CN112941203A - 一种牛ITGβ5基因插入/缺失突变的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛ITGβ5基因插入/缺失突变的检测方法及其应用。以牛全基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增牛ITGβ5基因部分片段，应用琼脂糖凝胶电泳鉴定个体ITGβ5基因13‑bp InDel多态性位点的基因型。根据性状关联分析结果，ITGβ5基因13‑bpInDel多态性位点的基因型与母牛的繁殖性状显著相关。因此，ITGβ5基因13‑bp InDel多态性位点可用于母牛繁殖性状的早期标记辅助选择，以加快建立遗传资源优良的牛群体。

Description

一种牛ITGβ5基因插入/缺失突变的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种技术领域，涉及一种牛ITGβ5基因插入/缺失(InDel)多态性的检测方法和应用。

背景技术

提高雌性家畜的繁殖力是使牛养殖行业盈利的最直接、最有效的途径，然而，随着对高产奶牛不断进行人工选择，雌性生育力逐渐降低。因此，增加母牛的繁殖性能是亟待解决的难题。

卵巢是母牛性腺和生殖细胞如卵母细胞的来源，卵巢的发育和形态与母牛的繁殖性能密切相关。卵巢中的黄体是一种“临时腺体”，其主要任务是合成和分泌黄体酮，黄体会进一步退化成为白体，黄体酮是一种天然孕激素，在体内对雌激素激发过的子宫内膜形态有显著影响，为维持妊娠所必需。近年来，Freelyly、Kouamo以及Niswender等人的许多研究表明，卵巢发育和成熟卵泡质量等多个指标可评价母牛的繁殖性能，卵巢相关性状以及黄体特征可作为估计雌性生殖能力的有效指标，选择调控这些相关性状的关键候选基因是应用分子标记辅助选择提高牛繁殖力的前提。

分子标记辅助选择(Marker-assisted Selection，MAS)在动物育种中广为应用，可以显著提高选择的准确性和选择效率。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，及进行分子育种。插入/缺失(InDel)突变作为一种重要的分子遗传标记，具有分布广、密度高、数量多、检测方便等优点。且与其它变异相比，InDel多态性更容易通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术直接被鉴定。但作为遗传学鉴定标记，反刍动物繁殖性状的选育方面的InDel标记的研究和应用甚少。Cai等基于全基因组关联研究(GWAS)，已在牛的6条染色体上鉴定出7个数量性状位点(QTL)。在1号染色体上，确定了针对两个QTL的10个候选基因，而对于其余的染色体，针对每个QTL，不同研究中的基因的不同表达提示以FRAS1、ITGβ5、ADCY5和SEMA5B作为奶牛繁殖性状的候选基因。Zhu等利用GEO数据库和TCGA数据库中的高通量表达数据，评估了整合素两个超家族ITGA和ITGB在HGSOC中的预后价值。

整合素是众所周知的细胞粘附受体，是由α和β亚基组成的异二聚体，Gillan等研究表明整合素在卵巢和卵泡发育中具有重要作用；整合素家族基因ITGβ5编码整合素β5，现已知整合素β5结合细胞外基质并介导细胞迁移、复制或凋亡，Herrera等研究表明ITGβ5在牛卵巢发育中有重要作用；Hatzirodos等研究表明ITGβ5在卵巢中卵泡的发育过程中有重要作用；Liu等研究发现ITGβ5在卵泡选择中具有重要意义。但目前尚未见到研究ITGβ5基因多态性与牛卵巢表型性状关系的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛ITGβ5基因插入/缺失突变的检测方法及其应用，通过简单、快速、低成本、精确地对InDel多态性位点进行分型，可以快速建立优良繁殖性状的遗传资源群体，加速对牛优良繁殖性能的选育。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测牛个体基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含ITGβ5基因插入/缺失多态性位点的片段，将扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定该个体插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位13-bp缺失突变位点。

优选的，所述PCR的扩增引物对为：

上游引物：5’-GTTCCTGCTCAAGTCTCGGG-3’

下游引物：5’-CTTCCACTCTCACCCCCAAC-3’。

优选的，所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为2.5％的琼脂糖凝胶。

优选的，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点有三个基因型，其中插入/插入基因型II表现为187bp一条带纹，插入/缺失基因型ID表现为187bp和174bp两条带纹，缺失/缺失基因型DD表现为174bp一条带纹。

