KR20010012280A - 인간의 프로호르몬 변환효소 4 - Google Patents

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리스 데브라 케이.
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Abstract

본 발명은 신규한 인간 프로호르몬 변환효소4에 대한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 인간 프로호르몬 변환효소4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염색체(19)에 위치하고 예컨대 인간의 질환에 관련한 게놈의 영역을 동정하기 위해 사용된다. 본 발명은 또한 단백질 및 그 항체를 생산하기 위한 방법을 포함한다.

Description

인간의 프로호르몬 변환효소 4{HUMAN PROHORMONE CONVERTASE 4}
전구체로서 합성된 많은 단백질 및 호르몬이 프로호르몬 변환효소 족의 매우 특이적인 단백질 분해효소에 의해 그들의 성숙 형태로 프로세싱된다. 이러한 포유동물의 엔도프로테아제의 족은 그들의 기질 폴리펩티드 내의 이염기성 부위의 COOH-터미널 측에서 세포내 절단을 수행한다. 이러한 프로호르몬 변환효소(PC) 족의 구성원은 효모의 이염기성-특이성 엔도프로테아제 Kex2 (Smeekins, S.P., Bio/Technology 11: 182-186, 1993)에 관련된 Ca++-의존적 세린 프로테아제이다. 더구나 그들의 촉매적 도메인은 박테리아의 서브틸리신과 유사하게 구성되어 있다. 적어도 여섯개의 포유동물 프로호르몬 변환효소가 발견되었고 PC2, PC3/PC1, PC4, PC5/6 푸린(furin)/PACE 및 PACE4를 포함한다(Smeekins, S.P., ibid., Seidah, N.G. et al., Biochimie (France) 76: 197-209, 1994).
포유동물의 프로호르몬 변환효소는 일련의 생물학적 활성을 갖는 매우 다양한 전구체 분자에 작용한다. 프로인슐린 프로호르몬이 동정된 첫번째 기질 전구체였다. 뒤따라서 150개 이상의 기질이 효모에서부터 포유동물에 이르기까지의 유기체에서 발견되었다. 여기에는 뉴로펩티드, 펩티드 호르몬, 성장 인자 및 그들의 수용체, 플라즈마 및 응고 단백질, 레트로바이러스의 엔벨롭 단백질 및 세포 독소 예컨대 탄저병을 포함한다.절단부위는 염기성 아미노산을 포함하고, 쌍의 염기성 잔기에서 절단이 일어나는데 통상 Lys-Arg 또는 Arg-Arg 뒤에서 그리고 더 드물게는 Arg-Lys 또는 Lys-Lys 뒤에서 일어난다(Smeekins, S.P., ibid.).
프로호르몬 변환효소 족은 조직-특이적 발현 및 세포 구획화를 나타내는데 이것은 생물학적 기능에 관련이 있다. 예컨대 PC1/3 및 PC2는 뉴로엔도크린 조직에서 단독으로 발현된다. 이러한 단백질의 생물학적 활성은 뉴로엔도크린 세포, 특히 분비 그래뉼의 조절된 분비 경로에 국소화 되어있고; 둘다 그래뉼에서 프로글루카곤, 프로오피오멜라노코틴(POMC) 및 프로인슐린 등의 프로세싱 전구체에 중요한 역할을 한다. 그러므로 세포내 국소화 및 조직 특이성은 이러한 엔도프로테아제의 생물학적 활성이 어느 곳에서 나타날 지를 반영하는 것으로 보인다.
PC4는 유전자 발현의 매우 특이적인 조직-선택성을 나타낸다. PC4를 마우스 및 래트로부터 분리하여 고환에서 단독으로 발현시킨다. 마우스에서는 PC4 유전자 발현이 정자형성의 첫번째 단계에 상응하는 임신기간 약 20일째에 일어난다. 높은 PC4 mRNA 발현 수준이 Leydig, Sertoli 또는 소관주위(peritubular) 세포가 아닌 배세포에서 발견된다. 인시츄 혼성화에 의해, 신장하는 정자세포에서가 아닌 태사기 정모세포 및 둥근 정자세포에서의 mRNA 발현이 증명되었다(N.G. Seidah et al., Mol. Endocrinol. 6: 1559-1570, 1992). 더구나 래트 및 마우스 둘다에서 세개의 PC4 mRNA가 발견되고, 이러한 RNA는 아마도 분화적 스플리싱 및/또는 엑손 스킵핑으로부터 유도된 것이다. 원칙 또는 양가택일적으로 스플리싱된 형태로부터 유도된 마우스 및 래트의 PC4 단백질의 생물학적 기능은 알려지지 않았다.
정자형성은 수정관에서 일어나는 일련의 과정으로 그곳에서 배(또는 정자) 세포가 궁극적으로 성숙하여 정자가 된다. 고환 내에서 생산된 펩티드는 고환 세포 간의 상호작용을 매개하는 잠재적인 파라크린 및 오토크린 인자이다. 이러한 알려진 잠재적인 펩티드 기질 대부분은 배세포가 아닌 Leydig 및 Sertoli 세포 안에서 생산된다. 수정관 내에 위치한 Sertoli 세포는 배세포와 접촉하고 있으며, 배세포 성숙에 영향을 미치는 고환-특이적 인자를 직접 생산한다. 배세포에 영향을 미치는 다른 인자들은 파라크린 또는 엔도크린 인자일 것이고; 수정관 외부에서 생산된 많은 이러한 분자들이 수송 및 Sertoli 세포에 의해 발현된 결합 단백질에 의해 배세포의 미세환경 안으로 운반되어진다. 게다가 세포 방어벽을 뚫고 정자 세포의 미세환경으로 들어가는 파라크린 인자는 Leydig 세포로부터 분비된 분자들을 포함한다. Leydig 세포는 수정관들 사이에서 발견되는 간질성 공간에 위치되어 있고, 성숙 과정에서 중요한 역할을 하는 테스토스테론, Leydig 인자, IGF-1, 인히빈(inhibin) 및 프로히빈(prohibin) 등의 몇몇 인자들을 생산한다. 이러한 그리고 다른 인자들은 정자형성 주기의 한 특정된 단계동안 특이적으로 작용할 것이다. 더구나 Sertoli 세포에 매우 근접해있는 배세포에서 발현되는 일부 펩티드 호르몬이 고환세포 간의 상호작용을 매개하는 잠재적인 파라크린 및 오토크린 인자이다. 예컨대 오피오이드 펩티드, POMC 및 프로엔케팔린이 배세포에서 발현되고 아마도 프로세싱된다. 흥미롭게도 쥐의 프로엔케팔린이 정자형성동안 쥐의 PC4와 유사한 mRNA 발현 양상을 갖는다(S. Torii, et al., FEBS Let. 316: 12-16, 1993). 쥐의 PC4의 단계-특이적 발현이 고환으로부터의 프로호르몬 인자를 프로세싱하는 것에 있어서의 생물학적 역할에 관련있다. 정자형성에서 PC4의 역할이 제안된다해도 PC4의 기능은 아직 밝혀지지 않았다.
여기에서 인간의 상동성이 기대된다. 본 발명은 쥐의 PC4에 대한 인간의 상동물질의 분리를 유익하게 제공한다.
본 발명은 (a) SEQ ID NO:2에서 아미노산 114번(Ser)부터 아미노산 443번(Ala)까지의 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2에서 아미노산 114번(Ser)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2에서 아미노산 20번(Arg)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열; 및 (d) SEQ ID NO:2에서 아미노산 1번(Met)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또다른 구체예에서 상기 기술한 분리된 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리뉴클레오티드는 (a) SEQ ID NO:1에서 뉴클레오티드 400번부터 뉴클레오티드 1389번까지의 폴리뉴클레오티드 서열; (b) SEQ ID NO:1에서 뉴클레오티드 400번부터 뉴클레오티드2325번까지의 폴리뉴클레오티드 서열; (c) SEQ ID NO:1에서 뉴클레오티드 118번부터 뉴클레오티드2325 번까지의 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (d) SEQ ID NO:1에서 뉴클레오티드 61번부터 뉴클레오티드 2325번까지의 폴리뉴클레오티드서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또다른 구체예에서 상기 기재된 분리된 인간의 프로호르몬 변환효소4의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 2265를 포함한다. 또다른 구체예에서 상기 기재된 분리된 인간의 프로호르몬 변환효소4의 폴리뉴클레오티드가 본질적으로 SEQ ID NO:2의 아미노산 20번 (Arg)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열에 90%이상 상동적인 아미노산 잔기의 서열로 구성된 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 코딩한다. 또다른 구체예에서 상기 기재된 분리된 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 SEQ ID NO:2의 아미노산 20번 (Arg)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 잔기의 서열로 구성된 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 코딩한다.
제2의 관점에서, 본 발명은 하기 작동가능하게 연결된 요소들을 포함하는 발현벡터를 제공한다: 전사 프로모터; SEQ ID NO:2의 아미노산 20번 (Arg)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열에 90%이상 상동적인 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 절편; 및 전사 터미네이터. 또다른 구체예에서 상기 기재된 발현벡터가 DNA 절편에 작동가능하게 연결된 분비 신호서열을 더욱 포함한다.
제3의 관점에서, 본 발명은 상기 기재된 발현벡터를 도입한 배양된 세포를 제공하고, 그 세포는 DNA 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 융합 단백질을 코딩하는 DNA 구조체를 제공하는데, 그 DNA 구조체는 SEQ ID NO:2의 잔기 1번 (Met)부터 잔기 21번(Pro)까지의 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 잔기 20번 (Arg)부터 잔기 113번(Arg)까지의 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 잔기 114번 (Ser)부터 잔기 443번(Ala)까지의 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 잔기 444번 (Arg)부터 잔기 561번(Tyr)까지의 아미노산 서열; (e) SEQ ID NO:2의 잔기 562번 (Tyr)부터 잔기 755번(Thr)까지의 아미노산 서열; (f) SEQ ID NO:2의 잔기 114번 (Ser)부터 잔기 755번(Thr)까지의 아미노산 서열; (g) SEQ ID NO:2의 잔기 20번 (Arg)부터 잔기 755번(Thr)까지의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열에 적어도 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 DNA 절편; 및 부가적 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 다른 DNA 절편을 포함하고, 그 제1 및 다른 DNA 절편이 프레임 내로 연결되고; 융합 단백질을 코딩한다. 또다른 관점에서 본 발명은 숙주세포를 (a) 전사 프로모터; (b) 상기 기재된 융합 단백질을 코딩하는 DNA 구조체; 및 (c) 전사 터미네이터가 작동가능하게 연결된 것을 포함하는 벡터를 도입한 숙주세포를 배양하는 것; 및 상기 DNA 절편에 의해 코딩된 단백질을 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 융합 단백질을 제공한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:2에서 아미노산 114번(Ser)부터 아미노산 443번(Ala)까지의 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2에서 아미노산 114번(Ser)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2에서 아미노산 20번(Arg)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열; 및 (d) SEQ ID NO:2에서 아미노산 1번(Met)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 또다른 구체예에서 상기 기재된 분리된 폴리펩티드는 본질적으로 SEQ ID NO:2에서 아미노산 20번(Arg)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 잔기의 서열로 이루어진다. 또다른 구체예에서 상기 기재된 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에서 아미노산 20번(Arg)부터 아미노산 755번(Thr)까지의 아미노산 서열이다.
또다른 관점에서, 본 발명은 상기 기재한 세포를 배양하는 것; 그리고 세포에 의해 생산된 인간의 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하는 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 상기 기재한 발현벡터를 도입한 세포를 배양하는 것(그안의 세포는 DNA 절편에 의해 코딩되는 인간의 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 발현하고 테스트 기질의 프로호르몬 폴리펩티드를 공동발현한다); 인간의 프로호르몬 변환효소4에 의해 테스트 기질이 절단된 결과인 절단 생성물을 검출하는 것을 포함하는 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 폴리펩티드 프로호르몬 기질을 측정하는 방법을 제공한다. 또다른 구체예에서 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 폴리펩티드 호르몬 기질을 측정하는 방법은 체외에서 특허청구범위 제11항에 따른 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 테스트 기질 폴리펩티드와 조합시키는 것; 및 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 의한 테스트 기질의 절단 결과 얻은 절단 생성물을 검출하는 것을 포함한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 상기 기재한 발현벡터가 도입된 세포를 테스트 샘플의 존재 및 부재하에서 배양하는 것(그 세포는 DNA 절편에 의해 코딩되는 인간의 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 발현시키고, 알려진 지시자 프로호르몬 폴리펩티드 기질을 공동발현시킨다.); 및 테스트 샘플의 존재 및 부재하에서, 생물학적 또는 생화학적 분석법에 의해 인간의 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드에 의한 기질의 절단 결과 얻은 절단 생성물의 수준을 비교하는 것; 및 그 비교로부터 테스트 샘플에서 인간의 프로호르몬 변환효소 활성의 조절제 존재를 결정하는 것을 포함하는, 인간 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드 활성의 조절제의 존재를 테스트 샘플에서 검출하는 방법을 제공한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2에서 아미노산 20번(Arg)부터 아미노산 755(Ser)까지의 아미노산의 연속 스트레치와 90% 이상의 상동성을 갖는, 9 내지 755 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드; (b) 상기 기재한 폴리펩티드; (c) SEQ ID NO:2에서 잔기 444번(Arg)부터 잔기 561번(Tyr)까지와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및 (d) SEQ ID NO:2에서 잔기 562번(Tyr)부터 잔기 755번(Thr)까지와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드로 동물을 접종하는 것(그 폴리펩티드가 동물에서 면역반응을 유도함); 및 동물로부터 항체를 분리해내는 것을 포함하는 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 또다른 구체예에서, 상기 개시된 방법에 의해 생산된 항체는 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 결합한다. 또다른 구체예에서 상기 기재된 항체는 모노클로날 항체이다.
또다른 관점에서, 본 발명은 상기 기술한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 이러한 그리고 다른 관점들은 하기 발명의 상세한 설명 및 첨부 도면의 참조로 명백하게 될 것이다.
도면은 인간의 PC1, 인간의 PC2, 래트의 PC4, 쥐의 PC4, 본 발명의 신규한 인간의 PC4, 쥐의 푸린 및 인간의 푸린의 다중적 배열이다.
본 발명을 상세히 설명하기 전에 하기 용어들을 정의하는 것이 그 이해에 도움이 될 것이다:
여기서 사용되는 용어 "친화성 태그"는 두번째 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하기 위해 또는 두번째 폴리펩티드의 기질에의 결합 부위를 제공하기 위해 두번째 폴리펩티드에 결합될 수 있는 폴리펩티드 절편을 나타낸다. 주로 항체 또는 다른 특이적 결합제가 이용할 수 있는 펩티드 또는 단백질이 친화성 태그로서 이용될 수 있다. 친화성 태그는 폴리-히스티딘계, 단백질A [Nilsson et al, EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)], 글루타티온 S 트랜스퍼라제[Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)], Glu-Glu 친화성 태그[Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4 (1985)], 물질 P, Flag™ 펩티드(Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988); Eastman Kodak Co., New Haven, CT로부터 구입가능), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원의 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다. 일반적으로 Ford 등의 단백질 발현 및 정제 2:95-107(1991)을 참조하라. 친화성 태그를 코딩하는 DNA는 상업적 공급자(예컨대 Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 입수할 수 있다.
용어 "대립유전자 변이체"는 같은 염색체 위치를 점하는 한 유전자의 둘 이상의 대안적 형태들 중 어느 하나를 의미한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고 개체군 내에서 표현형의 다형현상을 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵일 수도 있고(코딩된 폴리펩티드에 변화가 없는 것) 또는 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수도 있다. 여기서 사용된 용어 대립유전자 변이체는 또한 한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 코딩된 단백질을 의미한다.
용어 "아미노-말단" 및 "카르복시 말단"은 폴리펩티드 안의 위치를 나타내는 데에 사용된다. 문맥이 그러하듯이 이러한 용어는 근접한 또는 상대적인 위치를 나타내는 폴리펩티드의 특정 서열 또는 부분의 기준으로서 사용된다. 예컨대 폴리펩티드 내부의 기준 서열에 대해 카르복시-말단 위치된 어떤 서열은 참고서열의 카르복시 말단에 대해 근접한 위치에 있다는 것이지 반드시 완전한 폴리펩티드의 카르복시 말단에 있다는 것이 아니다.
용어 "절단 생성물"은 프로호르몬 변환효소에 의해 프로세싱 되지 않은 프로호르몬 폴리펩티드의 절단으로 얻은 프로호르몬 폴리펩티드 단편을 의미한다.
용어 "상보적/항-상보적 쌍"은 적절한 조건하에서 비공유 결합되고 안정한 쌍을 형성하는 다른 부위를 의미한다. 예를 들면 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙타비딘)은 상보적/항-상보적 쌍의 최초 멤버이다. 상보적/항-상보적 쌍의 다른 예는 수용체/리간드 쌍, 항체/항원(또는 햅텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등을 포함한다. 그 상보적/항-상보적 쌍의 뒤따르는 해리가 필요할 경우, 그 상보적/항-상보적 쌍은 바람직하게는 109M-1보다 작은 결합 친화도를 갖는다.
용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 상보체"는 상보적인 염기서열을 갖고 기준 서열에 대해 역방향인 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 예컨대 서열 5' ATGCACGGG 3'은 5' CCCGTGCAT 3'에 상보적이다.
용어 "축퇴 뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 축퇴 코돈을 포함하는(폴리펩티드를 코딩하는 기준 폴리뉴클레오티드 분자와 비교하여) 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 축퇴 코톤은 뉴클레오티드의 다른 트리플렛을 함유하지만 같은 아미노산 잔기를 코딩한다(즉 GAU 및 GAC 트리플렛 각각은 Asp를 코딩한다).
용어 "DNA 구조체"는 자연적으로는 발견되지 않는 방식으로 조합되고 배열된 DNA 절편을 포함하는 단일 또는 이중가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. 인간 조작의 결과로서 존재하는 DNA 구조체는 클론 및 다른 조작된 분자들의 복사체를 포함한다.
"DNA 절편"은 특정 성질을 갖는 더 큰 DNA 분자의 일부이다. 예컨대 특정 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 절편은 플라스미드 또는 플라스미드 단편 등의 더 큰 DNA 분자의 일부이고 그것은 5'로부터 3' 방향으로 읽혀질 때 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩한다.
