CN109943643B

CN109943643B - 一种获得中国人群个体年龄的方法

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Publication number: CN109943643B
Application number: CN201910294695.1A
Authority: CN
Inventors: 黄志伟; 辛叶; 沈裕虎; 朱倩; 史萍; 王蕾; 王寒冬; 陈冉冉; 张晓宇; 孔颖颖
Original assignee: Donghua University; Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Donghua University; Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: CN109943643A

Abstract

本发明涉及一种获得中国人群个体年龄的方法，提取样本个体的DNA，进行DNA甲基化的亚硫酸氢盐修饰；获得所述DNA的hTERT基因的甲基化程度，建立甲基化程度和年龄的回归模型，即可获得中国人群个体年龄。本发明通过可靠的方法实现了利用血液或血痕对个体年龄的推断。

Description

一种获得中国人群个体年龄的方法

技术领域

本发明属于获得年龄的方法领域，特别涉及一种获得中国人群个体年龄的方法。

背景技术

个体年龄推断一直是法医学的重要研究课题之一，个体年龄的评估目前主要是依据对骨骼、牙齿等组织以及组织中各类物质的物理和化学特性等随年龄增长的时序性变化。然而，获得的年龄推断结果受到评估者的主观因素的影响，分析需要完整的骨骼或牙齿。如果没有现场留下的形态特征，则无法估计生物样本的年龄。而在许多的案件现场残留的检材只有血液或血痕，使用上述方法则无法进行个体年龄的推断。

如何提供一种方法可以用于公安实战中犯罪现场遗留的生物检材血液或血痕样本，实现对于血液或血痕来源个体年龄的推断，将有利于快速锁定嫌疑人范围，为案件侦破提供线索，提高案件侦破速度，成为研究的热点。

众所周知，DNA甲基化是表观遗传中重要的一种化学修饰，是指DNA甲基转移酶催化胞嘧啶环第5位碳原子形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。人类单倍体基因组中约有5×10⁷个CpG，它广泛分布在转座元件、其他重复的DNA和大多数功能基因的编码区，几乎所有的甲基化胞嘧啶都发生在CpG二核苷酸。DNA甲基化在维持基因组遗传物质稳定性和调控基因表达中起重要作用，与肿瘤，遗传病，自身免疫性疾病和衰老的发生密切相关。DNA甲基化与年龄之间存在一定的相关性。一些研究表明，人类DNA甲基化的总体水平随着年龄的增长而降低，并且在细胞分化过程中DNA维持甲基化的能力降低。

人端粒酶逆转录酶(hTERT)是参与肿瘤发生和发展的重要蛋白酶，其启动子区域的甲基化状态影响其表达。hTERT基因启动子含有大量CpG岛，具有富含GC的序列，表明hTERT表达可能受甲基化调节。在肿瘤细胞和组织中，大多数hTERT启动子是高甲基化的，但甲基化模式是复杂的。正常细胞或组织hTERT启动子主要是无甲基或仅低甲基化。以前，对hTERT基因甲基化的研究主要集中在肿瘤发生发展，诊断和治疗的机制上。

如CN 104357561 A公开了一种获得中国人群女性个体年龄的方法和系统，它整合了四个基因上的11个CpG位点，在获取了它们的甲基化率后，对这11个位点和年龄进行了回归分析，建立了回归模型。首先，在预测年龄的时候方法越简单，才会更加的方便、快捷。四个基因，11个CpG位点，会加大工作量和工作难度，此外，它们建立的方法和系统主要针对的是女性群体，当面对男性群体时，方法可能就不会起作用。我们只是针对一个基因，使用最常规的PCR的办法建立的数学模型，适用于大多数年龄段的个体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种获得中国人群个体年龄的方法，克服因为生物标志物和方法选择不当，造成的预测年龄误差比较大的缺陷。该方法通过MSP(甲基化特异性聚合酶链反应)和Real-time PCR(相对定量和绝对定量)方法探讨了hTERT DNA甲基化与年龄预测的关系，拟合了三种基于甲基化检测的年龄预测模型，对90例1-79岁供者的血液样本进行了年龄预测，实现了利用血液或血痕对个体年龄的推断。

本发明的一种获得中国人群个体年龄的方法，包括：

(1)提取样本个体的DNA，进行DNA甲基化的亚硫酸氢盐修饰；

(2)获得所述DNA的hTERT基因的甲基化程度，建立甲基化程度和年龄的线性回归模型，即可获得中国人群个体年龄。

所述步骤(2)中hTERT基因的甲基化程度分别通过甲基化特异性聚合酶链反应，Real-time相对定量PCR或Real-time绝对定量PCR获得，并分别建立甲基化程度和年龄的回归模型。所述通过Real-time绝对定量PCR建立的回归模型R²＝0.9687，P<0.0001，在上述回归模型中，R²为相关系数或多元决定系数，表示拟合度，越大表示方程拟合度越好，其也代表模型的准确性，P为显著性，用于判断构建的方程是否有意义，小于0.05就可以说构建的方程有统计学意义。

