CN113025723A - 一种提高绵羊产羔数的snp标记、检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种影响绵羊产羔数的KISS1基因外显子区的SNP标记、检测方法及其应用。该标记位于绵羊12号染色体的KISS1基因上，具体的SNP标记为序列表中SEQ ID NO：1的第154bp处的C＞T碱基突变，CC基因型母羊的产羔数显著多于CT型，且CC为湖羊的优势基因型。本发明还公开了扩增SEQ ID NO：1序列所用的引物对及扩增方法。本发明以湖羊为研究对象，利用PCR扩增绵羊KISS1基因的DNA序列变异，分析该变异导致的氨基酸变化，分析基因特定位点多态性对绵羊产羔数的影响，可用于提高湖羊产羔数，加快以湖羊为育种素材的绵羊品种培育，也为绵羊繁殖性状的标记辅助选择育种提供基础，从而提高绵羊养殖业的经济效益。

Description

一种提高绵羊产羔数的SNP标记、检测方法及其应用

技术领域

本发明属于动物分子育种技术领域，涉及影响绵羊繁殖性状的SNP标记、检测方法及其在绵羊育种中的应用。

背景技术

绵羊繁殖力是影响其经济效益的重要指标，其中产羔数可显著影响羊场的经济效益。湖羊是绵羊的一种，具有四季发情、繁殖力强等繁殖特征，平均产羔率高达200％以 上，因此研究影响绵羊产羔数的分子标记对于绵羊多胎资源的开发利用及生产实践有重要意义。

青春期启动受下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic Pituitary Gonadal，HPG)内分泌系 统的调控，KISS1(肿瘤转移抑制基因)是HPG轴上游的重要调控激素，参与启动青春期。KISS1基因的编码产物是kisspeptins，与其受体GPR54结合通过KISS1/GPR54系统发 挥功能。KISS1基因在小尾寒羊卵巢发情周期的各阶段都有表达，并且发情期母羊卵巢 KISS1基因的表达量极显著高于发情后期、间情期和发情前期，因此KISS1基因在母羊发情 排卵中发挥功能。

目前，有关KISS1基因与羊产羔数相关的区域多位于内含子。在山羊上，KISS1基因内含子上的多态性位点与产羔数显著相关，且TT基因型在发情期雌二醇17β的水平较高，在黄体早、中期均具有较高的孕酮水平，这可能是影响产羔数的重要原因。在绵羊上，KISS1基因的g.1311578G＞T和g.1317523C＞T位点与小尾寒羊产羔数无关，但季节性发情绵 羊群体KISS1基因g.1317523C＞T位点的基因型频率和基因频率与常年发情绵羊群体有差 异，推测KISS1基因功能可能也与绵羊繁殖有关。因此，本发明通过寻找与绵羊产羔数性状相关的KISS1基因SNP标记，以期为绵羊产羔数性状的标记辅助选择提供新的标记资 源。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中对湖羊产羔数遗传选育所存在的技术问题之一。为此， 本发明的目的在于提供一种与绵羊产羔数性状相关，能够有效用于湖羊产羔数选育的SNP 标记及其应用。

根据本发明的实施例，所述SNP标记位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的下划线标记处。

根据本发明的实施例，该SNP标记的CC基因型个体的产羔数显著高于CT基因型的个体。根据本发明的实施例，通过检测绵羊的上述SNP标记，能够有效地预测其产羔数， 从而能够根据该SNP标记的基因型对绵羊繁殖性能进行评估。由此，本发明的SNP标记与 绵羊的产羔数性状紧密相关，能够有效用于绵羊的分子标记辅助育种，进而能够根据实际育 种需求对绵羊育种素材进行选择，进一步提高育种的效率和准确性，从而能够准确、高效地选育出绵羊优良品种。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测权利要求1所述一种SNP标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物为具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列， 用于检测所述SNP标记。具体地，引物对的序列如下所示：

P1：CACCCTGTGGCTCTGTCCT(SEQ ID NO：2)

P2：TCGGCAGCATTTCCTTTATT(SEQ ID NO：3)