용어 "발현 벡터"는 그 전사를 위해 제공되는 부가적인 절편들과 작동가능하게 연결되고 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 절편을 포함하는 선형 또는 원형의 DNA 분자를 의미한다. 그러한 부가적 절편들은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함하고 선택적으로 하나이상의 복제 개시점, 하나이상의 선별 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함한다. 발현 벡터는 통상 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나 또는 둘다의 요소를 함유한다.
폴리뉴클레오티드 분자에 적용될 때, 용어 "분리된"은 폴리뉴클레오티드가 그것의 자연적 유전 환경으로부터 제거되고 다른 외래의 또는 원치않는 코딩 서열을 갖지 않고 유전학적으로 엔지니어링된 단백질 생산 시스템 내에서의 사용에 적합한 형태인 것을 의미한다. 그러한 분리된 분자는 그것의 자연 환경으로부터 분리된 것들이고 cDNA 및 게노믹 클론을 포함한다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 그것들이 통상 결합하고 있는 다른 유전자들은 없지만 자연적으로 발생하는 프로모터 및 터미네이터 등의 5' 및 3' 비번역 부위들을 포함할 수 있다. 관련된 영역의 동정은 당업자에게 명백할 것이다. 예컨대 Dynan 및 Tijan, Nature 316:774-78 (1985)를 참조하라.
단백질 또는 폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "분리된"은 단백질 또는 폴리펩티드가 혈액 및 동물 조직으로부터 분리되는 등의 그것의 출처 환경 이외의 조건에서 발견된 것을 의미한다. 바람직한 형태로 그 분리된 폴리펩티드는 본질적으로 다른 폴리펩티드, 특히 다른다른 동물 기원의 폴리펩티드를 갖고 있지 않다. 극도로 정제된 형태, 즉 95% 순도보다 큰, 더 바람직하게는 99% 순도보다 큰 순도를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이 바람직하다. 이 문맥으로 사용될 때 용어 "분리된"은 이량체 또는 대안적으로 글리코실화된 또는 유도된 형태 등의 대안적 물리적 형태로 같은 폴리펩티드의 존재를 배제하지 않는다.
용어 "작동가능하게 연결된"은, DNA 절편을 언급할 때, 그것들이 그들의 의도된 목적 예컨대 전사가 프로모터에서 개시되고 터미네이터를 향해 코딩 절편을 통해 진행하는 등의 목적을 위해 그들이 협조하여 기능하도록 배열된 절편을 의미한다.
용어 "오르톨로그"는 다른 종으로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 카운트파트인 한 종의 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 오르톨로그 사이의 서열 차이는 종분화의 결과이다.
용어 "파라톨로그"는 개체에 의해 생성된 단백질이 별개이지만 구조적으로 연관된 것이다. 파라톨로그는 유전자 중복을 통해 발생되는 것으로 믿어진다. 예컨대 α-글로빈, β-글로빈 및 미오글로빈이 서로에게 파라톨로그이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'말단으로부터 3'말단으로 읽혀지는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기들의 단일 또는 이중가닥의 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고 천연원료로부터 분리되거나 체외에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자들의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 염기쌍("bp"로 나타냄), 뉴클레오티드("nt"), 또는 킬로베이스("kb")로 표현된다. 문맥과 같이 마지막 두 용어는 단일가닥 또는 이중가닥인 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어가 이중가닥 분자에 적용될 때 그것은 전체 길이를 나타내는 데 사용되고 용어 "염기쌍"에 상응하는 것으로 이해될 수 있다. 이중가닥의 폴리뉴클레오티드의 두 가닥이 길이가 약간 다르고 그 말단이 효소 절단의 결과로 비틀림이 있고; 따라서 이중가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드가 짝짓기 하는 것은 아니라는 것이 당업자에게 알려져 있다. 그러한 짝짓지 않은 말단은 통상 20nt의 길이를 초과하지 않을 것이다.
용어 "폴리펩티드"는 자연적으로 또는 합성적으로 생산되고, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 폴리머이다. 약 10개의 아미노산 잔기 미만인 폴리펩티드는 통상 "펩티드"로서 칭한다.
용어 "프로모터"는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하는 유전자의 부위를 의미한다. 프로모터 서열은 통상 그러나 항상 그렇지는 않지만 유전자의 5' 비코딩 영역에서 발견된다.
용어 "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 고분자이다. 단백질은 또한 탄수화물 기 등의 비펩티드성 성분을 포함할 수도 있다. 탄수화물 및 다른 비펩티드성 치환기가 그 단백질이 생산되는 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있고, 세포유형에 따라 다양할 것이다. 그들의 아미노산 백본 구조; 탄수화물기 등의 치환기의 관점에서 여기서 정의되는 단백질들은 통상 특정되지는 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 것이다.
용어 "분비 신호 서열"은 더 큰 폴리펩티드의 한 구성성분으로서 그 더 큰 폴리펩티드를 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통해 이동하도록 하는 폴리펩티드("분비 펩티드)를 코딩하는 DNA 서열을 의미한다. 그 더 큰 펩티드는 통상 분비 경로를 통해 이동할 때 분비 펩티드를 제거하기 위해 잘려진다. 분비 신호서열은 세포의 분비경로 안으로 폴리펩티드를 보낼 것이지만 그 서열을 함유하는 표적 폴리펩티드가 세포로부터 실제로 분비될 수도 있고 안될 수도 있다.
여기서 사용된 용어 "스플리스 변이체"는 유전자로부터 전사된 RNA의 양가택일적인 형태를 나타낸다. 스플리스 변이는 전사된 RNA 분자 내에서 또는 드물게는 별개로 전사된 RNA 분자 간에 양가택일적 스플리싱 부위의 사용을 통해 자연적으로 발생되어 동일 유전자로부터 전사된 다른 mRNA를 초래한다. 스플리스 변이체는 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 것이다. 여기서 사용된 용어 스플리스 변이체는 또한 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플리스 변이체에 의해 코딩되는 단백질을 나타낸다.
불명확한 분석 방법(예컨대 젤 전기영동)에 의해 결정된 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적인 값인 것으로 이해될 것이다. 그러한 값이 "약" X 또는 "대략" X로서 표현되며 X의 값은 ±10%로 정확한 것으로 이해될 것이다.
여기서 인용된 모든 참고 기술들은 전적으로 인용문헌으로 통합되어 있다.
본 발명은 부분적으로 프로호르몬 변환효소 족(예컨대 쥐 및 래트의 PC4, PC2, PC1, 푸린)에 상동적인 단백질을 코딩하는 신규한 DNA 서열의 발견에 기초한 것이다. 그 DNA 서열은 여기서 "인간 PC4"로 표현된 인간의 프로호르몬 변환효소4이다. 이 신규한 cDNA에 상응하는 mRNA의 조직 분포 분석은 mRNA 발현이 고환에 제한되었다는 것을 보여주었다. 그러한 조직-특이적 발현은 성장 또는 분화 인자의 프로호르몬 폴리펩티드가 고환-특이적 및 비-고환 세포유형을 위해 성숙 또는 활성 형태로 전부 또는 일부를 프로세싱하는 프로호르몬 변환효소로서의 역할을 암시한다.
포유동물의 프로호르몬 변환효소는 일반적인 구조적 특징을 공유한다. Smeekins, S.P., ibid., 및 Seidah, N. Methods in Enz., 244: 175-188, 1995를 참고하라. 모든 것은 단백질을 분비 경로로 보내는 N-터미널 분비 펩티드를 함유한다. 이 영역 다음에는 Homo-A 도메인이 뒤따르고 프로테아제의 폴딩(folding)에 관련되어 있을 것이다. 자가촉매활성에 의한 Homo-A 도메인의 제거는 단백질 분해 활성에 필수적이다. Homo-A 도메인을 뒤따르는 것이 촉매적 도메인이고 그것은 활성에 필수적이다. 그 촉매적 도메인은 박테리아 서브틸리신의 촉매적 영역과 가장 높은 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 촉매적 도메인에 근접한 것이 Homo-B 도메인이고 그것이 또한 효소적 활성에 필수적이다. 이 영역 이상, C-터미널 말단에서 프로호르몬 변환효소가 구조적으로 분지한다. 그 C-터미널 영역에 대한 기능적 역할이 밝혀지지 않았지만 포유동물의 프로호르몬 변환효소의 세포 및 세포소기관-특이적 표적화에 관련이 있는 것으로 보인다.
본 발명은 신규한 인간의 프로호르몬 변환효소를 제공한다. 프로호르몬 변환효소(SEQ ID NO: 1)를 코딩하는 인간의 cDNA의 분석으로 755개 아미노산(SEQ ID NO: 2)을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 밝혔고, 이것은 추정의 분비 펩티드(SEQ ID NO: 2의 잔기1(Met)부터 잔기 19(Val)를 참조하라.) 및 성숙 폴리펩티드(SEQ ID NO: 2의 잔기20(Arg)부터 잔기755(Thr)까지를 참조하라)를 포함한다. 도면에서 보여지듯이 성숙 폴리펩티드는 엔도프로테아제의 Kex2 족의 다른 구성원들과 상동성을 갖고, 그것은 래트 및 쥐의 PC4, 인간의 푸린, 인간의 PC1 및 인간의 PC2를 포함한다. 상기 기술한 바와 같이 이 단백질 족은 각각 Homo-A(SEQ ID NO: 2의 잔기 20(Arg)부터 잔기 113(Arg) 참조) 및 Homo-B(SEQ ID NO: 2의 잔기 444(Arg)부터 잔기 561(Tyr) 참조) 도메인으로 칭해지는 덜 보존적인 영역에 의해 NH2- 및 COOH-터미널 말단에서 플랭킹(flanking)되는 보존된 서브틸리신-유사 촉매적 도메인(SEQ ID NO: 2의 잔기 114(Ser) 부터 잔기 443(Ala) 참조)에 의해 특징화된다(나카야마 등의 J. Biochem (도쿄), 109: 803-806, 1991). 래트 및 쥐의 PC4에 존재하는 활성 부위 Asp, His 및 Ser잔기 및 촉매적으로 중요한 Asn 잔기가 인간의 PC4에 보존되어 있다(SEQ ID NO: 2의 잔기 Asp-158, His-198, Ser-372 및 Asn-300 참조). 신호 펩티다제 절단 부위는 인간 프로호르몬 변환효소의 배열에 기초하여 잔기19(Val) 다음에 일어날 것으로 예견된다. 모든 알려진 포유동물의 프로호르몬 변환효소에서 발견되는 보존된 Arg-Gly-Asp 서열(SEQ ID NO: 2의 잔기 503부터 505 참조)이 인간의 PC4에 존재한다(나카야마, ibid., 및 그 참고문헌). 인간 PC4는 활성 효소를 얻기 위해 Arg-Arg-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 2의 잔기 109(Arg)부터 잔기 113(Arg) 서열 또한 참조) 서열의 C-터미널 측에서 자가촉매 절단을 행하는 전구체 효소(효소원)로서 합성될 것으로 예견된다. 유사한 효소원 활성화 서열은 Kex2 및 래트의 PC4에 관해 관찰된다(나카야마 등의 J. Biochem (도쿄), 109: 803-806, 1991). 인간 PC4에 유일한 C-터미널 도메인(SEQ ID NO: 2의 잔기 562(Tyr) 부터 잔기 755(Thr) 참조)은 푸린과 가장 높은 서열 상동성을 갖는다. 이 도메인의 기능은 세포 및 세포기관-특이적 표적화에 관련되어 있을 것이다.
예컨대 인간 PC4의 서브틸리신-유사 촉매적 도메인 등의 매우 보존적인 아미노산이 새로운 족 구성원을 동정하는 수단으로서 사용될 수 있다. 예컨대 역전사-중합효소 사슬 반응(RT-PCR)이 다양한 조직원 또는 세포주로부터 얻은 RNA의 보존된 서브틸리신-유사 촉매적 도메인을 코딩하는 서열을 증폭하는 데에 사용될 수 있다. 구체적으로 인간 PC4 서열로부터 지정된 극도로 축퇴성인 프라이머가 이 목적을 위해 유용하다.
본 발명은 또한 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고 그것은 여기서 기재된 인간 PC4 폴리펩티드를 코딩한다. 당업자는 유전 코드의 축퇴성의 관점에서 이러한 폴리뉴클레오티드 분자간에 상당한 서열의 변이가 가능하다는 것을 쉽게 인식할 것이다. SEQ ID NO: 3은 SEQ ID NO: 2의 인간 PC4 폴리펩티드를 코딩하는 모든 DNA를 포함하는 축퇴 DNA 서열이다. 당업자는 SEQ ID NO: 3의 축퇴서열이 또한 T 대신 U로 치환함으로써 SEQ ID NO: 2를 코딩하는 모든 RNA 서열을 제공한다는 것을 인식할 것이다. 따라서 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드1부터 뉴클레오티드2265 및 그들의 RNA 등가물을 포함하는 인간 PC4 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 고려된다. 표1은 축퇴성 뉴클레오티드 위치를 나타내기 위해서 SEQ ID NO: 3 내에서 사용되는 한문자 코드를 설명한다. "해석"은 한 코드 문자에 의해 나타낸 뉴클레오티드이다. "상보체"는 상보적 뉴클레오티드에 대한 코드를 암시한다. 예컨대 코드Y는 C 또는 T를 나타내고 그것의 상보적인 R은 A 또는 G를 나타내고, A는 T에 상보적이고 G는 C에 상보적이다.
SEQ ID NO: 3에서 사용된 축퇴코돈은, 주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하고, 이것을 표2에 나타내었다.
당업자는 각각의 아미노산을 코딩하는 모든 가능한 코돈의 대표인 축퇴코돈을 결정하는 데에 어떤 다의성이 도입된다는 것을 인정할 것이다. 예컨대 세린의 축퇴코돈(WSN)은 어떤 조건하에서 아르기닌(AGR)을 코딩하고, 아르기닌의 축퇴코돈(MGN)이 어떤 조건하에서 세린(AGY)을 코딩한다. 페닐알라닌 및 루신을 코딩하는 코돈 간에 유사한 관계가 존재한다. 따라서 축퇴서열에 의해 포함되는 어떤 폴리뉴클레오티드는 다양한 아미노산 서열을 코딩하지만 당업자는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 참고하여 그러한 다양한 서열을 쉽게 동정할 수 있다. 다양한 서열들은 여기서 기술한 바와 같이 기능성에 대해 쉽게 테스트할 수 있다.
당업자는 또한 다른 종들이 "선호되는 코돈의 사용"을 보인다는 것을 인정할 것이다. 일반적으로 Grantham 등의 Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas 등의 Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson 등의 Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean 및 Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982를 참조하라. 여기서 사용한 바와 같이 용어 "선호되는 코돈의 사용" 또는 "선호되는 코돈"은 특정 종의 세포에서 가장 자주 사용되는 단백질 번역 코돈을 의미하는 기술용어이고, 따라서 각각의 아미노산을 코딩하는 가능한 코돈 중의 하나 이상의 대표를 선호한다(표2참조). 예컨대 아미노산 트레오닌(Thr)은 ACA, ACC, ACG 또는 ACT에 의해 코딩되지만 포유동물 세포에서 ACC가 가장 일반적으로 사용되는 코돈이고; 다른 종, 예컨대 곤충세포, 효모, 바이러스 또는 박테리아에서는 다른 Thr 코돈이 선호된다. 특정 종에 대해 선호되는 코돈이 당업계에 알려진 다양한 방법들에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드 안으로 도입될 수 있다. 선호되는 코돈 서열을 재조합 DNA 안으로 도입하는 것은 예컨대 특정 세포유형 또는 종 안에서 단백질 번역을 더욱 효과적으로 함으로써 그 단백질 생산을 증대시킬 수 있다. 그러므로 SEQ ID NO: 3에 기재된 축퇴 코돈 서열은 당업계에서 통상 사용되고 여기서 기재된 다양한 세포유형 및 종들에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 주형으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예서 분리된 폴리뉴클레오티드는 긴축조건하에서 SEQ ID NO: 1, 또는 그것에 상보적인 서열의 유사한 크기의 영역에 혼성화한다. 일반적으로 긴축조건은 한정된 이온강도 및 pH에서 특정 서열에 대해 열융점(Tm)보다 약5℃ 낮도록 선택된다. 그 Tm은 50%의 표적서열이 완전히 일치하는 프로브에 혼성화하는 온도(한정된 이온강도 및 pH 하에서)이다. 전형적인 긴축조건은 NaCl 농도가 pH7에서 약 0.03M이하이고 온도가 적어도 약 60℃인 것이다.
앞서 언급하였듯이 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함한다. DNA 및 RNA를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로 RNA는 대량의 인간의 PC4 RNA를 생산하는 조직 또는 세포로부터 분리된다. 그러한 조직 및 세포는 노던 블롯팅에 의해 동정되고(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980) 고환조직 및 고환-유래 세포주를 포함한다. 총 RNA는 구아니딘 HCl 추출 후 CsCl 구배에서 원심분리에 의한 분리에 의해 준비될 수 있다(Chirgwin 등의 Biochemistry 18: 52-94, 1979). 폴리(A)+RNA는 Aviv 및 Leder의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972)을 이용하여 총 RNA로부터 준비된다. 상보적 DNA(cDNA)는 공지의 방법을 이용하여 폴리(A)+RNA로부터 준비될 수 있다. 대안으로는 게노믹 DNA가 분리될 수 있다. 그 후 인간의 PC4 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 예컨대 혼성화 또는 PCR에 의해 동정 및 분리될 수 있다.
인간의 PC4를 코딩하는 전장 클론을 종래의 클로닝 절차에 의해 얻을 수 있다. 비록 어떤 적용에 있어서는(예컨대 트랜즈제닉 동물에서의 발현) 게노믹 클론을 사용하거나 적어도 하나의 게노믹 인트론을 포함하기 위해 cDNA 클론을 변형시키는 것이 바람직하다해도 상보적 DNA(cDNA) 클론이 바람직하다. cDNA 및 게노믹 클론을 준비하는 방법이 잘 알려져 있고 당업계의 통상의 기술수준 내이고 여기서 개시된 서열 또는 그 일부가 라이브러리를 프로빙 또는 프라이밍시키기 위해 사용되는 것을 포함한다. 발현 라이브러리는 항체를 가지고 인간 PC4, 수용체 단편 또는 다른 특이적 결합 파트너에 프로브될 수 있다. 본 발명은 또한 인간 프로호르몬 변환효소4를 코딩하는 인간 게노믹 서열의 분리를 제공한다. SEQ ID NO: 1으로부터 유래된 프로브를 당업계에 알려지고 여기서 개시된 표준 절차에 따라 인간 PC4의 인간 게노믹 서열을 클론한 인간 원료로부터 게노믹 라이브러리를 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다.