所述甲基化特异性聚合酶链反应，Real-time相对定量PCR或Real-time绝对定量PCR过程均采用两对hTERT基因扩增引物：

上游引物：M 5’-TTGAGAATTTGTAAAGAGAAATGAC-3’(如SEQ ID NO.1所示)和下游引物M 5’-TAAAAACGAACCCGAAAACG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

上游引物：U 5’-TTGAGAATTTGTAAAGAGAAATGATG-3’(如SEQ ID NO.3所示)和下游引物：U 5’-ACTAAAAACAAACCCAAAAACACA-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

三种方法分别得到的线性回归模型的方程式(x指的是年龄，Y指的是甲基化率)如下：

甲基化特异性PCR:Y＝-0.0064x+1.2078(R²＝0.9846)；

Real-time相对定量PCR：Y＝-0.1023x+7.9449(R²＝0.9324)；

Real-time绝对定量PCR：Y＝-0.7603x+75.583(R2＝0.9687)。

本发明中使用三个模型都能实现对中国人群个体年龄的推断，并能对1-79岁的个体进行年龄推断，通过MSP建立的模型推断的年龄的平均误差在6.6岁左右；通过Real-time相对定量PCR和Real-time绝对定量PCR建立的模型推断的年龄的平均误差分别在5.19岁和4.29岁。最终，优选通过Real-time绝对定量PCR建立的模型能更好的预测年龄。

本发明中根据三种方法，分别建立年龄和甲基化程度的数学模型，并使用60个年龄样本建立的测试集。最后用30个血液样本对建立的模型进行验证，得到实际年龄和预测年龄的平均误差。

有益效果

(1)本发明利用甲基化特异性聚合酶链反应和Real-time PCR(相对定量和绝对定量)方法来探索hTERT DNA甲基化与年龄预测的关系，基于甲基化分析，拟合了三种用于年龄预测的模型，用于来自1-79岁的捐赠者的90份血样；其中，Real-time相对定量PCR模型使年龄预测能够达到R²＝0.9634，用30个血样的验证集验证了线性回归模型，预测平均误差为4.29年，这种可靠的方法实现了利用血液或血痕对个体年龄的推断；

(2)本发明方法和系统可以在涉外、反恐案件中，尤其对于在上述案件中提取到的血液或血痕样本进行年龄推断，推断犯罪嫌疑人或者受害人年龄范围，为案件的侦破提供线索，缩小搜查范围，提高破案效率；

(3)此发明涉及到的三种方法相比较其他的方法，比如焦磷酸测序，二代测序等，更加的方便和经济，能更好的适用于大量样本的检测；

(4)此发明研究的hTERT基因在其他的研究中只是和癌症相关，没有将其和年龄关联起来，而且在其他的发明中用于年龄的预测往往是多个基因，增加了预测的复杂性，本发明仅利用hTERT基因能更好的对个体年龄进行推断；

(5)由本发明实施例数据可以看出，本申请的方法应用于中国人群中30名不同年龄的无关个体的年龄推断，推断结果与30名个体的已知年龄非常接近，说明由本发明的的方法可以比较准确地获得中国人群个体的年龄，实现了利用血液或血痕对个体年龄的推断，推断的年龄的平均误差在6.4岁左右，具有良好的推断准确性。

附图说明

图1为hTERT基因部分样本中MSP产物的电泳图谱，其中甲基化条带是151bp，未甲基化条带是153bp。

图2为通过MSP(甲基化特异性聚合酶链反应)，建立的甲基化与年龄的数学模型(a)以及60个血液样本通过模型预测的误差(b)。

图3为通过Real-time相对定量PCR，建立的甲基化与年龄的数学模型(a)以及60个血液样本通过模型预测的误差(b)。

图4为通过Real-time绝对定量PCR，建立的甲基化与年龄的数学模型(a)以及60个血液样本通过模型预测的误差(b)。

图5为最后通过另外的30个样本对建立的模型进行预测；MSP(a)；Real-time相对定量PCR(b)；Real-time绝对定量PCR(c)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.样本的收集和DNA的提取

收集来自90个年龄在1至79岁之间的个体(女44，男46)的血液样品。将收集的血液样品置于含有EDTA的收集管中，在-20℃冷冻直至DNA提取。使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)根据制造商的方案从200μl外周血中提取基因组DNA，终体积为100μl。最后，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离完整性。

2.亚硫酸氢盐修饰

使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(NO.D5005)试剂盒，转化体积为20μl的基因组DNA(200ng)，其中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶未改变。在3小时内完全转化富含GC的DNA。两个热变性反应步骤简化了未甲基化的胞嘧啶向尿嘧啶的转化。总反应体积为10μl。DNA可以立即进行分析，也可以在-20℃或更低温度下保存，以备日后使用。对于长期储存，储存在等于或低于-70℃。

3.甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)