一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括用于PCR扩增牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位13-bp缺失突变位点的引物对(例如，上述上游引物和下游引物)。

上述牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测方法在牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位13-bp缺失突变位点的多态性与牛的繁殖性状显著相关。

优选的，所述繁殖性状选自卵巢宽、黄体直径中的一种或两种。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据牛ITGβ5基因插入/缺失多态性位点(NC_037328.1:g.69192856-69192868)设计引物，以牛基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。对该插入/缺失多态性位点与牛繁殖性状进行关联性分析的结果表明，本发明检测的插入/缺失多态性位点存在提高牛繁殖性状的DNA标记(InDel标记)，可应用于牛分子标记辅助选择育种中，从而加快建立繁殖性状优良的种群，有利于提高良种选育速度。

附图说明

图1为牛ITGβ5基因13-bp缺失突变位点扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，M表示Marker。

图2为牛ITGβ5基因PCR扩增产物测序图；其中，方框标出的部分表示13-bp缺失序列GTCAGATACGGGA(NC_037328.1:g.69192856-69192868)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。需要说明的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的保护范围的限制。

本发明利用PCR方法对牛ITGβ5基因g.69192856-69192868位点(参考序列：NC_037328.1)缺失突变在牛群体中可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其基因型与牛繁殖性状进行关联性分析，验证其是否可以作为牛分子育种中辅助选择的分子标记。具体说明如下。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker(100-600bp)(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品，包括柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》，高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)、25min。

1)提取组织样DNA所用溶液：

除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：

①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。

②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-HCl(pH 8.0)l mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，及2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计牛ITGβ5基因突变位点引物

根据牛ITGβ5参考基因序列(NC_037328.1)，利用NCBI设计能够扩增包含牛ITGβ5基因13-bp缺失突变位点(NC_037328.1:g.69192856-69192868位)的DNA片段的引物对，引物对序列如下：

上游引物：5’-GTTCCTGCTCAAGTCTCGGG-3’(20nt)

下游引物：5’-CTTCCACTCTCACCCCCAAC-3’(20nt)。

以上述引物对牛基因组进行扩增，扩增产物包含牛ITGβ5基因(NC_037328.1)下游4000bp位置附近的13-bp缺失变异区域(该位点仍属于ITGβ5基因)；其插入/插入基因型表现为187bp一条带纹；插入/缺失基因型表现为187bp和174bp两条带纹，缺失/缺失基因型表现为174bp一条带纹。

3.PCR扩增牛ITGβ5基因目的片段

3.1奶牛卵巢样本采集

从奶牛(中国荷斯坦牛)个体采集卵巢样品696份，于2019年3月至2020年6月间采样(采样地：陕西省西安市)，用统一标准同组测定这些卵巢样本的形态表型，包括卵巢长度、宽度、黄体直径与黄体个数，其中，采用无菌电子秤对卵巢进行称重，采用游标卡尺或双尺测量给定卵巢的长度、宽度与黄体直径。考虑到卵巢的大小取决于发情周期的阶段，仅对相同年龄阶段(5-6岁)的健康中国荷斯坦牛进行采样。根据其线粒体DNA的D-loop区域比对结果可确定所有卵巢来源于不同的牛个体。

3.2卵巢样品组织基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和参考以下文献：蓝贤勇.山羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至20ng/μL作为模板，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6PCR反应体系

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系：2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL(上下游引物浓度为10pmol/μL)、基因组DNA(浓度为20ng/μL)0.5μL，及去离子水5.2μL；共13μL。

3.7PCR反应程序

1)95.0℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)94.0℃变性30s，68.0℃退火30s(每个循环减1℃)，72.0℃延伸20s，共18个循环，然后进入步骤3)；

3)94.0℃变性30s，50.0℃退火30s，72.0℃延伸20s，共25个循环；

4)经过步骤3)后，72.0℃延伸10min。

4.琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作2.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4.0μL，点样后120V电压电泳50-60min；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像系统成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析InDel多态性。

扩增产物的电泳检测如图1所示，第3泳道为Marker(由大到小依次为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp)，其余泳道为不同个体的扩增目的片段检测结果，结果表明，牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位存在的13-bp缺失突变位点有II、ID和DD三个基因型，II为插入/插入基因型，表现为187bp一条带纹，ID为插入/缺失基因型，表现为187bp和174bp两条带纹，DD为缺失/缺失基因型，表现为174bp一条带纹。对扩增的片段进行测序鉴定后发现存在13-bp缺失突变，测序峰图如图2所示。

