CN105200051A - 一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用snp标记 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用SNP标记，一种区分皱纹盘鲍中国和日本群体的SNP位点。本发明另一个方面还提供用于检测上述SNP位点的引物组和探针。使用本发明的SNP标记对皱纹盘鲍中国和日本群体进行鉴定，将使群体水平的育种亲本鉴别更加简便易行。

Description

一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用SNP标记
技术领域
本发明属于水产养殖分子标记技术领域，具体涉及一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用SNP标记。
背景技术
皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)隶属于软体动物门，腹足纲，分布于我国辽宁、山东半岛，日本东北部等地区，是我国北方重要的养殖经济贝类。90年代中后期，为减少种质衰退带来的养殖皱纹盘鲍产量和成活率降低等问题，我国开始从日本引进皱纹盘鲍，将其与本地群体杂交生产杂交鲍。中日群体杂交产生的杂交鲍有明显的杂交优势，已被广泛应用于养殖生产。但在杂交种培育过程中，对高价购买的日本群体难以在形态上与中国群体进行区分，因此开发能够鉴别两群体的分子标记对确定杂交种培育的亲本来源至关重要，但目前尚未有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用SNP标记，即一种区分皱纹盘鲍中国和日本群体的SNP位点，以及检测该位点的分型用的引物和探针，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供SNP位点，其中位点HdhSNP30_CT是序列为SEQIDNO:1的第99位，其碱基为C/T；位点HdhSNP32_CT是序列为SEQIDNO:2的第138位，其碱基为C/T；位点HdhSNP36_CA是序列为SEQIDNO:3的第107位，其碱基为C/A；位点HdhSNP41_CT是序列为SEQIDNO:4的第106位，其碱基为C/T；位点HdhSNP44_AG是序列为SEQIDNO:5的第54位，其碱基为A/G。
本发明另一个方面提供用于检测上述SNP位点的引物组和探针；具体如下：
检测位点HdhSNP30_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，探针的序列为SEQIDNO:8；
检测位点HdhSNP32_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10，探针的序列为SEQIDNO:11；
检测位点HdhSNP36_CA的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:12和SEQIDNO:13，探针的序列为SEQIDNO:14；
检测位点HdhSNP41_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，探针的序列为SEQIDNO:17；
检测位点HdhSNP44_AG的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:18和SEQIDNO:19，探针的序列为SEQIDNO:20；
上述SNP位点的引物组和探针用于皱纹盘鲍中国和日本群体的鉴别；
本发明再一个方面提供一种鉴别皱纹盘鲍中国和日本群体的方法，包括如下的步骤：
1)基因组DNA的提取：提取待检测的皱纹盘鲍各群体中不少于30个个体的基因组DNA；同时提取作为检测参考群体的中国群体的不少于30个个体的基因组DNA；
2)SNP位点分型：采用上述的引物组对群体中每个取样个体的基因组DNA分别进行PCR扩增，然后向PCR产物中加入探针，95℃变性10min；再利用高分辨率溶解曲线(HighResolutionMelting,HRM)对变性产物进行分型检测，以0.1℃/s的速率从40℃升温至95℃，分析扩增产物的溶解曲线，记录个体的基因型；
3)SNP位点等位基因频率差异分析：统计SNP位点在待检测群体中的等位基因频率，利用Chi-squared检验，分析待检测群体与参考群体的等位基因频率的差异；若检测结果符合以下差异分布情况，则确定待测群体为日本群体，具体如下：
位点HdhSNP30_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP32_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP36_CA中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP41_CT中，等位基因C的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP44_AG中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)。
本发明操作简单、费用低、精确度高。使用本发明的SNP标记对皱纹盘鲍中国和日本群体进行鉴定，将使群体水平的育种亲本鉴别更加简便易行。
具体实施方式
