle (D) STÁT: WA (E) ZEMĚ: USA (F) ZIP: 98102 (v) POČÍTAČOVÉ VYBAVENÍ:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ pro Windows Verse 2.0 (vi) ÚDAJE O PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(vii) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(vii-i) ÚDAJE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Parker, Gary E.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO:31.648 ··*· • · * ·»«· φ

	·«	··	9·
• ·	• ·	• «	• 9
•	•	• ·	• ·
	< ·	·· »	« 9 ·
•	•	•	•
		« ·

(C) REFERENČNÍ ČÍSLO: 97-05PC (ix) INFORMACE O SPOJENI:

(A) TELEFON: 206-442-6673 (B) TELEFAX: 206-442-6678 (C) TELEX:

(2) INFORMACE K SEKVENCI č.l:

(i) CHARACTERIŠTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2744 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: dvouvláknový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLECULY: cDNA (ix) ZÁKLADNÍ RYS:

(A) JMÉNO/KLÍČ: kódující sekvence (B) UMÍSTĚNÍ: 61...2325 (D) DALŠÍ INFORMACE:

(xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.l:

GAATTCGGCA CGAGGCGGGA GGGAGGGGAT TTGCGCAGGC CCCGCTCCCG CCCCGCCTCC 60

ATG Met

CGG Arg 1

CCC Pro

GCC Ala

CCG Pro

ATT Ile 5

GCG Ala

CTG Leu

TGG Trp

CTG Leu

CGC Arg 10

CTG Leu

GTC Val

TTG Leu

GCC Ala

CTG Leu 15

108

GCC

CTT

GTC

CGC

CCC

CGG

GCT

GTG

GGG

TGG

GCC

CCG

GTC

CGA

GCC

CCC

156

Ala

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

Ala

Val

Gly

Trp

Ala

Pro

Val

Arg

Ala

Pro

20

25

30

ATC

TAT

GTC

AGC

TGG

GCC

GTC

CAG

GTG

TCC

CAG

GGT

AAC

CGG

GAG

204

Ile

Tyr

Val

Ser

Trp

Ala

Val

Gin

Val

Ser

Gin

Gly

Asn

Arg

Glu

35

40

45

GTC

GAG

CGC

CTG

GCA

CGC

AAA

TTC

GGC

TTC

GTC

AAC

CTG

GGG

CCG

ATC

252

Val

Glu

Arg

Leu

Ala

Arg

Lys

Phe

Gly

Phe

Val

Asn

Leu

Gly

Pro

Ile

50

55

60

TTC

CCT

GAC

GGG

CAG

TAC

TTT

CAC

CTG

CGG

CAC

CGG

GGC

GTG

GTC

CAG

300

Phe

Pro

Asp

Gly

Gin

Tyr

Phe

His

Leu

Arg

His

Arg

Gly

Val

Gin

65

70

75

80

···· ·· · • ··· • « * • ·

<4	• e ··	··
··	• · · ·	* ·
•	• * ·	• ·
•	• * ·«·
•	• ·	•
		«·

CAG Gin

TCC Ser

CTG Leu

ACC Thr

CCG Pro 85

CAC His

TGG GGC

CAC His

CGC Arg 90

CTG CAC

CTG AAG AAA AAC

348

Trp

Gly

Leu

His

Leu

Lys

Lys 95

Asn

CCC

AAG

GTG

CAG

TGG

TTC

CAG

ACG

CTG

CAG

CGG

GTG

AAA

396

Pro

Lys

Val

Gin

Trp

Phe

Gin

Thr

Leu

Gin

Arg

Val

Lys

100

105

110

CGC

TCT

GTC

GTG

CCC

ACG

GAC

CCC

TGG

TTC

TCC

AAG

CAG

TGG

TAC

444

Arg

Ser

Val

Pro

Thr

Asp

Pro

Trp

Phe

Ser

Lys

Gin

Trp

Tyr

115

120

125

ATG

AAC

AGC

GAG

GCC

CAA

CCA

GAC

CTG

AGC

ATC

CTG

CAG

GCC

TGG

AGT

492

Met

Asn

Ser

Glu

Ala

Gin

Pro

Asp

Leu

Ser

Ile

Leu

Gin

Ala

Trp

Ser

130

135

140

CAG

GGG

CTG

TCA

GGC

CAG

GGC

ATC

GTG

GTC

TCT

GTG

CTG

GAC

GAT

GGC

540

Gin

Gly

Leu

Ser

Gly

Gin

Gly

Ile

Val

Ser

Val

Leu

Asp

Gly

145

150

155

160

ATC

GAG

AAG

GAC

