CN113249468A - 检测朗格罕细胞组织细胞增生症的基因组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种检测朗格罕细胞组织细胞增生症的基因组合，其包含已报道的致病相关突变基因，并包含MAPK、PI3K、JAK‑STAT、NF‑κB、Notch、衰老、酪氨酸激酶受体、细胞周期、上皮间质转化信号通路相关基因，以及MAPK激酶互作分子、血液髓系肿瘤相关基因。本申请还提供了上述基因组合在朗格罕细胞组织细胞增生症的具体应用。

Description

检测朗格罕细胞组织细胞增生症的基因组合及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学诊断领域，具体地，本申请提供了一种检测朗格罕细胞组织细胞增生症的基因组合及其具体应用方式。

背景技术

朗格罕细胞组织细胞增生症（LCH）是一类以CD1a和/或CD207阳性树突状细胞异常克隆性增殖聚集、并导致组织损伤为特点的疾病，可发生于任何年龄，多发于幼年儿童，15岁以下儿童年发病率约为2.6-8.9/100万。该病临床表现复杂多变、异质性极强，轻者表现为自限性的单纯骨或皮肤损害，重者累及全身多个器官或系统，如骨、皮肤、淋巴结、肺、垂体、耳、眼、口腔、甲状腺等，肝、脾、骨髓这些危险器官受累会危及生命。该病极易误诊、误治，治疗过程中容易复发，病情反复进展易遗留尿崩、生长发育迟缓、骨骼畸形等后遗症，是血液系统疑难罕见病的代表病种之一。

目前认为LCH是一种骨髓髓系来源的肿瘤，但又同时具有炎症性疾病的特点，发病机制尚不明确。2010年研究人员首次发现，在57%的LCH患者中存在B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶（BRAF）基因的V600E突变，导致丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activatedprotein kinase, MAPK）RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的激活，是重要的致病驱动基因（Badalian-Very 等, Blood 2010, 116 (11): 1919-1923.）。之后陆续在LCH中发现其它MAPK通路相关基因的突变，如MAP2K1（Brown等, Blood 2014, 124 (10): 1655-1658.）、BRAF缺失（Chakraborty等, Blood 2016, 128 (21), 2533-2537.）、ARAF（Nelson等,Blood 2014, 123 (20): 3152-3155.）、ERBB3（Chakraborty等, Blood 2014, 124 (19):3007-3015.）、MAPK3及MAPK7（Durham等, Nature Medicine 2019, 25 (12): 1839-1842.）等基因突变；少数患者中存在PI3K信号通路的基因突变，如PIK3CA、PIK3CD突变等（Héritier等, Blood 2015, 125 (15): 2448-2449.），这些突变均导致了细胞外调节蛋白激酶（Extracellular signa regulated kinase, ERK）的磷酸化激活。这些基因突变类型多样，有错义突变、插入/缺失突变、移码突变、剪接突变或激酶融合等。在LCH中还发现同时存在一些其它重要信号通路的基因突变，如JAK-STAT、Notch、NF-κB、细胞周期、酪氨酸激酶受体等（Durham等, Nature Medicine 2019, 25 (12): 1839-1842.），这些突变在LCH的发病中也可能发挥了一定作用。

研究表明，BRAF-V600E突变与LCH患者的临床危险度分型和预后密切相关；针对BRAF-V600E突变的靶向治疗如维罗非尼、达拉非尼被尝试用于治疗复发/难治性LCH患者，显示出良好的治疗反应和安全性。由于该疾病极强的异质性，MAP2K1、ARAF等其它相关基因突变的临床意义、与预后的关系及分子靶向治疗的应用尚不明确；并且仍有约20%的LCH患者中未发现明确的已知致病相关基因突变，其分子谱尚未完全清楚。因此，基因检测在协助LCH诊断、指导临床治疗中起着重要作用。

近年来，基因测序技术有了飞速发展，从最初以Sanger测序法为代表的一代测序技术，发展到二代测序技术的广泛应用。外显子是真核生物基因序列中可被表达合成为蛋白质的编码序列，外显子区域虽然仅占人类基因组区域的1%左右，但却拥有约85%与疾病相关的变异位点。专注于外显子区域的研究，具有相对高效性、能够检测到绝大多数与疾病相关的编码区变异的特点，因而广泛地应用于疾病的基因诊断中。已有一些报道采用全外显子测序方法（whole exome sequencing, WES）对LCH进行了基因突变检测（RikhiaChakraborty等, Blood,124(19):3007-3015; David S. Nelson等, Blood,123(20):3152-3155; Rikhia Chakraborty等, Blood 2016,128(21):2533-2537），但全外显子测序方法仍较昂贵，且程序和环节复杂、费时费力，在临床应用中仍存在一定的限制。

基因组合测序方法，是采用二代测序技术，对捕获的多个相关基因的目标区域DNA序列进行测定，目的是检测出对诊断、治疗有指导意义的基因，优点是可在较短的周期内一次性检测多个基因的多个位点，快速高效、通量高、结果可靠，价格也相对合理。但目前已报道在LCH中应用的基因组合，多采用非特异性的肿瘤基因组合进行测序，包含的基因在35~500个基因不等（Luc Xerri等， American Journal of Surgical Pathology 2018,42(2):150-159; David S. Nelson等, Genes Chromosomes Cancer 2015,54(6):361-8）; SaraZarnegar等, Pediatr Blood Cancer 2018, 65 (1): 10.1002/pbc.26699)，应用非特异性的肿瘤基因组合可能会造成检测结果不准确、给受检者带来心理负担等问题。近期有报道采用一种基因组合对LCH的病灶组织进行了测序分析，但该基因组合检测基因数目较少，仅包含MAPK、PI3K等相关信号通路的74个基因（Fanélie Jouenne等, EuropeanRespiratory Journal 2020,55(2):1901190）。

为了进一步研究LCH疾病的发病机制，分析LCH致病的分子谱，阐明LCH中病理性MAPK通路激活的机制，并应用于指导临床诊断、治疗，为临床实施靶向治疗提供新靶点，急待针对LCH设计的测序基因组合，以更好地检测和研究LCH。