당업자는 SEQ ID NO: 1에 기재된 서열이 대립유전자 변이 및 양가택일적인 스플리싱이 발생하는 것이 기대되는 인간 PC4의 단일 대립유전자를 나타낸다. 이 서열의 대립유전자 변이는 표준 절차에 따라 다른 개체로부터 cDNA 또는 게노믹 라이브러리를 프로빙함으로써 클론될 수 있다. 아미노산 서열의 변화가 그 결과인 침묵 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 DNA 서열의 대립유전자 변이는 본 발명의 범위 내이고, SEQ ID NO: 2의 대립유전자 변이체인 단백질도 마찬가지이다. 본 발명은 또한 인간의 프로호르몬 변환효소4의 유전자발현의 결과로서 자연적으로 발생하는 분리된 폴리뉴클레오티드의 mRNA 스플리스 변이 형태를 제공한다. 양가택일적으로 스플리싱된 mRNA로부터 생성된 cDNA는 인간의 PC4 폴리펩티드의 성질을 보유하며 그것은 본 발명의 범위 내이고, 그러한 cDNA 및 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩티드도 마찬가지이다. 이 서열의 스플리스 변이체는 표준 절차에 따라 인간의 cDNA 라이브러리, 예컨대 인간의 고환 cDNA 라이브러리를 프로빙함으로써 클론될 수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2 및 그들의 오르토로그의 폴리펩티드에 본질적으로 상동적인 분리된 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 제공한다. 바람직한 형태로 분리된 폴리펩티드는 본질적으로 다른 폴리펩티드가 없는, 특히 다른 동물 기원의 폴리펩티드가 없는 형태이다. 극도로 정제도니 형태, 즉 95% 순도보다 큰, 더 바람직하게는 99% 순도보다 큰 순도를 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 여기서 사용된 용어 "본질적으로 상동인"은 SEQ ID NO: 2 또는 그 SEQ ID NO: 2의 스플리스 변이체에서 보여지는 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 폴리펩티드는 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 그것의 스플리스 변이체와 적어도 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는다. 퍼센트 서열 상동성은 종래 방법에 의해 측정한다. 예로서 Altschul 등의 Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1986) 및 Henikoff와 Henikoff의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992)를 참조하라. 요컨대 두개의 아미노산 서열이 표3(아미노산이 표준 한 문자 코드로 표시됨)에서 보여지는 바와 같이 Henikoff 및 Henikoff(ibid.)의 갭 오프닝 벌점 10, 갭 확장 벌점 1 및 "블로섬 62" 점수 매트릭스를 이용하여 결합 점수를 최적하하기 위해 결합된다.
그 퍼센트 상동성은 하기와 같이 계산된다:
(상동적 매치의 총 수) / (긴 서열의 길이 + 두 서열을 결합시키기 위해 긴 서열 안으로 도입되는 갭의 수) X 100
폴리뉴클레오티드 분자의 서열 상동성은 상기 기술된 바와 같은 비율을 사용하여 유사한 방법에 의해 결정된다.
변이체 인간 PC4 폴리펩티드 또는 본질적으로 상동성인 인간 PC4 폴리펩티드는 하나이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 특성이 있다. 이러한 변화는 바람직하게는 중요치 않은 성질로서 폴리펩티드의 폴딩(folding) 또는 활성에 현저한 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환(표4 참조) 및 다른 치환; 전형적으로 1 - 약 30개 아미노산의 적은 결실; 아미노-터미널의 메티오닌 잔기, 약 20-25 잔기 이하의 작은 링커 펩티드 등의 작은 아미노- 또는 카르복시-터미널의 연장, 또는 폴리히스티딘계, 항원의 에피토프 또는 결합 도메인 등의 정제를 촉진하는 작은 연장(친화성 태그)인 것이 바람직하다. 일반적으로 Ford 등의 '단백질 발현 및 정제' 2:95-107(1991)을 참조하라. 친화성 태그를 포함하는 폴리펩티드는 인간 PC4 폴리펩티드 및 그 친화성 태그 사이의 단백질 분해적 절단을 더욱 포함한다. 그러한 절단을 예컨대 트롬빈 절단부위 및 인자 Xa 절단부위를 포함한다.
보존적 아미노산 치환
염기성: 아르니긴리신히스티딘
산성: 글루탐산아스파르트산
극성: 글루타민아스파라진
소수성: 루신이소루신발린
방향족: 페닐알라닌트립토판티로신
소형: 글리신알라닌세린트레오닌메티오닌
본 발명의 단백질은 또한 비-자연 발생적 아미노산 잔기를 포함한다. 비-자연 발생적 아미노산은 제한없이 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메탄올프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호로글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 디히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, 터트-루신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다. 비-자연발생적 아미노산 잔기를 단백질에 도입하기 위한 방법이 당업계에 알려져 있다. 예컨대 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 사용하여 억제된 넌센스 돌연변이가 있는 실험실 시스템이 이용될 수 있다. 아미노산을 합성하고 tRNA를 아미노아실화 하기위한 방법이 당업계에 알려져 있다. 넌센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역이 E. coli S30 추출물 및 상업적으로 구입가능한 효소 및 다른 시약들을 포함하는 셀-프리 시스템에서 수행한다. 단백질은 크로마토그래피로 정제한다. 예컨대 Robertson 등의 J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman 등의 Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung 등의 Science 259:806-9, 1993; 및 Chung 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993)를 참조하라. 두번째 방법에서는 번역이 돌연변이된 mRNA의 미세주입 및 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA에 의해 Xenopus oocytes에서 수행된다(Turcatti 등의 J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). 세번째 방법에서는 E. coli 세포가 교체된 자연적 아미노산이 없고(예컨대 페닐알라닌) 원하는 자연 발생적 아미노산(예컨대, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재하에 배양된다. 비-자연 발생적 아미노산은 그것의 자연적 카운터파트의 위치에 있는 그 단백질 안으로 통합된다. Koide 등의 Biochem. 33: 7470-6, 1994 참조. 자연적 발생 아미노산 잔기는 실험실내의 화학적 변형에 의해 비-자연 발생적 아미노산으로 변환될 수 있다. 화학적 변형이 부위-특이적 돌연변이유발과 조합되어 치환 범위를 더욱 확장할 수 있다(Wynn 및 Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).
한정된 수의 비-보존적 아미노산, 유전 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산, 비-자연 발생적 아미노산 및 이상한 아미노산이 인간의 PC4 아미노산 잔기를 치환할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 필수 아미노산은 부위-특이적 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발 등의 당업계에 알려진 절차에 따라 동정될 수 있다(Cunningham 및 Wells, Science 244, 1081-1085, 1989; Bass 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-502, 1991). 두번째 기술에서 단일 알라닌 돌연변이가 분자의 매 잔기마다 도입되고 그 결과된 돌연변이 분자는 그 분자의 활성이 뚜렷한 아미노산 잔기를 동정하기 위해 하기 기재한 바와 같이 생물학적 활성에 대한 테스트를 하였다. 또한 Hilton 등의 J. Biol. Chem. 271: 4699-708, 1996을 참조하라. 그 기질과의 상호작용을 위해 중요한 인간 PC4 촉매적 도메인 부위 또한 추정의 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화 등의 기술에 의해 결정되는 것과 같이 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예컨대 de Vos 등의 Science 255: 306-12, 1992; Smith 등의 J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver 등의 FEBS Lett. 309: 59-64, 1992를 참조하라. 필수 아미노산의 동일성은 관련 프로호르몬 변환효소와의 상동성 분석으로부터 당업자에 의해 추론될 수 있다.
다양한 아미노산 치환이 Reidhaar-Olson 및 Sauer(Science 241: 53-57, 1988) 또는 Bowie 및 Sauer(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989)에 의해 개시된 것과 같이 돌연변이유발 및 스크리닝의 공지의 방법을 사용하여 생성되고 테스트될 수 있다. 요컨대 이러한 저자들은 폴리펩티드에서 둘 이상의 위치를 동시에 무작위화하고 기능성 폴리펩티드를 위해 선택한 다음 그 돌연변이된 폴리펩티드를 시퀀싱하여 각 위치에서 허용되는 치환의 스펙트럼을 결정하는 방법들을 개시한다. 사용가능한 다른 방법들은 파지 디스플레이(예컨대 Lowman 등의 Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner 등의 미국특허 제 5,223,409호; Huse, WIPO 공개 WO 92/06204) 및 영역-특이적 돌연변이유발(Derbyshire 등의 Gene 46: 145, 1986; Ner 등의 DNA 7: 127, 1988)를 포함한다.
개시된 인간 PC4의 DNA 및 폴리펩티드 서열의 변이체는 Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994; Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51, 1994; 및 WIPO 공개 WO 97/20078에 기재된 것과 같은 DNA 혼합을 통해 제조될 수 있다. 요컨대 변이체 DNA는 부모 DNA의 무작위 단편화 후 PCR을 사용하여 재조립하도록 하여 결과적으로 무작위적으로 도입된 점 돌연변이를 만드는 체외에서의 상동적 재조합에 의해 재조된다. 이 기술은 다른 종으로부터의 대립유전자 변이체 또는 DNA 등의 부모 DNA의 족을 사용하여 그 과정에 부가적인 변이성을 도입하기 위해 변형될 수 있다. 원하는 활성을 위한 선택 또는 스크리닝 후 부가적인 돌연변이 및 분석의 반복이, 해로운 변화를 동시에 가려내면서 원하는 돌연변이를 선택함으로써 서열의 빠른 "진화"를 가능케 한다.
여기서 개시된 돌연변이유발 방법은 숙주세포에서 클론된, 돌연변이유발된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위해 고-처리량의 자동화된 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 활성 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이유발된 DNA 분자(예컨대 알려진 지시자 폴리펩티드 기질을 자른다)가 숙주세포로부터 회수되어 현대 장비를 이용하여 빠르게 시퀀싱 될 수 있다. 이러한 방법들은 원하는 폴리펩티드의 중요한 개개 아미노산 잔기의 빠른 결정을 가능토록 하며 알려지지 않은 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 더구나 이러한 돌연변이유발 방법은 반응 동력학을 변경하거나, 그 기질의 특이성을 축소 또는 확장하거나, 인간의 프로호르몬 변환효소4 등의 폴리펩티드의 조직 및 세포 국소화를 변경시키는 단백질을 엔지니어링 하는 데에 사용될 수 있다.
상기 SEQ ID NO: 2의 1 내지 755의 잔기 또는 그 대립유전자 변이체 또는 스플리스 변이체에 본질적으로 상동적이고 야생형 단백질의 활성을 보유한 다양한 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
더구나 당업계의 방법을 이용하여 폴리펩티드 융합 또는 하이브리드 프로호르몬 변환효소 단백질이, 본 발명의 인간 프로호르몬 변환효소4의 영역 또는 도메인을 다른 알려진 또는 알려지지 않은 프로호르몬 변환효소 단백질(예컨대 PC2 및 PC1), 또는 이종성 단백질의 그것과 조합하여 사용함으로써 구성된다(Sambrook 등의 ibid., Altschul 등의 ibid., Picard, D., Cur. Opin. Biology 5: 511-515, 1994, 및 그안의 참고문헌). 이러한 방법들은 관심의 폴리펩티드안의 더 큰 도메인 또는 영역의 생물학적 중요성을 결정하도록 한다. 그러한 하이브리드는 반응 동력학을 변경시키거나, 기질의 특이성을 축소 또는 확장하거나, 폴리펩티드의 조직 및 세포 국소화를 변경시키고, 알려지지 않은 구조의 폴리펩티드에 적용가능하다.
당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 융합 단백질이 제조될 수 있다. 알려진 기술 및 여기서 기술된 방법들에 의해 표현된 기술을 사용하여 적절한 리딩 프레임에서 융합 단백질의 각 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제조될 수 있다. 예컨대 생물학적 기능을 제공하는 도메인의 일부 또는 전부를 PC2 또는 PC1 등의 또다른 프로호르몬 변환효소로부터 상응하는 도메인과 본 발명의 인간 PC4와 혼합한다. 그러한 도메인은 여기서 기재된 분자의 분비 신호서열, Homo-A 도메인, 촉매적 도메인, Homo-B 도메인 및 C-터미널 부분을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 기재된 것과 같은 하나 이상의 도메인이 적절한 리딩 프레임 안에서 폴리뉴클레오티드 절편들을 연결함으로써 융합 단백질의 몇 도메인을 코딩하는 DNA 폴리절편을 만드는 이러한 방식으로 혼합될 수 있다. 그러한 융합 단백질을 만드는 방법이 당업계에서 잘 알려져 있다(Sambrook 등의 ibid., Altschul 등의 ibid., Picard, D., ibid.). 그러한 융합 단백질은 인간 PC4로부터 얻은 적어도 하나의 도메인을 포함하고, 형성된 융합에 따라 본 발명의 폴리펩티드 또는 다른 알려진 또는 알려지지 않은 프로호르몬 변환효소 단백질(예컨대 PC2 및 PC1)에 동일한 또는 유사한 생물학적 기능적 프로필을 가질 것으로 기대된다. 더구나 그러한 융합 단백질은 상기 개시된 바와 같은 다른 특징들을 보일 것이다.
변이체 및 융합 단백질을 포함하는 어떤 인간의 PC4 폴리펩티드에 대해 당업자는 여기서 개시되고 상기 표1 및 표2에 나타낸 정보를 사용하여 변이체를 코딩하는 완전 축퇴의 폴리뉴클레오티드 서열을 쉽게 제조할 수 있다.
전장 폴리펩티드, 생물학적으로 활성인 단편 및 융합 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 종래의 기술에 따라 유전학적으로 엔지니어링된 숙주세포에서 생산될 수 있다. 적당한 숙주세포는 형질전환되거나 외부 DNA로 트랜스펙션되어 배양액에서 성장할 수 있는 세포유형이고, 박테리아, 균류세포 및 배양된 고등 진핵세포를 포함한다. 진핵세포, 특히 다세포 유기체의 배양된 세포가 바람직하다. 클론된 DNA 분자를 조작하고 외부 DNA를 다양한 숙주세포 안으로 도입하기 위한 기술이 Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987에 의해 기재되어 있다.
일반적으로 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 그들의 발현을 위해 필요한 다른 유전요소에 작동가능하게 연결되어 있고 일반적으로 발현벡터 안에 전사 프로모터 및 터미네이터를 포함한다. 그 벡터는 비록 어떤 시스템 내에서 선별마커가 분리된 벡터에서 공급되고 외부 DNA의 복제가 숙주세포 게놈 안으로의 삽입에 의해 제공된다는 것을 당업자가 인식한다고 하더라도, 통상은 또한 하나이상의 선별마커 및 하나이상의 복제개시점을 함유할 것이다. 프로모터, 터미네이터, 선별마커, 벡터 및 다른 요소들의 선택은 당업계의 보통 기술수준내에서 루틴한 고안의 문제이다. 많은 그러한 요소들은 문헌에 기재되어 있고 상업적 공급자를 통해 구입가능하다.
인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 숙주세포의 분비경로에 보내기 위해서 신호서열(또한 리더서열, 프리프로서열 또는 프리서열로 알려져 있음)이 발현벡터에 제공된다. 그 분비 신호서열은 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 그것일 수 있고 또는 다른 분비된 단백질(예컨대 t-PA)로부터 유도될 수 있고 또는 새로 합성될 수도 있다. 그 분비 신호서열이 올바른 리딩 프레임으로 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드 DNA 서열과 연결된다. 분비 신호서열은 통상 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA서열의 5'에 위치하지만, 특정 신호서열은 원하는 DNA서열에서 다른 곳에 위치될 수도 있다(예컨대 Welch 등의 미국특허 제 5,037,743호; Holland 등의 미국특허 제 5,143,830호 참조).
대안적으로 본 발명의 폴리펩티드에 포함된 분비 신호서열이 분비경로 안으로 다른 폴리펩티드를 보내는 데에 사용될 수 있다. 본 발명은 그러한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 신호 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기1(Met) 내지 잔기19(Val)를 코딩하는 분비 신호서열이 여기서 개시되고 당업계에 알려진 방법을 사용하여 또다른 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 절편에 작동가능하게 연결된 신호 융합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 본 발명의 결과된 융합 폴리펩티드에 포함된 분비 펩티드는 바람직하게는 부가적 펩티드에 아미노-터미널로 융합되어 부가적 펩티드를 분비경로로 보낸다. 많은 응용을 갖는 그러한 구조체는 당업계에 알려져 있다. 예컨대 이러한 신규한 분비 신호서열 융합 구조체는 예컨대 세포표면 수용체 또는 다른 비-분리된 단백질 등의 정상적으로 완전히 분비되지 않는 단백질의 활성 성분의 분비를 야기한다. 그러한 융합은 생체내에서 또는 체외에서 분비경로를 통해 펩티드를 향하도록 하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 배양된 포유동물세포가 바람직한 숙주이다. 외부DNA를 포유동물 숙주세포 안으로 도입하기 위한 방법은 칼슘-포스페이트-매개 트랜스펙션[Wigler 등의 Cell 14:725 (1978); Corsaro 및 Pearson의 Somatic Cell Genetics 7:603 (1981): Graham 및 Van der Eb의 Virology 52:456 (1973)], 일렉트로포레이션[ Neumann 등의 EMBO J. 1:841-845 (1982)], DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션( Ausubel 등의 ibid.) 및 리포좀-매개 트랜스펙션[Hawley-Nelson 등의 Focus 15:73 (1993); Ciccarone 등의 Focus 15:80 (1993)] 및 바이러스 벡터 (Miller 및 Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Wang 및 Finer, Nature Med. 2:714-6, 1996)을 포함한다. 배양된 포유동물세포에서 재조합 폴리펩티드의 생산이 예컨대 Levinson 등의 미국특허 제 4,713,339호; Hagen 등의 미국특허 제 4,784,950호; Palmiter 등의 미국특허 제 4,579,821호 및 Ringold의 미국특허 제 4,656,134호에 개시되어 있다. 적당한 배양된 포유동물세포는 COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 [ATCC No. CRL 1573; Graham 등의 J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977)] 및 차이니스 햄스터 난소(예컨대 CHO-K1; ATCC No. CCL 61) 세포주를 포함한다. 다른 바람직한 세포주는 돌핀 DB1.Tes 세포(CRL-6258); 마우스 GC-1 spg 세포(CRL-2053);TM3 세포(CRL-1714); TM4 세포(CRL-1715); 및 돼지의 ST세포(CRL-1746)을 포함하는 배양된 고환세포이고, American Type Culture Collection, Rockville, MD로부터 얻을 수 있다. 부가적인 적당한 세포주가 당업계에 알려져 있고 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 등의 공공 수탁소로부터 얻을 수 있다. 일반적으로 SV-40 또는 사이토메갈로바이러스로부터 얻은 프로모터 등의 강한 전사 프로모터가 바람직하다. 예컨대 미국특허 제 4,956,288을 참조하라 다른 적당한 프로모터들은 메탈로티오네인 유전자로부터 얻은 것(미국특허 제 4,579,821호 및 제 4,601,978) 및 아데노바이러스의 주요 후기 프로모터를 포함한다.