CAC

CCG

GAC

CTC

TGG

GCC

AAC

TAC

GAC

CCC

CTG

GCC

588

Ile

Glu

Lys

Asp

His

Pro

Asp

Leu

Trp

Ala

Asn

Tyr

Asp

Pro

Leu

Ala

165

170

175

AGC

TAT

GAC

TTC

AAT

GAC

TAC

GAC

CCG

GAC

CCC

CAG

CCC

CGC

TAC

ACC

636

Ser

Tyr

Asp

Phe

Asn

Asp

Tyr

Asp

Pro

Asp

Pro

Gin

Pro

Arg

Tyr

Thr

180

185

190

CCC

AGC

ΑΆΆ

GAG

AAC

CGG

CAC

GGG

ACC

CGC

TGT

GCT

GGG

GAG

GTG

GCC

684

Pro

Ser

Lys

Glu

Asn

Arg

His

Gly

Thr

Arg

Cys

Ala

Gly

Glu

Val

Ala

195

200

205

GCG

ATG

GCC

AAC

AAT

GGC

TTC

TGT

GGT

GTG

GGG

GTC

GCT

TTC

AAC

GCC

732

Ala

Met

Ala

Asn

Gly

Phe

Cys

Gly

Val

Gly

Val

Ala

Phe

Asn

Ala

210

215

220

CGA

ATC

GGA

GGC

GTA

CGG

ATG

CTG

GAC

GGT

ACC

ATC

ACC

GAT

GTC

ATC

780

Arg

Ile

Gly

Val

Arg

Met

Leu

Asp

Gly

Thr

Ile

Thr

Asp

Val

Ile

225

230

235

240

GAG

GCC

CAG

TCG

CTG

AGC

CTG

CAG

CCG

CAG

CAC

ATC

CAC

ATT

TAC

AGC

828

Glu

Ala

Gin

Ser

Leu

Ser

Leu

Gin

Pro

Gin

His

Ile

His

Ile

Tyr

Ser

245

250

255

• · · · · «···«· ······· ·· ··

GCC Ala

AGC Ser

TGG Trp

GGT Gly 260

CCC Pro

GAG Glu

GAC Asp

GGC Gly 265

CGC Arg

ACG Thr

GTG Val

GAC Asp

GGC Gly 270

CCC Pro

GGC Gly

876

ATC

CTC

ACC

CGC

GAG

GCC

TTC

CGG

CGT

GGT

GTG

ACC

AAG

GGC

CGC

GGC

924

Ile

Leu

Thr

Arg

Glu

Ala

Phe

Arg

Gly

Val

Thr

Lys

Gly

Arg

Gly

275

280

285

GGG

CTG

GGC

ACG

CTC

TTC

ATC

TGG

GCC

TCG

GGC

AAC

GGC

CTG

CAC

972

Gly

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ile

Trp

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

Leu

His

290

295

300

TAC

GAC

AAC

TGC

AAC

TGC

GAC

GGC

TAC

ACC

AAC

AGC

ATC

CAC

ACG

CTT

1020

Tyr

Asp

Asn

Cys

Asn

Cys

Asp

Gly

Tyr

Thr

Asn

Ser

Ile

His

Thr

Leu

305

310

315

320

TCC

GTG

GGC

AGC

ACC

CAG

GGC

CGC

GTG

CCC

TGG

TAC

AGC

GAA

1068

Ser

Val

Gly

Ser

Thr

Gin

Gly

Arg

Val

Pro

Trp

Tyr

Ser

Glu

325

330

335

GCC

TGC

GCC

TCC

ACC

CTC

ACC

TAC

AGC

GGC

GTG

GCC

ACC

1116

Ala

Cys

Ala

Ser

Thr

Leu

Thr

Tyr

Ser

Gly

Val

Ala

Thr

340

345

350

GAC

CCC

CAG

ATC

GTC

ACC

ACG

GAC

CTG

CAT

CAC

GGG

TGC

ACA

GAC

CAG

1164

Asp

Pro

Gin

Ile

Val

Thr

Asp

Leu

His

Gly

Cys

Thr

Asp

Gin

355

360

365

CAC

ACG

GGC

ACC

TCG

GCC

TCA

GCC

CCA

CTG

GCG

GCC

GGC

ATG

ATC

GCC

1212

His

Thr

Gly

Thr

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Leu

Ala

Gly

Met

Ile

Ala

370

375

380

CTA

GCG

CTG

GAG

GCC

AAC

CCG

TTC

CTG

ACG

TGG

AGA

GAC

ATG

CAG

CAC

1260

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Asn

Pro

Phe

Leu

Thr

Trp

Arg

Asp

Met

Gin

His

385

390

395

400

CTG

GTG

GTC

CGC

GCG

TCC

AAG

CCG

GCG

CAC

CTG

CAG

GCC

GAG

GAC

TGG

1308

Leu

Val

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

Ala

His