发明内容

一方面，本申请提供了检测朗格罕细胞组织细胞增生症的基因组合，其特征在于，所述基因组合包含下表所示的基因：

表1检测LCH基因组合Ⅰ组合所包含的基因名称

AKT1

CTBP1

GSK3A

MAP2K6

MAPK14

PAK2

RORC

TP53

ALK

CTBP2

GSK3B

MAP2K7

MAPK3

PDGFRA

ROS1

TSC1

APC

CXCL8

HRAS

MAP3K1

MAPK7

PDK1

SIRT1

TSC2

ARAF

DDR2

IKBKB

MAP3K10

MAPK8

PICK1

SMAD2

TWIST1

ARHGAP1

DOCK1

IKZF1

MAP3K11

MAPK9

PIK3CA

SMAD3

VCL

ATM

EDNRA

IL17A

MAP3K12

MAPKAPK2

PIK3CB

SMAD4

WNT1

ATR

EGFR

IL1A

MAP3K13

MDM2

PIK3CD

SMO

ZEB1

BCAR1

EIF4EBP1

IL1RN

MAP3K14

MET

PIK3CG

SNAI1

ZEB2

BRAF

EPHA6

IL6

MAP3K2

MIGA1

PIK3R1

SNAI2

CLIP2-BRAF

CASP8AP2

ERBB2

JAK1

MAP3K20

MST1

PIK3R2

SOS1

FIP1L1-PDGFRA

CDC25A

ERBB3

JAK2

MAP3K21

MTOR

PTEN

SOS2

KIF5B-ALK

CDC42

EZH2

JAK3

MAP3K3

NF2

PTK2

SQSTM1

LMNA-NTRK1

CDKN1A

FGFR1

KIF5B

MAP3K4

NFKB1

RAF1

SRC

MIGA1-BRAF

CDKN1B

FGFR2

KIT

MAP3K5

NFKB2

RALA

STAT3

PACSIN2-BRAF

CDKN2A

FIP1L1

KMT2D

MAP3K6

NFKBIA

RALGDS

STAT5B

RNF11-BRAF

CDKN2B

FOXO1

KRAS

MAP3K7

NLK

RASA1

TAB1

CHEK1

FOXO3

LMNA

MAP3K8

NOTCH1

RB1

TAB2

CHEK2

GATA4

MAP2K1

MAP3K9

NR2C2

RET

TAOK1

CLIP2

GCK

MAP2K2

MAP4K1

NRAS

RHEB

TAOK2

CREBBP

GNA11

MAP2K3

MAP4K4

NTRK1

RHOA

TGFB1

CRK

GNAQ

MAP2K4

MAPK1

PACSIN2

RNF11

TGFBR1

CSHL1

GRB2

MAP2K5

MAPK10

PAK1

ROCK1

TNF

进一步地，所述基因组合包含下表所示的基因：

表2 检测LCH基因组合Ⅱ组合包含的基因名称

AKT1

CDKN2B

FGFR1

KIF5B

MAP4K4

NR4A2

RHOA

TET2

ALK

CHEK1

FGFR2

KIT

MAPK1

NRAS

RIPK1

TGFB1

ANK3

CHEK2

FIP1L1

KLLN

MAPK10

NTRK1

RNF11

TGFBR1

APC

CLIP2

FLT3

KMT2D

MAPK14

PACSIN2

ROCK1

TNF

ARAF

CREBBP

FOXO1

KRAS

MAPK3

PAK1

RORC

TNFAIP3

ARHGAP1

CRK

FOXO3

LMNA

MAPK7

PAK2

ROS1

TP53

ARID1A

CSF1R

GAB1

MAP2K1

MAPK8

PDGFRA

SETD2

TRIM28

ARID1B

CSF3R

GATA3

MAP2K2

MAPK9

PDK1

SF3B1

TSC1

ARID2

CSHL1

GATA4

MAP2K3

MAPKAPK2

PICK1

SH2D2A

TSC2

ATM

CTBP1

GCK

MAP2K4

MDM2

PIK3CA

SIRT1

TWIST1

ATR

CTBP2

GNA11

MAP2K5

MET

PIK3CB

SMAD2

ULK1

B2M

CTNNA1

GNAQ

MAP2K6

MIGA1

PIK3CD

SMAD3

USP8

B9D2

CXCL8

GRB2

MAP2K7

MKNK1

PIK3CG

SMAD4

VCAN

BAG3

CYFIP2

GSK3A

MAP3K1

MST1

PIK3R1

SMO

VCL

BCAR1

DAXX

GSK3B

MAP3K10

MTAP

PIK3R2

SNAI1

VCP

BRAF

DDR2

HRAS

MAP3K11

MTOR

PRKCE

SNAI2

WNT1

BTK

DNMT3A

HSPB8

MAP3K12

MUC4

PTEN

SOS1

ZBTB42

CASP8AP2

DOCK1

HSPD1

MAP3K13

MYC

PTK2

SOS2

ZEB1

CBL

EDNRA

IKBKB

MAP3K14

MYD88

PTPN11

SPRED1

ZEB2

CCND1

EGFR

IKZF1

MAP3K2

MYH9

PTPN3

SQSTM1

CLIP2-BRAF

CCND2

EGR1

IL17A

MAP3K20

NF1

RAC1

SRC

FIP1L1-PDGFRA

CCND3

EGR2

IL1A

MAP3K21

NF2

RAF1

STAT1

KIF5B-ALK

CCR6

EIF4EBP1

IL1RN

MAP3K3

NFE2L2

RALA

STAT3

LMNA-NTRK1

CD79B

EP300

IL6

MAP3K4

NFKB1

RALGDS

STAT5B

MIGA1-BRAF

CDC25A

EPHA6

IRF2BP2

MAP3K5

NFKB2

RASA1

TAB1

PACSIN2-BRAF

CDC42

ERBB2

IRF8

MAP3K6

NFKBIA

RB1

TAB2

RNF11-BRAF

CDKN1A

ERBB3

JAK1

MAP3K7

NLK

RBBP6

TAF1

IRF2BP2-NTRK1

CDKN1B

EXTL3

JAK2

MAP3K8

NOTCH1

RELA

TAOK1

EPHA6-RET

CDKN1C

EZH2

JAK3

MAP3K9

NOTCH2

RET

TAOK2

FAM73A-BRAF

CDKN2A

FBXW7

KIF14

MAP4K1

NR2C2

RHEB

TERT

进一步地，本申请提供了检测上述基因组合的非诊断方法。

进一步地，所述方法包括检测上述基因的全部外显子区域，上述基因在HGMD突变数据库中所有内含子、基因间及上下游区域的致病位点。

进一步地，所述方法为二代测序方法。

另一方面，本申请提供了检测上述基因组合的试剂。

进一步地，所述试剂为二代测序方法所用试剂。

进一步地，所述试剂为Illumina HiSeq PE150所用试剂。

另一方面，本申请提供了上述试剂在制备朗格罕细胞组织细胞增生症预后判断或用药指导试剂盒中的应用。

另一方面，本申请提供了上述基因组合或者方法或者试剂在研究朗格罕细胞组织细胞增生症发病机制中的应用。

另一方面，本申请提供了上述基因组合或者方法或者试剂在筛选朗格罕细胞组织细胞增生症相关突变中的应用。

本申请中的测序方法包括各种已知可以实现上述基因测序的方法，包括但不限于二代测序，如Illumina、Roche、Helicos等平台的测序技术，作为示例，本申请中实际使用并优选Illumina HiSeq PE150。

