CN103276086B - 京海黄鸡开产日龄的分子遗传标记及应用 - Google Patents

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本发明涉及家禽育种领域，具体涉及京海黄鸡开产日龄的分子遗传标记及筛选应用。该分子标记IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因。筛选方法为：提取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO：1-6的特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择具有BB/KK/OO复合基因型的个体。本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。

Description

京海黄鸡开产日龄的分子遗传标记及应用
技术领域
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种利用纯合复合基因型使鸡提早开产的方法。
背景技术
在种禽生产中,开产日龄作为种禽生长发育程度的一项重要指标,与整个产蛋期的生产性能有着密切的关系,已越来越受到了国内外饲养者的重视。国外的育种公司已用适当提早鸡开产日龄的方法来增加鸡产蛋数。开产日龄属于数量性状，是由多基因控制的。随着现代分子生物学技术的飞速发展，遗传学家和育种学家认识到控制数量性状的基因并非在基因组中随机分布，且存在影响数量性状的主效基因。
目前，在育种中对鸡开产日龄的筛选方法主要是通过数量遗传学方法，而数量遗传学方法进展缓慢，寻找到合适的DNA标记用于辅助选择能增强选择的准确性、缩短世代间隔，加快遗传进展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用纯合复合基因型使鸡提早开产的方法，该方法利用胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）、胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）和信号转导和转录激活子5b（STAT5b）基因的组合基因型对鸡的开产日龄进行标记辅助选择，不受环境影响。
本发明公开了IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因作为京海黄鸡开产日龄的分子遗传标记的应用。
基于上述应用的一种利用纯合复合基因型使鸡提早开产的方法，是：提取待测样本的鸡基因组DNA，经特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的基因型分别BB/KK/OO复合基因型的个体，也就是在2276、2359、3746、3753和3754、9221和9401bp处分别为T、C、G、T、T、A和T等位基因的纯合个体。
本发明的原理是：针对IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因分别设计1对引物，IGFBP-1引物的扩增产物经SSCP分析产生3种基因型（AA、AB和BB），直接测序表明BB型与AA型相比在2276bp处发生了A→T突变，在2359bp处发生了T→C突变；IGFBP-2引物的扩增产物经SSCP分析产生3种基因型（KK、KL和LL），LL型与KK型在3746bp处发生了G→T突变，在3753bp处发生了TT→CC的突变；STAT5b引物的扩增产物经SSCP分析产生5种基因型（OO、OP、OQ、PP和PQ），QQ型与OO型相比检测到A9921G突变，PP型和OO型相比发现一处T9401C突变。3个基因复合基因型与京海黄鸡开产日龄的相关分析表明，BB/KK/OO三基因纯合复合基因型的开产日龄最早，显著的早于AB/KK/PP、BB/KK/PP、BB/KL/OP和BB/LL/OP复合基因型（P<0.05）。该复合基因型能稳定遗传，选择的检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于京海黄鸡开产日龄的分子遗传标记。
附图说明
图1是IGFBP-1基因的SSCP图谱。1，2：BB型；5，6：AA型；3，4：AB型。
图2是IGFBP-1基因的测序图。
图3是IGFBP-2基因的SSCP图谱。1，2，6：KK；3，5：LL；4：KL。
图4是IGFBP-2基因的测序图。
图5是STAT5b基因的SSCP图谱。1：QQ型；2：PP型；3：PQ型；4，5：OQ型；6，8：OP型；7：OO型。
图6是STAT5b基因的测序图。
具体实施方式
实施例1
1.试验材料
200只京海黄鸡血样采自江苏京海禽业集团有限公司，翅静脉采集血样1.5mL，肝素钠抗凝，-20℃保存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE，对基因组DNA进行浓度测定后备用。
2.引物设计和PCR扩增
2.1SSCP引物的设计
分别根据GenBank中已发表鸡的IGFBP-1基因外显子2序列（登录号为：NC_006089）、IGFBP-2基因第3内含子序列（登录号：NC_006094）、STAT5b基因内含子13序列（登录号：NC_006114）设计1对引物。扩增产物大小分别为192、250和272bp。引物序列如下：
IGFBP-1：F:5’-CCAGAATCTACCGAGCCTGA-3’（SEQ ID NO：1）R:5’-CCCACTCACCTGTTCTTTCC-3’（SEQ ID NO：2）
IGFBP-2：F:5’-GTGAGGGTGATCAAATCCCTA-3’（SEQ ID NO：3）R:5’-AAGCAGGACCACATCCATCT-3’（SEQ ID NO：4）
STAT5b：F:5’-ACCCTGTGCCGTGTCTTTC-3’（SEQ ID NO：5）R:5’-AGAGCAGCCAAGCCCATC-3’（SEQ ID NO：6）
2.2PCR扩增