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Trp

405

410

415

AGG

ACC

AAC

GGC

GTG

GGG

CGC

CAA

GTG

AGC

CAT

CAC

TAC

GGA

TAC

GGG

1356

Arg

Thr

Asn

Gly

Val

Gly

Arg

Gin

Val

Ser

His

Tyr

Gly

Tyr

Gly

420

425

430

CTG Leu

GAC Asp 435

GCC Ala

GGG Gly

CTG Leu

GTG GAC

ACC Thr

GCC Ala

CGC Arg

ACC Thr 445

TGG Trp

CTG Leu

CCC Pro

1404

Val 440

Asp

ACC

CAG

CCG

CAG

AGG

AAG

TGC

GCC

GTC

CGG

GTC

CAG

AGC

CGC

CCC

ACC

1452

Thr

Gin

Pro

Gin

Arg

Lys

Cys

Ala

Val

Arg

Val

Gin

Ser

Arg

Pro

Thr

450

455

460

CCC

ATC

CTG

CCG

CTG

ATC

TAC

ATC

AGG

GAA

AAC

GTA

TCG

GCC

TGC

GCC

1500

Pro

Ile

Leu

Pro

Leu

Ile

Tyr

Ile

Arg

Glu

Asn

Val

Ser

Ala

Cys

Ala

465

470

475

480

GGC

CTC

CAC

AAC

TCC

ATC

CGC

TCG

CTG

GAG

CAC

GTG

CAG

GCG

CAG

CTG

1548

Gly

Leu

His

Asn

Ser

Ile

Arg

Ser

Leu

Glu

His

Val

Gin

Ala

Gin

Leu

485

490

495

ACG

CTG

TCC

TAC

AGC

CGG

CGC

GGA

GAC

CTG

GAG

ATC

TCG

CTC

ACC

AGC

1596

Thr

Leu

Ser

Tyr

Ser

Arg

Gly

Asp

Leu

Glu

Ile

Ser

Leu

Thr

Ser

500

505

510

CCC

ATG

GGC

ACG

CGC

TCC

ACA

CTC

GTG

GCC

ATA

CGA

CCC

TTG

GAC

GTC

1644

Pro

Met

Gly

Thr

Arg

Ser

Thr

Leu

Val

Ala

Ile

Arg

Pro

Leu

Asp

Val

515

520

525

AGC

ACT

GAA

GGC

TAC

AAC

TGG

GTC

TTC

ATG

TCC

ACC

CAC

TTC

TGG

1692

Ser

Thr

Glu

Gly

Tyr

Asn

Trp

Val

Phe

Met

Ser

Thr

His

Phe

Trp

530

535

540

GAT

GAG

AAC

CCA

CAG

GGC

GTG

TGG

ACC

CTG

GGC

CTA

GAG

AAC

AAG

GGC

1740

Asp

Glu

Asn

Pro

Gin

Gly

Val

Trp

Thr

Leu

Gly

Leu

Glu

Asn

Lys

Gly

545

550

555

560

TAC

TAT

TTC

AAC

ACG

GGG

ACG

TTG

TAC

CGC

TAC

ACG

CTG

CTC

TAT

1788

Tyr

Phe

Asn

Thr

Gly

Thr

Leu

Tyr

Arg

Tyr

Thr

Leu

Tyr

565

570

575

GGG

ACG

GCC

GAG

GAC

ATG

ACA

GCG

CGG

CCT

ACA

GGC

CCC

CAG

GTG

ACC

1836

Gly

Thr

Ala

Glu

Asp

Met

Thr

Ala

Arg

Pro

Thr

Gly

Pro

Gin

Val

Thr

580

585

590

AGC

GCG

TGT

GTG

CAG

CGG

GAC

ACA

GAG

GGG

CTG

TGC

CAG

GCG

TGT

1884

Ser

Ala

Cys

Val

Gin

Arg

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Cys

Gin

Ala

Cys

595

600

605

• · · · · ·

GAC Asp

GGC Gly 610

CCC Pro

GCC Ala

TAC Tyr

ATC Ile

CTG Leu 615

GGA Gly

CAG Gin

CTC Leu

TGC Cys

CTG Leu 620

GCC Ala

TAC Tyr

TGC Cys

CCC Pro

1932

CCG

CGG

TTC

AAC

CAC

ACA

AGG

CTG

GTG

ACC

GCT

GGG

CCT

GGG

CAC

1980

Pro

Arg

Phe

Asn

His

Thr

Arg

Leu

Val

Thr

Ala

Gly

Pro

Gly

His

625

630

635

640

ACG

GCG

CCC

GCG

CTG

AGG

GTC

TGC

TCC

AGC

TGC

CAT

GCC

TCC

TGC

2028

Thr

Ala

Pro

Ala

Leu

Arg

Val

Cys

Ser

Cys

His

Ala

Ser

Cys

645

650

655

TAC

ACC

TGC

CGC

GGC

TCC

CCG

AGG

GAC

TGC

ACC

TCC

TGT

CCC

CCA

2076

Tyr

Thr

Cys

Arg

Gly

Ser

Pro

Arg

Asp

Cys

Thr

Ser

Cys

Pro

660

665

670

TCC

ACG

CTG

GAC

CAG

GGC

TCC

TGC

ATG

GGA

CCC

ACC

