CN117512124A - 用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组、试剂盒及方法，涉及基因检测技术领域，所述引物组包括用于检测相互连锁的SNP1位点、SNP2位点和SNP3位点的3组引物对，3组所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑6所示。本发明首次发现一种地方鸡的3个相互连锁的与性连锁雪花羽鸡表型相关的SNP位点，并以此建立了检测性连锁雪花羽鸡表型及其基因型的方法；该方法操作简单、准确性高、重复性好、省时，可进行相互检验，达到100％准确率，有很好的应用价值，值得大力推广。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
鸡的羽色十分丰富，是品种的重要特征之一，也能直接反映鸡的生长和健康状态，其发育状态是决定地方鸡品种经济价值的重要因素，在地方鸡市场上，鸡的羽毛颜色、色泽、形态等外观性状是影响优质鸡价格的重要因素，因此，羽色是地方鸡育种工作中一项重要选择指标。鸡的雪花羽是一种背部羽毛为麻羽色的同时有白色花点，象雪花漂洒在羽毛上，地方鸡种-七百弄鸡呈现这种羽毛性状，因其外观易于区别其它品种，该品种好看又好吃，受消费者青睐。雪花羽为一种羽色性状，是伴性遗传的羽色性状，位于Z染色体上。为了在进行七百弄鸡选育过程中，利用雪花羽性状实现品种鉴别，探讨一种快捷省时省工、准确率高的鉴别方式。
细胞周期依赖性激酶抑制基因(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKN2A/B)是一种重要的抑癌基因，属于细胞周期依赖性激酶抑制因子基因家族。Doreen等(2017)研究发现CDKN2A/B基因调控区和编码区的碱基突变导致鸡羽色不同表型形成。鸡羽色的表型是由B1等位基因控制，中国农业大学邓雪梅教授已根据B1等位基因开发出与芦花羽相关的分子标记。但是，雪花羽表型的基因控制与CDKN2A/B基因调控区和编码区的碱基突变有关，但目前还没有雪花羽基因的鉴定方法。鉴于此，本发明提供用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组、试剂盒及方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组、试剂盒及方法。目的是研究雪花羽表型的基因控制与CDKN2A/B基因调控区和编码区的碱基突变的关系，且通过相互连锁的3个SNP位点变异组合检测地方鸡伴性雪花羽表型。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
第一方面，提供用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组，所述引物组包括用于检测相互连锁的SNP1位点、SNP2位点和SNP3位点的3组引物对，3组所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，第一组引物对如序列表SEQ ID NO：1-2所示，用于检测所述SNP1位点。第二组引物对如序列表SEQ ID NO：3-4所示，用于检测所述SNP2位点。第三组引物对如序列表SEQ ID NO：5-6所示，用于检测所述SNP3位点。
其中，检测所述SNP1的检测引物对，SNP1上游引物：5’-TTGACGCGGAGGGATGAGAT-3’(SEQ ID NO:1)；SNP1下游引物：5’-TTCCCGATCTCGCAGGCTT-3’(SEQ ID NO:2)。
检测所述SNP2的检测引物对，SNP2上游引物：5’-TTCTGTTCTAAATATAAATGCAACTCG-3’(SEQ ID NO:3)；SNP2下游引物：5’-TCAAAAAGAAAACGAAGTGCAAA-3’(SEQ ID NO:4)。
检测所述SNP3的检测引物对，SNP3上游引物：5’-CCTGTTCCCATGACCTCTCGGAT-3’(SEQ ID NO:5)；SNP3下游引物：5’-GGGTTCTGAGAAGGAGGCACCGG-3’(SEQ ID NO:6)
进一步，所述SNP1位点为CDKN2A/B基因启动子区域转录起始位点上游267bp的位点；所述SNP2位点为CDKN2A/B基因内含子1的380bp的位点；所述SNP3位点为CDKN2A/B基因外显子1的170bp的位点。其中，CDKN2A/B基因的登录号，Gene ID：395077。
第二方面，提供用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
进一步，所述试剂盒还包括2×KeyPo Master Mix(Dye Plus)。
第三方面，提供用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的方法，包括如下步骤：