根据本发明的实施例，利用本发明的引物对能够有效地对待测绵羊的上述与产羔数相关的 SNP标记所在片段进行PCR扩增，通过测序能够有效实现对这种SNP标记的检测，确定待 测绵羊该SNP标记的基因型，进而能够有效预测待测绵羊的产羔数。具体地，该SNP位点 的CC基因型个体产羔数显著高于CT基因型的个体。进而表明该SNP位点的CC基因型可以作为判断绵羊产羔数多少的重要标准。在绵羊选育工作中可以通过保留该SNP位点基因型为CC的个体，淘汰该SNP位点基因型为CT的个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。由 此，本发明用于检测前面所述SNP标记的引物对，能够有效用于绵羊的分子标记辅助育 种，进而能够实现低成本、高准确性地选育绵羊优良品种。

本发明的第三个目的是提供一种筛选所述分子标记的PCR扩增体系和扩增程序。

根据本发明的实施例，利用本发明的引物对及PCR扩增体系、扩增程序，对扩增产物进行测序，能够有效实现对待测绵羊的上述与绵羊产羔数相关的SNP标记的多态性检测，确定待测绵羊该SNP标记位点的基因型，进而能够有效预测待测绵羊的产羔数性状， 从而能够有效辅助绵羊选育。

本发明的第四个目的是提供一种预测绵羊产羔数性状的方法。根据本发明的实施例，该方法通过对待测绵羊进行前面所述的SNP标记的检测，预测所述待测绵羊的产羔数性状。具体地，可以通过能够用于检测本发明的与绵羊产羔数性状相关的SNP标记的试 剂、引物对等，对待测绵羊进行PCR扩增、测序，以便确定待测绵羊的上述SNP标记的基 因型，进而基于获得的基因型有效预测待测绵羊的产羔数性状。具体地，该SNP位点的CC 基因型个体中产羔数显著高于CT基因型的个体。

本发明提供了一个影响湖羊产羔数性状的SNP标记。所标记的SNP位点对应于GenBank上已经发布的绵羊12号染色体KISS1基因(登录号：NC_040263.1)编码区，该 位点核苷酸的C/T差异导致了绵羊产羔数的不同。

一种筛选具有高产羔数湖羊的方法，包含以下步骤：

(1)提取绵羊基因组DNA；

(2)利用两条特异性引物PCR扩增KISS1基因第三外显子区序列，得到428bp扩增产物； 所述的两条特异性引物序列为P1：SEQ ID NO：2和P2：SEQ ID NO：2；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；

(4)根据测序结果确定待测绵羊样品在所述SNP标记的基因型；

(5)CC基因型绵羊个体的产羔数显著多于CT基因型，选择CC基因型个体留种。

本发明所述的分子标记在筛选具有高产羔数湖羊中的应用。

本发明所述的引物对在筛选具有高产羔数湖羊中的应用。

本发明具有以下有益效果：(1)本发明提供的SNP标记与湖羊的产羔数显著相关，CC基因型湖羊的产羔数显著高于CT基因型母羊；(2)该SNP标记可以用于湖羊繁殖性状 的辅助选择，筛选多羔性状的绵羊，对进一步提高湖羊繁殖力和利用湖羊为素材进行品种(或品系)选育具有重要的实际应用价值。

附图说明

本发明的上述方面结合附图将更容易理解对实施例的描述，图1展示本发明的SNP标记CC、CT基因型测序峰图，其中，图1A为该SNP标记的CC基因型测序峰图，图1B 为该SNP标记的CT基因型测序峰图。

具体实施例

下面详细描述本发明的实施例，结合实施例对本发明进行进一步详细说明，此处实 施例仅用于说明本发明，而不能理解为对本发明的限制。

1.实验样本

采集湖北致清和农牧有限公司292只成年经产母羊的血样5ml，用乙二胺四乙酸二钾 (EDTA2K dipotassium edetate，EDTA-2K)抗凝，样品-20℃保存。记录母羊二胎以上的产羔 数。

2.基因组DNA提取

采用传统酚-氯仿法提取血液样本中的基因组DNA。测定样本DNA的OD260和OD280，OD260/OD280值在1.6～1.8之间个体的样本DNA用于后续实验，测定样本DNA浓度并稀 释至50mg/mL，4℃保存。

3.引物设计

根据绵羊KISS1基因(Gene Bank登录号：NC_040263.1)序列，用Primer-BLAST设计一 对特异性引物(P1：SEQ ID NO：2，P2 SEQ ID NO：3)扩增KISS1基因DNA序列，扩增产物428bp，该DNA序列为序列表中SEQ ID NO：1所示。