2124

Ser

Thr

Leu

Asp

Gin

Gly

Ser

Cys

Met

Gly

Pro

Thr

675

680

685

CCC Pro

GAC Asp 690

AGC Ser

CGC Arg

CCC Pro

CGG Arg

CTT Leu 695

AGA Arg

GCT Ala

GCC Ala

TGT Cys 700

CCC Pro

CAC His

CGC Arg

2172

TGC

CCA

GCC

TCG

GCC

ATG

GTG

CTG

AGC

CTC

CTG

GCC

GTG

ACC

CTC

GGA

2220

Cys

Pro

Ala

Ser

Ala

Met

Val

Leu

Ser

Leu

Ala

Val

Thr

Leu

Gly

705

710

715

720

GGC

CCC

GTC

CTC

TGC

GGC

ATG

TCC

ATG

GAC

CTC

CCA

CTA

TAC

GCC

TGG

2268

Gly

Pro

Val

Leu

Cys

Gly

Met

Ser

Met

Asp

Leu

Pro

Leu

Tyr

Ala

Trp

725

730

735

CTC

TCC

CGT

GCC

AGG

GCC

ACC

CCC

ACC

AAA

CCC

CAG

GTC

TGG

CTG

CCA

2316

Leu

Ser

Arg

Ala

Arg

Ala

Thr

Pro

Thr

Lys

Pro

Gin

Val

Trp

Leu

Pro

740 745 750

GCT GGA ACC TGAAGTTGTC AGCTCAGAAA GCGACCTTGC CCCCGCCTGG GTCCCTGAC 2374 Ala Gly Thr

755

AGGCACTGCT

ACGCCTGGCC

AGAGAAGTCT

CACCCCAAAA

CGCATCCAAC

GCCATGCTGC

TGCCAGGGAT

CCTCTGCATT

GCCAGGGGAA

CTCAGAGTTT

CTCCCCAGGC

GGGCCCCGTG

TTGGGTTTGG

AGTGGAGGGA

GCAAATAAAG

TGGCCCCAGA

GAACCCCGAA

GCGGGAGTGG

GAGAAACGTG

GTTGCTTAGA

CCAGCACCCG 2434 AGAGAGAGAG 2494 GAGGCTGGAG 2554 CCTCGGGCAC 2614 AAAAAAAAAA 2674

GGAGCGAGCA

GCCTGGCGGG

GCTGGGGGGA

ACACTGTCCG

AGGTGAAAAA • to toto · · • toto ··· ··· ···· toto to·

ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΆΑΆΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ 2734 AAGCGGCCGC 2744 (2) INFORMACE Κ SEKVENCI č.2:

(i) CHARACTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 755 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (D) TOPOLOGY: lineární (ii) TYP MOLEKULY: bílkovina (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní

(>	>i) 1	POPIS SEKVENCE:	SEKVENCE č.2:
Met	Arg	Pro Ala Pro Ile	Ala Leu Trp Leu Arg Leu Val Leu Ala Leu
	1	5	10 15
Ala	Leu	Val Arg Pro Arg	Ala Val Gly Trp Ala Pro Val Arg Ala Pro
		20	25 30
Ile	Tyr	Val Ser Ser Trp	Ala Val Gin Val Ser Gin Gly Asn Arg Glu
		35	40 45
Val	Glu	Arg Leu Ala Arg	Lys Phe Gly Phe Val Asn Leu Gly Pro Ile
	50		55 60
Phe	Pro	Asp Gly Gin Tyr	Phe His Leu Arg His Arg Gly Val Val Gin
65		70	75 80
Gin	Ser	Leu Thr Pro His	Trp Gly His Arg Leu His Leu Lys Lys Asn
		85	90 95
Pro	Lys	Val Gin Trp Phe	Gin Gin Gin Thr Leu Gin Arg Arg Val Lys
		100	105 110
Arg	Ser	Val Val Val Pro	Thr Asp Pro Trp Phe Ser Lys Gin Trp Tyr
		115	120 125
Met	Asn	Ser Glu Ala Gin	Pro Asp Leu Ser Ile Leu Gin Ala Trp Ser
	130		135 140
Gin	Gly	Leu Ser Gly Gin	Gly Ile Val Val Ser Val Leu Asp Asp Gly
145		150	155 160
Ile	Glu	Lys Asp His Pro	Asp Leu Trp Ala Asn Tyr Asp Pro Leu Ala
		165	170 175
Ser	Tyr	Asp Phe Asn Asp	Tyr Asp Pro Asp Pro Gin Pro Arg Tyr Thr
		180	185 190
Pro	Ser	Lys Glu Asn Arg	His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala
		195	200 205
Ala	Met	Ala Asn Asn Gly	Phe Cys Gly Val Gly Val Ala Phe Asn Ala
	210		215 220

• · · · · ft ftft ftft ftft • ftft · · ft · ···· • ftftft · · ···· « ftft · ft · ftft···· ft ft · · ftft

