CN115819602A - 一种针对细胞具有调节增殖和凋亡效果的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对细胞具有调节增殖和凋亡效果的药物组合物及其应用。本发明以重组人DNMT1蛋白作为免疫原通过免疫Balb/c小鼠制备并获得相应的杂交瘤细胞，通过筛选，获得了特异性抑制DNMT1活性的单克隆抗体7F23，所述抗体能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖以及细胞凋亡，具有治疗癌症的效果。

Description

一种针对细胞具有调节增殖和凋亡效果的药物组合物及其 应用

技术领域

本申请涉及生物领域，具体的涉及一种针对细胞具有调节增殖和凋亡效果的药物组合物及其应用。

背景技术

DNA甲基化可以调控基因转录，从而影响基因表达水平，是表观遗传学研究最清楚、也是最重要的形式之一，在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面都发挥着重要作用，因而日益成为分子生物学研究的热点之一。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化完成的，主要包括DNMT1，DNMT2和DNMT3。研究表明，DNA甲基转移酶(DNMTs)缺陷而引起的基因表观遗传改变往往伴随着肿瘤的发生和发展。

DNMT1是第一个被克隆出来的DNA甲基转移酶。它由N-端的调节区，C-端的催化区组成，该酶的催化能力需要N-端和C-端的相互作用。但也有研究表明，DNMT1的半胱氨酸富集区可与未甲基化的CpG岛作用。这说明除了催化区域外，DNMT1的其他结构域与酶的活性有重要关系。DNMT1可以维持基因组中的全部甲基化。一般认为，它主要负责在DNA复制的过程中保持原来的DNA甲基化状态。也就是说母链模板上某个位置的胞嘧啶被甲基化，在DNA复制时，DNMT1就会识别这种半甲基化，催化子链相应位置的胞嘧啶发生甲基化。DNMT3A和DNMT3B都是由N-端的调节区，C-端的催化区组成，其C-端不需要与N-端相互作用就可以有催化活性，有很强的重新甲基化能力也具有保持甲基化的能力。最近一项研究发现，小鼠生殖细胞中存在新的DNA甲基转移酶DNMT3C。DNMT3C表现出与DNMT3B的高度一致性，并且专攻新的逆转录转座子的甲基化。除上述对哺乳动物的DNA甲基化必不可少的酶外，DNMT家族还包括另外两个成员，DNMT2和DNMT3L。DNMT3L没有催化活性，起调控作用，以DNMT3L-DNMT3A异四聚体的形式促进胞嘧啶残基甲基化。

近年来，DNMT1已经被证实参与体内的多种生物学过程，如胚胎发育、组织重建、慢性炎症，并且DNMT1也参与了多种肿瘤的发生与发展。DNMT1在多种肿瘤包括肺癌、白血病、胃癌和肝癌中都呈现出高表达的状态。研究人员检测了正常胰腺组织和不同时期的胰腺癌组织中DNMT1的表达情况，发现DNMT1在肿瘤组织中的表达量较正常组织高，且在肿瘤组织中DNMT1的表达量与肿瘤恶性程度显著相关。最近动物模型研究也发现，在正常肺上皮细胞中上调DNMT1，可诱导正常细胞朝向肿瘤细胞甲基化模式发生变化(即个别基因启动子区域高甲基化和全基因组低甲基化模式)，并同时伴随EMT表型的变化。这种具有EMT表型的正常肺上皮细胞对癌基因突变更加敏感，单个癌基因突变即可导致肿瘤形成，表明了DNMT1诱导的表观遗传变化在肺癌发生发展中至关重要。之前人们都认为肿瘤只是简单基因疾病，但目前发现肿瘤不仅仅是简单的基因疾病，肿瘤的增殖与生长涉及到肿瘤微环境的密切参与。肿瘤微环境中的IL-6可以介导STATs通路上调DNMT1，高甲基化P21和P53，进而促进肺癌细胞的增殖。利用5-氮杂-2’-脱氧胞苷抑制DNMT1活性后可以降低肺癌细胞的增殖和肿瘤生长的能力。恶性肿瘤最主要的特征是肿瘤细胞的转移，这也是癌症难以根治的原因之一。相关文献报道，DNMT1还参与肿瘤的转移过程，当DNMT1通过甲基化EMT相关标志物的启动子，抑制其转录使表达量下降后会增强肺癌细胞的迁徙和迁移能力，且DNMT1通过甲基化肿瘤抑制因子的启动子区引起的表达下降在前列腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌中都与肿瘤的不良预后密切相关。