本发明针对LCH疾病设计，覆盖目前已报道的致病相关基因突变，并涉及多个相关的信号通路，包括MAPK、PI3K、JAK-STAT、NF-κB、Notch、衰老、酪氨酸激酶受体、细胞周期、上皮间质转化等通路，以及MAPK激酶互作分子、血液髓系肿瘤相关等基因。

借助高通量捕获测序技术，测序探针设计覆盖所包含基因的全部外显子区域，还增加了HGMD突变数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）报道的所有内含子、基因间及上下游区域的致病位点，因而进一步增加了基因突变位点的阳性检出率。本发明测序深度达300×，并可一次性检测单核苷酸变异、插入、缺失等多种基因变异，具有快速高效、通量高的优点。

本发明应用于LCH的检测，有助于明确LCH致病的相关基因，进一步研究LCH疾病的发病机制，同时，辅助临床对患者进行精准的分子分型和预后判断，为制定合理的治疗方案、对患者实施精准分子靶向治疗提供重要参考依据。

附图说明

图1为融合基因FNBP1-BRAF序列结构示意图；

图2为Western 杂交检测部分结果图，2A显示FNBP1-BRAF融合基因表达可激活HEK-293T细胞中MAPK通路的ERK激酶活性；2B显示表达FNBP1-BRAF融合蛋白的HEK-293T细胞对靶向药物曲美替尼敏感，而对达拉非尼耐药；

图3为基因组合测序部分结果图：结果显示检测到MAP3K10-A17T突变，基因序列上第49位碱基由鸟嘌呤G突变为腺嘌呤A；

图4为基因组合测序部分结果图：基因组合测序结果显示MAP3K10-R823C突变，基因序列上第2467位碱基由胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T；

图5为Western 杂交检测部分结果图，5A显示MAP3K10-A17T和MAP3K10-R823C突变蛋白表达可激活HEK-293T细胞中MAPK通路的ERK激酶活性；5B显示表达MAP3K10-A17T或MAP3K10-R823C突变蛋白的HEK-293T细胞对靶向药物曲美替尼敏感，而对达拉非尼耐药；

图6为具有不同基因突变的LCH患儿的无进展生存率图，生存率存在显着差异（P =0.029），具有ARAF突变或者同时存在两个及以上突变的患儿组预后最差，明显低于其它组患儿。

具体实施方式

实施例1基本检测方法

1. 建库测序：

（1）DNA样本提取及检测：从检测样本中提取人基因组DNA，并进行DNA样本质量检测，琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解的程度以及是否存在杂带、RNA以及蛋白污染；Qubit 2.0对DNA浓度进行检测，DNA浓度 ≥ 20ng/μL，总量0.1μg以上的DNA样本被用来建库。

（2）文库构建：基因组DNA利用Covaris破碎仪随机打断成长度为180~280bp的片段，经末端修复并加A尾后，在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异index的文库polling后与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将基因上的外显子捕获下来，经PCR扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。

（3）库检：文库构建完成后，先用Qubit 2.0进行初步定量，然后使用Agilent 2100对文库的Insert Size进行检测，符合预期后再使用Q-PCR方法对文库的有效浓度（3nmol/L）进行准确定量，以保证文库质量。

（4）上机测序：库检合格后，根据文库的有效浓度以及数据产出需求进行IlluminaHiSeq PE150测序。PE150（Pair End 150 bp）指高通量双端测序，每端各测150bp。在构建的小片段文库中，Insert DNA，即插入片段是高通量测序直接测序的单位。双端测序是将每条插入片段的两端进行测序的方法。由于插入片段的长度分布已知，双端测序时不仅可以知道片段两端的序列，也能知道这两段序列之间的长度，从而便于后续比对分析。高通量测序平台得到的原始图像数据经过碱基识别（Base Calling）分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），统称为Raw data或Raw reads，并以FASTQ文件格式储存，其中包含测序序列（Reads）的序列信息以及序列对应的质量信息。

2. 生物信息分析流程：

高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列，称之为Raw Data，结果以FASTQ文件格式存储，其中包含测序序列的序列信息以及其对应的测序质量信息。流程分为两个部分：

（1）测序数据质量评估：主要通过对测序错误率、数据量、比对率等进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续的分析，否则需要重新建库或加测。

（2）变异信息挖掘及分析：对测序得到的原始数据（Raw data）进行质控，步骤如下：1）去除序列5’和3’末端低质量碱基；2）丢掉含未检出的碱基（N）占比过多的序列；3）去除序列中的接头碱基，得到高质量的Clean data；然后将Clean data与人参考基因组（版本hg19）序列进行比对分析，采用MEM算法，参数-M，其余参数均使用软件默认参数，获得Bam文件；最后基于Bam文件进行单核苷酸变异/插入或缺失(SNVs/InDel)的检出及注释，从而得到全部突变信息。

（3）体细胞SNVs/Indels变异检测：1）候选体细胞SNVs/Indels变异检测：使用Mutect2软件对Tumor及Normal成对样本进行体细胞突变检测，获得候选SNVs/Indels变异信息。使用ANNOVAR软件同时关联多个数据库（如dbSNP，1000g，ESP6500，HGMD，OMIM等）对上述获得的变异进行注释。2）确定体细胞SNVs/Indels变异：对上一节1）中获得的变异进行二次过滤，保留等位基因频率0.05以上的位点。在ANNOVAR功能注释后，选择在正常人群数据库中罕见的所有变异。二次过滤标准为：纳入统计的reads标准为在突变位点左右20bp内应无mismatch，此外如果突变位点处于reads的两端少于20bp位置时此类reads也不纳入统计；针对非热点，保留满足Alt_T列≥5且Depth_T列≥20 且Ratio_T列≥0.05，且同时满足Alt_N列＜5且Ratio_N列＜0.3的突变位点；针对热点，保留满足Alt_T列≥1且Depth_T列≥20的突变位点；利用IGV软件，针对上述保留的位点再查看其覆盖情况，排除假阳性。

