CN105018495B - 肝癌中环状rna-met基因及其制备方法和荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌中环状RNA‑MET基因及其表达方法和荧光定量PCR检测方法，该肝癌中环状RNA‑MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法测定出来了环状RNA‑MET的准确的环化位点；确定了MET基因客观存在一种由1214个核苷酸组成的环状RNA。本发明通过肝癌中环状RNA‑MET基因的荧光定量PCR检测方法；能够特异性检测肝癌细胞和肝癌临床组织标本中的环状RNA‑MET的存在及表达性差异；本发明可以为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肝癌中环状RNA-MET基因及其制备方法和荧光定量PCR检测方法；为肝癌的早期诊断和分类提供基础。
背景技术
生物体内的环状RNA(circRNA)是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有明确，目前只有几种假定的说法1)环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能2)circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平3)circRNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性4)circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。
MET基因又叫HGFR(hepatocyte growth factor,HGF),肝脏细胞生长因子受体，其作用是促进肝脏细胞及一些内皮细胞的分裂生长，在肝癌的发生发展过程中具有重要作用。通过环状RNA专门数据库(http://circrna.org/)检索发现MET基因的RNA存在环化现象；然而，目前在这一领域并没有更深入的研究。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因，从肝癌细胞中PCR扩增环状的RNA-MET，通过克隆测序的方法准确确定了环状RNA-MET环化位点。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
肝癌中环状RNA-MET基因，该肝癌中环状RNA-MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
进一步的，上述方案中，PCR扩增所述肝癌中环状RNA-MET基因的引物为：
上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'。
肝癌中环状RNA-MET蛋白，该肝癌中环状RNA-MET蛋白结构为SEQ ID NO:1所示的1214个核苷酸首尾相接形成环状的分子。
本发明的另一目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因的制备方法，通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法测定出来了环状RNA-MET的准确的环化位点；确定了MET基因客观存在一种由1214个核苷酸组成的环状RNA。具体方案如下：
肝癌中环状RNA-MET基因的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)提取细胞或组织中的总RNA：提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA；
2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；
3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
4)引物设计及PCR扩增克隆测序
设计PCR扩增引物，引物序列为MET-F:5'CCAGATTCTGC CGAACCAATG 3'，MET-R1:5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；选取β-actin基因为内参基因，作为荧光定量结果数据的矫正基因，上下游引物序列如下：β-actin F:5'GCATGGGTCA GAAGGATTCCT 3'，β-actin R:5'TCGTCCCAGTTGGTGACGA T 3'；然后用PCR扩增环状RNA-MET，电泳检测PCR产物，将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，然后DNA测序鉴定；用上述引物进行PCR反应，反应完取PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克隆做DNA测序鉴定，PCR产物克隆测序显示RNA-MET的第二个外显子1214bp通过首尾相连发生了环化，即cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的环状RNA-MET基因。
进一步的，上述制备方法所述的步骤1)中具体按照以下步骤提取总RNA：
(a)肝癌组织取2mg大小的组织块，组织用液氮研磨至粉碎，转移到1.5ml离心管，加入1ml trizol；肝癌细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol；
(b)加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；
(c)4℃下，12,000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
(d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
(e)4℃下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
(f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；
(g)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。
进一步的，上述制备方法所述的步骤2)中的反应液总体积为20μL，由如下组分组成：
步骤1)提取的提取的总RNA在上述反应液中于37℃消化30min后，加入0.5μlEDTA，65℃灭活10min。
