CN115125305A - 一组可提高绵羊乳头数的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一组影响绵羊乳头数KISS1基因外显子区的SNP标记及其应用。该组标记位于绵羊12号染色体的KISS1基因上，具体的SNP标记为序列表SEQ ID NO：1的第176bp处的C＞T碱基突变(TT基因型母羊的乳头数显著多于CC和CT基因型)、228bp处的G＞A碱基突变(AA基因型母羊的乳头数显著多于GG和GA基因型)和306bp处的C＞G碱基突变(GG基因型母羊的乳头数显著多于CC和CG基因型)。本发明还公开了扩增SEQ ID NO：1序列所用的引物对。本发明以湖羊为研究对象，利用PCR扩增绵羊KISS1基因的DNA序列变异，分析该变异导致的氨基酸变化及KISS1基因特定位点多态性对绵羊乳头数的影响，通过优选该组SNP的优势等位基因，可提高湖羊乳头数，加快以湖羊为育种素材的绵羊品种培育，为绵羊乳头数性状的标记辅助选择育种提供基础。
Description
技术领域
本发明属于动物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一组影响绵羊乳头数性状的SNP标记及其在绵羊育种中的应用。
背景技术
绵羊产羔数是重要的经济性状，而多数绵羊为单胎品种，因此近年来人们利用多羔绵羊品种为实验材料，寻找影响绵羊产羔数性状的基因，并据此进行选育以提高绵羊的产羔数，因此绵羊产羔数不断提高。目前正在培育的绵羊群体产羔数已得到快速提高，有很多个体可以产双羔、三羔、四羔，甚至五羔。但绵羊只有两个乳头，随着产羔数的增加，母羊不能够正常哺乳，羔羊育成率大大降低，生产中往往采用寄养和人工饲养来解决这个问题，但这些管理措施增加管理难度和管理成本。乳头是羔羊哺乳期获取营养的重要器官，乳头数与部分繁殖性状(如窝产子数、泌乳力等)有中等程度的相关，因此在提高绵羊产羔数的选育过程中增加绵羊乳头数才能实现提高产羔数的效果，这对产三羔以上绵羊个体尤其重要。我们在湖羊群体中发现有的个体有四个乳头，极少数个体有三个乳头，因此可能存在控制乳头数的基因。若在高产羔数的绵羊群体中根据此基因选择乳头数性状，则可选育出高产羔数和多乳头数的群体，进而提高绵羊的繁殖效率。
Kisspeptins是下丘脑-垂体-性腺轴的上游激素，与其受体GPR54结合通过KISS1/GPR54系统参与繁殖调控。目前的研究表明编码Kisspeptins的KISS1基因多态性与绵羊和山羊的产羔数相关，因此KISS1基因与绵羊繁殖有关。目前还没有发现控制绵羊乳头数基因的文献报道，因此，本发明寻找与绵羊乳头数性状相关的KISS1基因SNP标记，以期为绵羊乳头数性状的标记辅助选择提供新的标记资源，为加快绵羊乳头数性状的遗传改良和提高绵羊生产效益奠定基础。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中对绵羊乳头数遗传选育所存在的技术问题之一。
本发明的第一个目的在于提供三个与绵羊乳头数性状相关、能够有效用于绵羊乳头数选育的SNP标记。所述三个SNP标记分别位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第176bp处的C＞T碱基突变、228bp处的G＞A碱基突变和306bp处的C＞G碱基突变。根据本发明实施例，当绵羊个体所述SNP标记1的基因型为IT时，其乳头数显著高于CC和CT基因型个体；当绵羊个体所述SNP标记2的基因型为AA时，其乳头数显著高于GG和GA基因型个体；当绵羊个体所述SNP标记3的基因型为GG时，其乳头数高于CC和CG基因型个体。根据本发明实施例，检测绵羊的上述SNP标记能有效地预测其乳头数，根据三个SNP标记的基因型可以评估绵羊乳头数。由此，本发明的三个SNP标记与绵羊的乳头数性状紧密相关，能够用于绵羊的分子标记辅助育种，从而能够准确、高效地选育出乳头数多的绵羊品种或品系。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测权利要求1所述三个SNP标记的引物对。根据本发明的实施例，所述引物为具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，用于检测所述SNP标记。具体地，引物对的序列如下所示：
P1：GGGCAGAGTGGATCTGTGAG(SEQ ID NO：2)
P2：GATCAGCACCCCTTTTGCCT(SEQ ID NO：3)