Arg

Ile

Gly

Val Arg Met

Leu Asp

Gly

Thr

Ile

Thr

Asp

Val

Ile

225

230

235

240

Glu

Ala

Gin

Ser

Leu

Ser

Leu

Gin

Pro

Gin

His

Ile

His

Ile

Tyr

Ser

245

250

255

Ala

Ser

Trp

Gly

Pro

Glu

Asp

Gly

Arg

Thr

Val

Asp

Gly

Pro

Gly

260

265

270

Ile

Leu

Thr

Arg

Glu

Ala

Phe

Arg

Gly

Val

Thr

Lys

Gly

Arg

Gly

275

280

285

Gly

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ile

Trp

Ala

Ser

Gly

Asn

Gly

Leu

His

290

295

300

Tyr

Asp

Asn

Cys

Asn

Cys

Asp

Gly

Tyr

Thr

Asn

Ser

Ile

His

Thr

Leu

305

310

315

320

Ser

Val

Gly

Ser

Thr

Gin

Gly

Arg

Val

Pro

Trp

Tyr

Ser

Glu

325

330

335

Ala

Cys

Ala

Ser

Thr

Leu

Thr

Tyr

Ser

Gly

Val

Ala

Thr

340

345

350

Asp

Pro

Gin

Ile

Val

Thr

Asp

Leu

His

Gly

Cys

Thr

Asp

Gin

355

360

365

His

Thr

Gly

Thr

Ser

Ala

Ser

Ala

Pro

Leu

Ala

Gly

Met

Ile

Ala

370

375

380

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Asn

Pro

Phe

Leu

Thr

Trp

Arg

Asp

Met

Gin

His

385

390

395

400

Leu

Val

Arg

Ala

Ser

Lys

Pro

Ala

His

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Trp

405

410

415

Arg

Thr

Asn

Gly

Val

Gly

Arg

Gin

Val

Ser

His

Tyr

Gly

Tyr

Gly

420

425

430

Leu

Asp

Ala

Gly

Leu

Val

Asp

Thr

Ala

Arg

Thr

Trp

Leu

Pro

435

440

445

Thr

Gin

Pro

Gin

Arg

Lys

Cys

Ala

Val

Arg

Val

Gin

Ser

Arg

Pro

Thr

450

455

460

Pro

Ile

Leu

Pro

Leu

Ile

Tyr

Ile

Arg

Glu

Asn

Val

Ser

Ala

Cys

Ala

465

470

475

480

Gly

Leu

His

Asn

Ser

Ile

Arg

Ser

Leu

Glu

His

Val

Gin

Ala

Gin

Leu

485

490

495

Thr

Leu

Ser

Tyr

Ser

Arg

Gly

Asp

Leu

Glu

Ile

Ser

Leu

Thr

Ser

500

505

510

Pro

Met

Gly

Thr

Arg

Ser

Thr

Leu

Val

Ala

Ile

Arg

Pro

Leu

Asp

Val

515

520

525

Ser

Thr

Glu

Gly

Tyr

Asn

Trp

Val

Phe

Met

Ser

Thr

His

Phe

Trp

530

535

540

Asp

Glu

Asn

Pro

Gin

Gly

Val

Trp

Thr

Leu

Gly

Leu

Glu

Asn

Lys

Gly

545

550

555

560

Tyr

Phe

Asn

Thr

Gly

Thr

Leu

Tyr

Arg

Tyr

Thr

Leu

Tyr

565

570

575

• 4444 4 4 4 44 44 • 4 4 4 4 4 4 4 .» 4 4

4 4 4 · 4 4··4 • · · 4 4 4 44 4 4 4 4 • 4 4 · 4 · •44444 4444444 44 4·

Gly Thr Ala

Glu 580

Asp

Met

Thr

Ala

Arg 585

Pro

Thr

Gly

Pro

Gin 590

Val

Thr

Ser Ser Ala

Cys

Val

Gin

Arg

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Cys

Gin

Ala

Cys

595

600

605

Asp Gly Pro

Ala

Tyr

Ile

Leu

Gly

Gin

Leu

Cys

Leu

Ala

Tyr

Cys

Pro

610

615

620

Pro Arg Phe

Phe

Asn

His

Thr

Arg

Leu

Val

Thr

Ala

Gly

Pro

Gly

His

625

630

635

640

Thr Ala Ala

Pro

Ala

Leu

Arg

Val

Cys

Ser

Cys

His

Ala

Ser

Cys

645

650

655

Tyr Thr Cys

Arg

Gly

Ser

Pro

Arg

Asp

Cys

Thr

Ser

Cys

Pro

660

665

670

Ser Ser Thr

Leu

Asp

Gin

Gly

Ser

Cys

Met

Gly

Pro

Thr

675

680

685

Pro Asp Ser

Arg

Pro

Arg

Leu

Arg

Ala

Cys

Pro

His

Arg

690

695

700

Cys Pro Ala

Ser

Ala

Met

Val

Leu

Ser

Leu

Ala

Val

Thr

Leu

Gly

705

710

715

720

Gly Pro Val

Leu

Cys

Gly

Met

Ser

Met

Asp

Leu

Pro

Leu

Tyr

Ala

Trp

725

730

735

Leu Ser Arg

Ala

Arg

Ala

Thr

Pro

Thr

Lys

Pro

Gin

Val

Trp

Leu

Pro

740 745 750

Ala Gly Thr 755 (2) INFORMACE K SEKVENCI č.3:

(i) CHARACTERIŠTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.3:

Arg Arg Val Lys Arg

5 (2) INFORMACE K SEKVENCI č 4:

(i) CHARACTERIŠTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) klon ZC6091 (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.4:

GAGCACAGAA TTCACTACTC GAGGCGGCCG CTTTTTTTTT _TTTTTTTTT 49 (2) INFORMACE K SEKVENCI č 5:

(i) CHARACTERIŠTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2458 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiný (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.5:

ATGCGGCCCT CCCAGACAGC GCTGTGGCTG GGTCTGGTTT TGTCTTTGGC CCTCCTGGCT 60

GTGGGGTGGG CCTCAGCCCG ACCACCCATC TATGTCAGCA GCTGGGCAGT GCGGGTGACC 120

AAAGGTTACC AGGAGGCTGA GCGCCTGGCA CGTAAATTTG GCTTCGTCAA CCTGGGACAG 180

ATCTTTCCTG ATGACCAGTA TTTCCATCTG AGGCACCGGG GTGTGGCCCA GCAGTCCCTG 240

ACTCCGCACT GGGGCCACCG TCTGCGCCTG AAGAAAGAGC CCAAGGTGCG GTGGTTTGAG 300

CAGCAGACTT TGAGGCGGCG GGTGAAGCGC TCCCTGGTGG TACCCACAGA CCCCTGGTTT 360

TCCAAGCAGT GGTACATGAA CAAGGAGATA GAACAAGATC TCAACATCCT AAAGGTTTGG 420

AACCAGGGAC TGACTGGCCG GGGAGTGGTG GTCTCCATCT TGGATGATGG CATTGAGAAG 480

GACCATCCGG ACCTCTGGGC TAATTATGAC CCCCTGGCCA GCTATGACTT CAATGATTAC 540

GACCCAGATC CCCAGCCTCG ATACACACCC AACGATGAGA ACCGGCATGG AACACGCTGC 600

GCTGGGGAGG TGTCTGCCAC AGCAAACAAC GGTTTCTGTG GTGCCGGTGT GGCCTTCAAT 660

GCCAGAATTG GAGGCGTGCG CATGTTGGAT GGAGCCATCA CTGACATCGT GGAGGCTCAG 720

TCCCTCAGCC TGCAGCCGCA ACACATACAC ATCTATAGCG CCAGTTGGGG CCCCGAGGAT 780

GATGGGCGCA CAGTGGACGG ACCCGGCCTC CTCACGCAGG AGGCCTTCAG GCGTGGTGTA 840

ACCAAGGGCC GCCAAGGGCT GGGCACGCTG TTCATCTGGG CCTCGGGAAA CGGTGGCCTC 900

CACTACGACA ACTGCAATTG TGACGGCTAC ACCAACAGCA TCCACACGCT GTCAGTGGGC 960

AGTACCACGC GGCAGGGCCG AGTGCCCTGG TACAGCGAGG CCTGCGCCTC CACGTTCACC 1020

ACCACCTTCA GCAGCGGTGT GGTCACCGAC CCACAGATCG TCACCACGGA CCTACACCAT 1080

CAATGCACCG ACAAGCACAC GGGCACCTCG GCCTCCGCCC CGCTGGCCGC TGGCATGATC 1140

GCCCTGGCGC TGGAGGCCAA CCCGCTGCTG ACCTGGAGGG ACCTGCAGCA CCTGGTGGTC 1200

CGCGCGTCCA GGCCGGCGCA GCTGCAGGCG GAGGACTGGA GGATCAACGG CGTGGGGCGC 1260

CAAGTGAGCC ACCACTATGG CTATGGGCTG CTGGACGCGG GGCTGCTGGT AGACCTGGCT 1320

CGCGTGTGGC TCCCTACTAA GCCTCAGAAG AAATGCACCA TTCGGGTGGT GCACACCCCA 1380

0 0 0 0 « 00 ·0 ·0 • 00 0 0 0 0 00·· • ··· 0 0 0000 0 >0 · 0*000000 « 0 0 0 0 0

ACCCCCATCC	TGCCTCGGAT	GCTGGTGCCA	AAGAACGTGA	CTGTATGCTG	CGATGGCTCG	1440
CGCCGCCGCC	TCATCCGCTC	GCTAGAGCAT	GTTCAGGTCC	AGCTGTCGCT	CTCCTACAGC	1500
CGCCGCGGG6	ACCTGGAGAT	CTTCCTCACC	AGCCCCATGG	GCACGCGCTC	CACGCTTGTG	1560
GCCATCAGAC	CCTTGGATAT	CAGCGGCCAA	GGCTACAACA	ACTGGATCTT	CATGTCTACT	1620
CACTACTGGG	ATGAGGACCC	GCAGGGCCTG	TGGACCCTGG	GGCTGGAGAA	TAAGGGCTAC	1680
TATTATAACA	CAGGAACTCT	GTACTACTGC	ACGCTGCTGC	TGTATGG6AC	GGCAGAGGAC	1740
ATGACAGCGC	GGCCCCAGAC	CCCCCAGGTG	ACCAGCTGCG	CGCACGCATG	T6CAGAGGGA	1800
CACAGAGGGG	CTGTGCCAGG	AAAGTCATTG	TCCCCTCTCC	ATTGTGGCAG	AACTCTGCCT	1860
CATCTCCAGC	AAGCAGTGGT	GGTGGCTCTA	CA6CCACACA	CAGCAGCCAG	TGACCAAGGG	1920
ACAGGACAGC	TGTCACCCTC	CTACCACACC	TGCTCGGCAG	CTTGACCAGC	GACTACACTG	1980
CCTGTTCCCT	GCCCCTCATG	CTGGGAGTGC	TTCAGAGCCC	CTCCAAGGCT	TGTCACCTCT	2040
GGCAGCCATC	CTGGCTATCA	GTCTTGGGCC	ATGGTGCTGT	CCCTGCTAAC	CAGGGCCTTT	2100
GGAAGGCCCC	TCATCTTGAG	GAAGGCCCAC	CTCTCCCCAG	GCTGGATACC	CCTGGGGAGC	2160
CAGAGATGCC	CCACTCTCAG	GACAGAAGGC	CGGTACCCCA	AGGCCCTGCT	CCCA6GCCGG	2220
GATAGGAATA	TGCCCCAGAA	GGCCACGGCA	GAGAGCTGCA	TGGGTCACGT	GACAGCCCGC	2280
AGCTCAGCCT	CAGCTGCTCC	CAGTGGAAGA	GACGTTTCCT	CATTCTTTTT	GGAGCAGGTA	2340
TGGCAGACAA	GAGGTCAGAC	CACAGCCACC	AACCACCTGC	CCCTTCCCTG	TCTCCAAACC	2400
ATCCCCATGT	CTAACCTCAT	AGTTGGCAAA	TAAAGTTAAA	CAGAAAAAAA	ΆΑΑΑΑΑΆΆ	2458

(2) INFORMACE Κ SEKVENCI č 6:

(i) CHARACTERISTIKY SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 25 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	TYP ŘETĚZCE: jednovláknový