实施例2本发明在223名儿童LCH患者中进行了基因组合检测和应用

1. 样本采集及基因检测

共收集223例LCH患者病灶活检组织或石蜡包埋的未染色切片，包括骨140例、皮肤42例、其它部位组织41例。其中148例患儿的病灶组织采用本发明的基因组合组合Ⅰ（包含162个基因和7个融合基因）进行基因测序，75例患儿的病灶组织和口腔拭子样本（作为对照）采用本发明的基因组合组合Ⅱ（包含229个基因和10个融合基因）进行了基因测序。

（1）从检测样本提取人基因组DNA，并进行DNA样本质量；

（2）基因组DNA随机打断成成长度为180-280bp的片段，制备DNA文库，与生物素标记的探针进行液相杂交，再进行外显子捕获，经PCR扩增后进行文库质检，合格即可进行测序；

（3）根据文库的有效浓度以及数据产出需求进行Illumina HiSeq PE150测序，获得原始测序序列（Raw Data）。

2. 生物信息分析

（1）测序数据质量评估：通过对测序错误率、数据量、比对率等进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则进行后续的分析。

（2）变异信息挖掘及分析：对测序得到的原始数据（Raw data）进行质控，步骤如下：1）去除序列5’和3’末端低质量碱基；2）丢掉含未检出的碱基（N）占比过多的序列；3）去除序列中的接头碱基，得到高质量的Clean data；然后将Clean data与人参考基因组（版本hg19）序列进行比对分析，采用MEM算法，参数-M，其余参数均使用软件默认参数，获得Bam文件；最后基于Bam文件进行SNVs /InDel的检出及注释，从而得到全部突变信息。

（3）体细胞SNVs/Indels变异检测：1）候选体细胞SNVs/Indels变异检测：使用Mutect2软件对Tumor及Normal成对样本进行体细胞突变检测，获得候选SNVs/Indels变异信息。使用ANNOVAR软件同时关联多个数据库（如dbSNP，1000g，ESP6500，HGMD，OMIM等）对上述获得的变异进行注释。2）确定体细胞SNVs/Indels变异：对上一节1）中获得的变异进行二次过滤，保留等位基因频率0.05以上的位点。在ANNOVAR功能注释后，选择在正常人群数据库中罕见的所有变异。二次过滤标准为：纳入统计的reads标准为在突变位点左右20bp内应无mismatch，此外如果突变位点处于reads的两端少于20bp位置时此类reads也不纳入统计；针对非热点，保留满足Alt_T列≥5且Depth_T列≥20 且Ratio_T列≥0.05，且同时满足Alt_N列＜5且Ratio_N列＜0.3的突变位点；针对热点，保留满足Alt_T列≥1且Depth_T列≥20的突变位点；利用IGV软件，针对上述保留的位点再查看其覆盖情况，排除假阳性。

3. 检测结果

（1）进行基因检测的LCH患儿临床特征：

总计223例初治LCH患者采用本发明的基因组合进行了基因测序，其中148例患儿采用基因组合Ⅰ进行基因测序，75例患儿采用基因组合Ⅱ进行基因测序，两组患儿的临床特征和预后无差异，因此，我们将两组患儿合并分析。

223例LCH患者中男孩为131例（58.7%），女孩为92例（41.3%），诊断时中位年龄为3.3岁（范围0.1岁-16.1岁）。临床分型：单系统受累组（SS组）为129例（57.8%），无危险器官受累的多系统组（MS RO—组）为56例（25.1%），有危险器官受累的多系统组即高危组（MS RO＋组）为38例（17.0%）。受累器官以骨（发生率89.7%）最为常见，其它依次为皮肤（17.5%）、肺（13.9%）、垂体（13.0%）、淋巴结（12.6%）、耳部（12.1%）、肝（12.1%）、脾（9.4%）、造血系统（7.6%）、眼部（4.5%）等。

所有患儿的中位随访期为16.1月（范围1.0月-36.2月）。随访期内有55例（24.7%）患儿出现疾病进展或复发；17例（7.6%）患儿发生了后遗症，其中包括15例尿崩症、1例肝硬化和1例矮小症。总体2年无进展生存率（PFS）为66.4%±5.3%。

（2）基因突变检测结果：

在223例进行了基因组合测序的LCH患者中，186例患者（83.4%）中检测到已知的MAPK信号通路相关基因突变，具体检测结果见表3。

最常见基因突变为BRAF-V600E，阳性率为51.6%（115例），其次为MAP2K1突变，阳性率为17.9%（40例）。检测到的MAP2K1突变主要发生于基因2号和3号外显子上的调控和催化核心区域，最常见的为p. Q58_E62del缺失突变（12例，5.4%），其它为多种缺失插入和错义突变，有2例MAP2K1-Q354H突变，发生在10号外显子蛋白激酶催化功能域。

检出的BRAF其它突变有：BRAF-V600D突变（8例，3.6%）；BRAF框内缺失突变（15例，6.7%），框内缺失突变中，最多见的为BRAF p. N486_T491delinsK (7例，3.6%)；其次为BRAF剪接突变p. R506_K507insLLR（4例，1.8%）。此外，还检出ARAF突变5例（2.2%），KRAS突变2例（0.8%）。

同时，在一些患儿中同时存在两种突变，如4例BRAF-V600E阳性患者中同时检测到其它基因突变，包括2例样本同时存在MAP2K1突变，1例为KRAS突变，1例为BRAF-K601Q突变；1例患儿同时存在BRAF p. N486_T491delinsK突变和MAP2K1-T28I突变； 1例患儿中同时检测到两个不同的MAP2K1突变，MAP2K1 p. I103N和p.Y130C突变；1例患儿中同时存在ARAQ347_A348del与p.F351L两种突变。