硫化后DNA序列中的甲基化胞嘧啶保持不变，而未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且在PCR反应期间尿嘧啶可被脱氧胸苷取代。MSP技术设计了两对不同的引物，用于检测DNA序列中的甲基化状态，具有所需DNA含量极少，不需要特定限制性位点和高灵敏度的优点。反应条件：98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环。MethPrimer设计的特异性引物及其序列如下所示表1。将扩增产物在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上电泳(图1)，并在UV检测器下观察。M-引物扩增产物的存在表明存在DNA甲基化。U-引物中扩增产物的存在是不存在DNA甲基化。如果扩增产物同时存在，则考虑部分DNA甲基化。最后，通过比较M和U波段的光密度值建立了年龄预测模型(图2a，线性相关R²＝0.9846)，并用60个样本建立测试集(图2b，线性相关R²＝0.9106，平均误差＝6.6年，60个样本)。

4.Real-time PCR

实时PCR用于进行hTERT基因的相对定量和绝对定量。PCR反应系统含有SYBR@Premix Ex TaqTM(2x)12.5μl，0.5μl上游和下游引物，以及200ng模板DNA。用双蒸水补充反应体积至25μl并进行两步PCR扩增。循环参数：95℃，30s；95℃，5秒；60℃，30秒。40个周期；95℃，15s，60℃，1分钟。95℃15秒。为每个样品提供两个重复孔。使用β-actin作为内部参考基因，通过比较hTERT基因的光密度和β-肌动蛋白获得hTRET基因的甲基化程度。它们的序列如表1所示。建立年龄预测模型(图3a，线性相关R²＝0.9324)，并用60个样本建立测试集(图3b，线性相关R²＝0.9383，平均误差＝5.31年，60个样本)。

通过甲基化标准对hTERT基因进行绝对定量，用双蒸水作为溶剂将混合物稀释10倍，浓度为100,80,60,40,200ng/μl，并在4℃下保存。甲基化阳性对照DNA以不同浓度作为反应底物。根据浓度梯度。通过将Ct值作为横坐标并且将标准DNA的量作为纵坐标来制备标准曲线，以检测hTERT基因的甲基化程度(图4a，线性相关R²＝0.9687)，并用60个样本建立测试集(图4b，线性相关R²＝0.9564，平均误差＝4.36年，60个样本)。

6.验证模型

使用30个血样作为验证集检查年龄预测模型,计算实际年龄的平均误差，以用线性回归模型评估我们的预测分析的准确性。最后，通过比较三种年龄预测模型的平均误差，确定最终的年龄预测模型如图5所示，MSP的线性相关R²＝0.9153，平均误差＝6.60年；Real-time相对定量PCR的线性相关R²＝0.9488，平均误差＝5.19年；Real-time绝对定量PCR，线性相关R²＝0.9634，平均误差＝4.29年。

7.性能比较

CN 104357561 A公开了一种获得中国人群女性个体年龄的方法和系统，以此为对比例，从三个方面进行性能比较。

第一，选择预测年龄的生物标志物。在应用于法医学预测嫌疑人年龄的时候，花费的时间越少越会为破案争取更多的时间。CN 104357561 A选择的是四个基因上的11个CpG位点，这无疑会对年龄的预测产生很大的工作量和工作难度，也许也会因为操作计算的失误，造成更大的年龄误差；我们本专利针对的是一个基因，即hTERT基因的启动子区域，操作起来更加的方便和快捷。

第二，针对的个体不同。CN 104357561 A适用于中国女性个体，而我们的专利面向中国所有年龄段的个体，包括男性，说明能更好的应用于法医学。

第三，两个专利同样的都是建立回归模型，预测的年龄误差却不同。CN 104357561A预测的年龄误差是6.4岁左右，而我们预测的是4.29岁，提高了年龄预测的准确度。

表1 PCR的引物序列

SEQUENCE LISTING

<110> 东华大学，中国科学院西北高原生物研究所

<120> 一种获得中国人群个体年龄的方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgagaattt gtaaagagaa atgac 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taaaaacgaa cccgaaaacg 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgagaattt gtaaagagaa atgatg 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

actaaaaaca aacccaaaaa caca 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaggtttag taagtttttt ggattgtg 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaacctact cctcccttaa aaattaca 28

Claims

1.一种获得中国人群个体年龄的方法，包括：

（1）提取样本个体的DNA，进行DNA甲基化的亚硫酸氢盐修饰；

（2）通过Real-time 绝对定量PCR获得所述DNA的hTERT基因的甲基化程度，建立甲基化程度和年龄的回归模型，即可获得中国人群个体年龄；

所述Real-time 绝对定量PCR过程采用两对hTERT基因扩增引物：

上游引物：M 5’-TTGAGAATTTGTAAAGAGAAATGAC-3’ 和

下游引物M5’-TAAAAACGAACCCGAAAACG-3’；

上游引物：U 5’-TTGAGAATTTGTAAAGAGAAATGATG-3’ 和

下游引物：U 5’-ACTAAAAACAAACCCAAAAACACA-3’；

所述建立甲基化程度和年龄的回归模型为 Y=-0.7603x+75.583；其中x指的是年龄，Y指的是甲基化率。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述通过Real-time 绝对定量PCR建立的回归模型R²＝0.9687，P<0 .0001。