약제 선별은 일반적으로 외부 DNA가 삽입된 배양된 포유동물세포를 위해 선별시 사용된다. 그러한 세포는 통상 "트랜스펙턴트"라 불린다. 선별적 약제의 존재하에 배양되고 그 자손으로 원하는 유전자를 전달할 수 있는 세포를 "안정한 트랜스펙턴트"라고 한다. 바람직한 선별 마커는 항생제 네오마이신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자이다. 선별은 G-418 등의 네오마이신 유형의 약제의 존재하에 수행된다. 선별 시스템은 또한 원하는 유전자의 발현 수준을 증가시키는, 즉 "증폭"에 사용될 수 있다. 증폭은 선별 약제의 낮은 수준의 존재하에서 트랜스펙턴트를 배양한 후 선별 약제의 양을 증가시켜 도입된 유전자 생성물을 높은 수준으로 생산하는 세포를 선별함로써 수행된다. 바람직한 증폭 선별 마커는 디히드로폴레이트 환원제로서 그것은 메토트렉세이트에 저항성을 나타낸다. 다른 약제 저항성 유전자(예컨대 하이그로마이신 저항성, 다수-약제 저항성, 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제) 또한 사용될 수 있다. 그린 형광 단백질, 또는 CD4, CD8, 클래스 I MHC 등의 세포표면 단백질, 태반의 알칼리성 포스파타제 등의 변경된 표현형을 도입하는 대안적인 마커를 FACS 분류 또는 자석 비드 분리 기술에 의해 트랜스펙션된 세포를 그렇지 않은 세포들로부터 분류하기 위해 사용된다.
곤충세포, 식물세포 및 조류세포를 포함하는 다른 고등 진핵세포 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물세포에서 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 Agrobacterium rhizogenes의 이용이 Sinkar 등의 J. Biosci. (Banglore) 11:47-58 (1987)에 개시되어 있다. 곤충세포의 형질전환 및 그 안에서 외부 폴리펩티드의 생산이 Guarino 등의 미국특허 제 5,162,222; 및 WIPO 공보 WO 94/06463에 개시되어 있다. 곤충세포는 통상 핵다각체병바이러스(AcNPV)로부터 유래된 재조합 바큘로바이러스로 감염될 수 있다. King, L.A. 및 Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman ＆ Hall; O'Reilly, D.R. 등의 바큘로바이러스 발현 벡터: 실험실 메뉴얼, 뉴욕, 옥스포드 유니버서티 출판., 1994; 및 Richardson, C.D.,Ed.,바큘로바이러스 발현 프로토콜. 분자 생물학의 방법, Totowa, NJ, Humana 출판, 1995를 참조하라. 재조합 인간 PC4 바큘로바이러스를 만드는 두번째 방법은 Luckow(Luckow, V.A, 등의 J Virol 67: 4566-79, 1993)에 의해 기재된 트랜스포손-기초 시스템을 이용한다. 트랜스퍼 벡터를 이용하는 이 시스템은 Bac-to-Bac™ 키트(Life Technologies, Rockville, MD)로 시판된다. Hill-Perkins, M.S. 및 Possee, R.D., J Gen Virol 71: 971-6, 1990; Bonning, B.C. 등의 J Gen Virol 75: 1551-6, 1994; 및 Chazenbalk, G.D., 및 Rapoport, B., J Biol Chem 270: 1543-9, 1995를 참조하라. 게다가 트랜스퍼 벡터는 예컨대 Glu-Glu 에피토프 태그(Grussenmeyer, T. 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985)와 같은 발현된 인간 PC4 폴리펩티드의 C-터미널 또는 N-터미널에서 에피토프 태그를 코딩하는 DNA와의 프레임내 융합을 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 기술을 이용하여 인간의 PC4를 함유하는 트랜스퍼 벡터를 E. Coli 내로 형질전환시키고 재조합 박큘로바이러스의 인터럽트된 lacZ 유전자 지시자를 함유하는 박미드(bacmid)에 대해 스크리닝한다. 재조합 바큘로바이러스 게놈을 함유하는 박미드 DNA를 통상의 기술을 이용하여 분리할 수 있고 예컨대 Sf9 세포와 같은 Spodoptera frugiperda 세포를 트랜스펙션시키는 데에 이용된다. 인간의 PC4를 발현하는 재조합 바이러스를 이어서 생산한다. 재조합 바이러스 스톡은 통상 당업계에서 사용되는 기술에 의한다.
숙주세포, 전형적으로 가을 행렬구더기(fall armyworm), Spodoptera frugiperda로부터 유래된 세포주를 감염하는 데에 재조합 바이러스가 이용된다. 일반적으로 Glick 및 Pasternak, Molecular Biotechnology: 재조합 DNA의 원리 및 응용, ASM 출판, 워싱톤 디씨, 1994를 참조하라. 또다른 적당한 세포주는 Trichoplusia ni (미국특허 제 5,300,435)로부터 유래된 High FiveO™ 세포주(Invitrogen)이다. 상업적으로 구입가능한 무세륨 배지를 세포의 성장 및 지속을 위해 이용한다. 적당한 배지는 Sf9 세포를 위해 Sf900 II™(Life Technologies) 또는 ESF 921™(Expression Systems); T. ni 세포를 위해 Ex-cellO405™(JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 Express FiveO™(Life Technologies)이다. 재조합 바이러스 스톡은 0.1 내지 10, 전형적으로는 거의 3의 감염의 다양성(MOI)으로 첨가되었을 때 약 2-5 x 105세포의 접종밀도로부터 1-2 x 106세포의 밀도로 성장한다. 일반적으로 가능한 실험실 메뉴얼에 기재된 절차들을 이용한다(King, L.A. 및 Possee, R.D., ibid.; O'Reilly, D.R. 등의 ibid.; Richardson, C.D., ibid). 상징액으로부터 인간의 PC4 폴리펩티드의 뒤따르는 정제는 여기에 기재된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
효모세포를 포함하는 균쥬세포가 또한 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 이러한 관점에서 관심의 특정 효모 종은 Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastores, 및 Pichia methanolica를 포함한다. 외부 DNA로 Saccharomyces cerevisiae세포를 형질전환시키고 그것으로부터 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법이 예컨대 Kawasaki의 미국특허 제 4,599,311호; Kawasaki 등의 미국특허 제 4,931,373호; Brake의 미국특허 제 4,870,008호; Welch 등의 미국특허 제 5,037,743호 및 Murray 등의 미국특허 제 4,845,075호에 개시되어 있다. 형질전환된 세포는 선별 마커, 통상 약제 저항성 또는 특정 영양분(예컨대 루신)의 부재하에 성장하는 능력에 의해 결정된 표현형에 따라 선별될 수 있다. Saccharomyces cerevisiae에서 이용하기 위한 바람직한 벡터 시스템은 Kawasaki 등의 미국특허 제 4,931,373호에 의해 개시된 POT1벡터 시스템으로, 그것은 형질전환된 세포가 글루코스-함유 배지에서의 성장에 의해 선별될 수 있다. 효모에서 이용하기 위한 적당한 프로모터 및 터미네이터는 해당작용 효소 유전자(예컨대 Kawasaki의 미국특허 제 4,599,311호; Kingsman 등의 미국특허 제 4,615,974호; Bitter의 미국특허 제 4,977,092호) 및 알코올 탈수소화제 유전자로부터 얻은 것을 포함한다. 또한 미국특허 제 4,990,446호; 제 5,063,154호; 제 5,139,936호 및 제 4,661,454호를 참조하라. Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii 및 Candida maltosa를 포함하는 다른 효모의 형질전환 시스템이 당업계에 알려져 있다. 예컨대 Gleeson 등의 J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465 (1986) 및 Cregg의 미국특허 제 4,882,279호를 참조하라. Aspergillus 세포가 McKnight 등의 미국특허 제 4,935,349호의 방법에 따라 이용될 수 있다. Acremonium chrysogenum을 형질전환시키는 방법이 Sumino 등의 미국특허 제 5,162,228호에 개시되어 있다. Neurospora를 형질전환시키는 방법이 Lambowitz의 미국특허 제 4,486,533에 개시되어 있다.
재조합 단백질의 생산을 위한 숙주로서 Pichia methanolica의 사용이 WIPO 공개 WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 및 WO 98/02565에 개시되어 있다. P. methanolica를 형질전환시키는 데에 이용하기 위한 DNA 분자가 통상 이중가닥, 원형의 플라스미드(이것은 형질전환에 앞서 바람직하게는 선형화됨)가 제조된다. P. methanolica에서 폴리펩티드 생산을 위해 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터가 P. methanolica 알코올 이용 유전자(AUG1 또는 AUG2) 등의 P. methanolica 유전자의 그것인 것이 바람직하다. 다른 유용한 프로모터는 디히드록시아세톤 신타제(DHAS), 포름산 탈수소화제(FMD) 및 카탈라제(CAT) 유전자의 그것을 포함한다. DNA의 숙주 염색체 안으로의 삽입을 증대시키기 위해 플라스미드의 전체 발현 절편이 숙주 DNA 서열에 의해 양 말단에서 플랭크된 것이 바람직하다. P. methanolica 에서의 이용을 위해 바람직한 선별마커는 P. methanolica ADE2 유전자이고, 그것은 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제(AIRC; EC 4.1.1.21)를 코딩하고, 그것은 아데닌의 부재하에서 ade2 숙주세포가 성장하도록 한다. 대규모를 위해 메탄올의 이용을 최소화하는 것이 바람직한 산업적 공정은 메탄올 이용 유전자 둘다(AUG1 및 AUG2)가 결실된 숙주세포를 사용하는 것이 바람직하다. 분비 단백질을 생산하기 위해 액포 프로테아제 유전자(PEP4 및 PRB1)이 없는 숙주세포가 바람직하다. P. methanolica 세포 안으로 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드의 도입을 증대시키기 위해 일렉트로포레이션이 사용된다. 지수적 붕괴, 2.5 내지 4.5kV/cm, 바람직하게는 약 3.75kV/cm의 강도를 갖는 펄스된 전기장 및 1 내지 40밀리세컨드, 가장 바람직하게는 약 20밀리세컨드의 시간 정수(t)를 이용하는 일렉트로포레이션에 의해 P. methanolica 세포를 형질전환시키는 것이 바람직하다. P. methanolica 세포는 적당한 탄소원, 질소원 및 미량원소를 포함한 배지에서 약 25℃ 내지 35℃의 온도에서 배양된다. 액체배양은 작은 플라스크의 진동 또는 발효기의 살포 등의 종래수단에 의해 충분한 공기가 제공된다. P. methanolica 를 위해 바람직한 배양배지는 YEPD(2% D-글루코스, 2% Bacto™ 펩톤(Difco Laboratories, 디트로이트, MI), 1% Bacto™ 효모 추출물(Difco Laboratories), 0.004% 아데닌 및 0.006% L-루신이다.
박테리아인 대장균, 바실루스 및 다른 속의 균주들을 포함하는 원핵 숙주세포 또한 본 발명 내에서 유용한 숙주세포이다. 이러한 숙주를 형질전환시키고 그 안에서 클론된 외부 DNA 서열을 발현시키는 기술이 당업계에 잘 알려져 있다(Sambrook 등의 ibid.). 대장균 등의 박테리아에서 인간 PC4 폴리펩티드를 발현시킬 때 그 폴리펩티드는 세포질에서, 전형적으로 불용성 미립자로서 보유되어 있거나, 박테리아의 분비 서열에 의해 페리플라슴 간극으로 보내질지도 모른다. 전자의 경우에 세포가 용해되고 그 미립자가 회수되고 예컨대 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 유레아를 사용하여 변성시킨다. 그 변성된 폴리펩티드를 재폴딩(folding)시키고 유레아 및 환원된 그리고 산화된 글루타티온의 조합에 대한 투석 후 완충된 살린 수용액에 대한 투석 등에 의해, 그 변성체를 희석시킴으로써 이량화시킨다. 후자의 경우에 페리플라슴 간극의 내용물을 방출하기 위해 세포를 부수고(예컨대 초음파분해 또는 삼투압쇼크), 그 단백질을 회수하고, 이로써 변성 및 재폴딩의 필요를 제거함으로써 용해성 및 기능성 형태로 페리플라슴 간극으로부터 그 폴리펩티드를 회수가능하다.
형질전환거나 트랜스펙션된 숙주세포가 선택된 숙주세포의 성장에 필요한 영양소 및 다른 성분들을 함유하는 배양배지에서 종래절차에 따라 배양된다. 제한배지 및 복합배지를 포함하는 다양한 적당한 배지가 당업계에 알려져 있고, 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함한다. 배지는 또한 필요시 성장인자 또는 세륨과 같은 성분을 함유할 수도 있다. 그 성장배지는 통상 외부적으로 첨가된 DNA를 함유하는 세포를 선별하는데, 예컨대 약제 저항성 또는 발현벡터 상에서 운반되거나 숙주세포 안으로 공동-트랜스펙션되는 선별 마커에 의해 보충되는 필수 영양분의 결핍으로 선별한다.
본 발명의 폴리펩티드의 순도는 80%이상의 순도, 더 바람직하게는 90%이상의 순도, 더욱 바람직하게는 95%이상의 순도, 그리고 특히 바람직한 것은 오염 고분자, 특히 다른 단백질 및 핵산 및 감염성 및 발열성 약제의 부재에 관하여 99.9%순도보다 큰 약제학적으로 순수한 상태가 바람직하다. 바람직하게는 정제된 폴리펩티드는 본질적으로 다른 폴리펩티드가 없고, 특히 다른 동물 기원의 폴리펩티드가 없다.
본 발명에 따른 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드는 친화성 정제 및 크기, 전하, 용해도 및 다른 단백질의 특징 등의 당업계에 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 정제된다. 단백질이 배양된 포유동물 세포에서 생산될 때 오염 단백질의 양을 제한하기 위해 무-세륨 배양 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 그 세포를 수거하고 용해하고 단편화한다. 단편화의 바람직한 방법은 친화성 크로마토그래피, Q-Fast Flow Sepharose, MonoQ 수지, FPLC, 페닐 Sepharose, 수산화인회석, MonoS 및/또는 S-Sepharose를 포함한다. 단백질은 또한 고정된 친화성 태그(예컨대 폴리히스티딘, 물질 P, 또는 다른 폴리펩티드, 또는 항체 또는 다른 특이적 결합제가 결합할 수 있는 단백질)를 사용하여 정제될 수 있다. 특이한 절단 부위는 관심의 단백질 및 친화성 태그 사이에 제공될 수 있다. 바람직한 친화성 태그는 예컨대 고정된 니켈 상에서 융합 단백질의 정제를 가능케하는 폴리히스티딘 꼬리를 포함한다(Houchuli 등의 Bio/Technol. 6:1321-1325, 1988). 예컨대 막통과 또는 분비 신호서열 도메인이 없는 폴리펩티드의 잘려진 형태가 또한 형성될 수 있고 촉매적으로 활성인 프로호르몬 변환효소를 더욱 쉽게 정제하는 데에 이용될 수 있다(Nakayama, K. Methods in Enz., 244: 167-175, 1995). 원핵 발현 시스템에서 말토스 결합 단백질(MBP) 융합이 친화성 태그로서 유익하게 이용될 수 있다. 단백질이 숙주세포의 세포질 또는 페리플라슴으로부터 회수되는 것이라면 그 세포를 먼저 부수고 그 단백질을 함유하는 정제안된 추출물을 회수하고 그이상의 정제단계로 보낸다. 더구나 인간 프로호르몬 폴리펩티드 기질 및 본 발명에 의한 절단으로부터 생성된 그들의 절단 생성물을 상기 기술한 당업계에 일반적으로 알려진 방법을 변화없이 사용하여 정제하였다. 예컨대 절단 생성물 등의 분비 단백질이 세포-조건 배지로부터, 바람직하게는 조건배지의 농축 후 회수한다. 특별한 단편화 단계 및 그러한 단계의 순서는 숙주세포의 츄형 및 선택된 발현 시스템의 일부에 근거할 것이다. 그러한 결정은 당업계의 통상의 기술수준 내이다. 특별한 방법의 선택은 루틴한 고안의 문제이고 선택된 특징에 의해 부분적으로 결정된다. 예컨대, 친화성 크로마토그래피: 원리 및 방법(Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988)를 참조하라.
본 발명의 폴리펩티드는 그 특성을 이용하여 분리할 수 있다. 예컨대 고정된 금속 이온 흡수(IMAC) 크로마토그래피가 히스티딘-풍부 단백질을 정제하는 데에 이용된다. 요컨대 젤이 먼저 2가 금속이온으로 하전되어 킬레이트를 형성한다[ Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7 (1985)]. 히스티딘-풍부 단백질은 사용되는 금속이온에 대한 친화도를 다르게 함으로써 이 매트릭스로 흡수되고, 경쟁적인 용리에 의해 용리될 것이다. 다른 정제 방법에는 렉틴 친화도 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 글리코실화된 단백질을 정제하는 것이 있다[Methods in Enzymol., Vol. 182:529-39, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), (Acad. 출판, 산디에고, 1990). 대안적으로 원하는 폴리펩티드의 융합 및 친화성 태그(예컨대 말토스-결합 단백질, 면역 글로불린 도메인)가 정제를 촉진하기 위해 구성될 수 있다.