表3. LCH患者采用基因组合进行基因测序的结果

^a BRAF-V600E突变阳性患儿中，有3例患儿同时存在其它突变，其中一例同时存在BRAF-K601Q突变，一例同时存在MAP2K1-R49C突变，一例同时存在KRAS-G12V突变；^b这一例BRAF-p.486_491del同时存在MAP2K1-p.T28I突变；^c MAP2K1 p. I103N和p.Y130C突变发生在同一个病人中；^d一例患儿中同时存在ARAFp.F351L和ARAFp.347_348delQA突变。

（3）发现新的基因突变：

1）新的融合基因FNBP1-BRAF

在1例LCH患儿（病例LCH-147）的耳后软组织样本，经基因组合Ⅱ测序，发现1种新的融合基因，由位于染色体9q34.11的FNBP1基因和染色体7q34的BRAF基因形成，判断融合连接处是chr9:132666538和chr7:140497728，预测FNBP1基因的1号到12号外显子和BRAF基因的8号到18号外显子可以形成框内融合蛋白，形成的融合蛋白保留了BRAF蛋白激酶结构域；并且通过引物5'AGGCATCATGGTCTACAGAATCT3'（正向、SEQ ID NO.1）和5'ACTTCTCTAGGGATGCCTGC3'（反向、SEQ ID NO.2）进行了Sanger一代测序验证，进一步证实了FNBP1-BRAF的chr9:132666538和chr7:140497728融合位点，连接点为“AAAAT”序列（如图1所示）。

病例LCH-147临床特点：男孩，初诊年龄3个月，因主诉“发现右耳下肿物”入院，在外院行右耳下肿物活组织病理检查，确诊为LCH。入院后完善相关检查，受累器官评估为耳后软组织，临床分型为单系统受累型。由于该患儿年龄小，未给予化疗，目前观察一年，患儿无复发等事件发生，耳后软组织病变较前明显吸收好转。

为了评估FNBP1-BRAF融合基因的生物学功能，首先采用RT-PCR技术，获取FNBP1-BRAF融合转录本的完整编码基因序列片段，引物序列为：正向5’

-ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAGCTGGGGCACCGAGCTCTGGGATC-3’（SEQ IDNO.3），反向5’

-AGTCACTTAAGCTTGGTACCGAGTGGACAGGAAACGCACCATATC-3’

（SEQ ID NO.4）。将目的基因片段与GV141载体（元件：CMV-MCS-3FLAG-SV40-Neomycin，XhoI / KpnI 酶切，购自吉凯基因公司）连接，构建重组FNBP1-BRAF融合表达质粒,并经DNA测序鉴定序列正确。

按转染试剂KeyGenTrans（江苏凯基生物技术股份有限公司, KGD034）的使用说明，将FNBP1-BRAF融合基因表达质粒转染到HEK-293T细胞中，同时分别转染空载体作为阴性对照（Control），转染BRAF-V600E突变基因表达质粒（购自吉凯基因公司）作阳性对照。继续使用含10%胎牛血清（以色列Biological Industries，04-001-1ACS）的DMEM培养基（美国Corning，10-013-CV），在37℃、含5% CO2饱和湿度培养箱中培养，转染48小时后，收集细胞，采用RIPA裂解液（北京普利莱基因技术有限公司，C1053）提取蛋白，在4-12% Bis-Tris蛋白质凝胶（美国Thermo Fisher Scientific，NP0335PK2）电泳、分离蛋白质，转印到硝酸纤维素膜上，并采用以下抗体如抗p44/42 MAPK（ERK1/2）抗体（Proteintech公司，66192-1-Ig）、抗磷酸p44 / 42 MAPK（ERK1/2）抗体（美国CST公司，4370S）、抗α-Tubulin抗体（日本MBL公司，PM054）、抗FLAG抗体（美国Sigma公司，F1804），经Western 杂交检测，结果表明（图2A），FNBP1-BRAF融合蛋白在HEK-293T细胞中成功表达，并且与BRAF-V600E突变蛋白功能相似，FNBP1-BRAF融合蛋白可以激活细胞中MAPK通路的ERK激酶活性（磷酸化p-ERK表达明显增高），因而与LCH致病相关。

为了解表达FNBP1-BRAF融合蛋白的细胞对靶向药物的敏感性，分别将空载体（Control）、BRAF-V600E突变基因表达质粒、FNBP1-BRAF融合基因表达质粒转染到HEK-293T细胞中，培养48h后，再分别加入二甲基亚砜（美国MERCK公司，DMSO，作为阴性对照）、10μM达拉菲尼（美国Abmole公司，M1855）和10μM曲美替尼（美国Abmole公司，M1759），经药物处理48h后，收集细胞，并提取蛋白，进行Western 杂交检测，结果如图2B所示，表达BRAF-V600E突变蛋白的细胞对BRAF抑制剂达拉非尼、MEK激酶抑制剂曲美替尼这两种分子靶向药物均敏感（p-ERK表达均明显下降）；而表达FNBP1-BRAF融合蛋白的细胞仅对曲美替尼敏感（p-ERK表达明显下降），而对达拉非尼耐药（p-ERK表达无明显下降），这些结果为携带这种融合基因的患者应用靶向治疗提供了非常有价值的参考。

2）新的MAP3K10基因突变A17T和R823C

在2例LCH患儿中发现2个新的MAP3K10突变：

在病例LCH-176的右髋臼骨组织样本，经基因组合Ⅱ测序，发现1种新的MAP3K10-A17T突变，如图3所示，基因mRNA序列上第49位碱基由鸟嘌呤G突变为腺嘌呤A（c.49G>A），蛋白第7位氨基酸由丙氨酸A突变为苏氨酸T（p. A17T）。

在病例LCH-162的左侧髋骨组织样本，经基因组合Ⅱ测序，发现另1种新的MAP3K10-R823C突变，如图4所示，基因mRNA序列上第2467位碱基由胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T（c.2467C>T），突变蛋白第823位氨基酸由精氨酸突变为C半胱氨酸（p. R823C）。

有研究报道，在组织细胞疾病Erdheim-Chester病中曾发现MAP3K10-G677S突变，与我们发现的这两个突变位点不同，并且其致病意义尚未明确（Durham等, NatureMedicine 2019, 25 (12): 1839-1842.），在LCH中没有发现MAP3K10突变的相关报道。

