CN112746113A - 一种与鸡青脚性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与鸡青脚性状相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与鸡青脚性状相关的分子标记及其应用，属于基因工程领域；其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该序列在67位碱基处发生一个C/T碱基突变，导致鸡脚颜色性状的多态性。分型方法为：提取基因组DNA后，PCR扩增，测序，序列比较分析得到具有C/T多态性位点的核苷酸序列；本发明所述方法可以准确的鉴定被检个体的后代是否会出现青脚个体，可根据需要对被检个体进行精准选淘。

Description

一种与鸡青脚性状相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种与鸡青脚性状相关的 分子标记及其应用。
背景技术
“817类肉杂鸡”主要是指以快大型白羽肉鸡(AA、罗斯308、 科宝等的商品代公鸡或者父母代公鸡)为父本，高产型蛋鸡为母本(海 兰、京红、罗曼、伊莎等)生产商品代肉鸡的制种模式/配套模式。 目前，逐渐衍生出以快大型白羽肉鸡为父本，国内的高产蛋黄羽肉鸡 (其生长速度优于高产蛋鸡，肉质优于高产蛋鸡，但是其产蛋量要低 于高产蛋鸡)为母本的配套模式。目前817类制种模式存在一种现象， 即商品代存在10-20％不等的青脚个体(根据所用父本的不同，青脚 比例会有所不同)。“青脚”个体的存在严重影响了商品代肉鸡的屠 体外观的均匀度(817类肉杂鸡为黄脚)。给下游的屠宰企业造成不 同程度的经济损失。目前尚不清楚具体原因。
发明内容
本发明的目的是提供一种与鸡青脚性状相关的分子标记及其应 用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种与鸡青脚性状相关的分子标记，其核苷酸序列 如SEQ ID NO.4所示，所述核苷酸序列中的第67位为多态性位点， 所述多态性位点的基因型为C/T。
本发明提供一种鉴定所述分子标记的引物组，所述引物组包含扩 增PCR引物：
S2F：gcatttccatcgcggctctc，
S2R：gcctccactcggccctcc；
以及测序引物：S2-CXR：ccccgccgtacctgggccggcg。
本发明还提供一种与鸡青脚性状相关的分子标记的筛选方法，具 体包括以下步骤：
从青脚母鸡与黄脚母鸡的血液中提取基因组DNA后，用权利要求 2所述的引物组进行PCR扩增以及测序反应后，得到与鸡青脚性状相 关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所 述核苷酸序列中的第67位为多态性位点，所述多态性位点的基因型 为C/T。
本发明还提供一种含分子标记或所述引物组的试剂盒。
本发明还提供一种所述分子标记或所述引物组或所述试剂盒在 鸡青脚性状个体精准选淘中的应用。
进一步地，应用于817类肉杂鸡配套父系中公母鸡青脚性状个体 的精准选淘。
本发明公开了以下技术效果：
本发明是检测与本案中提及的“青脚”性状形成相关的致因突变， 该方法可以准确的鉴定被检个体的后代是否会出现青脚个体。可根据 需要对被检个体进行精准选淘，可精确到100％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面 将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描 述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来 讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
图1为测序结果示意图；黑色方框内为目的位点。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为 是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施 方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非 用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体 公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述 范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间 的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可 独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明 所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了 优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文 所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过 引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与 任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具 体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易 见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有” 等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
“青脚”个体，活体鳞片为黄色，看上去和黄脚鸡区别不明显。 但是屠宰后其胫部有黑色素沉淀，呈现黑色素沉积。此处的“青脚”， 与活体呈现“青脚”，屠宰后依然是“青脚”的“青脚”，非一个性 状。
实施例1
1日龄青脚雏鸡与黄脚雏鸡的基因分型
1、样本采集与DNA提取
1.1血样采集
挑选817类肉杂鸡科宝与海兰褐杂交后代中的1日龄青脚雏鸡母 鸡与黄脚雏鸡母鸡各36只，翅下静脉采血0.3ml置于装有70μL 2％ EDTA抗凝剂的离心管中。置于-20℃保存。
1.2DNA提取
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法，具体步骤如下：
(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL 1×SET 缓冲液、12.5μL 20％SDS和6μL 10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放 于55℃水浴过夜；
(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇 20min，10,000rpm离心10min；
(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm 离心10min；