인간의 PC4 폴리펩티드는 또한 인간의 PC4 에피토프, 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체들을 제조하는 데에 이용할 수 있다. 그 인간 PC4 폴리펩티드 또는 그 단편은 동물에게 접종할 항원(면역원)으로서 기능하여 면역반응을 유발한다. 적당한 항체는 SEQ ID NO: 2 안에 코딩된 여기서 기술한 다양한 인간 PC4 폴리펩티드 도메인, 또는 SEQ ID NO: 2 안의 연속의 9 내지 755 아미노산 단편을 포함한다. 이 면역 반응으로부터 제조한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 분리하고 정제한다. 예컨대 Current Protocols in Immunology, Cooligan 등(eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (제2판) (Cold Spring Harbor, NY, 1989); 및 Hurrell, J. G. R., Ed., 모노클로날 하이브리도마 항체: 기술 및 응용(CRC 출판, Inc., Boca Raton, FL, 1982를 참조하라.
당업자에게 명백하듯이 폴리클로날 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 및 래트 등의 다양한 온혈동물을 인간의 PC4 폴리펩티드 또는 그 단편으로 접종함으로써 제조될 수 있다. 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 면역원성은 알룸(수산화 알루미늄) 또는 Freund의 완전 또는 불완전 보조약 등의 보조제의 이용을 통해 증가될 수 있다. 면역법에 유용한 폴리펩티드는 또한 인간 프로호르몬 변환효소4 또는 그것의 일부의 면역 글로불린 폴리펩티드와의 융합 또는 말토스 결합 단백질과의 융합 등의 융합 폴리펩티드를 포함한다. 그 폴리펩티드 면역원은 전장 분자 또는 그 일부일 수 있다. 폴리펩티드의 일부가 "헵텐-유사"라면 그러한 일부는 거대분자 운반체[키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소혈청 알부민(BSA) 또는 파상풍 톡소이드]에 유익하게 조인 또는 링크될 것이다.
여기서 사용된 바와 같이 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 친화도-정제된 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 F(ab')2및 Fab' 단백질 가수분해 단편 등의 항체-결합 단편을 포함한다. 합성 항원 결합 펩티드 및 폴리펩티드 뿐만 아니라 키메라 항체 Fv 단편, 단일 사슬 항체 등의 유전학적으로 엔지니어링된 완전한 항체 또는 단편 또한 포함한다. 비-인간 항체는 비-인간 CDR을 인간의 프레임워크(framework) 및 불변(constant)부위로 이식함으로써 또는 전체 비-인간의 변이(variable)도메인을 통합함으로써(선택적으로 그것들을 노출된 잔기의 교체에 의해 인간-유사 표면으로 덮어 그 결과 "버니어(veneer)된" 항체가 됨) 인체에 적응할 수 있다. 몇몇 예에서 인체에 적응시킨 항체들은 적절한 결합 특성을 증가시키기 위해 인간의 변이부위 프레임워크 도메인 안에 비-인간 잔기들을 보유할 것이다. 항체를 인체에 적응킴으로써 생물학적 반감기가 증가할 것이고 인간에게 투여시 역 면역 반응의 가능성이 감소된다.
여기서 항체를 생산 또는 선별하는 데에 유용한 대안적 기술은 체외에서 림프구를 인간 프로호르몬 변환효소4 단백질 또는 펩티드에 노출시키고, 파지 또는 유사한 벡터에서 항체를 디스플레이하는 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다(예컨대 고정된 또는 표지된 인간 PC4 단백질 또는 펩티드의 사용을 통해). 잠재적인 인간 PC4 폴리펩티드 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 파지 상에(파지 디스플레이) 또는 대장균 등의 박테리아 상에 디스플레이된 무적위적 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 이러한 무작위적 펩티드 디스플레이 라이브러리는 리간드 또는 수용체, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질 등의 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있는 알려진 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다. 그러한 무작위적 펩티드 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 기술을 당업계에 알려져 있고(Ladner 등의 미국특허 제 5,223,409호; Ladner 등의 미국특허 제 4,946,778호; Ladner 등의 미국특허 제 5,403,484호 및 Ladner 등의 미국특허 제 5,571,698호), 무작위적 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 그러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는 예컨대 Clontech(Palo Alto, CA), Invitrogen Inc.(산디에고, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway, NJ) 등으로부터 상업적으로 구입가능하다. 무작위적 펩티드 디스플레이 라이브러리는 인간 PC4에 결합하는 단백질을 동정하기 위해 여기서 기술된 인간 PC4 서열을 사용하여 스크리닝 할 수 있다. 인간 PC4 폴리펩티드와 상호작용하는 이러한 "결합 단백질"은 세포를 태그하기 위해; 친화도 정제에 의해 상동 폴리펩티드를 분리하기 위해 이용될 수 있고; 그것들을 직접 또는 간접적으로 약제, 독소, 방사성 핵종 등과 컨져게이션할 수 있다. 이러한 결합 단백질은 또한 발현 라이브러리를 스크리닝하고 활성을 중화시키기 위함과 같은 분석 방법에 이용될 수 있다. 이 결합 단백질은 또한 폴리펩티드의 순환 수준을 결정하고, 병리 또는 질환에 기초한 마커로서 용해성 폴리펩티드를 검출 또는 정량하기 위한 진단적 분석에 이용할 수 있다. 이러한 결합 단백질은 또한 실험실 및 생체내에서 인간 PC4 결합 및 신호전달을 방해하기 위해 인간 PC4 "안타고니스트"로서 작용할 수 있다.
항체는 만약 1) 그것들이 결합 활성의 역치수준을 나타내고, 2) 그것들이 관련 폴리펩티드 분자와 현저히 교차반응하지 않는다면 특이적으로 결합하는 것으로 결정된다. 첫번째로, 항체가 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프와 (비-인간 PC4) 폴리펩티드를 조절하는 결합 친화도보다 적어도 10배이상의 친화도로 결합한다면 여기서 그것들은 특이적으로 결합하는 것이다. 그 항체는 106M-1이상, 바람직하게는 107M-1이상, 더욱 바람직하게는 108M-1이상, 가장 바람직하게는 109M-1이상의 결합 친화도(Ka)를 보이는 것이 바람직하다. 항체의 결합 친화도는 예컨대 Scatchard 분석(Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949) 등에 의해 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
두번째로, 항체는 만약 그것들이 관련 폴리펩티드와 현저히 교차반응하지 않는다면 특이적으로 결합하는 것으로 결정된다. 항체는 예컨대 그것들이 표준 웨스턴 블롯을 사용할 때 인간 PC4는 감지하나 알려진 관련 폴리펩티드는 그렇지 않으면 관련 폴리펩티드 분자와 현저히 교차반응하지 않는 것이다(Ausubel 등의 ibid). 알려진 관련 폴리펩티드의 예가 오르톨로그(예컨대 쥐의 PC4), 및 다른 알려진 인간 프로호르몬 변환효소(예컨대 PC1 및 PC2) 등의 파랄로그, 또는 돌연변이체 인간 PC4 폴리펩티드 및 비-포유동물의 프로호르몬 변환효소(예컨대 서브틸리신, 또는 Kex2)이다. 더구나 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 군집을 분리하기 위해 알려진 관련 폴리펩티드"에 대해 스크리닝"될 수 있다. 예컨대 인간 PC4에 대해 발생된 항체는 불용성 세포성간질에 부착된 관련 폴리펩티드에 흡착되고; 인간 PC4에 특이한 항체가 적절한 버퍼 조건하에서 세포성간질을 통해 흐를 것이다. 매우 관련된 폴리펩티드에 비-교차성인 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 분리를 그러한 스크리닝으로 인해 가능하게 된다(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 및 Lane(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory 출판, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan 등(eds.), National Institutes of Health, John Wiley 및 Sons, Inc., 1995). 특이적 항체의 스크리닝 및 분리가 당업계에 잘 알려져 있다. Fundamental Immunology, Paul(eds.), Raven 출판, 1993; Getzoff 등의 Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W.(eds.), Academic 출판 Ltd., 1996; Benjamin 등의 Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984를 참조하라.
당업자에게 알려진 다양한 분석법을 인간 PC4 단백질 또는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위해 이용할 수 있다. 분석법의 예는 항체:실험실 메뉴얼, Harlow 및 Lane (Eds.), (Cold Spring Harbor Laboratory 출판, 1988)에 상세히 기술되어 있다. 그러한 분석법의 대표적인 예로서 동시발생의 면역전기영동, 방사선면역분석법, 방사선면역침전법, 효소-링크된 면역흡착 분석법(엘리자, ELISA), 도트 블롯 분석법, 저해 또는 경쟁 분석법 및 샌드위치 분석법을 포함한다.
또한 야생형 대 돌연변이체 인간 PC4 단백질 또는 폴리펩티드에의 결합에 대해 스크리닝할 수 있다. 인간 PC4에 대한 항체는 인간 PC4를 발현하는 세포를 태크하기 위해; 친화성 정제에 의해 인간 PC4를 분리하기 위해; 실험실내 및 생체내에서 세포 및 조직 용해물에서의 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 수준을 측정하기 위한 진단분석법을 위해; 생체내에서 조직 분포를 결정하기 위한 인시츄 면역위치지정(immunolocalization)을 위해; 병리 또는 질병의 기초가 되는 마커로서 인간 프로호르몬 변환효소4 단백질을 검출하거나 측량하기 위해; 플로우 사이토미터 또는 FACS를 사용하는 분석적 방법에서; 발현 라이브러리를 스크리닝하기 위해; 항-유전자형 항체를 생산하기 위해; 그리고 항체를 중화하기 위해; 또는 실험실 및 생체내에서 인간 PC4의 촉매적 활성을 막기 위한 안타고니스트로서 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 항체를 이용하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 적당한 직접적 태그 또는 라벨은 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 저해제, 형광마커, 화학발광마커, 자석입자 등을 포함하고; 중간체로서 비오틴-아비딘 또는 다른 상보적/항-상보적 쌍의 사용을 특징으로 할 수도 있다. 여기서 항체는 또한 약제, 독소, 방사선핵종 등과 컨져게이션될 수 있고 이러한 컨져게이트는 생체내에서 진단 또는 치료법 적용을 위해 사용될 수 있다. 더구나 인간 PC4 또는 그 단편에 대한 항체는 분석법에서 변성된 인간 PC4 또는 그 단편을 체외에서 검출하기 위해 사용되는데 예컨대 웨스턴 블롯 또는 다른 분석법이 당업계에 알려져 있다.
인간 프로호르몬 변환효소4 등의 고환-특이적 프로세싱 효소는 고환세포에 의해 발현되는 프로호르몬 또는 결합 단백질을 프로세싱하는 것에 관련있다. 따라서 인간 프로호르몬 변환효소4가 고환의 프로호르몬의 생물학적 기능을 동정 및 결정하고 하기 논의될 신규 프로호르몬의 동정에 유용할 것이다. 인간 PC4가 수정능력 및/또는 정자형성에 관련된 고환의 기능에 한 역할을 한다는 제안의 지지로, 최근 논문은 동형접합성 수컷 쥐의 PC4 돌연변이체 마우스가 심각하게 손상된 수정능력을 갖는다고 설명하고 있다(Mbikay, M., 등의 Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6842-6846, 1997). 더구나 저자는 이러한 돌연변이 마우스에서의 명백한 정자형성의 비정상을 관찰하였고 이러한 정자에 의해 수정된 알은 낭포시기로 성장하지 못하여 수정에서의 역할 뿐 아니라 배발생 초기에 있어서의 역할을 제안한다.
본 발명의 단백질이 알려진 또는 알려지지 않은 프로호르몬 폴리펩티드를 프로세싱하거나 또는 부분적으로 프로세싱하여 그 성숙 또는 생물학적으로 활성인 형태로 하는데에 이용하며, 그것은 예컨대 고환세포의 증식 또는 분화를 자극한다. 더구나 본 발명의 단백질, 그 안타고니스트 및 아고니스트는 수컷의 수정능력에 한 역할을 한다. 인간의 PC4가 기질 상에 작용할지 안할지를 테스트하기 위해서, 잠재적인 프로호르몬 폴리펩티드 기질이 인간의 PC4와 같은 세포에서 공동발현되거나 체외에서 인간의 PC4와 조합됨으로써 행해진다. 그러한 세포를 형성시키거나 체외에서 단백질을 조합하는 방법들이 당업계에 알려져 있고 여기에 개시되어 있다. 잠재적인 프로호르몬 기질 상에서의 인간 PC4의 활성으로부터 절단 생성물이 얻어진다. 본 발명의 단백질 활성은 프로호르몬 변환효소4에 의해 잘려진 프로호르몬 전구체 폴리펩티드의 절단 생성물과 결합된 생물학적 활성을 분석함으로서 측정될 수 있다. 또한 절단 생성물의 생물학적 활성이 측정될 수 없다면, 웨스턴 블롯 등의 다른 방법이 인간의 PC4가 기질 프로호르몬을 절단했는지를 결정하는 데에 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 인간의 프로호르몬 변환효소4의 폴리펩티드 프로호르몬 기질을 결정하는 데에 이용될 수 있다. 당업계에서 잘 알려진 방법을 이용하여 인간의 프로호르몬 변환효소4의 성숙 형태를 발현하고 테스트 기질 프로호르몬 폴리펩티드를 공동발현하는 발현벡터가 도입될 한 세포를 배양할 수 있다. 인간 프로호르몬 변환효소4에 의한 테스트 기질의 절단으로부터 얻어진 절단 생성물이 여기서 기술된 생물학적 또는 생화학적 분석법에 의해 측정될 수 있다. 더구나 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 폴리펩티드 프로호르몬 기질을 결정하는 그러한 방법은 체외에서 측정될 수 있다. 분리된 또는 정제된 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드 또는 인간의 프로호르몬 변환효소4를 발현하는 세포를 테스트 기질 프로호르몬 폴리펩티드 또는 이염기성 절단부위를 함유하는 합성 폴리펩티드 등의 테스트 기질 폴리펩티드와 함께 체외에서 조합할 수 있다. 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 의한 테스트 기질 프로호르몬 폴리펩티드의 절단으로부터 얻은 절단 생성물을 여기서 기술된 생물학적 또는 생화학적 분석법에 의해 검출될 수 있다.
다양한 분석법이 절단 생성물의 생물학적 활성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대 증식 및 분화가 배양된 고환세포를 사용하거나 또는 본 발명의 폴리펩티드에 의해 절단되거나 프로세싱된 프로호르몬 분자를 적절한 동물 모델에게 투여함으로써 측정될 수 있다. 배양된 고환세포는 돌핀 DB1.Tes 세포(CRL-6258); 마우스 GC-1 spg 세포(CRL-2053); TM3 세포(CRL-1714); TM4 세포(CRL-1715); 및 돼지 ST 세포(CRL-1746)를 포함하고 이것은 American Type Culture Collection, Rockville, MD로부터 구입가능하다. 세포 증식 또는 분화를 측정하는 측정법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대 증식을 측정하는 측정법은 중성 레드 염료에 대한 화학민감성(Cavanaugh 등, Investigational New Drugs 8:347-354, 1990), 방사선표지된 뉴클레오티드의 통합(Cook 등, Analytical Biochem. 179:1-7, 1989), 증식하는 세포의 DNA에서 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 통합(Porstmann 등, J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985), 테트라졸륨 염의 이용(Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley 등, Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall 등, Growth Reg. 5:69-84, 1995; 및 Scudiero 등, Cancer Res. 48:4827-4833, 1988). 분화를 측정하는 분석법은 예컨대 조직의 단계-특이적 발현, 효소적 활성, 기능적 활성 또는 형태학적 변화와 관련된 세포-표면 마커를 측정하는 것을 포함한다(Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, ESACT, 9th meeting, 1989).
인간의 프로호르몬 변환효소4의 고환 폴리펩티드 요소에 대한 영향을 측정하기 위한 생체내 분석법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대 절단 생성물이 특정 시간의 존속동안 복막내로 주입될 수 있다. 처리기간 후에 동물을 죽이고 고환을 제거하여 무게를 잰다. 고환을 균질화하고 정자 머리수를 샌다(Meistrich 등, Exp. Cell Res. 99:72-78, 1976).
다른 활성, 예컨대 주화 활성등의 본 발명의 단백질에 의해 프로세싱된 폴리펩티드의 절단 생성물에 관한 활성 또한 측정될 수 있다. 예컨대 정자형성의 후기단계 인자는 정자-난자의 상호작용 및 정자의 운동성에 관련있다. 그러한 활성을 측정하는 분석법이 알려졌다(Fuchs, Zentralbl Gynakol 11:117-120, 1993; Neurwinger 등, Andrologia 22:335-339, 1990; Harris 등, Human Reprod. 3:856-860, 1988; 및 Jockenhovel, Andrologica 22:171-178,1990).
또한 웨스턴 블롯 등의 표준 생화학적 분석 기술을 알려지지 않은 활성의 기질 프로호르몬의 인간 PC4 프로세싱으로부터 얻어진 절단 생성물을 검출하는 데에 이용할 수 있다(Sambrook 등, ibid. 및 Ausubel 등, ibid.). 그러한 방법을 사용하여 인간 PC4 및 테스트 프로호르몬 기질을 발현하는 세포로부터 분비된 절단 생성물을 세포로부터 수집된 배지를 측정함으로써 검출할 수 있다.
본 발명의 단백질은 또한 인간 프로호르몬 변환효소4의 조절제에 대한 세포-기초의 스크리닝에 이용할 수 있다. 안타고니스트 및 아고니스트 등의 조절제가 예컨대 촉매적 활성, 유전자 발현 또는 기질 폴리펩티드와의 상호작용 등의 몇몇 방법으로 프로호르몬 변환효소에 영향을 미칠 수 있다. 그러한 안타고니스트 및 아고니스트는 인간의 PC4의 절단 활성을 각각 감소 또는 증가시킴으로써 본 발명의 프로호르몬 변환효소에 영향을 미칠 것이다. 이 증가 또는 감소는 인간 PC4가 작용하는 프로호르몬으로부터 절단 생성물을 평가함으로써 측정된다. 그러한 적용에서 본 발명의 폴리펩티드에 의해 잘려지는 것으로 알려진 지시자 프로호르몬 기질이 인간 프로호르몬 변환효소4를 발현하는 작은 세포안에서 발현된다. 그러한 세포를 형성하는 방법은 당업계에 알려져 있고 여기에 개시되어 있다. 바람직한 지시자 프로호르몬 폴리펩티드는 프로호르몬 변환효소에 의해 프로세싱될 때 분비되고 절단 생성물에 관련된 쉽게 측정가능한 생물학적 활성을 갖는다. 그러한 활성 측정법의 예는 상기에 기술되어 있다. 안타고니스트 및 아고니스트가 하기 논의될 다양한 약제의 존재에 노출된 후 그 세포로부터 분비된 결과된 절단 생성물을 스크리닝함으로써 동정된다. 지시자 기질의 프로세싱에 있어서의 변화는 약제에 노출되지 않은 콘트롤 세포와 비교하여, 약제가 프로호르몬 변환효소를 증대시키거나 저해함으로써 본 발명의 인간의 PC4 단백질에 미치는 활성을 반영한다. 예컨대 콘트롤과 비교하여 인간 PC4의 활성을 증가시키는 아고니스트는 증가된 절단을 야기하고 그러므로 지시자 기질로부터 더욱 생물학적으로 활성인 절단 생성물을 야기한다. 결과적으로 콘트롤과 비교하여 인간 PC4의 활성을 감소시키는 안타고니스트는 감소된 절단을 야기하여 그러므로 지시자 기질로부터 덜한 또는 잠재적으로 없는 생물학적 활성 절단 생성물을 야기한다. 인간의 PC4를 조절하는, 그리고 측정될 수 있거나 테스트 샘플에서 사용되는 약제를 위한 원료는 식물, 미생물 및 균류 추출물, 화학적 라이브러리 및 조합의 화학적 라이브러리를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 어떤 천연 또는 화학적 원료를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 세포-기초의 스크리닝 분석법의 이러한 유형을 확립하고 적용하는 방법이 당업계에 알려져 있다.