进一步的，上述制备方法所述的步骤3)中逆转录的PCR体系为：
反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。
进一步的，上述制备方法所述的步骤4)中PCR扩增环状RNA-MET反应体系为：2×PCR MIX 15μL，10mM上下游引物各1.5μL，HepG2肝癌细胞cDNA模板1μL，用灭菌水补足30μL体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃15s变性，60℃30s退火，72℃延伸30s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存。
进一步的，上述制备方法所述的步骤4)中用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中连接体系是：PCR产物4μL，TA载体1μL，T4连接酶1μL，10XT4buffer 1μL，无菌水3μL,16℃反应30min。
本发明的第三个目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因的荧光定量PCR检测方法；能够特异性检测肝癌细胞和肝癌临床组织标本中的环状RNA-MET的存在及表达性差异；本发明可以为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。
肝癌中环状RNA-MET基因的荧光定量检测方法，该荧光定量检测方法包括以下步骤：
1)提取总RNA：提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA；
2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；
3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
4)采用荧光定量反应Real-time PCR试剂盒，配置反应体系，对正常肝脏细胞和肝癌组织标本进行检测；具体检测反应体系如下：
其中，上下游引物分别为：
上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；
cDNA为权利要求4-9任一项所述的步骤3)的cDNA；
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃-95℃收集荧光信号然后进行融解曲线分析。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法测定出来了环状RNA-MET的准确的环化位点；确定了MET基因客观存在一种由1214个核苷酸组成的环状RNA；
2.本发明通过荧光定量PCR检测正常肝细胞和肝癌细胞结果显示在肝癌细胞中环状RNA-MET明显增高；通过检测癌症患者的癌组织和癌旁组织，发现在对应的癌组织中环状RNA-MET表达明显高于癌旁组织；荧光定量结果显示环状RNA-MET的表达量和肝癌有密切关联；
3.本发明中设计的检测环状RNA的引物检测环状RNA-MET的特异性高，能够特异性检测肝癌细胞和肝癌临床组织标本中的环状RNA-MET的存在及表达性差异；
4.本发明可以为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明的实施例1中PCR扩增的环状RNA-MET琼脂糖电泳图，其中M：Marker2000，扩增的cir-MET跨越接口的部分序列为250bp；
图2为本发明的实施例1的环状RNA-MET DNA序列测定峰图结果图；
图3为本发明的环状RNA-MET扩增融解曲线横坐标代表融解温度，纵坐标代表相对荧光值；
图4应用实施例1肝癌细胞标本荧光定量检测结果横坐标代表各个细胞系，纵坐标代表环状RNA-MET在各个细胞中的表达差异；
图5为引用实施例2肝癌临床组织标本荧光定量检测结果横坐标代表各个组织标本，纵坐标代表环状RNA-MET在各个组织中的表达差异，C为癌组织，NC为癌旁组织。
具体实施方式
肝癌中环状RNA-MET基因，其特征在于，该肝癌中环状RNA-MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步的，上述方案中，PCR扩增所述肝癌中环状RNA-MET基因的引物为：
上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'。
肝癌中环状RNA-MET蛋白，该肝癌中环状RNA-MET蛋白结构为SEQ ID NO:1所示的1214个核苷酸首尾相接形成环状的分子。
本发明的另一目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因的制备方法，通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法测定出来了环状RNA-MET的准确的环化位点；确定了MET基因客观存在一种由1214个核苷酸组成的环状RNA。具体方案如下：
肝癌中环状RNA-MET基因的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)提取细胞和组织中的总RNA：提取肝癌细胞和肝癌组织中的总RNA；
2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；
3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
4)引物设计及PCR扩增克隆测序
设计PCR扩增引物，引物序列为MET-F:5'CCAGATTCTGC CGAACCAATG 3'，MET-R1:5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；选取β-actin基因为内参基因，作为荧光定量结果数据的矫正基因，序列如下：β-actin F:5'GC ATGGGTCAGAAGGATTCCT 3'，β-actin R:5'TCGTCCCAGTTGGTGACGA T 3'；然后用PCR扩增环状RNA-MET，电泳检测PCR产物，将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，然后DNA测序鉴定；用上述引物进行PCR反应，反应完取PCR产物电泳；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中，再将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克隆做DNA测序鉴定，PCR产物克隆测序显示RNA-MET的第二个外显子1214bp通过首尾相连发生了环化，即cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的环状RNA-MET基因。
