CN103276090B - 京海黄鸡16周龄体重的分子遗传标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及京海黄鸡16周龄体重的分子遗传标记的应用。该分子标记IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因。筛选方法为：提取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO：1-6所示的特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的基因型分别BB/KL/OP三基因复合基因型的个体。本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。
Description
技术领域
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种利用三基因联合效应提高鸡上市体重的方法。
背景技术
虽然常规育种方法在家禽遗传改良中取得一定进展，但它对数量性状的选择要在个体生长发育到一定时期，育种周期长，费用高。鸡的生长性状大部分是由多基因控制的数量性状，表现值是由内在的多基因和外在的环境共同作用的结果，如果从多个基因入手进行分子辅助育种，不仅可以加快育种进程，还可以全面提高鸡的生长性能。许多研究结果表明，有多个基因位点影响鸡的生长性状。因此，在研究这类性状时，需要同时对多个位点进行分析，这样才能得到基因与性状之间的真实相关性，在利用DNA标记进行辅助选择时才可能会获得更大的遗传进展。
胰岛素样生长因子（IGFs）是一类多肽因子，因其化学结构与胰岛素原类似而得名。胰岛素样生长因子系统是胚胎和动物出生后生长的主要决定因素。然而，IGFs的作用又受到很多因素的调节，其中胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）对其具有重要影响。胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）主要的生物学作用是运输和调节IGF-I与受体结合。胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）具有广泛的生物学功能，它能调节IGFs、TGFβ等生长因子的生物活性。胰岛素信号转导在细胞和生物体的代谢、生长、发育中起非常重要的作用。已发现许多生物大分子参与这一信号途径，信号转导和转录激活5b（STAT5b）就是其中之一。本专利的独特之处是发现IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b三基因联合对生长性状的效应。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用三基因联合效应提高鸡上市体重（16周龄体重）的方法，该方法利用IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的复合基因型对鸡的上市体重进行标记辅助选择，不受环境影响。
本发明公开了IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因作为京海黄鸡16周龄体重的分子遗传标记的应用。
基于上述应用的一种利用三基因联合效应提高鸡上市体重的方法，是：提取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO：1-6所示的特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型筛选IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的基因型分别为BB/KL/OP基因型的个体，也就是在2276、2359、3746、3753和3754、9221和9401bp处分别为T、C、G/T、T/C、T/C、A和T/C等位基因个体。
本发明的原理是：针对IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因分别设计1对引物，IGFBP-1引物的扩增产物经SSCP分析产生3种基因型（AA、AB和BB），直接测序表明BB型与AA型相比在2276bp处发生了A→T突变，在2359bp处发生了T→C突变；IGFBP-2引物的扩增产物经SSCP分析产生3种基因型（KK、KL和LL），LL型与KK型在3746bp处发生了G→T突变，在3753bp处发生了TT→CC的突变；STAT5b引物的扩增产物经SSCP分析产生5种基因型（OO、OP、OQ、PP和PQ），QQ型与OO型相比检测到A9921G突变，PP型和OO型相比发现一处T9401C突变。3个基因不同复合基因型与京海黄鸡16周龄体重的相关分析表明，三基因复合基因型BB/KL/OP在所有复合基因型中的16周龄体重最高，显著的高于AB/KK/OP基因型（P<0.05）。该选择的效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于京海黄鸡16周龄体重的分子遗传标记。
附图说明
图1是IGFBP-1基因的SSCP图谱。1，2：BB型；5，6：AA型；3，4：AB型。
图2是IGFBP-1基因的测序图。
图3是IGFBP-2基因的SSCP图谱。1，2，6：KK；3，5：LL；4：KL。
图4是IGFBP-2基因的测序图。
图5是STAT5b基因的SSCP图谱。1：QQ型；2：PP型；3：PQ型；4，5：OQ型；6，8：OP型；7：OO型。
图6是STAT5b基因的测序图。
具体实施方式
实施例1
1.试验材料
200只京海黄鸡血样采自江苏京海禽业集团有限公司，翅静脉采集血样1.5mL，肝素钠抗凝，-20℃保存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE，对基因组DNA进行浓度测定后备用。
2.引物设计和PCR扩增
2.1SSCP引物的设计
分别根据GenBank中已发表鸡的IGFBP-1基因外显子2序列（登录号为：NC_006089）、IGFBP-2基因第3内含子序列（登录号：NC_006094）、STAT5b基因内含子13序列（登录号：NC_006114）设计1对引物。扩增产物大小分别为192、250和272bp。引物序列如下：
IGFBP-1：F:5’-CCAGAATCTACCGAGCCTGA-3’（SEQ ID NO：1）
R:5’-CCCACTCACCTGTTCTTTCC-3’（SEQ ID NO：2）
IGFBP-2：F:5’-GTGAGGGTGATCAAATCCCTA-3’（SEQ ID NO：3）
R:5’-AAGCAGGACCACATCCATCT-3’（SEQ ID NO：4）
STAT5b：F:5’-ACCCTGTGCCGTGTCTTTC-3’（SEQ ID NO：5）
R:5’-AGAGCAGCCAAGCCCATC-3’（SEQ ID NO：6）
2.2PCR扩增