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)标记具有基因组分布广泛，遗传稳定性高的优点，是群体遗传研究的有力分子工具。本发明在前期比较皱纹盘鲍中国群体和日本群体的基因组序列的基础上，筛查到在两群体间基因频率差异显著的SNP位点，进一步开发成标记，用于在群体水平对中国和日本皱纹盘鲍进行鉴别。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
利用二代测序技术分别对皱纹盘鲍5个中国个体和5个日本个体进行高通量测序，利用所有个体测序reads构建皱纹盘鲍基因组scaffold，作为后续分析的参考基因组序列。分别将中国个体和日本个体的测序reads向参考基因组上比对，筛查SNP位点并计算其在中国和日本群体中的等位基因频率，利用Chi-squared检验计算两个群体的等位基因频率的差异，筛选差异显著的SNP位点。共筛选出5个SNP位点，其中位点HdhSNP30_CT是序列为SEQIDNO:1的第99位，其碱基为C/T；位点HdhSNP32_CT是序列为SEQIDNO:2的第138位，其碱基为C/T；位点HdhSNP36_CA是序列为SEQIDNO:3的第107位，其碱基为C/A；位点HdhSNP41_CT是序列为SEQIDNO:4的第106位，其碱基为C/T；位点HdhSNP44_AG是序列为SEQIDNO:5的第54位，其碱基为A/G。
根据SNP位点附近的基因组序列，设计HRM分型用引物和探针。标准如下：a)探针长度为25-45bp；只包含1个候选位点，位点居于探针中间，不含缺失位点,3’端加2个错配碱基；退火温度为58℃-60℃；不含简单重复序列及回文序列。b)引物长度19-26bp；引物序列中不包含候选位点及缺失位点；扩增产物长度70-130bp；GC含量30％-70％。
检测位点HdhSNP30_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，探针的序列为SEQIDNO:8；
检测位点HdhSNP32_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10，探针的序列为SEQIDNO:11；
检测位点HdhSNP36_CA的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:12和SEQIDNO:13，探针的序列为SEQIDNO:14；
检测位点HdhSNP41_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，探针的序列为SEQIDNO:17；
检测位点HdhSNP44_AG的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:18和SEQIDNO:19，探针的序列为SEQIDNO:20。
实施例2
本实施例为利用上述的SNP位点的引物组和探针对鉴别皱纹盘鲍中国和日本群体的验证，包括如下的步骤：
1)皱纹盘鲍基因组DNA提取：取足肌肉约0.1g，加入500μlSTE裂解缓冲液，剪碎，依次加入50μl10％SDS、5μl蛋白酶K(20mg/ml)，56℃裂解约3h，至裂解液澄清。加入同体积Tris饱和酚(250μl)，氯仿/异戊醇(24:1)(250μl)，轻轻晃动20min，12000rpm离心10min。取上清，重复上述步骤，直至水相与有机相之间无蛋白质层。取上清，加入同体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻晃20min，12000rpm离心10min。取上清，加入1/10体积3MNaAc(pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇，摇匀后-20℃静置20min，12500rpm离心20min。将核酸沉淀于管底。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀。收集沉淀，空气中干燥至乙醇全部挥发。加入20μlTE(含RNaseA)溶解DNA并消化RNA，37℃静置约30min后，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
2)SNP位点分型：以皱纹盘鲍中国和日本两个群体的各30个个体的基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，反应体系如下：10×Buffer1μl，2.5mMdNTP0.8μl，2.5mMMgCl20.6μl，正向引物(10μM)0.1μl，反向引物(10μM)0.5μl，Taq酶(5U/μl)0.1μl，模板0.5μl，LCGreen饱和荧光染料0.7μl，加H2O补足至10μl。扩增反应在BiometraT-GradientPCR系统上完成，反应条件如下：94℃4min；94℃40s，63℃40s，60次循环；72℃5min。向每份PCR产物中加入3μl对应探针(10μM)，95℃变性10min。取10μl变性产物转入96孔BLK/WHT板中(Bio-Rad)，加入15μl矿物油，2000rpm离心1min。在Light-Scanner中进行分型检测，以0.1℃/s的速率从40℃升温至95℃，持续采集荧光信号。用LightScannerCallITv2.0软件分析溶解曲线，记录个体的基因型：熔解曲线单峰温度高者为与探针序列相同纯合型，单峰温度低者为突变纯合型，双峰者为杂合型。
3)皱纹盘鲍中国和日本群体等位基因频率差异性分析：统计SNP位点分别在两个群体中的等位基因频率，利用Chi-squared检验，分析两个群体的SNP位点等位基因频率的差异。结果如下：