根据本发明的实施例，利用本发明的引物对能够有效地对待测绵羊的上述与乳头数相关的三个SNP标记所在片段进行PCR扩增，通过测序能够有效实现对这三个SNP标记的检测，确定待测绵羊在这三个特定位点SNP标记的基因型。
本发明的第三个目的是提供一种预测绵羊乳头数性状并进行遗传改良的方法。利用上述位于绵羊12号染色体上与乳头数相关的SNP分子标记筛选多乳头数性状的绵羊品种的方法，包含如下步骤：检测绵羊12号染色体上与乳头数相关的SNP分子标记，确定所述SEQID NO：1序列第176位单核苷酸是C还是T，淘汰该SNP标记1位点处基因型为CC和CT的个体；确定所述SEQ ID NO：1序列第228位单核苷酸是G还是A，淘汰该SNP标记2位点处基因型为GG和GA的个体；确定所述SEQ ID NO：1序列第306位单核苷酸是C还是G，淘汰该SNP标记3位点处基因型为GG和GC的个体。
本发明提供了一种筛选具有多乳头数湖羊的方法，包含以下步骤：
(1)提取绵羊基因组DNA；
(2)利用两条特异性引物PCR扩增KISS1基因第一外显子区序列，得到469bp扩增产物；所述的两条特异性引物序列为P1：SEQ ID NO：2和P2：SEQ ID NO：2；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；
(4)根据测序结果确定待测绵羊样品在所述SNP标记的基因型；
(5)选择SNP标记1位点的TT基因型、SNP标记2位点的AA基因型、SNP标记3位点的GG基因型的绵羊个体留种。
本发明所述的分子标记在筛选具有多乳头数湖羊中应用。
本发明所述的引物对在筛选具有多乳头数湖羊中应用。
本发明具有以下有益效果：(1)本发明提供的SNP标记不受绵羊的年龄限制，可用于绵羊的早期选育。(2)本发明提供的SNP标记与绵羊的乳头数显著相关，SNP标记1位点为CC基因型绵羊的乳头数显著高于CC和CT基因型；SNP标记2位点为AA基因型绵羊的乳头数显著高于GG和GA基因型；SNP标记3位点为GG基因型绵羊的乳头数显著高于CC和CG基因型。(3)该组SNP标记可以作为筛选乳头数多的湖羊的辅助选择，对进一步提高湖羊繁殖力和利用湖羊为素材进行品种(或品系)选育具有重要的实际应用价值。
附图说明
本发明的上述方面结合附图将更容易理解对实施例的描述，图1展示本发明三个SNP标记的基因型测序峰图，其中，图1a为SNP标记1的CC基因型测序峰图，1b为SNP标记1的CT基因型测序峰图，1c为SNP标记1的TT基因型测序峰图。图1d为SNP标记2的GG基因型测序峰图，1e为SNP标记2的GA基因型测序峰图，1f为SNP标记2的AA基因型测序峰图。图1g为SNP标记3的CC基因型测序峰图，1h为SNP标记3的CG基因型测序峰图，1i为SNP标记3的GG基因型测序峰图。
具体实施例
下面详细描述本发明的实施例，结合实施例对本发明进行进一步详细说明，此处实施例仅用于说明本发明，而不能理解为对本发明的限制。
1.实验样本
采集湖北致清和农牧有限公司292只成年经产母羊的血样5ml，用乙二胺四乙酸二钾(EDTA2K dipotassium edetate，EDTA-2K)抗凝，样品-20℃保存。记录母羊的乳头数。
2.基因组DNA提取
采用传统酚-氯仿法提取血液样本中的基因组DNA。测定样本DNA的OD260和OD280，OD260/OD280值在1.6～1.8之间个体的样本DNA用于后续实验，测定样本DNA浓度并稀释至50mg/mL，4℃保存。
3.引物设计
根据绵羊KISS1基因(Gene Bank登录号：NC_040263.1)序列，用Primer-BLAST设计一对特异性引物(P1：SEQ ID NO：2，P2：SEQ ID NO：3)扩增KISS1基因的一段DNA序列，扩增产物469bp，该DNA序列为序列表SEQ ID NO：1所示。
4.聚合酶链式反应(PCR)扩增样本KISS1基因的目标序列并测序
(1)PCR反应体系：1μL DNA(50mg/mL)，引物P1和P2(100uM)各1μL，10μL MIX，7μL蒸馏水。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃ 1min，30个循环，72℃延伸10min；
(2)PCR扩增产物送天一辉远生物科技有限公司测序。用Chromas软件分析测序结果，将扩增产物测序结果与KISS1基因序列进行比对，判定序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列第176bp位点、228bp位点和306bp位点的基因型。
5.湖羊KISS1基因序列变异