目前，针对DNMT1开的抑制剂年来，DNMT抑制剂在临床试验中得到充分验证，如阿扎胞苷联合替莫唑胺可抑制IDH突变型胶质瘤的增殖。DC-517是一种新的DNA甲基转移酶1(DNAmethyhransferase-1，DNMTl)抑制剂，研究显示，DC-517可显著抑制肿瘤细胞的增殖。但是目前，可提供选择的抑制剂种类还不够多，需要进一步的研究。

发明内容

本发明以Balb/c小鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原并加强免疫，筛选出血清效价高的小鼠进行加强免疫，取经过加强免疫的小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆，获得稳定分泌抗DNMT1的单克隆抗体杂交瘤细胞株7F23。

本发明中使用的抗原免疫原为重组人DNMT1蛋白，UnitprotID:P26358，货号507282，纽普生物。

具体的，本发明针对单克隆抗体7F23进行轻重链可变区序列鉴定，获得了轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

由Kabat的定义确定的本发明抗体的CDR序列如下所述。

重链CDR1(CDR-H1)：VFQYCVK；

重链CDR2(CDR-H2)：YTHRVRYQSISGCECN；

重链CDR3(CDR-H3)：LNMGWCDKGYLD；

轻链CDR1(CDR-L1)：HVARQLMVFFFCFIWAR；

轻链CDR2(CDR-L2)：LDIDQRQ；以及

轻链CDR3(CDR-L3)：NHSKAGCDY。

本发明“抗体”在包含，对于指定的蛋白质或其肽具有特异反应性的免疫球蛋白或其片段。抗体可包含，与其他的蛋白质或标记融合而得的抗体和抗体片段。此外，在本说明书中，抗体以最广泛的意义进行使用，具体而言，只要其表现出所期望的生物活性，就包括：完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整的抗体构成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、或抗体片段。

本发明中所述的“抗体片段”是完整的抗体的一部分，通常包含完整的抗体的一个或多个抗原结合区或可变区。因此，在本发明中，抗体片段可包含完整的抗体的一个或多个抗原结合部分。本说明书中所用的术语，即抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合性片段”是指，抗体的一个或多个免疫活性片段，其保持有与抗原(例如FZD10)特异性结合的能力。抗体的抗原结合能力表现为，可以通过全长抗体的片段进行。作为抗体片段的实例，包括：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、直链状抗体、单链抗体分子。无论结构如何，抗体片段与完整抗体所识别的抗原相同的抗原结合。术语“抗体片段”包含与特异性抗原结合的合成多肽或基因工程多肽，例如可举出：包含轻链可变区的多肽、包含重链和轻链可变区的“Fv”片段、轻链和重链可变区通过肽接头连接而成的重组单链多肽分子(“scFv蛋白质”)、包含模拟高变区的氨基酸残基的最小识别单元。

本发明进一步的，提供了DNMT1单克隆抗体在制备用于抑制癌症增殖和促进细胞凋亡的药物组合物中的用途。

其中“癌症”是指高表达DNMT1的癌症，优选指过度表达DNMT1基因的癌症，例如可举出：胰腺癌、滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、结直肠癌(大肠癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)等，但不限于此。例如，通过使用了各种癌症类型的细胞株而得的mRNA的表达分析数据库CancerCellLineEncyclopedia(CCLE)等，可知DNMT1高表达的癌细胞。