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(vii)	ZDROJ:
(B) klon ZC611808
(xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.6:

TGGCTGGGTC TGGTTTTGTC TTTGG 25 (2) INFORMACE K SEKVENCI č 7:

(i) CHARACTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) klon ZC611809

4 · • · ·· · 4 4 4 44 «44 4 4·· 4 · «

4·4 4 4 «44 • «4 · 4*44· • 4 4 4 4 •44 444 ··· 4444 44 (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.7:

GCATTGATGG TGTAGGTCCG TGGT 24 (2) INFORMACE K SEKVENCI č 8:

(i) CHARACTERISTIKY SEKVENCE:

(B) klon ZC11870 (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.8:

TTTGGCCCTC CTGGCTGTGG GGTG 24 (2) INFORMACE K SEKVENCI č 9:

(i) CHARACTERISTIKY SEKVENCE:

(B) klon ZC11871 (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.9:

TGCTGAAGGT GGTGGTGAAC GTGG 24 (2) INFORMACE K SEKVENCI č 10:

(i) CHARACTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) klon ZC13557 *

φφφφ · «· ·· · · • · φ · φ · · * · φ 9 · Φ Φ «φΦΦ

Φ · Φ Φ 9 ΦΦΦΦΦΦ (χί) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.10

CAGCCGCAGC ACATCCACAT TTACAG (2) INFORMACE K SEKVENCI č 11:

(i) CHARACTERIŠTIKY SEKVENCE:

(E) DÉLKA: 21 párů baží (F) TYP: nukleová kyselina (G) TYP ŘETĚZCE: jednovláknový (H) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) klon ZC13558 (xi) POPIS SEKVENCE: Sekvence č.ll

Claims

1. Izolovaný polynukleotid kódující lidskou prohormonovou konvertázu 4, obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším v 90 % shodná s některou aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny:

(e) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 443 (Ala);

(f) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 755 (Thr);

(g) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr); a (h) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 1 (Met) po aminokyselinu číslo 755 (Thr).

2. Izolovaný polynukleotid podle patentového nároku 1, v y z n a č u j i c i se tím, že polynukleotid je vybrán ze skupiny:

(e) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, od nukleotidu 400 po nukleotid 1389;

(f) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, od nukleotidu 400 po nukleotid 2325;

(g) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, od nukleotidu 118 po nukleotid 2325; a (h) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, od nukleotidu 61 po nukleotid 2325.

4. Izolovaný polynukleotid podle patentového nároku 1, kde polypeptid lidské prohormonové konvertázy 4 se v podstatě skládá ze sekvence aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr).

5. Izolovaný polynukleotid polynukleotid podle patentového nároku 4, kde polypeptid lidské prohormonové konvertázy 4 se v podstatě skládá ze sekvence aminokyselinových zbytků, uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr).

6. Expresní vektor obsahující následující operativně vázané elementy:

transkripční promotor;

segment DNA kódující polypeptid prohormonové konvertázy, který je přinejmenším z 90 % shodný s aminokyselinovou sekvencí, uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr); a terminátor transkripce.

7. Expresní vektor podle patentového nároku 6, který dále obsahuje sekreční signální sekvenci, operativně vázanou k DNA segmentu.

8. Kultivovanou buňku, do níž byl vnesen expresní vektor podle patentového nároku 6, kdy buňka exprimuje polypeptid, kódovaný DNA segmentem.