患者临床特点：

病例LCH-176：女孩，初诊年龄6.6岁，因主诉“右髋疼痛2月”入院，行右侧髋臼活组织病理和免疫组织化学检查，结果为：CD1a（+），CD207（+），因此确诊为LCH。入院后完善相关检查，受累器官评估为左桡骨、右髂骨、右股骨颈，临床分型为单系统受累型（多发骨受累）。予以一线化疗（长春地辛、强的松治疗12周）及维持治疗（长春地辛、强的松治疗），病情好转，总疗程半年后停药，目前无复发等事件发生。

病例LCH-162：女孩，初诊年龄5.6岁，因主诉“左腿跛行3月余”入院，行左侧髋臼活组织病理检查，结果为：CD1a（+），CD207（+），因此确诊为LCH。入院后完善相关检查，受累器官评估为左侧髂骨、T6椎体及其附件，临床分型为单系统受累型（多发骨受累）。予以一线化疗（长春地辛、强的松治疗12周）及维持治疗（长春地辛、强的松及6-巯基嘌呤治疗），病情好转，总疗程1年后停药，目前无复发等事件发生。

为了研究MAP3K10基因突变的生物学功能，首先采用RT-PCR技术，分别获取MAP3K10-A17T和MAP3K10-R823C突变转录本的完整编码基因序列片段，引物序列分别为：MAP3K10-A17T：正向5’

-ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGGAGGAGGAGGGGGCGGTGGCC-3’

（SEQ ID NO.5），反向5’

- AGTCACTTAAGCTTGGTACCGAGTGGGAGCCGTGGGCCCCGCACAGGGGCACTGTG -3’

（SEQ ID NO.6）；MAP3K10-R823C：正向5’

-ACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGGAGGAGGAGGGGGCGGTGGCC-3’ （SEQ IDNO.7），反向5’

-AGTCACTTAAGCTTGGTACCGAGTGGGAGCCGTGGGCCCCGCACAGGGGCACTGTG-3’ （SEQ IDNO.8）。将目的基因片段分别与GV141载体（元件：CMV-MCS-3FLAG-SV40-Neomycin，XhoI /KpnI 酶切，购自吉凯基因公司）连接，构建重组MAP3K10-A17T和MAP3K10-R823C突变表达质粒，并经DNA测序鉴定序列正确。

按转染试剂KeyGenTrans的使用说明，分别将MAP3K10-A17T和MAP3K10-R823C突变表达质粒转染到HEK-293T细胞中，同时转染空载体作为阴性对照（Control），转染BRAF-V600E突变基因表达质粒作阳性对照。转染48小时后，收集细胞，提取蛋白，经Western 杂交检测，结果表明（图5A），MAP3K10-A17T和MAP3K10-R823C突变蛋白在HEK-293T细胞中成功表达，与对照阴性相比，2种MAP3K10突变蛋白及BRAF-V600E突变蛋白都可以激活细胞中MAPK通路的ERK激酶活性（磷酸化p-ERK表达明显增高），因而与LCH致病相关。

为了解表达FNBP1-BRAF融合蛋白的细胞对靶向药物的敏感性，分别将MAP3K10-A17T、MAP3K10-R823C突变表达质粒转染到HEK-293T细胞中，培养48h后，再分别加入DMSO（作为阴性对照）、10μM达拉菲尼或10μM曲美替尼，经药物处理48h后，收集细胞，并提取蛋白，进行Western 杂交检测，结果如图5B所示，表达MAP3K10-A17T或MAP3K10-R823C突变蛋白的细胞，仅对曲美替尼敏感（p-ERK表达明显下降），而对达拉非尼耐药（p-ERK表达无明显下降），这些结果为携带这两种突变患者应用靶向治疗提供了非常有价值的参考。

新的FNBP1-BRAF融合基因和MAP3K10-A17T、MAP3K10-R823C突变的检出过程，是样本经基因组合测序，得到的数据进行质控、注释，再根据测序深度等指标经过二次过滤，除去等位基因频率（VAF）极低的非热点突变位点，保留了VAF>0.05的可靠突变位点；重要的是，分析过程中将检出的基因突变经正常人群数据库包括千人基因组数据库（1000Genomes）、外显子组整合数据库（ExAC）、GenomAD数据库进行比对，排除了正常人群中可能存在的SNP位点，最后筛选出在正常人群中罕见的变异（频率<0.01）。

FNBP1-BRAF融合基因在病例LCH-147的病灶样本中检出的VAF为0.25，并且在上述正常人群数据库中均无检出。该融合基因形成的融合蛋白保留了BRAF蛋白激酶结构域和相关生物学功能。MAP3K10-A17T突变在病例LCH-176的病灶样本中检出的VAF为0.19，并且在上述正常数据库中均未检出正常人携带，属于稀有变异。该突变位于MAP3K10蛋白的SH3结构域，可能通过影响蛋白间的相互作用发挥生物学功能。MAP3K10-R823C突变在病例LCH-162的病灶样本中检出的VAF为0.11，并且在千人基因组数据库（1000 Genomes）、GenomAD数据库中均未检出正常人携带，仅在ExAC数据库_EAS东亚人群中的检出频率为0.0022，低于0.01，属于正常人群中罕见的变异。该突变位于MAP3K10蛋白的功能域及相关功能目前尚不清楚。我们经细胞学功能试验证明，FNBP1-BRAF融合基因、MAP3K10-A17T突变、MAP3K10-R823C突变产生的突变蛋白均可以激活细胞中MAPK通路的ERK激酶活性，并对MEK激酶抑制剂曲美替尼敏感，因此认为这些变异是具有生物学功能的罕见有害变异，随着未来阳性检出病例数的增多，将进一步明确这些变异的临床意义和生物学功能。

（4）基因突变与LCH患者临床分型、预后的相关性

如表4所示，将患者按检出的基因突变分为6组，分别为BRAF-V600E阳性组、BRAF其它突变、MAP2K1突变、ARAF突变、两种及以上基因突变、其它/未知突变，采用Fisher精确检验方法，分析不同类型的基因突变与LCH患者临床分型、治疗反应和预后的相关性（以统计学P值小于0.05为有统计学差异）。