세포-기초의 스크리닝의 이러한 유형은 테스트 샘플에서 인간 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드 활성의 조절제의 존재하에 검출하기 위해 사용될 수 있다. 성숙 인간 PC4 단백질을 발현하고 알려진 지시자 프로호르몬 폴리펩티드 기질을 공동발현하는 세포가 테스트 샘플의 존재 및 부재하에서 배양될 수 있다. 그러한 세포의 형성은 당업계에 알려지고 여기서 기술된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예컨대 성숙 인간 PC4 단백질의 발현을 유도하는 발현벡터 및 알려진 지시자 프로호르몬 폴리펩티드 기질의 발현을 유도할 발현벡터가 같은 세포내에 도입될 수 있다. 테스트 샘플이 없는 세포는 테스트 샘플이 존재하는 분자의 활성에 대해 비교하는 콘트롤로서 작용한다. 생물학적 또는 생화학적 분석법을 사용하여 인간 프로호르몬 변환효소4에 의한 기질의 절단으로 얻은 절단 생성물의 수준을 테스트 샘플의 존재 및 부재하에서 비교할 수 있다. 이 비교로부터 테스트 샘플에 인간 프로호르몬 변환효소 활성의 조절제의 존재가 상기 기술한 바와 같이 명확해질 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드가 또한 질병 또는 다른 인간의 특징과 관련된 인간 염색체19의 비정상을 검출하기 위해 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인간 염색체19의 19p13.3 영역에 위치한다. 프로호르몬 변환효소 유전자 위치에서 검출가능한 염색체 이상은 이수배수체, 유전자 카피 넘버 변화, 삽입, 결실, 제한부위 변화 및 재배열을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 그러한 이상은 제한단편길이 다양성(RFLP) 분석, PCR 기술을 사용하는 짧은 세로반복(STR) 분석, 및 당업계에 알려진 다른 유전적 연관 분석기술(Sambrook 등, ibid.; Ausubel 등, ibid.; Marian, A.J., Chest 108: 255-265, 1995) 등의 분자 유전학적 기술을 적용함으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 진단적 응용에 이용하기 위한 시약들을 제공한다. 예컨대 인간 PC4 유전자, 인간 PC4의 DNA 또는 RNA를 포함하는 프로브, 또는 그 결과가 인간 PC4 유전자가 염색체19 상에 존재하는지 또는 돌연변이가 발생했는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 인간 PC4 유전자 위치에서 검출가능한 염색체 이상은 이수배수체, 유전자 카피 넘버 변화, 삽입, 결실, 제한부위변화 및 재배열을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 이상은 코딩서열 내에, 인트론 내에, 또는 플랭킹 서열 내에 발생할 수 있고 이것은 코딩서열 내의 물리적 변화 또는 유전자 발현 수준의 변화로서 증명될 것이다. 분석적 프로브는 비록 약간 더 짧은 프로브(14-17 뉴클레오티드)가 사용된다 할지라도 일반적으로 적어도 20뉴클레오티드 길이가 될 것이다. PCR 프라이머는 적어도 5뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 15이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 20-30뉴클레오티드 길이이다. 유전자의 짧은 영역이 분석을 위해 표적화된 때 짧은 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 유전자의 총체적 분석을 위해 폴리뉴클레오티드 프로브는 전체의 엑손 이상을 포함한다. 프로브는 일반적으로 방사선 표지된 뉴클레오티드 등의 신호-발생 부분과 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 일반적으로 이러한 진단적 방법은 (a) 환자로부터 유전적 샘플을 얻는 단계 (b) 폴리뉴클레오티드가 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하여 제1 반응 생성물을 형성하는 조건하에, 그 유전적 샘플을 상기 기술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로 인큐베이션시키는 단계 (c) 제1 반응 생성물을 콘트롤 반응 생성물과 비교하는 단계를 포함한다. 제1 반응 생성물 및 콘트롤 반응 생성물 간의 차이점은 환자에 있어서 유전적 비정상을 지시하는 것이다. 본 발명의 사용을 위한 유전적 샘플은 게노믹 DNA, cDNA, 및 RNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 RNA 또는 DNA일 수 있고, SEQ ID NO: 1의 일부, SEQ ID NO: 1의 상보체, 또는 그 RNA 등가물을 포함할 것이다. 이 관점에서 적당한 분석 방법은 제한단편길이 다형현상(RFLP) 분석, PCR을 사용하는 짧은 세로반복(STR) 분석, 라이게이션 사슬 반응(Barany, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991), 리보뉴클레아제 보호 분석, 및 다른 당업계에 알려진 유전적 연관 분석기술(Sambrook 등, ibid.; Ausubel 등, ibid; A.J. Marian, ibid., 1995) 등의 당업자에게 알려진 분자 유전학적 기술을 포함한다. 리보뉴클레아제 보호 분석(Ausubel 등, ibid., ch. 4)은 RNA 프로브를 환자의 RNA 샘플에 혼성화하고, 그 후 그 반응 생성물(RNA-RNA 하이브리드)이 RNase에 노출되도록 하는 것을 포함한다. 혼성화된 RNA의 영역은 분해로부터 보호된다. PCR 분석에서 환자의 유전적 샘플이 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머로 인큐베이션하여, 그 프라이머들 사이의 영역이 증폭되고 회수된다. 회수된 생성물의 크기 또는 양의 변화가 그 환자의 돌연변이를 나타낸다. 또다른 적용가능한 PCR-기초의 기술은 단일가닥 구조의 다형현상(SSCP) 분석이다(Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-38, 1991).
실시예
실시예1
인간의 프로호르몬 변환효소4의 클로닝
A. 요약
인간의 고환 cDNA 라이브러리를 쥐의 PC4 cDNA 프로브로 스크리닝함으로써 분리된 cDNA, 클론 pSLHPC4-5가 쥐의 PC4 cDNA에 상동적이라는 것이 밝혀졌다. 이 cDNA는 인간의 프로호르몬 변환효소4(인간의 PC4)를 코딩하였다.
B. 인간의 고환 cDNA 라이브러리의 제조
전장 인간의 PC4 cDNA를 λZAPII (Stratagene, La Jolla, CA) 인간 고환 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻었다. 그 고환 cDNA 라이브러리의 구성은 다음과 같았다:
제1가닥 cDNA 반응은 1.0㎍/㎕의 농도의 인간 고환 투와이스 폴리 d(T)-선택된 폴리(A)+ mRNA(Clontech Laboratories)를 15㎕, Xho I 제한부위를 함유하는 20pmole/㎕의 제1가닥 프라이머 ZC6091 (SEQ ID NO: 5) 3㎕를 함유하였다. 그 혼합물을 70℃에서 4분간 가열하고 얼음상에서 냉각하였다. 제1가닥 cDNA 합성은 12㎕의 제1가닥 버퍼(5x SUPERSCRIPT™ 버퍼; Life Technologies, Gaithersburg, MD), 6㎕의 100mM 디티오트레이톨, 및 각각 10mM의 dTTP, dATP, dGTP 및 5-메틸-dCTP(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)를 그 RNA-프라이머 혼합물에 첨가함으로써 개시하였다. 그 반응 혼합물을 37℃에서 2분간 인큐베이션한 후 15㎕의 200U/㎕ RNase H-역전사효소(SUPERSCRIPT II; Life Technologies)를 첨가하였다. 분석을 위한 반응물을 표지하기 위해 그 반응 혼합물 중 하나로부터의 5㎕의 앨리컷에 5μCi의32P-αdCTP를 첨가함으로써 평행반응으로 제1가닥 합성의 효율을 분석하였다. 그 반응물을 37℃에서 10분간, 45℃에서 1시간동안 인큐베이션한 후 50℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 표지된 반응물에서 통합되지 않은32P-αdCTP를 400구멍 크기 젤 여과 칼럼(Clontech Laboratories) 상에서 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 표지되지 않은 제1가닥에서 통합되지 않은 뉴클레오티드 및 프라이머를 400구멍 크기 젤 여과 칼럼(Clontech Laboratories) 상에서 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 표지된 제1가닥 cDNA의 길이를 아가로스 젤 전기영동으로 측정하였다.
제2가닥은 120㎕의 표지되지 않은 제1가닥 cDNA, 36㎕의 5x 중합효소 I 버퍼(125mM 트리스: HCl, pH 7.5, 500mM KCl, 25mM MgCl2, 50mM(NH4)2SO4), 2.4㎕의 100mM 디티오트레이톨, 각각의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 10mM 함유하는 용액 3.6㎕, 6㎕의 5mM β-NAD, 3.6㎕의 3U/㎕ E coli DNA 리가아제(New England Biolabs; Beverly, MA), 9㎕의 10U/㎕ E coli DNA 중합효소I(New England Biolabs), 및 1.8㎕의 2U/㎕ RNase H(Life Technologies)를 함유하였다. 제2가닥 합성 반응물 중 하나로부터의 10㎕의 앨리컷을 제2가닥 합성의 효율을 모니터하기 위해32P-αdCTP를 첨가함으로써 표지하였다. 그 반응물을 16℃에서 2시간동안 인큐베이션 한 후 15㎕의 T4 DNA 중합효소(10U/㎕, Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN)를 첨가하고 16℃에서 5분간 더욱 인큐베이션하였다. 표지된 반응물에서 통합되지 않은32P-αdCTP를 아가로스 젤 전기영동 하기전에 400구멍 크기 젤 여과 칼럼(Clontech Laboratories) 상에서 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 그 반응을 20㎕의 0.5EDTA를 첨가하고 페놀/클로로포름 및 클로로포름으로 추출하고 이어서 2.5M의 아세트산 암모늄 및 4㎍의 글리코겐 운반체의 존재하에 에탄올 침전을 함으로써 종결시켰다. cDNA의 수율은 15㎍의 출발 mRNA 주형으로부터 약 3㎍으로 측정되었다.
Eco RI 어뎁터는 상기 기술된 cDNA의 5'말단에 연결되어 발현벡터로의 클로닝을 가능케하였다. cDNA(~1.5㎍)의 앨리컷 10㎕ 및 65pmole/㎕의 Eco RI 어뎁터(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) 5㎕를 10x 리가아제 버퍼(660mM 트리스-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2) 2㎕, 10mM의 ATP 2㎕ 및 15U/㎕ T4 DNA 리가아제(Promega Corp., Madison, WI) 1㎕와 혼합하였다. 그 반응물을 5℃에서 2시간, 7.5℃에서 2시간, 10℃에서 2시간 및 12.5℃에서 10시간 인큐베이션하였다. 그 반응을 70℃에서 20분 인큐베이션함으로써 종결하였다.
lZapII벡터(Stratagene)안으로 cDNA의 방향성 클로닝을 용이하게 하기 위해 그 cDNA를 Xho I으로 분해시켜 5' Eco RI 점착성 말단 및 3' Xho I 점착성 말단을 갖는 cDNA를 얻었다. cDNA의 3'말단에 있는 Xho I 제한부위를 ZC6091 프라이머(SEQ ID NO: 5)를 사용하여 미리 도입하였다. 상기 기술한 cDNA 20㎕, 10x H 버퍼(Boehringer Mannheim) 10㎕, 69㎕의 물 및 40U/㎕의 Xho I(Boehringer Mannheim) 1.0㎕를 함유하는 반응 혼합물에서 제한효소 분해를 수행하였다. 분해를 37℃에서 40분간 수행하였다. 그 반응을 70℃에서 10분간 인큐베이션하고 400구멍 크기 젤의 여과 칼럼(Clontech Laboratories)을 통해 크로마토그래피함으로써 종결하였다.
그 cDNA를 에탄올 침전시키고 70%에탄올로 세척하고 공기 건조하고 14㎕의 물, 2㎕의 리가아제 버퍼(Promega Corp., Madison WI), 2㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(10U/㎕, Life Technologies)에 재현탁시켰다. 그 후 37℃에서 30분간 인큐베이션하고 그 cDNA를 65℃로 5분간 가열하고 얼음상에서 냉각하고 0.8% 저용융 아가로스젤 상에서 전기영동하였다. 그 오염 어뎁터 및 하기 0.6kb 길이의 cDNA를 젤로부터 제거하였다. 전극을 역전하고 cDNA를 그 래인 개시점 근처로 농축될 때까지 전기영동하였다. 농축 cDNA를 함유하는 젤의 부분을 제거하고 미크로휴즈 튜브안에 넣고 젤 슬라이스의 대략적 부피를 측정하였다. 젤 슬라이스 부피의 약 세배인 물의 한 앨리컷(300㎕) 및 35㎕의 10x β-아가로스 I 버퍼(New England Biolabs)를 튜브에 첨가하고 그 아가로스를 65℃로 15분간 용융하였다. 그 샘플의 뒤이은 평형은 45℃로 되고 3㎕의 1U/㎕ β-아가로스 I(New England Biolabs)를 첨가하고 그 혼합물을 45℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 한 후 40㎕의 3M Na 아세테이트를 샘플에 첨가한 후 그 혼합물을 15분간 얼음상에서 냉각하였다. 그 샘플을 분해안된 아가로스를 제거하기 위해 실온에서 15분간 14000 x g으로 원심분리하였다. cDNA를 에탄올 침전하고 70%에탄올로 세척하고 공기건조하고 10㎕의 물로 재현탁하였다.
그 결과된 cDNA를 이미 Eco RI 및 Xho I으로 분해되고 탈인산화된 람다 파지 벡터 λZapII(Stratagene) 안으로 클론하였다. cDNA의 λZapII 벡터로의 라이게이션을 1.0㎕의 제조된 벡터, 1.0㎕의 인간 고환 cDNA, 1.0㎕의 10X 리가아제 버퍼(Promega Corp.), 1.0㎕의 10mM ATP, 5㎕의 물 및 15유니트/㎕(Promega Corp.)의 T4 DNA 리가아제 1.0㎕를 함유하는 반응 혼합물에서 수행하였다. 그 라이게이션 혼합물을 온도 구배로 5℃-15℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 그 라이게이션 혼합물을 실험실의 패키징 추출물(GigapackIII Gold 패키징 추출물; Stratagene)을 사용하여 파지안으로 패키지해 넣고 그 결과된 라이브러리를 생산자의 설명서에 따라 적정하였다.
C. 폴리뉴클레오티드의 분리
인간 고환 λZapII 라이브러리를 대장균 숙주세포(XL1-Blue™ MRF' 균주;Stratagene)를 감염시키는데 사용하고 150-mm NZY 플레이트 상에 ~40000pfu/플레이트의 밀도로 1.5 x 106pfu를 플레이트하였다. 그 접종된 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 필터 플라크 리프트를 생산업자에 의해 제공된 절차에 따라 나일론 멤브레인(Hybond™-N; Amersham Corp., Arlington Heights, IL)을 사용하여 제조하였다. 그 필터를 실온에서 7분간 1.5M NaCl 및 0.5M NaOH를 함유하는 용액에서 변성에 의해 가공하였다. 그 필터를 필터 페이퍼 상에서 짧게 블롯트하여 여분의 변성 용액을 제거한 후 1M 트리스-HCl, pH 7.5, 및 1.5M NaCl에서 5분간 중화하였다. 파지 DNA를 필터상에서 UV 크로스링커(Stratalinker; Stratagene)로 1200μJoules의 UV에너지를 가지고 고정하였다. 고정한 후 그 필터를 혼성화 용액(5X SSC, 5X Denhardt's 용액, 0.2% SDS 및 1mM EDTA)에서 사전혼성화하였다. 열로 변성시키고 잘린 연어 정자 DNA를 최종농도 100㎍/ml로 첨가하였다. 그 필터를 65℃에서 밤새 사전혼성화하였다.
SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드45 내지 뉴클레오티드1033에 상당하는 래트 프로호르몬 변환효소 cDNA 코딩영역을 증폭하기 위해 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR 생성물로서 프로브를 제조하였다. 개시의 첫번째 원형 PCR 반응 혼합물은 2㎕의 ZC11,808(SEQ ID NO: 7) 및 2㎕의 ZC11,809(SEQ ID NO: 8), 1㎕의 400 펨토그램/㎕ 래트 고환 cDNA, 1㎕의 10mM dNTP, 10㎕의 10X Klentaq 버퍼(Clontech), 83㎕의 물 및 2㎕의 Klentaq DNA 중합효소(Clontech)를 함유하였다. 그 첫번째 원형 PCR 반응은 다음과 같이 행하였다: 초기 95℃에서 30초간; 그 후 30사이클을 95℃에서 30초간, 57℃에서 30초간, 68℃에서 2분간; 그 후 68℃에서 10분간 작동하였다. 그 첫번째 원형 PCR 생성물을 물로 1:2000 희석하였다. 희석된 첫번째 원형 PCR 생성물의 1㎕를 프라이머, ZC11,870(SEQ ID NO:9) 및 ZC11,871(SEQ ID NO:10)을 사용하여 첫번째 원형 PCR 생성물의 DNA 내부를 증폭시키기 위해 고안된 두번째 PCR에 적용시켰다. 두번째 원형 PCR 반응은 하기와 같이 작동하였다: 초기 95℃에서 30초간; 그 후 30사이클을 95℃에서 30초간, 58℃에서 30초간, 68℃에서 2분간; 그 후 68℃에서 10분간 작동하였다. 두번째 원형 PCR 생성물을 인간 PC4를 위한 인간 고환 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용하기 위해 1.5% 저용융 아가로스젤 상에서 젤 정제하였다.