9. Konstrukci DNA kódující fúzní protein, vyznačující se tím, že obsahuje: první DNA segment kódující polypeptid, který je přinejmenším v 90 % shodný s některou aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny:

(a) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 1 (Met) po aminokyselinu číslo 21 (Pro);

(b) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 113 (Arg);

(c) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 443 (Ala);

(d) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 444 (Arg) po aminokyselinu číslo 561 (Tyr);

(e) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 562 (Tyr) po aminokyselinu číslo 755 (Thr);

»· · ·

I (f) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 755 (Thr);

(g) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr); a přinejmenším jeden jiný segment DNA, který kóduje další polypeptid, kde první a ostatní DNA segmenty jsou spojeny v čtecím rámci; a kódují fúzní protein.

10. Fúzní protein vytvořený postupem vyznačujícím se tím, že obsahuje:

kultivaci hostitelských buněk, do nichž byl vnesen vektor obsahující následující, operačně vázané elementy:

(a) transkripční promotor;

(b) konstrukci DNA, kódující fúzní protein podle nároku 9; a (c) terminátor transkripce; a izolaci proteinu kódovaného DNA segmentem.

11. Izolovaný polypeptid, obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším v 90 % shodná s některou aminokyselinovou sekvencí, vybranou ze skupiny:

(a) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 443 (Ala);

(b) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 114 (Ser) po aminokyselinu číslo 755 (Thr);

(c) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr); a (d) aminokyselinová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 1 (Met) po aminokyselinu číslo 755 (Thr).

12. Izolovaný polypeptid podle patentového nároku 11, který se skládá v podstatě ze sekvence aminokyselinových zbytků, která je přinejmenším v 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr).

9 9 9· »· ·9

13. Izolovaný polypeptid podle patentového nároku 12, jehož sekvence aminokyselinových zbytků je uvedena v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Thr).

14. Způsob produkce polypeptidu lidské prohormonové konvertázy 4 vyznačující se 11 m, že obsahuje kroky:

kultivaci buněk, podle nároku 8; a izolaci polypeptidu lidské prohormonové konvertázy produkovaného buňkou.

15. Způsob detekce polypeptidů prohormonových substrátů pro polypeptid lidské prohormonové konvertázy 4 vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

kultivaci buněk, do nichž byl vnesen expresní vektor podle nároku 6, kdy buňka exprimuje protein lidské prohormonové konvertázy, kódovaný DNA segmentem a současně exprimuje polypeptid testovaného prohormonového substrátu; a detekování štěpných produktů, které jsou výsledkem štěpení testovaného substrátu proteinem lidské prohormonové konvertázy 4.

16. Způsob detekce polypeptidů prohormonových substrátů pro protein lidské prohormonové konvertázy 4 vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

spojení in vitro proteinu prohormonové konvertázy 4 podle nároku 11 s polypeptidem testovaného substrátu; a detekováni štěpných produktů, které jsou výsledkem štěpení testovaného substrátu proteinem lidské prohormonové konvertázy 4.

17. Způsob detekce přítomnosti modulátorů aktivity proteinu lidské prohormonové konvertázy v testovaném vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

kultivaci buněk, do nichž byl vnesen expresní vektor podle nároku 6, kdy buňka exprimuje protein lidské prohormonové konvertázy, kódovaný DNA segmentem a současně exprimuje známý indikátorový polypeptid prohormonového substrátu, v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku; a porovnání hladin štěpných produktů, pocházejících ze štěpení substrátu lidskou prohormonovou konvertázou, v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku, pomocí biologického nebo biochemického testu; a • · ·♦ ► * * « ► · · « ·♦· · ·<

• «

9 · 9 * určení na základě tohoto porovnání, zda je v testovaném vzorku přítomen modulátor aktivity lidské prohormonové konvertázy.

18. Způsob přípravy protilátky proti polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

očkování zvířete polypeptidem, vybraným ze skupiny:

(e) polypeptid skládající se z 9 až 744 aminokyselin, přičemž polypeptid je přinejmenším v 90 % shodný se souvislou aminokyselinovou sekvencí v SEQ ID NO: 2, od aminokyseliny číslo 20 (Arg) po aminokyselinu číslo 755 (Ser);

(f) polypeptid podle nároku 11;

(g) polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci přinejmenším v 90 % shodnou se zbytkem aminokyseliny číslo 444 (Arg) po zbytek číslo 561 (Tyr) v SEQ ID NO: 2; a (h) polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci přinejmenším v 90 % shodnou se zbytkem aminokyseliny číslo 562 (Tyr) po zbytek číslo 755 (Thr) v SEQ ID NO: 2, kde polypeptid vyvolává ve zvířeti imunní odpověď; a izolace protilátky ze zvířete.

19. Protilátka produkovaná způsobem podle patentového nároku 18, která se váže k polypeptidů lidské prohormonové konvertázy 4.

20. Protilátka podle patentového nároku 19, kde protilátka je monoklonální protilátka.

21. Protilátka, která se specificky váže k polypeptidů podle patentového nároku 11.