(1)采集待测鸡血样，使用血液基因组DNA柱式小提试剂盒(CW2087)提取血样中的DNA，得到血样DNA；
(2)将所述血样DNA作为模板，采用所述的试剂盒进行PCR扩增，使用2％琼脂糖凝胶电泳DNA片段，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段，得到扩增产物；
(3)对所述扩增产物使用上游引物进行Sanger测序，得到待测样品SNP1位点、SNP2位点和SNP3位点的序列和波峰图；其中Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法；
(4)采用SnapGene(分子生物学软件，版本6.02)对所述待测样品的SNP1、SNP2、SNP3位点序列和波峰图进行比对，得到地方鸡雪花羽性状分子鉴定的结果。
进一步，步骤(2)中PCR扩增的程序为：98℃变性10秒，60℃退火5秒，72℃延伸5秒，共35个循环。
进一步，步骤(4)中若三个位点中所述SNP1位点的碱基位点为G、所述SNP2位点的碱基位点为A、所述SNP3位点的碱基位点为A，即可判定为雪花羽鸡。
本发明的有益效果是：本发明首次发现一种地方鸡的3个相互连锁的与性连锁雪花羽鸡表型相关的SNP位点，并以此建立了检测性连锁雪花羽鸡表型及其基因型的方法，方法操作简单、准确性高、重复性好、省时，可进行相互检验，达到100％准确率，该方可用于品种选育中羽色的选择及品种的鉴定，有很好的应用价值，值得大力推广。
附图说明
图1为本发明地方鸡雪花羽性状分子鉴定流程图；
图2为本发明SNP1待测位点序列比对图；
图3为本发明SNP1待测位点测序波峰比对图；
图4为本发明SNP2待测位点序列比对图；
图5为本发明SNP2待测位点测序波峰比对图；
图6为本发明SNP3待测位点序列比对图；
图7为本发明SNP3待测位点测序波峰比对图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例1
一种地方鸡伴性雪花羽表型相关的相互连锁的SNP位点组合，所述SNP位点包括SNP1、SNP2和SNP3，其中SNP1为CDKN2A/B基因启动子区域转录起始位点上游的267bp处，SNP2为CDKN2A/B基因内含子1的380bp处，SNP3为CDKN2A/B基因外显子1的170bp处。CDKN2A/B基因的登录号，Gene ID：395077。
如图1所示，检测方法如下：
1、引物设计：
一对检测所述SNP1的检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示。SNP1上游引物：5’-TTGACGCGGAGGGATGAGAT-3’(SEQ ID NO:1)；
SNP1下游引物：5’-TTCCCGATCTCGCAGGCTT-3’(SEQ ID NO:2)。
一对检测所述SNP2的检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示。SNP2上游引物：5’-TTCTGTTCTAAATATAAATGCAACTCG-3’(SEQ ID NO:3)；SNP2下游引物：5’-TCAAAAAGAAAACGAAGTGCAAA-3’(SEQ ID NO:4)。
一对检测所述SNP3的检测引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5-6所示。SNP3上游引物：5’-CCTGTTCCCATGACCTCTCGGAT-3’(SEQ ID NO:5)；SNP3下游引物：5’-GGGTTCTGAGAAGGAGGCACCGG-3’(SEQ ID NO:6)。
2、样品DNA提取及扩增：
采集鸡血样，并提取血样DNA，对血样DNA进行扩增，采用的扩增体系如下表1：
表1 50μL扩增体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| ddH2O | 19 |
| 2×KeyPo Master Mix(Dye Plus) | 25 |
| 上、下游引物 | 各2 |
| 模板 | 2 |
本实验使用的2×KeyPo Master Mix(Dye Plus)为南京诺唯赞生物科技有限公司提供，货号为PK-501。
3、扩增程序：98℃变性10秒，60℃退火5秒，72℃延伸5秒，共35个循环。
4、扩增产物测序：扩增产物经过纯化后使用上游引物进行Sanger测序。
5、结果分析：使用SnapGene(版本6.02)对待测样品的SNP1、SNP2、SNP3位点序列和波峰图进行比对。
6、结果：