25나노그램 PCR 생성물을 생산업자의 설명에 따라 MEGAPRIME™ DNA Labeling System(Amersham)을 사용하여 무작위 프라이밍에 의해32P-dCTP로 방사선표지하였다. 그 사전혼성화 용액을 6.5 X 105cpm/ml의 표지된 프로브를 함유하는 후레쉬한 혼성화 용액으로 대체하고 60℃에서 밤새 혼성화하였다. 혼성화한 후 그 혼성화 용액을 제거하고 그 필터를 1 X SSC, 0.25% SDS 및 1mM EDTA 를 함유하는 세척용액으로 45℃에서 헹구었다. 그 필터를 자기방사능사진 필름 상에 위치시키고 -70℃에서 96시간동안 강한 스크린으로 노출시켰다.
자기방사능사진의 검사로 표지된 프로브와 혼성화된 다중 영역을 밝혀냈다. 아가 플러그를 정제를 위해 39영역으로부터 골랐다. 각 아가 플러그를 1%(v/v)클로로포름을 함유하는 0.5ml의 SM에서 밤새 적셨다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory 출판, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 인큐베이션 후 각 플러그로부터 파지를 SM에서 1:1000으로 희석하였다. E coli XL-1 Blue™ MRF' 세포 상에 50㎕의 앨리컷을 플레이트하였다. 그 플레이트를 37℃에서 밤새 교반하고 필터 리프트를 제조하고, 사전혼성화하고, 혼성화하고 세척하고 상기 기술한 바와 같이 자기방사선사진을 찍었다. 그 결과된 자기방사선사진의 검사로 10개 필터 리프트 상에 포지티브 신호를 밝혀냈다. 아가 플러그를 이 영역으로부터 골라서 플라크 정제의 부가적 라운드에 적용시켰다.
플라스미드를 생산업자의 설명서에 따라 ExASSIST/SOLR™ 시스템(Stratagene)을 사용하여 잘랐다. 이 플라스미드를 삽입 크기 결정 및 시퀀싱을 위해 PCR에 의해 증폭하였다. 한 클론, 고안된 pSLHPC4-5를 SEQ ID NO: 1로 나타내지는 서열을 함유하는 것으로 나타났다.
실시예2
조직 분포
pSLHPC4-5의 전장 코딩서열로부터 한 프로브를 제조하여 Human Multiple Tissue Northern Blots(Clontech)를 프로브하는 데에 사용하였다. 노던 분석으로 고환에만 존재하는 약 2.8kb의 밴드를 밝혀냈다.
실시예3
PCR-기초로한 인간 PC4 유전자의 염색체 맵핑
인간의 PC4를 상업적으로 구입가능한 "GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)를 사용하여 염색체19를 맵핑하였다. 그 GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel은 93개의 방사 하이브리드 클론 각각으로부터의 DNA와 두 콘트롤 DNA(HFL 공여체 및 A23 수용체)를 함유한다. 공공연히 이용가능한 WWW 서버 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)로 GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel로 형성된 인간 게놈의 Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research의 맵("WICGR" 인간 게노믹 맵)에 관하여 맵핑이 가능토록 한다.
"GeneBridge 4 RH Panel"을 가지고 인간 PC4를 맵핑하기 위해서 20㎕의 PCR 반응물을 96-웰 미크로티터 플레이트(Stratagene)에 장치하고 "RoboCycler Gradient 96" 열 사이클러(Stratagene)에 사용하였다. 95 PCR 반응물 각각은 2㎕의 10X KlenTaq PCR 반응 버퍼(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1.6㎕의 dNTP 믹스(각각 2.5mM, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1㎕의 센스 프라이머, ZC13,557(SEQ ID NO:11), 1㎕의 안티센스 프라이머, ZC13,558(SEQ ID NO:12), 2㎕의 "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0.4㎕의 50X Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 개체의 하이브리드 클론 또는 콘트롤로부터의 25ng의 DNA 및 총부피 20㎕를 위한 ddH2O로 구성되어 있었다. 그 반응물을 동량의 미네랄 오일로 칠하고 밀봉하였다. PCR 사이클러 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 5분간 변성의 초기 1사이클, 95℃에서 1분간 변성의 35사이클, 68℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 1.5분간 연장, 그 후 72℃에서 7분 연장의 최종 1사이클. 그 반응물을 3% NuSieve GTG 아가로스 젤(FMC Bioproducts, Rockland, ME) 상에서 전기영동에 의해 분리하였다.
그 결과는 인간의 PC4가 WICGR 방사 하이브리드 맵 상에서 염색체 19 프레임워크 마커 IB1264로부터 10.54cR_3000 말단에 위치한다는 것을 보여주었다. 이것은 인간 PC4를 통합된 LDB 염색체19 맵 상의 19p13.3 영역에 위치시킨다(The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar. genetics. soton.ac.uk/public_html).
실시예4
인간 PC4 Mammalian Expression Vector PPC4-5/pHZ1의 제조
인간 PC4 폴리펩티드를 포유동물 세포내에서 발현시키기 위해 발현벡터를 제조하였다. 그 포유동물 발현벡터 pHZ1은 SV40의 초기 프로모터, SV40의 폴리아데닐화 부위, 메탈로티오닌(MT-1) 프로모터의 조절 하에 원하는 유전자를 삽입하기 위한 다중 클로닝 부위(폴리링커) 및 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 부위의 조절 하의 네오마이신 유전자를 갖는다. 그 발현벡터를 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD와 함께 두었다.
인간 PC4를 PHZ1 폴리링커로 EcoRI/XbaI 부위로 서브클론하였다. EcoRI 및 XbaI(Boehringer-Mannheim)으로 PHZ1을 자른 후 Qiaquick™ 칼럼(Qiagen)을 통해 단편을 분리함으로써 벡터 단편을 제조하였다. 1644bp 단편(5'단편)을 실시예1에 따라 SEQ ID NO:1에 개시된 것과 같은 5' UTR을 포함하는 인간 PC4 서열의 5'말단을 제공하는 제한효소 Eco RI 및 Aat II를 가지고 인간 PC4 클론으로부터 잘라냈다. 약 681bp인 PCR 단편을 인간 PC4 Aat II 부위에 걸친 프라이머 ZC13,359(SEQ ID NO:13) 및 SEQ ID NO:1에 기재된 것과 같은 3'UTR을 포함하는 인간 PC4 서열의 3'말단을 제공하는 Xba I 부위를 함유하는 프라이머 ZC13,358(SEQ ID NO:14)를 가지고 실시예1의 인간 PC4 클론으로부터 PCR 증폭하였다. 그 PCR 반응 조건을 다음과 같다: 94℃에서 1분간 1사이클, 그 후 94℃에서 30초간 35사이클, 50℃에서 20초간 및 72℃에서 30초간; 그 후 72℃에서 10분의 최종 1사이클. 그 PCR 생성물을 Ata II 및 Xba I로 절단하고 상기와 같이 정제된 단편을 681bp PCR 단편(3'단편)으로 제조하였다.
잘려진 5'단편 및 3'단편 DNA를 pHZ1 벡터 단편으로 서브클론하였다. 약20나노그램의 Eco RI/Aat II 분해된 인간 PC4의 5'단편, 약 20나노그램의 Aat II/Xba I 분해된 인간 PC4의 3'단편, 및 약40나노그램의 대응하는 벡터 단편을 표준 라이게이션 반응 버퍼 조건하에서 실온에서 5시간 라이게이션시켰다. 이 라이게이션 반응물 중에 1㎕를 생산업자의 지시에 따라 25㎕의 DH10B 컴피턴트 세포(GIBCOBRL, Gaithersburg, MD)로 일렉트로포레이션하고 100mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
콜로니를 하기 PCR 조건 하에서 프라이머ZC12,634(SEQ ID NO:15) 및 ZC12,945(SEQ ID NO:16)를 사용하여 스크리닝하였다: 94℃에서 1분간 1사이클, 그 후 94℃에서 20초간 25사이클, 50℃에서 30초간 및 72℃에서 1분간; 그 후 72℃에서 10분의 최종 1사이클. 포지티브 클론의 삽입 서열은 서열분석에 의해 다양화하였다. 큰 규모의 플라스미드 제조를 생산업자의 지시에 따라 QIAGENMaxi 제조 키트(Qiagen)를 사용하여 행하였다.
상기로부터 비록 본 발명의 특정 구체예를 예시의 목적으로 여기에 기재하였다 하더라도 다양한 변형이 본 발명의 범위내에서 가능하다는 것을 인정할 것이다. 따라서 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.
〈110〉 ZYMOGENETICS, INC.
〈120〉 HUMAN PROHORMONE CONVERTASE 4
〈130〉 1
〈150〉 US 60/044,015
〈151〉 1997-05-06
〈160〉 10
〈170〉 KOPATIN 1.5
〈210〉 1
〈211〉 2744
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (61)..(2325)
〈400〉 1
gaattcggca cgaggcggga gggaggggat ttgcgcaggc cccgctcccg ccccgcctcc 60
atg cgg ccc gcc ccg att gcg ctg tgg ctg cgc ctg gtc ttg gcc ctg 108
Met Arg Pro Ala Pro Ile Ala Leu Trp Leu Arg Leu Val Leu Ala Leu
1 5 10 15
gcc ctt gtc cgc ccc cgg gct gtg ggg tgg gcc ccg gtc cga gcc ccc 156
Ala Leu Val Arg Pro Arg Ala Val Gly Trp Ala Pro Val Arg Ala Pro
20 25 30
atc tat gtc agc agc tgg gcc gtc cag gtg tcc cag ggt aac cgg gag 204
Ile Tyr Val Ser Ser Trp Ala Val Gln Val Ser Gln Gly Asn Arg Glu
35 40 45
gtc gag cgc ctg gca cgc aaa ttc ggc ttc gtc aac ctg ggg ccg atc 252
Val Glu Arg Leu Ala Arg Lys Phe Gly Phe Val Asn Leu Gly Pro Ile
50 55 60
ttc cct gac ggg cag tac ttt cac ctg cgg cac cgg ggc gtg gtc cag 300
Phe Pro Asp Gly Gln Tyr Phe His Leu Arg His Arg Gly Val Val Gln
65 70 75 80
cag tcc ctg acc ccg cac tgg ggc cac cgc ctg cac ctg aag aaa aac 348
Gln Ser Leu Thr Pro His Trp Gly His Arg Leu His Leu Lys Lys Asn
85 90 95
ccc aag gtg cag tgg ttc cag cag cag acg ctg cag cgg cgg gtg aaa 396
Pro Lys Val Gln Trp Phe Gln Gln Gln Thr Leu Gln Arg Arg Val Lys
100 105 110
cgc tct gtc gtg gtg ccc acg gac ccc tgg ttc tcc aag cag tgg tac 444
Arg Ser Val Val Val Pro Thr Asp Pro Trp Phe Ser Lys Gln Trp Tyr
115 120 125
atg aac agc gag gcc caa cca gac ctg agc atc ctg cag gcc tgg agt 492
Met Asn Ser Glu Ala Gln Pro Asp Leu Ser Ile Leu Gln Ala Trp Ser
130 135 140
cag ggg ctg tca ggc cag ggc atc gtg gtc tct gtg ctg gac gat ggc 540
Gln Gly Leu Ser Gly Gln Gly Ile Val Val Ser Val Leu Asp Asp Gly
145 150 155 160
atc gag aag gac cac ccg gac ctc tgg gcc aac tac gac ccc ctg gcc 588
Ile Glu Lys Asp His Pro Asp Leu Trp Ala Asn Tyr Asp Pro Leu Ala
165 170 175
agc tat gac ttc aat gac tac gac ccg gac ccc cag ccc cgc tac acc 636
Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Tyr Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr
180 185 190
ccc agc aaa gag aac cgg cac ggg acc cgc tgt gct ggg gag gtg gcc 684
Pro Ser Lys Glu Asn Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala
195 200 205
gcg atg gcc aac aat ggc ttc tgt ggt gtg ggg gtc gct ttc aac gcc 732
Ala Met Ala Asn Asn Gly Phe Cys Gly Val Gly Val Ala Phe Asn Ala
210 215 220
cga atc gga ggc gta cgg atg ctg gac ggt acc atc acc gat gtc atc 780
Arg Ile Gly Gly Val Arg Met Leu Asp Gly Thr Ile Thr Asp Val Ile
225 230 235 240
gag gcc cag tcg ctg agc ctg cag ccg cag cac atc cac att tac agc 828
Glu Ala Gln Ser Leu Ser Leu Gln Pro Gln His Ile His Ile Tyr Ser
245 250 255
gcc agc tgg ggt ccc gag gac gac ggc cgc acg gtg gac ggc ccc ggc 876
Ala Ser Trp Gly Pro Glu Asp Asp Gly Arg Thr Val Asp Gly Pro Gly
260 265 270
atc ctc acc cgc gag gcc ttc cgg cgt ggt gtg acc aag ggc cgc ggc 924
Ile Leu Thr Arg Glu Ala Phe Arg Arg Gly Val Thr Lys Gly Arg Gly
275 280 285
ggg ctg ggc acg ctc ttc atc tgg gcc tcg ggc aac ggc ggc ctg cac 972
Gly Leu Gly Thr Leu Phe Ile Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Leu His
290 295 300
tac gac aac tgc aac tgc gac ggc tac acc aac agc atc cac acg ctt 1020
Tyr Asp Asn Cys Asn Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile His Thr Leu
305 310 315 320
tcc gtg ggc agc acc acc cag cag ggc cgc gtg ccc tgg tac agc gaa 1068
Ser Val Gly Ser Thr Thr Gln Gln Gly Arg Val Pro Trp Tyr Ser Glu
325 330 335
gcc tgc gcc tcc acc ctc acc acc acc tac agc agc ggc gtg gcc acc 1116
Ala Cys Ala Ser Thr Leu Thr Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Val Ala Thr
340 345 350
gac ccc cag atc gtc acc acg gac ctg cat cac ggg tgc aca gac cag 1164
Asp Pro Gln Ile Val Thr Thr Asp Leu His His Gly Cys Thr Asp Gln
355 360 365
cac acg ggc acc tcg gcc tca gcc cca ctg gcg gcc ggc atg atc gcc 1212
His Thr Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Met Ile Ala
370 375 380
cta gcg ctg gag gcc aac ccg ttc ctg acg tgg aga gac atg cag cac 1260
Leu Ala Leu Glu Ala Asn Pro Phe Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His
385 390 395 400
ctg gtg gtc cgc gcg tcc aag ccg gcg cac ctg cag gcc gag gac tgg 1308
Leu Val Val Arg Ala Ser Lys Pro Ala His Leu Gln Ala Glu Asp Trp
405 410 415
agg acc aac ggc gtg ggg cgc caa gtg agc cat cac tac gga tac ggg 1356
Arg Thr Asn Gly Val Gly Arg Gln Val Ser His His Tyr Gly Tyr Gly
420 425 430
ctg ctg gac gcc ggg ctg ctg gtg gac acc gcc cgc acc tgg ctg ccc 1404
Leu Leu Asp Ala Gly Leu Leu Val Asp Thr Ala Arg Thr Trp Leu Pro
435 440 445
acc cag ccg cag agg aag tgc gcc gtc cgg gtc cag agc cgc ccc acc 1452
Thr Gln Pro Gln Arg Lys Cys Ala Val Arg Val Gln Ser Arg Pro Thr
450 455 460
ccc atc ctg ccg ctg atc tac atc agg gaa aac gta tcg gcc tgc gcc 1500
Pro Ile Leu Pro Leu Ile Tyr Ile Arg Glu Asn Val Ser Ala Cys Ala
465 470 475 480
ggc ctc cac aac tcc atc cgc tcg ctg gag cac gtg cag gcg cag ctg 1548
Gly Leu His Asn Ser Ile Arg Ser Leu Glu His Val Gln Ala Gln Leu
485 490 495
acg ctg tcc tac agc cgg cgc gga gac ctg gag atc tcg ctc acc agc 1596
Thr Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Gly Asp Leu Glu Ile Ser Leu Thr Ser
500 505 510
ccc atg ggc acg cgc tcc aca ctc gtg gcc ata cga ccc ttg gac gtc 1644
Pro Met Gly Thr Arg Ser Thr Leu Val Ala Ile Arg Pro Leu Asp Val
515 520 525
agc act gaa ggc tac aac aac tgg gtc ttc atg tcc acc cac ttc tgg 1692
Ser Thr Glu Gly Tyr Asn Asn Trp Val Phe Met Ser Thr His Phe Trp
530 535 540
gat gag aac cca cag ggc gtg tgg acc ctg ggc cta gag aac aag ggc 1740
Asp Glu Asn Pro Gln Gly Val Trp Thr Leu Gly Leu Glu Asn Lys Gly
545 550 555 560
tac tat ttc aac acg ggg acg ttg tac cgc tac acg ctg ctg ctc tat 1788
Tyr Tyr Phe Asn Thr Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr Thr Leu Leu Leu Tyr
565 570 575
ggg acg gcc gag gac atg aca gcg cgg cct aca ggc ccc cag gtg acc 1836
Gly Thr Ala Glu Asp Met Thr Ala Arg Pro Thr Gly Pro Gln Val Thr
580 585 590
agc agc gcg tgt gtg cag cgg gac aca gag ggg ctg tgc cag gcg tgt 1884
Ser Ser Ala Cys Val Gln Arg Asp Thr Glu Gly Leu Cys Gln Ala Cys
595 600 605
gac ggc ccc gcc tac atc ctg gga cag ctc tgc ctg gcc tac tgc ccc 1932
Asp Gly Pro Ala Tyr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Leu Ala Tyr Cys Pro
610 615 620
ccg cgg ttc ttc aac cac aca agg ctg gtg acc gct ggg cct ggg cac 1980
Pro Arg Phe Phe Asn His Thr Arg Leu Val Thr Ala Gly Pro Gly His
625 630 635 640
acg gcg gcg ccc gcg ctg agg gtc tgc tcc agc tgc cat gcc tcc tgc 2028
Thr Ala Ala Pro Ala Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys His Ala Ser Cys
645 650 655
tac acc tgc cgc ggc ggc tcc ccg agg gac tgc acc tcc tgt ccc cca 2076
Tyr Thr Cys Arg Gly Gly Ser Pro Arg Asp Cys Thr Ser Cys Pro Pro
660 665 670
tcc tcc acg ctg gac cag cag cag ggc tcc tgc atg gga ccc acc acc 2124
Ser Ser Thr Leu Asp Gln Gln Gln Gly Ser Cys Met Gly Pro Thr Thr
675 680 685
ccc gac agc cgc ccc cgg ctt aga gct gcc gcc tgt ccc cac cac cgc 2172
Pro Asp Ser Arg Pro Arg Leu Arg Ala Ala Ala Cys Pro His His Arg
690 695 700
tgc cca gcc tcg gcc atg gtg ctg agc ctc ctg gcc gtg acc ctc gga 2220
Cys Pro Ala Ser Ala Met Val Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Gly
705 710 715 720
ggc ccc gtc ctc tgc ggc atg tcc atg gac ctc cca cta tac gcc tgg 2268
Gly Pro Val Leu Cys Gly Met Ser Met Asp Leu Pro Leu Tyr Ala Trp
725 730 735
ctc tcc cgt gcc agg gcc acc ccc acc aaa ccc cag gtc tgg ctg cca 2316
Leu Ser Arg Ala Arg Ala Thr Pro Thr Lys Pro Gln Val Trp Leu Pro
740 745 750
gct gga acc tgaag ttgtcagctc agaaagcgac cttgcccccg cctgggtccc 2370
Ala Gly Thr
755
tgacaggcac tgctgccatg ctgcctcccc aggctggccc cagaggagcg agcaccagca 2430
cccgacgcct ggcctgccag ggatgggccc cgtggaaccc cgaagcctgg cgggagagag 2490
agagagagaa gtctcctctg cattttgggt ttgggcggga gtgggctggg gggagaggct 2550
ggagcacccc aaaagccagg ggaaagtgga gggagagaaa cgtgacactg tccgcctcgg 2610
gcaccgcatc caacctcaga gtttgcaaat aaaggttgct tagaaggtga aaaaaaaaaa 2670
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2730
aaaaaagcgg ccgc 2744
〈210〉 2
〈211〉 755
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 2
Met Arg Pro Ala Pro Ile Ala Leu Trp Leu Arg Leu Val Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Val Arg Pro Arg Ala Val Gly Trp Ala Pro Val Arg Ala Pro
20 25 30
Ile Tyr Val Ser Ser Trp Ala Val Gln Val Ser Gln Gly Asn Arg Glu
35 40 45
Val Glu Arg Leu Ala Arg Lys Phe Gly Phe Val Asn Leu Gly Pro Ile
50 55 60
Phe Pro Asp Gly Gln Tyr Phe His Leu Arg His Arg Gly Val Val Gln
65 70 75 80