5.牛ITGβ5基因13-bp缺失突变位点的基因型和基因频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：

P_YY＝N_YY/N

式中，P_YY代表某一位点的YY基因型频率；N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率：

P_Y＝(2N_YY+N_Ya1+N_Ya2+N_Ya3+N_Ya4+……+N_Yan)/2N

式中，P_Y表示等位基因Y频率，N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数量，N_Yai表示群体中具有Yai基因型个体数量，a1－an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。

针对采集的样品，牛ITGβ5基因13-bp缺失突变位点的基因型频率、等位基因频率及遗传多态性指数如表1所示。

表1.牛ITGβ5基因13-bp缺失突变位点的遗传参数分析

根据基因型和基因频率分析(表1)，牛ITGβ5基因13-bp缺失突变位点(NC_037328.1:g.69192856-69192868)为一个插入/缺失(InDel)多态性位点。

6.牛ITGβ5基因InDel位点多态性与卵巢相关性状的关联性分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；

分析方法：利用SPSS对牛个体进行基因型与繁殖性状的关联性分析，结果如表2所示。

表2.基因多态性与卵巢相关性状的关联性分析

注：同一行数据平均值肩上字母不同，表示存在统计学差异

由表2可以看出，ITGβ5基因13-bp缺失突变位点的多态性对奶牛繁殖性状有显著影响，与卵巢宽及黄体直径显著相关(P<0.05)，II基因型的个体黄体直径更优，ID基因基因型的个体卵巢宽更优。作为InDel(插入/缺失)多态性位点(NC_037328.1:g.69192856-69192868)，其II和ID基因型可作为牛繁殖性状的DNA分子标记。

总之，本发明利用PCR扩增方法检测所发现的牛ITGβ5基因一个新的InDel多态性位点(NC_037328.1:g.69192856-69192868)，并将其与牛的繁殖性状进行关联性分析，发现其与牛繁殖性状显著相关，存在作为牛分子育种中辅助选择的分子标记，可以用于快速建立繁殖性状优良的种群，从而加快良种选育速度。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种牛ITGβ5基因插入/缺失突变的检测方法及其应用

<160> 3

<210>1

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

gttcctgctc aagtctcggg 20

<210>2

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

cttccactct cacccccaac 20

<210>3

<211> 13

<212> DNA

<213> NC_037328.1:g.69192856-69192868位缺失序列

<400> 3

gtcagatacg gga 13

Claims (10)

1.一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以待测牛基因组DNA为模板，利用PCR扩增包含ITGβ5基因插入/缺失多态性位点的片段，将扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定该插入/缺失多态性位点的基因型；所述插入/缺失多态性位点选自牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位13-bp缺失突变位点。

2.根据权利要求1所述一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增引物对为：

上游引物：5’-GTTCCTGCTCAAGTCTCGGG-3’

下游引物：5’-CTTCCACTCTCACCCCCAAC-3’。

3.根据权利要求1所述一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，25个循环；72℃延伸10min；所述电泳采用质量浓度为2.5％的琼脂糖凝胶。

4.根据权利要求1所述一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点有三个基因型，其中插入/插入基因型II表现为187bp一条带纹，插入/缺失基因型ID表现为187bp和174bp两条带纹，缺失/缺失基因型DD表现为174bp一条带纹。

5.牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位13-bp缺失突变位点在牛分子标记辅助选择育种中的应用。

6.一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于PCR扩增牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位13-bp缺失突变位点的引物对。

7.根据权利要求6所述一种牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：所述引物对为：

上游引物：5’-GTTCCTGCTCAAGTCTCGGG-3’

下游引物：5’-CTTCCACTCTCACCCCCAAC-3’。

8.如权利要求1所述的牛ITGβ5基因插入/缺失多态性的检测方法在牛分子标记辅助选择育种中的应用。

9.根据权利要求5或8所述的应用，其特征在于：所述牛ITGβ5基因NC_037328.1:g.69192856-69192868位13-bp缺失突变位点的多态性与牛的繁殖性状显著相关。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述繁殖性状选自卵巢宽、黄体直径中的一种或两种。

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