进一步的，本发明还提供了治疗胰腺癌的药物组合物，所述药物组合物含有本发明的DNMT1单克隆抗体以及相应的药学上可接受的载体。

合适载体材料可以是非晶形粉末、晶体粉末或非晶形和晶体粉末的组合形式。合适物质包括碳水化合物，例如单糖，例如果糖，半乳糖，葡糖，D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，例如乳糖，海藻糖，纤维二糖，等等；环糊精，例如2-羟基丙基-环糊精；和多糖，例如棉子糖，麦芽糖糊精，葡聚糖，等等；(b)氨基酸，例如甘氨酸，精氨酸，门冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，等等；(c)用有机酸和碱制备的有机盐，例如枸橼酸钠，抗坏血酸钠，葡萄糖酸镁，葡糖酸钠，氨基丁三醇盐酸盐，等等；(d)肽和蛋白，例如阿斯巴甜，人血清白蛋白，凝胶，等等；(e)糖醇，例如甘露糖醇，木糖醇，等等。优选的一组载体包括乳糖，海藻糖，棉子糖，麦芽糖糊精，甘氨酸，枸橼酸钠，氨基丁三醇盐酸盐，人血清白蛋白和甘露糖醇。这种载体物质可以在喷雾干燥之前与胰岛素混合，即，向准备喷雾干燥的蛋白溶液或水溶液中加入载体。用这种方法，能够与蛋白颗粒同时并且作为蛋白颗粒的一部分形成载体。

有益效果

本发明以重组人DNMT1蛋白作为免疫原通过免疫Balb/c小鼠制备并获得相应的杂交瘤细胞，通过筛选，获得了特异性抑制DNMT1活性的单克隆抗体7F23，所述抗体能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖以及细胞凋亡，具有治疗癌症的效果。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1抗DNMT1单克隆抗体特异性鉴定结果图，其中泳道1的BSA蛋白没有条带显示，而泳道2的DNMT1重组蛋白显示特异性的条带。

图2单克隆抗体7F23对细胞的增殖抑制率结果图

具体实施方式

当对本发明的实施方式进行实施或试验时，可以使用与本说明书中记载的方法和材料类似或等同的任选的方法和材料，本说明书中记载了优选的方法、装置、材料。然而，在记载本发明的材料与方法之前，应当理解为，可以按照常规的实验方法以及最优化的目的来改变本说明书中记载的特定的大小、形状、尺寸、材料、方法、手段等，因此本发明不限于这些。并且应当理解为，本说明书中使用的专业术语仅用于说明特定的类型或实施方式，并不用于限制本发明的范围，本发明的范围仅受添附的权利要求的范围的限制。

实施例1抗DNMT1单克隆抗体的制备

取6周龄BALB/c雌性小鼠4只，按照以下步骤进行免疫：首次免疫：将DNMT1重组蛋白溶液与弗式完全佐剂按体积比1:1混合，充分乳化后，于小鼠背部皮下分两点注射0.1ml(DNMT1重组蛋白50μg/只)；第二次免疫：间隔14天后，将DNMT1重组蛋白溶液与弗式不完全佐剂按体积比1:1混合，充分乳化后，于小鼠两侧腹股沟部皮下分点共注射0.1ml(DNMT1重组蛋白80μg/只)；第三次免疫：间隔14天后，将DNMT1重组蛋白溶液与弗式不完全佐剂按体积比1:1混合，充分乳化后，于小鼠两侧肩后部及腹部皮下分点共注射0.1ml(DNMT1重组蛋白100μg/只)；间隔10天后，尾静脉采血ELISA检测血清效价，选择血清效价超过1:10000的效价最高的1号小鼠进行加强免疫，于小鼠腹腔注入DNMT1重组蛋白溶液0.1ml(DNMT1重组蛋白60μg/只)。