4.聚合酶链式反应(PCR)扩增样本DNA的目标序列并测序

(1)PCR反应体系：1μL DNA(50mg/mL)，上下游引物P1和P2(100uM)各0.5μ L，10xTrans Taq Buffer I 2.5μL，2μL dNTPs，Trans Taq HiFi DNA Polymerase 0.25μL，GC Enhancer 7.5μL，10.75μL蒸馏水。扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30 s，65～55℃退火30s，每1个循环退火温度降1℃，72℃1min，11个循环，95℃变性 30s，55℃退火30s，72℃1min，20个循环，72℃延伸10min；

(2)PCR扩增产物送天一辉远生物科技有限公司测序。用Chromas软件分析测序结果，将 扩增产物测序结果与KISS1基因序列进行比对，判定序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序 列第154bp位点的基因型。

5.湖羊KISS1基因序列变异

序列表中SEQ ID NO：1第154bp的SNP标记位点的碱基C突变为T使编码脯氨酸(Pro) 的密码子改变为编码亮氨酸(Leu)的密码子。

表1湖羊KISS1基因SNP位点。

位点	等位基因	位置	氨基酸变化
				g.5765C＞T	C/T	Exon3	P＞L

6.湖羊KISS1基因SNP标记与产羔数性状的关联分析

用SPSS软件中的单因素方差分析进行基因型与产羔数性状之间的关联分析。具体的线性分 析模型如下所述：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的基因型效应；E_ijk为随机误差。

7.湖羊不同基因型间产羔数差异显著性分析

湖羊不同基因型产羔数性状分析结果见表2。从表2可以看出，该位点只有两种基因型，采 用单因素方差分析比较不同基因型间平均产羔数的差异，发现CC基因型湖羊的产羔数显著 高于CT基因型(P＜0.05)。表明该SNP位点的CC基因型可以作为判断湖羊高产羔数的重 要标准。在湖羊选育工作中可以通过保留该位点基因型为CC的个体，淘汰该位点基因型为 CT或TT的个体，直至剔除TT或CT基因型个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。

表2 KISS1基因不同基因型与产羔数的相关性

注：不同的肩标字母表示差异显著(p＜0.05)

Claims (8)

1.一种与绵羊产羔数相关的分子标记，其特征在于：

(1)该分子标记位于KISS1基因外显子区域，具体的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述SNP标记位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的下划线标记处；

(2)该SNP标记位点具有C/T多态性，且该位点的CC基因型个体产羔数显著高于CT基因型个体。

2.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物对，其特征在于上游引物P1为：SEQ IDNO：2，下游引物P2为：SEQ ID NO：3。

3.一种检测权利要求1所述SNP标记的方法，其特征在于：

(1)扩增体系：1μL绵羊基因组DNA(50mg/mL)，上下游引物P1和P2(100uM)各0.5μL，10xTrans Taq Buffer I 2.5μL，2μL dNTPs，Trans Taq HiFi DNA Polymerase 0.25μL，GCEnhancer 7.5μL，10.75μL蒸馏水；

(2)PCR扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，65～55℃退火30s，每1个循环退火温度降1℃，72℃1min，11个循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃1min，20个循环，72℃延伸10min；

(3)对所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物428bp，对扩增产物进行测序，确定绵羊个体该SNP标记的基因型。

4.一种预测绵羊产羔数的方法，其特征在于，通过对待测绵羊进行权利要求1所述SNP标记的检测，预测待测绵羊的产羔数，确定是否留种。

5.如权利要求4所述的方法包括以下步骤：

(1)提取绵羊的基因组DNA；

(2)利用权利要求2和3的引物对、PCR扩增方法，用PCR法扩增待测绵羊的基因组DNA，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，根据测序结果确定待测绵羊个体在该SNP标记位点的基因型；

(4)该SNP标记位点CC型绵羊个体的产羔数显著多于CT基因型，选择CC型个体留种。

6.权利要求1所述的分子标记在高繁殖绵羊群体培育中的应用。

7.权利要求2所述的引物对在筛选具有高产羔数绵羊中的应用。

8.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述绵羊选自湖羊。

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