序列表中SEQ ID NO：1第176bp位点的SNP标记1位点的碱基C突变为T使编码的精氨酸(Arg)的密码子突变为终止密码子，第228bp位点的SNP标记2位点的碱基G突变为A使编码甘氨酸(Gly)的密码子改变为编码谷氨酸(Glu)的密码子，第306bp位点的SNP标记3位点的碱基C突变为G使编码脯氨酸(Pro)的密码子改变为编码精氨酸的密码子。
6.湖羊KISS1基因SNP标记与乳头数性状的关联分析
用SPSS软件中的单因素方差分析进行基因型与乳头数性状之间的关联分析。具体的线性分析模型如下所述：
Yijk＝μ+Gj+Eijk
其中：Yijk为个体表型记录；μ为群体均值；Gj为各位点的基因型效应；Eijk为随机误差。
7.湖羊不同基因型间乳头数差异显著性分析
湖羊不同基因型乳头数性状分析结果见表2。从表2可以看出，三个SNP标记位点均有3种基因型，采用单因素方差分析比较不同基因型间乳头数的差异，发现SNP标记1位点的TT基因型湖羊的乳头数显著高于CC和CT基因型(P＜0.05)，SNP标记2位点的AA基因型湖羊的乳头数显著高于GG和GA基因型(P＜0.05)，SNP标记3位点的GG基因型湖羊的乳头数显著高于CC和CG基因型(P＜0.05)。表明SNP标记1的TT基因型、SNP标记2的AA基因型和SNP标记3的GG基因型可以作为判断湖羊乳头数的重要标准。在湖羊选育工作中可以保留SNP标记1位点基因型为TT、SNP标记2位点基因型为AA和SNP标记3基因型为GG的个体，淘汰SNP标记1、SNP标记位点2和SNP标记3位点的其他基因型个体，从而逐步提高群体的乳头数。
Claims (7)
1.一组与绵羊乳头数相关的分子标记，其特征在于：
(1)三个SNP标记位于KISS1基因外显子区域，具体的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO：1所示，所述SNP标记位于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的下划线标记处。
(2)三个SNP标记特征描述如下：
SNP标记1，所述SNP标记1位点具有C/T多态性，该SNP标记位于序列SEQ ID NO：1的第176位，该位点的TT基因型个体乳头数显著高于CC或CT基因型个体。
SNP标记2，所述SNP标记2位点具有G/A多态性，该SNP标记位于序列SEQ ID NO：1的第228位，该位点的AA基因型个体乳头数显著高于GG或GA基因型个体。
SNP标记3，所述SNP标记3位点具有C/G多态性，该SNP标记位于序列SEQ ID NO：1的第306位，该位点的GG基因型个体乳头数显著高于CC或CG基因型个体。
2.一组用于检测权利要求1所述SNP标记的引物对，其特征在于上游引物P1为：SEQ IDNO：2，下游引物P2为：SEQ ID NO：3。
3.一种预测绵羊乳头数的方法，其特征在于，通过对待测绵羊进行权利要求1所述SNP标记的检测，预测待测绵羊的乳头数，确定是否留种。
4.如权利要求3所述的方法包括以下步骤：
(1)提取绵羊的基因组DNA；
(2)利用权利要求2所述的引物对，用PCR法扩增待测绵羊的基因组DNA，以便获得PCR扩增产物。PCR反应体系：1μL DNA(50mg/mL)，引物P1和P2各1μL(100μM)，10μL MIX，7μL蒸馏水。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火30s，72℃ 1min，30个循环，72℃延伸10min；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，根据测序结果确定待测绵羊个体在SNP标记位点的基因型；
(4)基于待测绵羊在所述SNP标记位点的基因型，按如下情况确定留种个体。
①当SNP标记1的基因型为TT基因型时，乳头数显著高于CC和CT型，选择TT基因型的个体留种；
②当SNP标记2的基因型为AA基因型时，乳头数显著高于GG和GA型，选择AA基因型的个体留种；
③当SNP标记3的基因型为GG基因型时，乳头数显著高于CC和CG型，选择GG基因型的个体留种。
5.权利要求1所述的分子标记在提高绵羊乳头数的培育过程中的应用。
6.权利要求2所述的引物对在筛选具有多乳头数绵羊的过程中的应用。
7.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述绵羊选自湖羊。
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