进一步的，上述制备方法所述的步骤1)中具体按照以下步骤提取总RNA：
(a)肝癌组织取2mg大小的组织块，组织用液氮研磨至粉碎，转移到1.5ml离心管，加入1ml trizol；肝癌细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol；
(b)加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；
(c)4℃下，12000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
(d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
(e)4℃下，12000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
(f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，弃去上清；
(g)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。
进一步的，上述制备方法所述的步骤2)中的反应液总体积为20μL，由如下组分组成：
步骤1)提取的提取的总RNA在上述反应液中于37℃消化30min后，加入0.5μlEDTA，65℃灭活10min。
进一步的，上述制备方法所述的步骤3)中逆转录的PCR体系为：
反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。
进一步的，上述制备方法所述的步骤4)中PCR扩增环状RNA-MET反应体系为：2×PCR MIX 15μL，10mM上下游引物各1.5μL，HepG2肝癌细胞cDNA模板1μL，用灭菌水补足30μL体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃15s变性，60℃30s退火，72℃延伸30s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存。
进一步的，上述制备方法所述的步骤4)中用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中连接体系是：PCR产物4μL，TA载体1μL，T4连接酶1μL，10XT4 buffer 1μL，无菌水3μL,16℃反应30min。
本发明的第三个目的在于提供一种肝癌中环状RNA-MET基因的荧光定量PCR检测方法；能够特异性检测肝癌细胞和肝癌临床组织标本中的环状RNA-MET的存在及表达性差异；本发明可以为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。
肝癌中环状RNA-MET基因的荧光定量检测方法，该荧光定量检测方法包括以下步骤：
1)提取总RNA：提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA；
2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；
3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
4)采用荧光定量反应Real-time PCR试剂盒，配置反应体系，对正常肝脏细胞和肝癌组织标本进行检测；具体检测反应体系如下：
其中，上下游引物分别为：
上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃-95℃收集荧光信号然后进行融解曲线分析。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所用到的试剂和材料均可以通过市场购买渠道获得；其中提取细胞和组织中的总RNA所用的试剂盒为Life technologies公司生产的Reagent试剂盒；除去提取的RNA中残留的基因组DNA所用的DNase I试剂为全式金公司生产；逆转录试剂盒为Vazyme公司所生产的试剂盒；荧光定量反应试剂盒为Vazyme公司生产的Real-time PCR试剂盒。
实施例1
肝癌中环状RNA-MET基因的制备方法，包括以下步骤
1)提取细胞和组织中的总RNA，按照Reagent试剂操作说明书提取肝癌细胞和肝癌组织中的总RNA；提取详细步骤为:
a)肝癌组织取2mg大小的组织块，组织用液氮研磨至粉碎，转移到1.5ml离心管，加入1ml trizol；肝癌细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol；
b)加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；
c)4℃下，12000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
e)4℃下，12000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；
g)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀；
2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA
使用RNase-free的DNase I(全式金公司)，按照说明书配置反应液如下：
然后将上述提取的总RNA于反应液中37℃消化30min，之后加入0.5μl EDTA，65℃灭活10min。
3)将RNA逆转录成cDNA
按照Vazyme公司生产的逆转录试剂盒的操作说明书在PCR管中加入PCR反应体系：
反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。
4)引物设计及PCR扩增克隆测序