(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min， 10,000rpm离心10min；
(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀 DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
(6)用1mL 75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥 箱内烘干；
(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃ 水浴锅中过夜以溶解DNA；
(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。
2、PCR与目的位点分型
2.1PCR扩增
根据目的位点所在基因的基因组序列信息(GenBank GU470992), 设计特异性引物，然后将PCR产物交由生物公司进行基因分型；PCR 扩增引物与测序引物见表1。
表1引物信息
Figure BDA0002924030840000051
Figure BDA0002924030840000061
注:“S2-CXR”分别为对应PCR扩增片段的测序引物。采用另设引物进 行测序，可以免去PCR产物纯化的步骤。
PCR扩增的反应体系见表2。
表2反应体系
试剂 用量
2×EcoTaqPCRSuperMix 10μL
上、下引物 0.2μL
模板DNA 2μL
ddH<sub>2</sub>O Upto20μL
PCR扩增的反应程序见表3。
表3反应程序
程序 反应温度 反应时间 循环数
预变性 94℃ 5min 1
变性 93℃ 40s
退火 60℃ 30s 35
延伸 72℃ 90s
后延伸 72℃ 7min 1
保存 16℃ Forever 1
2.2测序分型
将步骤(2)得到的PCR扩增产物使用S2-CXR测序引物进行测序， 并用DNAStar软件的SeqMan模块进行多重比对读取测序结果，查看 目的位点基因型，确定SEQ IN NO.4所示的核苷酸序列的第67位为 与鸡青脚状相关的分子标记。
配制测序反应体系如表4所示。
表4测序反应体系
Figure BDA0002924030840000062
Figure BDA0002924030840000071
测序反应条件如表5所示。
表5测序反应条件
Figure BDA0002924030840000072
目的位点基因型如图1所示，因是反向测序，故测序结果显示为 A/G突变。
3、结果统计
结果如表6所示，36个青脚个体目的位点基因型100％为G基因 型，黄脚个体中只有1只为G基因型。结果表明，该位点为产生青脚 个体的关键位点。可用于淘汰青脚性状的分子标记选择依据，即选择 基因型是AA的个体作为种鸡，淘汰育种群中基因型为GG的个体。
表6
Figure BDA0002924030840000073
注：括号中数字为个体数量
实施例2
根据实施例1中目的位点分型结果，选留AA型个体，并观察后 代脚色情况。
1、样本采集与DNA抽提
1.1样本采集
随机挑选817类肉杂鸡中罗斯308群体父母代种公鸡30只，所 述罗斯308群体作为父本与京红杂交有16.8％的青脚个体。
将所述30只罗斯308群体父母代种公鸡分别翅下静脉采集血样 0.3ml置于装有70μL 2％EDTA抗凝剂的离心管中，立刻摇匀。
1.2DNA抽提
参考实施例1步骤1.2中的方法。
2、PCR与目的位点分型
参考实施例1步骤2中的方法，根据分型结果将AA型个体留下。
3、后代脚色观察
观察经步骤2选留过的种鸡作为父本的1850个后代，青脚比例 为0％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本 发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普 通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本 发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 南昌师范学院
<120> 一种与鸡青脚性状相关的分子标记及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatttccat cgcggctctc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctccactc ggccctcc 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccccgccgta cctgggccgg cg 22
<210> 4
<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatttccat cgcggctctc cgggacctct cctgttccca tgacctctcg gataaggtgc 60
accgtcrgcc ttcggcgcgc ccgcagccgg cctctgtcct tctcgctgct ccggcgcatc 120
ttgcgcgggg tggccgctgt cctgcggcgc tccgggacgc ttcgccgcat tctgcgccgg 180
gttctgagaa ggaggcaccg gggcagccgc cggcccaggt acggcggggg gcggcggggc 240
ccggagggcc gagtggaggc 260

Claims (6)

1.一种与鸡青脚性状相关的分子标记，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述核苷酸序列中的第67位为多态性位点，所述多态性位点的基因型为C/T。
2.一种鉴定如权利要求1所述的分子标记的引物组，其特征在于：所述引物组包含扩增PCR引物：
S2F：gcatttccatcgcggctctc，
S2R：gcctccactcggccctcc；
以及测序引物：S2-CXR：ccccgccgtacctgggccggcg。
3.一种与鸡青脚性状相关的分子标记的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
从青脚母鸡与黄脚母鸡的血液中提取基因组DNA后，用权利要求2所述的引物组进行PCR扩增以及测序反应后，得到与鸡青脚性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述核苷酸序列中的第67位为多态性位点，所述多态性位点的基因型为C/T。
4.一种含权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物组的试剂盒。
5.一种权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂盒在鸡青脚性状个体精准选淘中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用于817类肉杂鸡配套父系中公母鸡青脚性状个体的精准选淘。
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