位点HdhSNP30_CT中，等位基因T的频率在日本群体(0.375)中显著低于中国群体(0.815)(P-value＝5.60E-06)；
位点HdhSNP32_CT中，等位基因T的频率在日本群体(0.500)中显著低于中国群体(0.768)(P-value＝0.004)；
位点HdhSNP36_CA中，等位基因A的频率在日本群体(0.479)中显著低于中国群体(0.839)(P-value＝9.50E-05)；
位点HdhSNP41_CT中，等位基因C的频率在日本群体(0.167)中显著低于中国群体(0.625)(P-value＝2.23E-06)；
位点HdhSNP44_AG中，等位基因A的频率在日本群体(0.208)中显著低于中国群体(0.571)(P-value＝1.68E-04)。
上述引物和探针在杂交鲍培育中用于日本皱纹盘鲍亲本群体的检测，优先选择5个位点的等位基因频率与中国群体均差异显著的群体作为亲本，提高育种效率。
本发明中公开的皱纹盘鲍中国和日本群体差异SNP标记和其引物组及探针，具有稳定遗传、操作简便、鉴定快速、结果直观、经济实用等优点，能有效地对皱纹盘鲍中国和日本地理群体进行区分鉴定。在实际杂交育种过程中，对已知的中国群体(参考群体)和与其杂交的待测群体进行SNP位点分型，计算等位基因频率，利用Chi-squared检验，检测上述SNP位点在参考群体和待测群体中的基因频率差异，可以确定待测群体是中国群体还是日本群体，利用验证的日本群体与已知的中国群体进行杂交育种工作，可加快育种进程，避免不必要的经济损失。

Claims (8)

1.一种SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点，其中位点HdhSNP30_CT是序列为SEQIDNO:1的第99位，其碱基为C/T；位点HdhSNP32_CT是序列为SEQIDNO:2的第138位，其碱基为C/T；位点HdhSNP36_CA是序列为SEQIDNO:3的第107位，其碱基为C/A；位点HdhSNP41_CT是序列为SEQIDNO:4的第106位，其碱基为C/T；位点HdhSNP44_AG是序列为SEQIDNO:5的第54位，其碱基为A/G。
2.权利要求1所述的SNP位点在制备鉴别皱纹盘鲍中国群体和日本群体的分子标记中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的分子标记为引物和探针。
4.一种引物组和探针，其特征在于，所述的引物组用于检测权利要求1所述的SNP位点。
5.如权利要求4所述的引物组和探针，其中检测位点HdhSNP30_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，探针的序列为SEQIDNO:8；
检测位点HdhSNP32_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10，探针的序列为SEQIDNO:11；
检测位点HdhSNP36_CA的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:12和SEQIDNO:13，探针的序列为SEQIDNO:14；
检测位点HdhSNP41_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，探针的序列为SEQIDNO:17；
检测位点HdhSNP44_AG的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO:18和SEQIDNO:19，探针的序列为SEQIDNO:20。
6.权利要求5所述的引物组和探针在鉴别皱纹盘鲍中国群体和日本群体中的应用。
7.一种鉴别皱纹盘鲍中国和日本群体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)基因组DNA的提取：提取待检测的皱纹盘鲍的个体的基因组DNA；同时提取作为检测参考群体的中国群体的个体的基因组DNA；
2)SNP位点分型：采用权利要求5所述的引物组对待检测的群体中每个取样个体的基因组DNA分别进行PCR扩增，然后向PCR产物中加入权利要求5所述的探针，95℃变性10min；再利用高分辨率溶解曲线对变性产物进行分型检测，以0.1℃/s的速率从40℃升温至95℃，分析扩增产物的溶解曲线，记录个体的基因型；
3)SNP位点等位基因频率差异分析：统计SNP位点在待检测群体中的等位基因频率，利用Chi-squared检验，分析待检测群体与参考群体的等位基因频率的差异；若检测结果符合以下差异分布情况，则确定待测群体为日本群体，具体如下：
位点HdhSNP30_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP32_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP36_CA中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP41_CT中，等位基因C的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)；
位点HdhSNP44_AG中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体(P<0.05)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中个体的数目不少于30个。
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