根据环状RNA-MET基因(登录号：hsa_circ_0082002)序列设计PCR扩增引物，上游引物为:5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'(SEQ ID NO:2)，下游引物为：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA3'(SEQ ID NO:3)，选取β-actin基因为内参基因，作为荧光定量结果数据的矫正基因，序列如下：β-actin F:5'GCATGGGTCAGAAGGATTCCT3'(SEQ ID NO:4)，β-actin R:5'TCGTCCCAGTTGGTGACGAT3'(SEQ ID NO:5)；然后用PCR扩增环状RNA-MET，PCR扩增反应体系：PCR为30μL总体系为：Vazyme公司生产的2×PCR MIX 15μL，10mM上、下游引物各1.5μL，HepG2肝癌细胞cDNA模板1μL，用灭菌水补足30μL体系；反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃15s变性，60℃30s退火，72℃延伸30s,共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸7min，然后16℃保存；用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将PCR产物克隆到TAKARA公司生产的PMD18-TA克隆载体中，然后DNA测序鉴定；PCR反应完后取3μL PCR产物进行2％琼脂糖电泳结果参见图1；将PCR产物切胶回收，使用胶回收试剂盒回收纯化，然后用T4连接酶将目标片段连接到PMD18-TA克隆载体中，具体连接体系是：PCR产物4μL，TA载体1μL，T4连接酶1μL，10XT4buffer 1μL，无菌水3μL，16℃反应30min，然后将产物转化到DH5a大肠杆菌，过夜培养；第二天挑取单克隆做DNA测序鉴定，结果参考图2；PCR产物克隆测序显示RNA-MET的第二个外显子1214bp通过首尾相连发生了环化，RNA-MET具体环化的序列为SEQ IDNO:1表示的全长序列为1214个核苷酸组成的环状RNA-MET。
应用实施例1
按照Vazyme公司生产的荧光定量反应试剂盒Real-time PCR的说明书配置反应体系，对1株正常肝脏细胞LO2细胞和肝癌细胞HepG2、SMCC7721、MHCC-97H进行荧光定量检测，步骤如下：
采用荧光定量反应Real-time PCR试剂盒，配置反应体系，对正常肝脏细胞和肝癌组织标本进行检测；具体检测反应体系如下：
其中，上下游引物分别为：
上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；
cDNA为实施例1步骤3)的cDNA；
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃-95℃收集荧光信号然后进行融解曲线分析；检测结果见图3和图4。
图3的结果显示，检测环状RNA-MET引物检测出来的融解曲线峰图单一，说明引物非常理想；图4的结果表明在肝癌细胞中环状RNA-MET明显增高；在高转移癌细胞株MHCC-97H中表达最高。
应用实施例2
按照Vazyme公司生产的荧光定量反应试剂盒Real-time PCR的说明书配置反应体系，对1株正常肝脏细胞LO2细胞和肝癌细胞HepG2、SMCC7721、MHCC-97H进行荧光定量检测，步骤如下：
采用荧光定量反应Real-time PCR试剂盒，配置反应体系，对10对肝癌组织标本进行检测进行检测；具体检测反应体系如下：
其中，上下游引物分别为：
上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；
cDNA为实施例1步骤3)的cDNA；
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃-95℃收集荧光信号然后进行融解曲线分析；检测结果见图3和图5。
图5的记过显示，通过检测10个癌症患者的癌组织(C)和癌旁组织(NC)，发现在对应的癌组织中环状RNA-MET表达明显高于癌旁组织；荧光定量结果显示环状RNA-MET的表达量和肝癌有密切关联。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (1)
1.肝癌中环状RNA-MET基因的非诊断性荧光定量检测方法，其特征在于，该荧光定量检测方法包括以下步骤：
1)提取总RNA：提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA，具体操作如下：
(a)肝癌组织取2mg大小的组织块，组织用液氮研磨至粉碎，转移到1.5ml离心管，加入1ml trizol；肝癌细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol；
(b)加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；
(c)4℃下，12,000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
(d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
(e)4℃下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
(f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；
(g)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀；
2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，于37℃消化30min后，加入0.5μl EDTA，65℃灭活10min除去残留的基因组DNA；
3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
逆转录的PCR体系为：
反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min；
4)采用荧光定量反应Real-time PCR试剂盒，配置反应体系，对正常肝脏细胞和肝癌组织标本进行检测；具体检测反应体系如下：
其中，上下游引物分别为：
上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'
下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃-95℃收集荧光信号然后进行融解曲线分析。
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