如图2所示，通过对待测样品序列比对得知，若该SNP1的碱基位点为G即为纯合或杂合性连锁雪花羽鸡(ZBZB或ZBZb)；若该碱基位点为A，则为该待测鸡为非性连锁雪花羽鸡(ZbZb)。如图3所示，进一步通过波峰图比对得知，若SNP1的基因型为GG时，则该待测鸡为纯合性连锁雪花羽鸡(ZBZB)；若SNP1基因型为AG时，则该待测鸡为杂合性连锁雪花羽鸡(ZBZb)。如图4所示，通过对待测样品序列比对得知，若该SNP2的碱基位点为A即为纯合或杂合性连锁雪花羽鸡(ZBZB或ZBZb)；若该碱基位点为C，则为该待测鸡为非性连锁雪花羽鸡(ZbZb)。如图5所示，进一步通过波峰图比对得知，若SNP2的基因型为AA时，则该待测鸡为纯合性连锁雪花羽鸡(ZBZB)；若SNP2基因型为AC时，则该待测鸡为杂合性连锁雪花羽鸡(ZBZb)。如图6所示，通过对待测样品序列比对得知，若该SNP3的碱基位点为A即为纯合或杂合性连锁雪花羽鸡(ZBZB或ZBZb)；若该碱基位点为T，则为该待测鸡为非性连锁雪花羽鸡(ZbZb)。如图7所示，进一步通过波峰图比对得知，若SNP3的基因型为GG时，则该待测鸡为纯合性连锁雪花羽鸡(ZBZB)；若SNP3基因型为AG时，则该待测鸡为杂合性连锁雪花羽鸡(ZBZb)。
三个位点中SNP1的碱基位点为G，SNP2的碱基位点为A，SNP3的碱基位点为A即可判定为雪花羽鸡。
实施例2：应用例
七百弄鸡、金陵麻鸡和凌云乌鸡的检测，其中七百弄鸡、金陵麻鸡和凌云乌鸡来源于广西壮族自治区畜牧研究所养殖基地。
1、实验方法
使用实施技术方案的检测方法检测七百弄鸡(雪花羽性状)、金陵麻鸡(非雪花羽性状)、凌云乌鸡(非雪花羽性状)的公母鸡的基因型。
采集七百弄鸡、金陵麻鸡和凌云乌鸡的全血，采用实施例1所述检测方法进行检测。
2、实验结果
表2七百弄鸡、金陵麻鸡和凌云乌鸡的检测结果
七百弄鸡为经典的雪花羽表型，金陵麻鸡和凌云乌鸡为非雪花羽表型鸡，三个SNP位点的测序结果如表2所示，七百弄鸡的3个SNP位点均发生了突变，且为纯合突变。而金陵麻鸡和凌云乌鸡的3个SNP位点均未发生突变。
综上所述，对于我国地方鸡来说，有3个连锁的SNP影响伴性雪花羽表型，可用于伴性雪花羽表型检测。方法操作简单、准确性高、重复性好、省时，可进行相互检验，达到100％准确率，该方可用于品种选育中羽色的选择及品种的鉴定，有很好的应用价值，值得大力推广。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于检测相互连锁的SNP1位点、SNP2位点和SNP3位点的3组引物对，3组所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示。
2.根据权利要求1所述用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组，其特征在于，第一组引物对如序列表SEQ ID NO：1-2所示，用于检测所述SNP1位点。
3.根据权利要求2所述用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组，其特征在于，第二组引物对如序列表SEQ ID NO：3-4所示，用于检测所述SNP2位点。
4.根据权利要求3所述用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组，其特征在于，第三组引物对如序列表SEQ ID NO：5-6所示，用于检测所述SNP3位点。
5.根据权利要求4所述用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的引物组，其特征在于，所述SNP1位点为CDKN2A/B基因启动子区域转录起始位点上游267bp的位点；所述SNP2位点为CDKN2A/B基因内含子1的380bp的位点；所述SNP3位点为CDKN2A/B基因外显子1的170bp的位点。
6.用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至5任一项所述的引物组。
7.根据权利要求6所述用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×KeyPo Master Mix(Dye Plus)。
8.用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集待测鸡血样，并提取血样中的DNA，得到血样DNA；
(2)将所述血样DNA作为模板，采用权利要求6或7所述的试剂盒进行PCR扩增，纯化后得到扩增产物；
(3)对所述扩增产物进行Sanger测序，得到待测样品SNP1位点、SNP2位点和SNP3位点的序列和波峰图；
(4)采用SnapGene对所述待测样品的SNP1、SNP2、SNP3位点序列和波峰图进行比对，得到地方鸡雪花羽性状分子鉴定的结果。
9.根据权利要求8所述用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增的程序为：98℃变性10秒，60℃退火5秒，72℃延伸5秒，共35个循环。
10.根据权利要求8所述用于地方鸡雪花羽性状分子鉴定的方法，其特征在于，步骤(4)中若三个位点中所述SNP1位点的碱基位点为G、所述SNP2位点的碱基位点为A、所述SNP3位点的碱基位点为A，即可判定为雪花羽鸡。
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