PCR扩增反应体系为20μL：10×buffer（25mmol/L）2μL；Mg2+（10pmol/μL）2.2μL；dNTPs（2.5mmol/L）0.8μL，DNA模板1μL，引物（均为10pmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，双蒸水11.8μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存，3对引物的退火温度分别为60、60和61℃。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.3PCR-SSCP检测
2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min，然后冰浴5min。3对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10%，凝胶交联度为29：1，电压都为150V，过夜电泳。
IGFBP-1引物的SSCP图谱如图1所示，显示3种基因型，分别定义为AA、AB和BB型（带型表明形成了3种基因型，两种纯合型分别用AA和BB表示，杂合型用AB表示，AA型在2276和2359bp处的等位基因分别为Ａ和Ｔ，BB型在相应的位点分别为Ｔ和Ｃ）。测序表明BB型与AA型相比在2276bp处发生了A→T突变，导致氨基酸的改变（Ile→Leu），在2359bp处发生了T→C突变，导致密码子ATT突变为ATC，但均编码异亮氨酸，属于同义突变（图2）。
IGFBP-2引物的SSCP图谱如图3所示，显示3种基因型，分别定义为KK、KL和LL型（带型表明形成了3种基因型，两种纯合型分别用KK和LL表示，杂合型用KL表示，KK型在3746、3753和3754ｂp处的等位基因分别为G、T和T，LL型在相应的位点分别为T、C和Ｃ）。测序表明LL型与KK型相比在第3内含子区域发生了3个突变，分别为：3746bp处，G→T；3753和3754bp处，TT→CC（图4）。
STAT5b引物SSCP图谱如图5所示，显示6种基因型，分别定义为OO、OP、OQ、PP、PQ和QQ基因型（带型表明形成了6种基因型，三种纯合型分别用OO、PP和QQ表示，相应的杂合型用OP、OQ和PQ表示，OO型在9221和9401bp处的等位基因分别为A和Ｔ，PP型在相应的位点分别为A和Ｃ，QQ型在相应的位点分别为G和T）。取OO、PP和QQ3种基因型的PCR产物片段进行测序。结果发现：QQ与OO相比在外显子13中检测到A9921G突变，PP和OO相比在内含子13内有一处T9401C突变（图6）。
2.4IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因复合基因型对京海黄鸡开产日龄的效应分析
配合下列模型分析IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b复合基因型对京海黄鸡开产日龄的影响：Y=μ+IGFBP-1基因的基因型效应+IGFBP-2基因的基因型效应+STAT5b基因的基因型效应+残差效应。京海黄鸡BB/KK/OO三基因纯合复合基因型与其他复合基因型开产日龄的比较见表1。
表1京海黄鸡BB/KK/OO三基因纯合复合基因型与其他复合基因型开产日龄的比较
复合基因型 开产日龄（天）
BB/KK/OO 134.11±3.33b
BB/KK/PP 146.25±5.00a
BB/LL/OP 146.00±4.50a
BB/KL/OP 144.00±5.00a
AB/KK/PP 142.50±5.00a
BB/LL/OO 141.80±3.16ab
AA/KK/OO 141.53±2.58ab
AA/LL/OP 141.33±4.08ab
AB/KK/OO 141.33±2.36ab
AB/LL/OO 141.29±2.67ab
BB/KK/OP 141.13±3.53ab
AA/LL/OO 140.65±2.42ab
AB/KK/OP 140.55±3.01ab
AA/KL/OO 139.50±5.00ab
AA/KL/OP 139.25±5.00ab
AB/LL/OP 137.54±2.77ab
AA/KK/OP 136.75±2.50ab
注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表可见，BB/KK/OO三基因纯合复合基因型的开产日龄最早，比BB/KK/PP基因型早开产12.14天（P<0.05），比BB/LL/OP基因型早开产11.89天（P<0.05），比BB/KL/OP基因型早开产9.89天（P<0.05），比AB/KK/PP基因型早开产8.39天（P<0.05），比16种复合基因型平均开产日龄141.33天提早7.22天。BB/KK/OO基因型在群体中容易固定，使京海黄鸡提早开产，所以根据IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的SSCP图谱筛选BB/KK/OO三基因纯合复合基因型可作为使京海黄鸡提早开产的方法，其法并可推广到其他品种。
Figure IDA00003274746800011
Figure IDA00003274746800021

Claims (1)

1.IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因作为京海黄鸡开产日龄的分子遗传标记的应用，其特征在于，提取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO：1-6的特异性引物扩增得到192、250和270 bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的基因型分别为BB/KK/OO复合基因型的个体，即在2276、2359、3746、3753和3754、9221和9401 bp处分别为T、C、G、T、T、A和T等位基因的纯合个体。
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