取前述免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞按PEG方法进行融合，置5％CO₂，37℃培养。于融合后第9天用间接ELISA法对细胞培养上清进行抗体检测，选择抗体效价高的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，直至亚克隆后凡是有细胞生长的孔的抗体检测均为阳性，且OD值(A值)相近，将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞转至24孔内扩大培养，得到了1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为7F23。

腹水抗体的生产与纯化：将杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，1×10⁶个/只.11d后小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。采用ProteinA亲和层析法对单克隆抗体进行初步纯化，ELISA法鉴定抗体的效价。具体检测方法为取已包被抗原(DNMT1重组蛋白)的酶标板，加入倍比稀释的抗体。同时设阴性和空白对照孔。酶标仪测定A450nm。P/N≥2.1为阳性，最大稀释度为其效价，结果显示纯化后的抗体效价达到1:1.024×10⁶。

实施例2抗DNMT1单克隆抗体亚型鉴定

将杂交瘤细胞上清原液加到已包被抗原(DNMT1重组蛋白)的酶标板，50μl/孔，37℃孵育1h。加入稀释的IgG分型二抗，50μl/孔，37℃孵育1h。再加入羊抗鼠HRP(1:3000)。50μl/孔，37℃孵育1h，最后加TMB显色，酶标仪测定A450nm。高值孔为抗体亚类。结果如表1所示。

表1抗DNMT1单克隆抗体亚型鉴定

抗体亚型	A450
		IgG1	0.096
IgG2a	2.786
		IgG2c	0.103
IgG3	0.124
		IgM	0.136
BSA	0.096

从表1的结果可以看出，本发明制备的抗DNMT1单克隆抗体亚型为IgG2a。

实施例3抗DNMT1单克隆抗体特异性鉴定

取人DNMT1重组蛋白和对照BSA蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，进行转移电泳，将蛋白条带转印到硝酸纤维素(NC)膜上。转印结束后，将NC膜放入纯化的单抗液中，单抗以1:3000的比例稀释，37℃温浴1h，再浸入HRP标记的羊抗鼠IgG溶液中，37℃温浴1h，ECL超敏发光液作用5min，暗室曝光显影，结果如图1显示。

从图1的结果可以看出，泳道1的BSA蛋白没有条带显示，而泳道2的DNMT1重组蛋白显示特异性的条带，说明本发明的抗DNMT1单克隆抗体特异性较好。

实施例4抗DNMT1单克隆抗体结合能力鉴定

抗体亲和力的测定，其亲和力的大小用亲和常数Ka的大小来表示，公式为：Vα＝Ka(1-V)，亲和常数的单位为浓度的倒数，其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高。其检测过程如下：第一步、确定抗原、抗体最佳作用浓度：将DNMT1重组蛋白分别进行100000，200000，400000，500000，600000，800000倍稀释后各包被4条，100μL/孔，37℃，温育2h，洗涤、封闭；将抗体进行20000，40000，80000，160000，320000，640000倍稀释，分别加于2条中，100μL/孔，室温温育1h；将这两条中的抗体分别移入第二条中，室温温育1h；将这两条洗涤加酶标二抗，继续做ELISA，最后测定OD值A1；后两条按上述步骤，最后测定OD值A2。根据公式f＝A1(c)-A2(c)A1(c)计算f值，选取所有f值都小于10％的抗原，抗体稀释度，根据OD值大小确定最佳抗原浓度为600000倍稀释，最佳抗体浓度为160000倍稀释。第二步、测定亲和力：配制一系列浓度抗原6个；在加有最佳浓度抗体的EP管内加入等量系列浓度抗原，共7管，最后一管加入抗原稀释液，室温下过夜；同时将抗原进行稀释后进行包被，室温下过夜，洗板，封闭；将第二步的反应产物取100μL加入以上封闭的板孔内，室温下进行ELISA，最后测定OD值A；根据Scatchard公式Vα＝Ka(1-V)计算其斜率值，其中，α为游离抗原的浓度，V为结合抗体位点与总抗体位点的比，所得亲和力的大小即亲和常数Ka，为斜率值的负数。得到的结果是单克隆抗体7F23的亲和常数为2.4×10¹⁰。