结果显示：基因突变类型与LCH患者的受累部位包括皮肤、肝、脾、中枢神经系统、耳部、中枢神经系统危险器官受累明显相关，在有危险器官（肝、脾、骨髓）受累（高危型）患者中，BRAF-V600E突变阳性率（84.2%）明显高于无危险器官受累（低危型）患者（42.7%，P<0.001）；皮肤受累的患儿中，BRAF-V600E突变阳性率（71.8%）明显高于无皮肤受累患儿（45.1%，P=0.014）；中枢神经系统危险器官受累的患儿中，BRAF-V600E突变阳性率更高（61.4%，P=0.006）。发生出现进展/复发的患儿中，ARAF突变、两种及以上基因突变的频率较高（P=0.049）。

我们进一步分析了基因突变与LCH患儿预后的相关性。结果显示（图6），具有不同基因突变LCH患儿的预后存在显着差异，2年无进展生存率分别为：BRAF-V600E 70.9±5.3%，BRAF其他突变 87.8%±6.6%，MAP2K1突变 57.9%±17.7%，ARAF突变 25.0%±21.7%，两个及以上突变 31.3%±23.7%，其它/未知突变 66.5%±8.6%（P = 0.029）；具有ARAF突变或者同时存在两个及以上突变的患儿组预后最差，明显低于其它组患儿。

多因素分析（表5）结果显示，诊断时年龄、ARAF突变、同时具有两个及以上基因突变是影响儿童LCH无进展生存的独立预后因素（ARAF突变：风险比4.250，P=0.019；两个及以上突变：风险比3.531， P=0.017；诊断时年龄< 3岁：风险比：2.437，P=0.003）。

（5）基因突变检测结果对LCH患者实施精准靶向治疗的指导意义

根据本发明检测LCH患者基因突变的结果，对于患者实施精准分层治疗、分子靶向治疗具有重要的指导价值。LCH目前主要采用以泼尼松与长春碱类联合应用作为一线化疗方案，对复发或无效的患者可采用克拉屈滨和/或阿糖胞苷为主的二线化疗方案，但因毒副作用较大，病情重或婴幼儿难以耐受；近年来，BRAF抑制剂如达拉非尼、维罗非尼、MEK激酶抑制剂如曲美替尼等分子靶向药物被尝试用于治疗复发或难治性LCH患者，显示出良好的治疗反应和安全性。

在这223例儿童LCH患者中，对24例BRAF-V600E突变阳性的高危型患者直接采用了BRAF抑制剂达拉非尼的靶向治疗，对9例BRAF-V600E突变阳性的难治性患儿在一线或二线治疗出现进展或复发后，也给予达拉非尼的靶向治疗；对2例具有BRAF-V600D突变和1例BRAF p.V600delinsDATV突变的难治/复发LCH患儿，给予了达拉非尼的靶向治疗；3例MAP2K1突变阳性的高危型/复发LCH患者采用MEK激酶抑制剂曲美替尼进行了靶向治疗。这些靶向治疗的患儿均获得了较好的短期疗效，靶向治疗1月和3月的反应率分别达到81.6%和76.3%，短期治疗反应良好，且未发生3级及以上严重的不良反应，安全性良好。

（6）基因组合检出的其它基因突变

在采用本基因组合进行基因测序的223例LCH患者中，除外上述分析的已知MAPK信号通路基因突变和新发现已验证的致病基因突变，还检测出一些在正常人群中罕见的、与LCH相关的基因突变。在采用基因组合Ⅰ进行基因测序的148例LCH患儿中，检出38种基因、123个位点的基因突变；在采用基因组合Ⅱ进行基因测序的75例LCH患儿中，检出85种基因、212个位点的基因突变（表6）。与组合Ⅰ相比，组合Ⅱ新增的67个检测基因中，新检出22种基因、88个位点的基因突变（表6中深色条目），显示出组合Ⅱ较组合I检出的基因突变更为全面。

这些检出的突变基因涉及多个相关的信号通路，包括PI3K、JAK-STAT、NF-κB、Notch、衰老、酪氨酸激酶受体、细胞周期、上皮间质转化通路，以及MAPK激酶互作分子、血液髓系肿瘤相关基因，在既往的文献报道中已证明这些通路在白血病、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌等多种血液及实体肿瘤的发生、发展中起重要作用。由于LCH疾病的罕见性和极大异质性，虽然目前这些基因突变在LCH发病中的具体作用和分子机制尚未清楚；但是，目前的研究显示，仍有15-20%左右的LCH患者中并未发现已知的MAPK通路基因突变、发病机制不明，同时，BRAF-V600E、MAP2K1等已知致病突变阳性的LCH患儿，他们的临床表现和预后仍存在较大的差异,这些都提示其它基因突变对LCH的发病及预后也产生重要影响。因此，采用本基因组合，进一步筛选这些LCH中存在的基因突变，为进一步深入LCH发病机制研究和临床治疗及应用提供了极其重要的线索和依据，因而具有重要的临床价值和应用前景。

表5. 多因素分析影响儿童LCH无进展生存的预后因素

表6采用基因组合Ⅰ进行基因测序的148例LCH患儿中，检出38种基因、123个位点的其它基因突变；采用基因组合Ⅱ进行基因测序的75例LCH患儿中，检出85种基因、212个位点的基因突变

序列表

<110> 首都医科大学附属北京儿童医院

<120> 检测朗格罕细胞组织细胞增生症的基因组合及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

aggcatcatg gtctacagaa tct 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

acttctctag ggatgcctgc 20

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

acgggccctc tagactcgag cgccaccatg agctggggca ccgagctctg ggatc 55

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

agtcacttaa gcttggtacc gagtggacag gaaacgcacc atatc 45

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

acgggccctc tagactcgag cgccaccatg gaggaggagg agggggcggt ggcc 54

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

agtcacttaa gcttggtacc gagtgggagc cgtgggcccc gcacaggggc actgtg 56

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

acgggccctc tagactcgag cgccaccatg gaggaggagg agggggcggt ggcc 54

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

agtcacttaa gcttggtacc gagtgggagc cgtgggcccc gcacaggggc actgtg 56

Claims (10)