PCR扩增反应体系为20μL：10×buffer（25mmol/L）2μL；Mg2+（10pmol/μL）2.2μL；dNTPs（2.5mmol/L）0.8μL，DNA模板1μL，引物（均为10pmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，双蒸水11.8μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存，3对引物的退火温度分别为60、60和61℃。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.3PCR-SSCP检测
2μL PCR扩增产物加入7μL上样缓冲液，98℃变性10min，然后冰浴5min。3对引物的聚丙烯酰胺凝胶浓度为10%，凝胶交联度为29：1，电压都为150V，过夜电泳。
IGFBP-1引物的SSCP图谱如图1所示，显示3种基因型，分别定义为AA、AB和BB型（带型表明形成了3种基因型，两种纯合型分别用AA和BB表示，杂合型用AB表示，AA型在2276和2359bp处的等位基因分别为Ａ和Ｔ，BB型在相应的位点分别为Ｔ和Ｃ）。测序表明BB型与AA型相比在2276bp处发生了A→T突变，导致氨基酸的改变（Ile→Leu），在2359bp处发生了T→C突变，导致密码子ATT突变为ATC，但均编码异亮氨酸，属于同义突变（图2）。
IGFBP-2引物的SSCP图谱如图3所示，显示3种基因型，分别定义为KK、KL和LL型（带型表明形成了3种基因型，两种纯合型分别用KK和LL表示，杂合型用KL表示，KK型在3746、3753和3754ｂp处的等位基因分别为G、T和T，LL型在相应的位点分别为T、C和Ｃ）。测序表明LL型与KK型相比在第3内含子区域发生了3个突变，分别为：3746bp处，G→T；3753和3754bp处，TT→CC（图4）。
STAT5b引物SSCP图谱如图5所示，显示6种基因型，分别定义为OO、OP、OQ、PP、PQ和QQ基因型（带型表明形成了6种基因型，三种纯合型分别用OO、PP和QQ表示，相应的杂合型用OP、OQ和PQ表示，OO型在9221和9401bp处的等位基因分别为A和Ｔ，PP型在相应的位点分别为A和Ｃ，QQ型在相应的位点分别为G和T）。取OO、PP和QQ3种基因型的PCR产物片段进行测序。结果发现：QQ与OO相比在外显子13中检测到A9921G突变，PP和OO相比在内含子13内有一处T9401C突变（图6）。
2.4IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因复合基因型对京海黄鸡上市体重的效应分析
配合下列模型分析IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b复合基因型对京海黄鸡上市体重的影响：Y=μ+IGFBP-1基因的基因型效应+IGFBP-2基因的基因型效应+STAT5b基因的基因型效应+残差效应。京海黄鸡BB/KL/OP三基因复合基因型与不同复合基因型上市体重的比较见表1。
表1京海黄鸡BB/KL/OP三基因复合基因型与不同复合基因型上市体重的比较
| 复合基因型 | 16周龄体重/g |
| BB/KL/OP | 1226.00±58.45a |
| AB/KK/OP | 1089.78±33.75b |
| AA/LLOQ | 1083.00±45.28ab |
| AA/KK/OO | 1106.50±32.02ab |
| AA/LL/OP | 1139.25±50.62ab |
| AB/KK/OO | 1142.14±27.06ab |
| AA/LL/OO | 1142.22±33.75ab |
| AB/LL/OP | 1148.00±35.79ab |
| AA/KL/OP | 1155.33±58.45ab |
| AA/KK/OP | 1157.15±28.08ab |
| BB/KK/OP | 1169.00±35.79ab |
| BB/LL/OO | 1169.88±35.79ab |
| AB/LL/OO | 1171.44±33.75ab |
| BB/KK/PP | 1177.25±50.62ab |
| BB/KK/OO | 1194.50±35.79ab |
| BB/LL/OP | 1225.33±58.45a |
注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
BB/KL/OP复合基因型在所有基因型中的16周龄体重最高，比AB/KK/OP基因型高136.22g（P<0.05），比15种复合基因型平均上市体重1151.38高74.6g。筛选BB/KL/OP复合基因型可以提高京海黄鸡群体上市体重，所以根据IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的SSCP图谱筛选BB/KL/OP三基因复合基因型可作为提高京海黄鸡上市体重的方法，该法亦可推广到其他品种。
Claims (1)
1. IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因作为京海黄鸡16周龄体重的分子遗传标记的应用，其特征在于，提取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO：1-6所示的特异性引物扩增得到192、250和270bp的目的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型选择IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5b基因的基因型分别BB/KL/OP三基因复合基因型的个体，即在2276、2359、3746、3753和3754、9221和9401 bp处分别为T、C、G/T、T/C、T/C、A和T/C等位基因个体。
Priority Applications (1)
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| CN 201310215271 CN103276090B (zh) | 2013-05-30 | 2013-05-30 | 京海黄鸡16周龄体重的分子遗传标记及应用 |
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| IGF-I与IGFBP-1基因对京海黄鸡生长性状的遗传效应分析;赵秀华等;《畜牧兽医学报》;20121231;第43卷(第1期);摘要，正文第1.2、2.2、3.2节，表2、4，图4 * |
| Polymorphisms of two neuroendocrine-correlated genes associated with body weight and reproductive traits in Jinghai yellow chicken;Xiu Hua Zhao等;《African Journal of Biotehnology》;20110919;第10卷(第54期);摘要，第11125页右栏第1段、第11126页左栏第1段-第11127页左栏第1段，表3-5 * |
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