实施例5单克隆抗体7F23对细胞的生物活性

人胰腺癌MIAPaCa-2细胞常规培养于含10％小牛血清、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素的RPMI1640培养液中置于37℃、CO₂体积分数为5％的饱和湿度培养箱中培养，每2～3d传代1次。

取对数生长期的MIAPaCa-2细胞，调整细胞密度为5×10⁴个/mL，接种于96孔板中，100μL/孔。分别加入终浓度为0、10、50、100和200μg/mL的单抗，阳性对照组加入含100μg/mLGSK-3484862的RPMI1640培养液，每组设3个重复孔；细胞分别培养72h后，加入MTT(5mg/mL)20μL/孔；细胞继续培养4h后，小心吸尽上清液，加入DMSO(150μL/孔)，在微量振荡器上振荡10min，使蓝紫色结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定490nm波长处各孔的吸光度(D)值，计算细胞抑制率。细胞抑制率(％)＝(对照组平均D值-实验组平均D值)/对照组平均D值。

MTT法检测结果(附图2)显示，不同浓度单抗作用MIAPaCa-2细胞72h后，各组细胞的增殖抑制率之间差异有统计学意义(P＜0.05)。MIAPaCa-2细胞的增殖抑制率随着单抗浓度的增加而提高，在200μg/mL的单抗的处理下，细胞增殖抑制率达到了(89.56±2.1)％，比阳性对照组的抑制效果还要高。

实施例6FCM法检测单抗对MIAPaCa-2细胞凋亡的影响

取对数生长期的MIAPaCa-2细胞，调整细胞密度为2×10⁵个/mL，接种于细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁后，分别加入终浓度为0、10、50、100和200μg/mL的单抗，阳性对照组加入含100μg/mLGSK-3484862的RPMI1640培养液，每组设3个重复孔；细胞继续培养72h；收集上述细胞，PBS洗涤细胞2次；弃上清液，每组收集10000个细胞，按凋亡检测试剂盒说明书提供的方法检测细胞凋亡，流式细胞仪激发光波长为488nm，异硫氰酸荧光素(FITC)的检测波长为515nm，碘化丙啶(PI)的检测波长为560nm。实验重复3次。

表2FCM法检测单抗对MIAPaCa-2细胞凋亡的影响

组别	凋亡率(％)
		空白对照	4.02±0.17
10μg/mL的单抗	16.25±0.21*
		50μg/mL的单抗	18.57±0.25*
100μg/mL的单抗	20.68±0.39*
		200μg/mL的单抗	24.53±0.47*
阳性对照组	20.34±0.53*

FCM法检测结果如表2显示，与空白对照组比较，单抗作用MIAPaCa-2细胞72h后，细胞的凋亡率明显上升(P＜0.05)。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种靶向DNMT1的单克隆抗体，所述单克隆抗体为7F23，该抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于由Kabat定义确定的抗体的CDR序列如下所述：

重链CDR1(CDR-H1)：VFQYCVK；

重链CDR2(CDR-H2)：YTHRVRYQSISGCECN；

重链CDR3(CDR-H3)：LNMGWCDKGYLD；

轻链CDR1(CDR-L1)：HVARQLMVFFFCFIWAR；

轻链CDR2(CDR-L2)：LDIDQRQ；以及

轻链CDR3(CDR-L3)：NHSKAGCDY。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于抑制胰腺癌MIAPaCa-2细胞增殖和加速凋亡的药物组合物中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的药物组合物中单克隆抗体的使用浓度为10μg/mL-200μg/mL。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药物组合物中单克隆抗体的使用浓度为200μg/mL。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药物组合物中单克隆抗体的使用浓度为10μg/mL。

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