1.检测朗格罕细胞组织细胞增生症的基因组合，其特征在于，所述基因组合包含如下基因：

AKT1 CTBP1 GSK3A MAP2K6 MAPK14 PAK2 RORC TP53 ALK CTBP2 GSK3B MAP2K7 MAPK3 PDGFRA ROS1 TSC1 APC CXCL8 HRAS MAP3K1 MAPK7 PDK1 SIRT1 TSC2 ARAF DDR2 IKBKB MAP3K10 MAPK8 PICK1 SMAD2 TWIST1 ARHGAP1 DOCK1 IKZF1 MAP3K11 MAPK9 PIK3CA SMAD3 VCL ATM EDNRA IL17A MAP3K12 MAPKAPK2 PIK3CB SMAD4 WNT1 ATR EGFR IL1A MAP3K13 MDM2 PIK3CD SMO ZEB1 BCAR1 EIF4EBP1 IL1RN MAP3K14 MET PIK3CG SNAI1 ZEB2 BRAF EPHA6 IL6 MAP3K2 MIGA1 PIK3R1 SNAI2 CLIP2-BRAF CASP8AP2 ERBB2 JAK1 MAP3K20 MST1 PIK3R2 SOS1 FIP1L1-PDGFRA CDC25A ERBB3 JAK2 MAP3K21 MTOR PTEN SOS2 KIF5B-ALK CDC42 EZH2 JAK3 MAP3K3 NF2 PTK2 SQSTM1 LMNA-NTRK1 CDKN1A FGFR1 KIF5B MAP3K4 NFKB1 RAF1 SRC MIGA1-BRAF CDKN1B FGFR2 KIT MAP3K5 NFKB2 RALA STAT3 PACSIN2-BRAF CDKN2A FIP1L1 KMT2D MAP3K6 NFKBIA RALGDS STAT5B RNF11-BRAF CDKN2B FOXO1 KRAS MAP3K7 NLK RASA1 TAB1 CHEK1 FOXO3 LMNA MAP3K8 NOTCH1 RB1 TAB2 CHEK2 GATA4 MAP2K1 MAP3K9 NR2C2 RET TAOK1 CLIP2 GCK MAP2K2 MAP4K1 NRAS RHEB TAOK2 CREBBP GNA11 MAP2K3 MAP4K4 NTRK1 RHOA TGFB1 CRK GNAQ MAP2K4 MAPK1 PACSIN2 RNF11 TGFBR1 CSHL1 GRB2 MAP2K5 MAPK10 PAK1 ROCK1 TNF

。

2.根据权利要求1所述的基因组合，其中所述基因组合包含如下基因：

AKT1 CDKN2B FGFR1 KIF5B MAP4K4 NR4A2 RHOA TET2 ALK CHEK1 FGFR2 KIT MAPK1 NRAS RIPK1 TGFB1 ANK3 CHEK2 FIP1L1 KLLN MAPK10 NTRK1 RNF11 TGFBR1 APC CLIP2 FLT3 KMT2D MAPK14 PACSIN2 ROCK1 TNF ARAF CREBBP FOXO1 KRAS MAPK3 PAK1 RORC TNFAIP3 ARHGAP1 CRK FOXO3 LMNA MAPK7 PAK2 ROS1 TP53 ARID1A CSF1R GAB1 MAP2K1 MAPK8 PDGFRA SETD2 TRIM28 ARID1B CSF3R GATA3 MAP2K2 MAPK9 PDK1 SF3B1 TSC1 ARID2 CSHL1 GATA4 MAP2K3 MAPKAPK2 PICK1 SH2D2A TSC2 ATM CTBP1 GCK MAP2K4 MDM2 PIK3CA SIRT1 TWIST1 ATR CTBP2 GNA11 MAP2K5 MET PIK3CB SMAD2 ULK1 B2M CTNNA1 GNAQ MAP2K6 MIGA1 PIK3CD SMAD3 USP8 B9D2 CXCL8 GRB2 MAP2K7 MKNK1 PIK3CG SMAD4 VCAN BAG3 CYFIP2 GSK3A MAP3K1 MST1 PIK3R1 SMO VCL BCAR1 DAXX GSK3B MAP3K10 MTAP PIK3R2 SNAI1 VCP BRAF DDR2 HRAS MAP3K11 MTOR PRKCE SNAI2 WNT1 BTK DNMT3A HSPB8 MAP3K12 MUC4 PTEN SOS1 ZBTB42 CASP8AP2 DOCK1 HSPD1 MAP3K13 MYC PTK2 SOS2 ZEB1 CBL EDNRA IKBKB MAP3K14 MYD88 PTPN11 SPRED1 ZEB2 CCND1 EGFR IKZF1 MAP3K2 MYH9 PTPN3 SQSTM1 CLIP2-BRAF CCND2 EGR1 IL17A MAP3K20 NF1 RAC1 SRC FIP1L1-PDGFRA CCND3 EGR2 IL1A MAP3K21 NF2 RAF1 STAT1 KIF5B-ALK CCR6 EIF4EBP1 IL1RN MAP3K3 NFE2L2 RALA STAT3 LMNA-NTRK1 CD79B EP300 IL6 MAP3K4 NFKB1 RALGDS STAT5B MIGA1-BRAF CDC25A EPHA6 IRF2BP2 MAP3K5 NFKB2 RASA1 TAB1 PACSIN2-BRAF CDC42 ERBB2 IRF8 MAP3K6 NFKBIA RB1 TAB2 RNF11-BRAF CDKN1A ERBB3 JAK1 MAP3K7 NLK RBBP6 TAF1 IRF2BP2-NTRK1 CDKN1B EXTL3 JAK2 MAP3K8 NOTCH1 RELA TAOK1 EPHA6-RET CDKN1C EZH2 JAK3 MAP3K9 NOTCH2 RET TAOK2 FAM73A-BRAF CDKN2A FBXW7 KIF14 MAP4K1 NR2C2 RHEB TERT

。

3.检测如权利要求1或2所述的基因组合的非诊断方法。

4.根据权利要求3所述的方法，其包括检测基因组合中基因的全部外显子区域，在HGMD突变数据库中所有内含子、基因间及上下游区域的致病位点。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其为二代测序方法。

6.用于检测如权利要求1或2所述的基因组合的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂，其为二代测序方法所用试剂。

8.根据权利要求6或7所述的试剂在制备朗格罕细胞组织细胞增生症预后判断或用药指导试剂盒中的应用。

9.根据权利要求1或2所述的基因组合、根据权利要求3-5任一项所述的方法或者根据权利要求6或7所述的试剂在研究朗格罕细胞组织细胞增生症发病机制中的应用。

10.根据权利要求1或2所述的基因组合、根据权利要求3-5任一项所述的方法或者根据权利要求6或7所述的试剂在筛选朗格罕细胞组织细胞增生症相关突变中的应用。

Images