Gln Ser Leu Thr Pro His Trp Gly His Arg Leu His Leu Lys Lys Asn
85 90 95
Pro Lys Val Gln Trp Phe Gln Gln Gln Thr Leu Gln Arg Arg Val Lys
100 105 110
Arg Ser Val Val Val Pro Thr Asp Pro Trp Phe Ser Lys Gln Trp Tyr
115 120 125
Met Asn Ser Glu Ala Gln Pro Asp Leu Ser Ile Leu Gln Ala Trp Ser
130 135 140
Gln Gly Leu Ser Gly Gln Gly Ile Val Val Ser Val Leu Asp Asp Gly
145 150 155 160
Ile Glu Lys Asp His Pro Asp Leu Trp Ala Asn Tyr Asp Pro Leu Ala
165 170 175
Ser Tyr Asp Phe Asn Asp Tyr Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr
180 185 190
Pro Ser Lys Glu Asn Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala
195 200 205
Ala Met Ala Asn Asn Gly Phe Cys Gly Val Gly Val Ala Phe Asn Ala
210 215 220
Arg Ile Gly Gly Val Arg Met Leu Asp Gly Thr Ile Thr Asp Val Ile
225 230 235 240
Glu Ala Gln Ser Leu Ser Leu Gln Pro Gln His Ile His Ile Tyr Ser
245 250 255
Ala Ser Trp Gly Pro Glu Asp Asp Gly Arg Thr Val Asp Gly Pro Gly
260 265 270
Ile Leu Thr Arg Glu Ala Phe Arg Arg Gly Val Thr Lys Gly Arg Gly
275 280 285
Gly Leu Gly Thr Leu Phe Ile Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Leu His
290 295 300
Tyr Asp Asn Cys Asn Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile His Thr Leu
305 310 315 320
Ser Val Gly Ser Thr Thr Gln Gln Gly Arg Val Pro Trp Tyr Ser Glu
325 330 335
Ala Cys Ala Ser Thr Leu Thr Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Val Ala Thr
340 345 350
Asp Pro Gln Ile Val Thr Thr Asp Leu His His Gly Cys Thr Asp Gln
355 360 365
His Thr Gly Thr Ser Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Met Ile Ala
370 375 380
Leu Ala Leu Glu Ala Asn Pro Phe Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His
385 390 395 400
Leu Val Val Arg Ala Ser Lys Pro Ala His Leu Gln Ala Glu Asp Trp
405 410 415
Arg Thr Asn Gly Val Gly Arg Gln Val Ser His His Tyr Gly Tyr Gly
420 425 430
Leu Leu Asp Ala Gly Leu Leu Val Asp Thr Ala Arg Thr Trp Leu Pro
435 440 445
Thr Gln Pro Gln Arg Lys Cys Ala Val Arg Val Gln Ser Arg Pro Thr
450 455 460
Pro Ile Leu Pro Leu Ile Tyr Ile Arg Glu Asn Val Ser Ala Cys Ala
465 470 475 480
Gly Leu His Asn Ser Ile Arg Ser Leu Glu His Val Gln Ala Gln Leu
485 490 495
Thr Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Gly Asp Leu Glu Ile Ser Leu Thr Ser
500 505 510
Pro Met Gly Thr Arg Ser Thr Leu Val Ala Ile Arg Pro Leu Asp Val
515 520 525
Ser Thr Glu Gly Tyr Asn Asn Trp Val Phe Met Ser Thr His Phe Trp
530 535 540
Asp Glu Asn Pro Gln Gly Val Trp Thr Leu Gly Leu Glu Asn Lys Gly
545 550 555 560
Tyr Tyr Phe Asn Thr Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr Thr Leu Leu Leu Tyr
565 570 575
Gly Thr Ala Glu Asp Met Thr Ala Arg Pro Thr Gly Pro Gln Val Thr
580 585 590
Ser Ser Ala Cys Val Gln Arg Asp Thr Glu Gly Leu Cys Gln Ala Cys
595 600 605
Asp Gly Pro Ala Tyr Ile Leu Gly Gln Leu Cys Leu Ala Tyr Cys Pro
610 615 620
Pro Arg Phe Phe Asn His Thr Arg Leu Val Thr Ala Gly Pro Gly His
625 630 635 640
Thr Ala Ala Pro Ala Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys His Ala Ser Cys
645 650 655
Tyr Thr Cys Arg Gly Gly Ser Pro Arg Asp Cys Thr Ser Cys Pro Pro
660 665 670
Ser Ser Thr Leu Asp Gln Gln Gln Gly Ser Cys Met Gly Pro Thr Thr
675 680 685
Pro Asp Ser Arg Pro Arg Leu Arg Ala Ala Ala Cys Pro His His Arg
690 695 700
Cys Pro Ala Ser Ala Met Val Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Gly
705 710 715 720
Gly Pro Val Leu Cys Gly Met Ser Met Asp Leu Pro Leu Tyr Ala Trp
725 730 735
Leu Ser Arg Ala Arg Ala Thr Pro Thr Lys Pro Gln Val Trp Leu Pro
740 745 750
Ala Gly Thr
755
〈210〉 3
〈211〉 5
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 3
Arg Arg Val Lys Arg
1 5
〈210〉 4
〈211〉 49
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 4
gagcacagaa ttcactactc gaggcggccg cttttttttt ttttttttt 49
〈210〉 5
〈211〉 2458
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 5
atgcggccct cccagacagc gctgtggctg ggtctggttt tgtctttggc cctcctggct 60
gtggggtggg cctcagcccg accacccatc tatgtcagca gctgggcagt gcgggtgacc 120
aaaggttacc aggaggctga gcgcctggca cgtaaatttg gcttcgtcaa cctgggacag 180
atctttcctg atgaccagta tttccatctg aggcaccggg gtgtggccca gcagtccctg 240
actccgcact ggggccaccg tctgcgcctg aagaaagagc ccaaggtgcg gtggtttgag 300
cagcagactt tgaggcggcg ggtgaagcgc tccctggtgg tacccacaga cccctggttt 360
tccaagcagt ggtacatgaa caaggagata gaacaagatc tcaacatcct aaaggtttgg 420
aaccagggac tgactggccg gggagtggtg gtctccatct tggatgatgg cattgagaag 480
gaccatccgg acctctgggc taattatgac cccctggcca gctatgactt caatgattac 540
gacccagatc cccagcctcg atacacaccc aacgatgaga accggcatgg aacacgctgc 600
gctggggagg tgtctgccac agcaaacaac ggtttctgtg gtgccggtgt ggccttcaat 660
gccagaattg gaggcgtgcg catgttggat ggagccatca ctgacatcgt ggaggctcag 720
tccctcagcc tgcagccgca acacatacac atctatagcg ccagttgggg ccccgaggat 780
gatgggcgca cagtggacgg acccggcctc ctcacgcagg aggccttcag gcgtggtgta 840
accaagggcc gccaagggct gggcacgctg ttcatctggg cctcgggaaa cggtggcctc 900
cactacgaca actgcaattg tgacggctac accaacagca tccacacgct gtcagtgggc 960
agtaccacgc ggcagggccg agtgccctgg tacagcgagg cctgcgcctc cacgttcacc 1020
accaccttca gcagcggtgt ggtcaccgac ccacagatcg tcaccacgga cctacaccat 1080
caatgcaccg acaagcacac gggcacctcg gcctccgccc cgctggccgc tggcatgatc 1140
gccctggcgc tggaggccaa cccgctgctg acctggaggg acctgcagca cctggtggtc 1200
cgcgcgtcca ggccggcgca gctgcaggcg gaggactgga ggatcaacgg cgtggggcgc 1260
caagtgagcc accactatgg ctatgggctg ctggacgcgg ggctgctggt agacctggct 1320
cgcgtgtggc tccctactaa gcctcagaag aaatgcacca ttcgggtggt gcacacccca 1380
acccccatcc tgcctcggat gctggtgcca aagaacgtga ctgtatgctg cgatggctcg 1440
cgccgccgcc tcatccgctc gctagagcat gttcaggtcc agctgtcgct ctcctacagc 1500
cgccgcgggg acctggagat cttcctcacc agccccatgg gcacgcgctc cacgcttgtg 1560
gccatcagac ccttggatat cagcggccaa ggctacaaca actggatctt catgtctact 1620
cactactggg atgaggaccc gcagggcctg tggaccctgg ggctggagaa taagggctac 1680
tattataaca caggaactct gtactactgc acgctgctgc tgtatgggac ggcagaggac 1740
atgacagcgc ggccccagac cccccaggtg accagctgcg cgcacgcatg tgcagaggga 1800
cacagagggg ctgtgccagg aaagtcattg tcccctctcc attgtggcag aactctgcct 1860
catctccagc aagcagtggt ggtggctcta cagccacaca cagcagccag tgaccaaggg 1920
acaggacagc tgtcaccctc ctaccacacc tgctcggcag cttgaccagc gactacactg 1980
cctgttccct gcccctcatg ctgggagtgc ttcagagccc ctccaaggct tgtcacctct 2040
ggcagccatc ctggctatca gtcttgggcc atggtgctgt ccctgctaac cagggccttt 2100
ggaaggcccc tcatcttgag gaaggcccac ctctccccag gctggatacc cctggggagc 2160
cagagatgcc ccactctcag gacagaaggc cggtacccca aggccctgct cccaggccgg 2220
gataggaata tgccccagaa ggccacggca gagagctgca tgggtcacgt gacagcccgc 2280
agctcagcct cagctgctcc cagtggaaga gacgtttcct cattcttttt ggagcaggta 2340
tggcagacaa gaggtcagac cacagccacc aaccacctgc cccttccctg tctccaaacc 2400
atccccatgt ctaacctcat agttggcaaa taaagttaaa cagaaaaaaa aaaaaaaa 2458
〈210〉 6
〈211〉 25
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 6
tggctgggtc tggttttgtc tttgg 25
〈210〉 7
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 7
gcattgatgg tgtaggtccg tggt 24
〈210〉 8
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 8
tttggccctc ctggctgtgg ggtg 24
〈210〉 9
〈211〉 24
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 9
tgctgaaggt ggtggtgaac gtgg 24
〈210〉 10
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 10
cagccgcagc acatccacat ttacag 26
〈210〉 11
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 11
gggtgaggat gccggggccg t 21

Claims (21)

  1. 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90% 상동적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 인간의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드:
    (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 114번(Ser) 내지 아미노산 443번(Ala)의 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 114번(Ser) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열;
    (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열; 및
    (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열.
  2. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
    (a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 400번 내지 뉴클레오티드 1389번의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (b) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 400번 내지 뉴클레오티드 2325번의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (c) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 118번 내지 뉴클레오티드 2325번의 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    (d) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 61번 내지 뉴클레오티드 2325번의 폴리뉴클레오티드서열
  3. 제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 2265를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드가 본질적으로 SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열에 적어도 90% 상동적인 아미노산 잔기의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서, 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드가 본질적으로 SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 잔기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 하기 작동가능하게 연결된 요소들을 포함하는 발현벡터:
    전사 프로모터;
    SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열에 적어도 90% 상동적인 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 절편; 및
    전사 터미네이터.
  7. 제 6 항에 있어서, DNA 절편에 작동가능하게 연결된 분비 신호서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  8. 제 6 항의 발현벡터가 도입된 배양된 세포로서, 세포가 상기 DNA 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 배양된 세포.
  9. (a) SEQ ID NO:2의 잔기 1번 (Met) 내지 잔기 21번(Pro)의 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NO:2의 잔기 20번 (Arg) 내지 잔기 113번(Arg)의 아미노산 서열;
    (c) SEQ ID NO:2의 잔기 114번 (Ser) 내지 잔기 443번(Ala)의 아미노산 서열;
    (d) SEQ ID NO:2의 잔기 444번 (Arg) 내지 잔기 561번(Tyr)의 아미노산 서열;
    (e) SEQ ID NO:2의 잔기 562번 (Tyr) 내지 잔기 755번(Thr)의 아미노산 서열;
    (f) SEQ ID NO:2의 잔기 114번 (Ser) 내지 잔기 755번(Thr)의 아미노산 서열; 및
    (g) SEQ ID NO:2의 잔기 20번 (Arg) 내지 잔기 755번(Thr)의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기 서열에 적어도 90% 상동적인 폴리펩티드를 코딩하는 제1 DNA 절편; 및
    부가적 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 다른 DNA 절편을 포함하며, 제1 및 다른 DNA 절편이 프레임 내에 연결되어 있고, 융합 단백질을 코딩하는 DNA 구조체.
  10. 하기 작동가능하게 연결된 요소들을 포함하는 벡터가 도입된 숙주세포를 배양하는 것:
    (a) 전사 프로모터;
    (b) 제 9 항의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 구조체; 및
    (c) 전사 터미네이터; 및
    DNA 절편에 의해 코딩된 단백질을 회수하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 융합 단백질.
  11. 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90% 상동적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드:
    (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 114번(Ser) 내지 아미노산 443번(Ala)의 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 114번(Ser) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열;
    (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열; 및
    (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 1번(Met) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열.
  12. 제 11 항에 있어서, 폴리펩티드가 본질적으로 SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Thr)의 아미노산 서열에 적어도 90% 상동적인 아미노산 잔기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  13. 제 12 항에 있어서, 아미노산 잔기 서열이 SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Thr)인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  14. 제 8 항의 세포를 배양하는 것; 및
    상기 세포에 의해 생산된 인간 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하는 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  15. DNA 절편에 의해 코딩된 인간 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 발현하고 테스트 기질 프로호르몬 폴리펩티드를 공동발현하는, 제 6 항의 발현벡터가 도입된 세포를 배양하는 것; 및
    인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 의한 테스트 기질의 절단으로부터 결과된 절단 생성물을 검출하는 것을 포함하는 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 폴리펩티드 프로호르몬 기질을 측정하는 방법.
  16. 제 11 항의 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드를 테스트 기질 폴리펩티드와 체외에서 조합하는 것; 및
    인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 의한 테스트 기질의 절단으로부터 결과된 절단 생성물을 검출하는 것을 포함하는 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드의 폴리펩티드 프로호르몬 기질을 측정하는 방법.
  17. 테스트 샘플의 존재 및 부재하에서 DNA 절편에 의해 코딩된 인간 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드를 발현하고 알려진 지시자 프로호르몬 폴리펩티드 기질을 공동발현하는, 제 6 항의 발현벡터가 도입된 세포를 배양하는 것; 및
    테스트 샘플의 존재 및 부재하에서, 생물학적 또는 생화학적 분석법에 의해인간 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드에 의한 기질의 절단으로부터 결과된 절단 생성물의 수준을 비교하는 것: 및
    그 비교로부터 테스트 샘플에서 인간 프로호르몬 변환효소 활성의 조절제의 존재를 결정하는 것을 포함하는 인간 프로호르몬 변환효소 폴리펩티드 활성의 조절제의 존재를 테스트 샘플에서 검출하는 방법.
  18. (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 20번(Arg) 내지 아미노산 755번(Ser)의 연속적인 아미노산 서열에 적어도 90% 상동적인 것을 특징으로 하는 9 내지 755 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드;
    (b) 제 11 항의 폴리펩티드;
    (c) SEQ ID NO:2의 잔기 444번 (Arg) 내지 잔기 561번(Tyr)에 적어도 90% 상동적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및
    (d) SEQ ID NO:2의 잔기 562번 (Tyr) 내지 잔기 755번(Thr)에 적어도 90% 상동적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되고 동물에서 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드로 동물을 접종하는 것; 및
    상기 동물로부터 항체를 분리하는 것을 포함하는 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하는 방법.
  19. 인간 프로호르몬 변환효소4 폴리펩티드에 결합하는 제 18 항의 방법에 의해 생산된 항체.
  20. 제 19 항에 있어서, 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  21. 제 11 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
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